Summary
Hier beschrijven we een methode voor het laden van een calciumgevoelige kleurstof door de kikker zenuwstomp in de zenuwuitgangen. We presenteren ook een protocol voor de opname en analyse van snelle calcium transiënten in de perifere zenuw eind.
Abstract
Een van de meest haalbare methoden voor het meten van presynaptische calciumniveaus in presynaptische zenuwterminals is optische opname. Het is gebaseerd op het gebruik van calciumgevoelige fluorescerende kleurstoffen die hun emissieintensiteit of golflengte veranderen afhankelijk van de concentratie van vrij calcium in de cel. Er zijn verschillende methoden gebruikt om cellen met calciumkleurstoffen te vlek. Meest voorkomend zijn de processen om de kleurstoffen te laden door middel van een micropipet of pre-incubatie met de acetoxymethylestervormen van de kleurstoffen. Deze methoden zijn echter niet goed van toepassing op neuromusculaire kruispunten (NMJ's) als gevolg van methodologische problemen die zich voordoen. In dit artikel presenteren we een methode voor het laden van een calciumgevoelige kleurstof door de kikker zenuwstomp van de kikkernauw in de zenuwuitgangen. Aangezien de invoer van extern calcium in zenuwterminals en de daaropvolgende binding aan de calciumverf binnen de milliseconde tijdschaal plaatsvinden, is het nodig om een snel beeldvormingssysteem te gebruiken om deze interactie te registrerenNS. Hier beschrijven we een protocol voor het opnemen van het calcium transient met een snelle CCD camera.
Introduction
Calciumionen (Ca 2+ ) nemen deel aan veel neuronale signaleringsprocessen, inclusief de initiëring, onderhoud en plasticiteit van mediator release 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Bij de komst van het actiepotentiaal komt extracellulaire Ca 2+ in de zenuwterminal en begint de vrijgave van neurotransmitter. In sommige synapses kan de calciumstroom direct met behulp van elektrofysiologische methoden 6 , 7 , 8 worden gemeten. In het geval van de neuromusculaire verbinding (NMJ) kan men geen directe patch klemmen en twee-elektrode spanningsklemtechnieken gebruiken door de minutengrootte van de zenuwuitgangen.
Opnamen van inwendige Ca 2+ stromen van de zenuwuitgangen in de NMJ kunnen worden gedaan door indirecte elektrofielenIologische methoden 9 , 10 . Deze methoden vereisen echter de voorbehandeling van de synaps door natrium- en kaliumionkanaalblokkers. Optische methoden vereisen geen farmacologische scheiding van ionische stromingen in de zenuwterminal en laten opnamen van Ca 2+ -toevoer toe, veroorzaakt door actiepotenties en de daaropvolgende verhoging van Ca 2+ ionen in de axoplasma 11 , 12 , 13 , 14 . Deze methoden zijn gebaseerd op opnames van veranderingen in de fluorescentie van specifieke Ca 2+ -gevoelige kleurstoffen bij de binding van vrije Ca 2 + ionen 15 , 16 , 17 , 18 , 19 .
Ca 2+ indicatoren kunnen in de c worden geladenElls door een verscheidenheid aan methoden, afhankelijk van het doel van het experiment. Onderzoekers gebruiken de badtoepassing van membraandoorlaatbare kleurstofvormen 20 , 21 , laden via patchpipette 22 of microinjectie 23 , 24 , 25 . Echter, al deze methoden hebben enkele beperkingen in het geval van de NMJ vanwege zijn eigenaardigheden in synaptische architectonica. Voor de NMJ is de meest geschikte en succesvolle methode de kleurstof door de zenuwstomp, een voorvulmethode 26 , 27 , 28 , 29 te laden . Deze techniek kan gebruikt worden voor het laden van verschillende fluorescentie-kleurstoffen in de perifere zenuwuitgangen. Deze methode is succesvol gebruikt voor Drosophila zenuwterminals 28 , de hagedis motorische zenuw28 en kikkermotor zenuwterminals 17 , 26 , 27 , 30 . Afhankelijk van het onderzochte object kunnen methodische details variëren. Een glazen micropipet kan worden gebruikt voor kleine zenuwen van larven 28 . Verscheidene onderzoekers hebben een methode beschreven 27 , 28 waarin een vers gesneden einde van de zenuw die een spier binnentreedt, wordt gedompeld in een put die vooraf met een kleurstof wordt gevuld. De voorbereiding wordt vervolgens enkele uren gelaten om de kleurstof te laten ontdoen. De kleurstof wordt door de axonen doordrenkt en naar de zenuwterminals vervoerd. In dit artikel beschrijven we een methode om een fluorescentie-indicator in te laden in kikkermotor zenuwterminals via de zenuwstomp. Ons protocol maakt gebruik van een plastic pipet tip voor de incubatie van het weefsel met een kleurstof. We beschrijven ook hoe Ca 2+ fluorescentie tra te verwerven en analyserennsients.
Protocol
Experimenten werden uitgevoerd op geïsoleerde zenuwspierpreparaten van de musculus cutane pectoris van de Rana ridibunda kikker. De grootte van de dieren van beide geslachten was ongeveer 5-9 cm. De experimentele procedures werden uitgevoerd overeenkomstig de richtlijnen voor het gebruik van laboratoriumdieren van de Kazan Federal University en de Kazan Medical University, in overeenstemming met de NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals. Het experimentele protocol voldoet aan de eisen van Richtlijn 86/609 / EEG van de Europese Gemeenschappen en is goedgekeurd door het Ethisch Comité van de Kazan Medical University.
1. Voorbereiding van de oplossingen
- Bereiding van de oplossing van Ringer.
- Bereid de oplossing van Ringer: 113,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 3,0 mM NaHC03 en 1,8 mM CaCl2. Stel de pH op op 7.2-7.4.
- Bereid de oplossing van Ringer met een lage Ca 2+ 2+ inhoud: 113,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 3,0 mM NaHC03, 6,0 mM MgCl2, 0,9 mM CaCl2. Stel de pH op op 7.2-7.4.
- Bereiding van de kleurstofoplossingsoplossing.
- Bereid de op water gebaseerde oplossing die HEPES-Na bevat bij 10 mM (pH 7,2-7,4).
- Voeg 14 μl van de HEPES-oplossing toe aan een injectieflacon met de kleurstof 30 .
OPMERKING: de Ca 2+ indicator kleurstof komt in een 500 ml injectieflacon met 500 μg poeder. - Vortex en draai omlaag om grondig te mengen.
- Verdun de oplossing om de uiteindelijke concentratie van de Ca 2+ indicator tot 30 mM te brengen. Vermijd blootstelling aan licht en opslaan bij -20 ° C.
2. Dye-loading Procedure
- Dissect de spierpectorisspier met een pectoralis proprius zenuw.
OPMERKING: De dissectie procedure is beschikbaarIn een gratis download van het papier door Blioch et al. , 1968 31 .- Voor de dissectie procedure, gebruik twee fijne tang en hoornvliesschaar (zie de tabel van materialen ). Breng het gezaagde weefsel over in een silicium-elastomeer-gecoate Petri-schaal, die gevuld is met Ringer's oplossing en maak het weefsel vast met fijne roestvrijstalen pennen, zodat het licht in het gerecht is gestrekt.
- Vul de Petri-schotel opnieuw op met een frisse aliquot van de oplossing van de Ringer. Verwijder de bindweefsels. Beschadig de zenuw niet.
- Bereid de vulpijp voor: gebruik een scheermesje, snijd een 2 mm lang stuk van het conische gedeelte van een standaard plastic 10 μL pipetpunt uit.
- Bereid een stuk modelleer om de vulpijp op de Petri-schotel te monteren.
- Sluit de achterkant van de vulpijp aan op een plastic spuit via siliconenpijp en plastic verbindingsadapters gemaakt van pipettespen.
- Voor de dLaadprocedure, verwijder de oplossing van de Ringer uit de petrischaal met behulp van een plastic pipet. Droog de spier-zenuwpreparatie met een fijne spuit; Dit voorkomt de verdunning van de Ca 2+ kleurstof bij de daaropvolgende laad van de vulpijp.
- Verwijder de Ca 2+ indicator flesje uit de vriezer en laat het op kamertemperatuur op een donkere plaats ontdooien.
- Onder stereomicroscoopcontrole met lage vergroting (10 ×), detecteer de verbinding tussen de spier en de zenuw. Met fijne pincetjes en scharen, snij de pectoralis proprius zenuw dicht bij het spieroppervlak (zie stap 2.1). Laat een zenuwstomp ongeveer 2 mm lang.
- Bevestig de vulpijp aan de buizen en de spuit op de petrischaal met behulp van modelleerklep.
- Verplaats de tip van de pipet dicht bij de zenuwstomp.
- Zuig het zenuwstomp zachtjes in de punt van de vulpijp voorzichtig.
- Verwijder de zuigleiding van de blunT einde van de vulpijp.
- Verwijder de overtollige oplossing voorzichtig uit de vulpijp met behulp van een spuit met een lange naald (zie de tabel ). Knip de zenuwstomp niet vast.
- Verhoog de punt van de vulpijp lichtjes verticaal en houd de zenuwstomp in de punt geaspireerd.
- Isolatie van het aspiratiegedeelte van de zenuwstomp van de buitenkant van de vulpipettaart met behulp van petroleumjelly.
- Zet de zenuwstomp die in de vulpijp is geïsoleerde, indien nodig op: Smeer de overtollige oplossing van de vulpijp voorzichtig met een spuit met een lange naald.
- Teken 0,5 μL van de kleurstofoplossingsoplossing (zie stap 1) met een pipet met een lange pipettaart.
- Steek de pipetpunt voorzichtig in met de laadoplossing in de vulpijp. Verwijder het mengsel direct op de zenuwstomp.
- Verzegel het open einde van de vulpijp met petroleumjelie.
- Voeg een kleine aliquot van Ringer's toeOlivering aan de Petri-schotel om het preparaat nat te houden.
- Incubeer het preparaat bij kamertemperatuur onder donkere en natte omstandigheden gedurende 5 uur.
- Verwijder het vulpijpje met de oplaadoplossing, spoel het preparaat met de oplossing van de Ringer en houd het overnacht in de koelkast bij 8 ° C.
3. Het voorbereiden van de weefsel voor microscopie
- Monteer het preparaat in de silicium elastomeer gecoate kamer en fixeer het met stalen micro-naalden, zodat het licht uitgestrekt is.
- Spoel het weefsel af met een aliquot van verse Ringer's oplossing.
- Gebruik een zuigelektrode om de zenuw te stimuleren; Constructie van de elektrode is verkrijgbaar bij de gratis download van het papier door Kazakov et al. , 2015 32 . Plaats de elektrodepunt dicht bij het gesneden einde van de zenuw en zet de zenuwstomp in de elektrodeopening.
- Monteer de voorbereidingskamer op de microscoopfase. PlacE de temperatuursensor en de inlaat- en uitlaatontstekingen in de kamer.
- Sluit het netsnoer aan op het Peltier-element.
- Om het preparaat te overbruggen, gebruik een eenvoudig zwaartekrachtgedreven systeem. Om de overtollige oplossing te verwijderen, zet de perfusie zuigpomp aan.
- Schakel de thermostuureenheid in.
- Stel de temperatuurregelaar in op 20 ° C.
- Monteer het ultraviolette beschermingsschild.
- Sluit de stimulerende draadelektrode aan op de elektrische stimulator en let op de spiercontracties onder de microscoop met een 4x objectieflens.
- Vul het perfusiesysteem in met de oplossing van de Ringer met een laaggehalte van Ca 2+ en een hoge Mg 2+ -inhoud.
OPMERKING: Deze oplossing wordt gebruikt om spiercontracties te voorkomen. Een afname in de concentratie van extern calcium en een verhoging van extern magnesium resulteert in de reductie van de amplitude van Ca 2+ transiënten. Echter, op basis van eerdere ervaring, 0,9 mM CaCl - Schakel de pomp in en start de superfusie van het preparaat met de oplossing van de Ringer met een lage Ca 2+ en hoge Mg 2+ .
- Overschakelen naar de 40 × objectieve lens op de microscoop.
- Schakel t in Hij monochromator (zie de Tabel van Materialen ).
- Selecteer een emissiegolflengte van 488 nm en een continue verlichtingswijze in de monochromator besturingssoftware.
- Bij hoge vergroting in de fluorescentiemodus moet u ervoor zorgen dat de zenuwterminals met de kleurstof geladen zijn.
Figuur 1 : Zenuw en terminals met geladen Ca 2+ indicator. ( A ) Zenuw gevuld met Ca 2+ indicator na de laadprocedure. Schaalbalk = 200 μm. ( B ) Zenuwuitgangen gevuld met Ca 2+ indicator. Schaalbalk = 20 μm. ( C ) Ca 2+ -indicator fluorescentie is duidelijk zichtbaar in de zenuwafsluiting. Schaalbalk = 20 μm._blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Laat het preparaat tenminste 30 minuten in evenwicht brengen in de lage Ca 2+ en hoge Mg 2+ oplossing.
4. Video-opname met de digitale CCD-camera
Opmerking: De details van het vastleggen van fluorescentiesignalen zijn specifiek voor elk microscoop- en cameratype, maar de belangrijkste overweging is de opname snelheid.
- Gebruik 1 kHz als de minimale opnamefrequentie voor opnames van enkele Ca 2+ transiënten in de NMJ.
OPMERKING: Snelle digitale CCD-camera's zijn nodig voor het imago van fluorescentie (zie de tabel van materialen ). Het gegevensverzamelingssysteem en de software (zie de tabel van materialen ) werden hier gebruikt voor de synchronisatie van de camera, monochromator en stimulator. Kortom, dit protocol maakt het mogelijk de synchronisatiepulsen te genereren op digitale uitgangen van de dataAcquisitie systeem om de sluiter te openen, het videosignaal op te nemen en stimulatie te starten. Alle temporale parameters kunnen in de protocollen en / of op de apparaten worden ingesteld. Een typisch protocol is een serie van 500 frames die zijn verkregen bij 1 kHz (80 x 80 pixels). Verlichting met excitatie licht kan de Ca2 + indicator bleken en fotodamage het celweefsel. Zo vermijd lange blootstellingen aan excitatie licht. In dit protocol is de sluiter alleen geopend voor de benodigde tijd om de video vast te leggen. Verkrijg twintig series per specifieke zenuw terminal. Het doel hiervan is om dezelfde locaties in de controlegroep en na de levering van geneesmiddelen te controleren. - Onder de 4X objectieflens van een microscoop, gebruik de helderveldregime om de spier- en zenuwtakken te visualiseren.
- Schakel over naar de 40X objectieflens en zoek met behulp van het epifluorescentie regime en een excitatie golflengte van 488 nm naar kleurstofbelaste zenuwuitgangen. Identificeer een zenuw eindigend gebied van belang.
- Op de trinoculaire buis oVoor de microscoop, selecteer de lichtweguitwisselingsniveaus: 100% licht naar de camera.
- Start de acquisitie software voor de CCD camera.
- Zoek in de modus "Live" de ROI en pas de focus aan.
- Selecteer het menu "Wijzigen" instellingen.
- Gebruik de 'Basic Configuration' op 1000 frames per seconde (fps), met een resolutie van 80 x 80.
- Stel het aantal invoerframes in op 500.
- Voer de naam van het experiment in.
- Kies 'Externe trigger'.
- Stel de pre-trigger-tijd in op 10 ms.
- Stel het aantal herhalingen in op 20.
- Selecteer in de monochromator besturingssoftware een emissiegolflengte van 488 nm en de 'externe triggerverlichting' modus.
- Run de data-acquisitie software.
- Laad het stimulatieprotocol.
- Voordat u de video opneemt, moet u het donkere frame vastleggen met behulp van de video-acquisitie software.
- Voer het stimulatieprotocol uit.
- Selecteer de ROI en checK het opgenomen signaal.
5. Data-analyse
NoOTE: Voor data analyse gebruik de CCD camera software en ImageJ; De gegevens worden weergegeven als een curve in een spreadsheet programma. In de CCD-camerasoftware herhaalt en verwerkt gemiddeld 20 de resultaten naar een ImageJ-ondersteuningsbestand. Selecteer in ImageJ de ROI en de achtergrond. Trek de achtergrond van de ROI af. Vertel de gegevens als een verhouding: (ΔF / F 0-1 ) x 100%, waar is ΔF de intensiteit van fluorescentie tijdens stimulatie en F 0 de intensiteit van fluorescentie in rust is.
- Klik in de acquisitie software voor de CCD camera op Bestand> Gemiddelde bestanden. Selecteer de bestanden en gemiddelde ze.
- Sla het gemiddelde bestand op als een .fit bestand door op "Save as Fit file" te klikken.
- Voer de ImageJ-software uit. Voer de volgende stappen uit:
- Klik op Afbeelding> aanpassen> helderheid / contrast.
- Klik op Afbeelding> stapels> tools>; Stapel sorteren.
- Klik op Analyse> tools> ROI manager.
- Sleep het gemiddelde .fit-bestand naar het ImageJ-venster.
- Zoom in op het raam voor een betere weergave.
- Door de cursor te verplaatsen selecteert u het laatste frame en verwijdert u het (dit is het donkere frame)
- Selecteer een rechthoekige ROI over het gebied dat wordt beschouwd als de achtergrond. Voeg het toe aan de ROI manager
- Meet de achtergrond door op Meer> Multi Measurement te klikken. Let op de MEAN. Kopieer de data, exporteer het naar een spreadsheet programma en berekén de gemiddelde waarde van de drempel voor een ratio.
- Trek de drempel van de stapels af door op Process> Main> Subtract te klikken. Voer de gemiddelde waarde van de drempel in.
- Selecteer een rechthoekige ROI rond een zenuwaansluiting. Voeg het toe aan de ROI manager.
- Meet door te klikken op Meer> Multi Measure. Let op de MEAN. Kopieer en exporteer het naar een spreadsheet programma.
- Gemiddeld de compensatie van de signalen.
OPMERKING: gebruik deEerst een paar dozen punten die basisfluorescentie tonen zonder stimulatie; Dit is de fluorescentie in rust. - Verdeel de signalen door de fluorescentie in rust.
- Trek "1" af en vermenigvuldigd met 100%.
- Plot het signaal en bereken de amplitude van de Ca 2+ transient.
Representative Results
Na het laden van de kleurstof en bij motorische zenuwstimulatie kan een toename van de amplitude van het fluorescerende signaal (Ca 2+ transiënt) worden gedetecteerd in de zenuwterminals (zie Figuur 2 ). Parameters van Ca 2+ transiënten worden weergegeven in Tabel 1 . Kwantitatief zijn de parameters van de Ca 2+ transiënten gemeten in onze studie dicht bij de gegevens verkregen door andere wetenschappers bij synaptes van koudbloedige dieren 15 , 34 . De parameters van de Ca 2+ transienten zijn afhankelijk van de bindingssnelheid van Ca 2+ met de kleurstof en de daaropvolgende dissociatie. De toedieningssnelheid van Ca 2+ in de zenuwuitgang, de interactie met de kleurstof en diffusie in het cytoplasma beïnvloeden allemaal de stijgtijd van de Ca 2+ transient. De vervalstijd van het fluorescerende signaal hangt af van de affiniteit van de kleurstof,De snelheid van de Ca 2+ interactie met intracellulaire buffers en de verwijdering door ionpompen 35 . De amplitude analyse van Ca 2+ transiënten kan worden gebruikt om de invloed van verschillende stoffen op de calciuminvoer te onderzoeken die deelneemt aan neurotransmitter vrijgave 33 .
Figuur 2 : De gemiddelde Ca 2+ Voorbijgaande gemeten in de kikker NMJ. De Ca 2+ transient werd berekend op basis van het gemiddelde van signalen van 13 kikker NMJ's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| HoogtepuntΔF / F (%) | Stijgingstijd 20% -80% (ms) | Τ (ms) |
| 12,6 ± 1,1 (n = 13) | 4,6 ± 0,5 (n = 13) | 115,3 ± 8,3 (n = 13) |
Tabel 1: De gemiddelde parameters van de Ca 2+ transient. De gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± SE; N is het aantal metingen in verschillende NMJ's. De piek ΔF / F is de gemiddelde amplitude van ΔF / F.
Discussion
In dit document hebben we de methode voor het uitvoeren van Ca 2+ -gevoelige kleurstoflading in de zenuwuitgangen van kikker door de zenuwstomp gepresenteerd. Aan het eind van de laadprocedure hebben alle terminals in het proximale gedeelte van de zenuw significante niveaus van fluorescentie. Er is geschat dat de intra-terminale concentratie van de sonde tussen 40 en 150 μM 17 varieert.
De incubatieprocedure wordt uitgevoerd in twee stappen: bij kamertemperatuur en dan bij een lagere temperatuur in de koelkast. Het is belangrijk om de tijd van weefsel incubatie met de kleurstof bij kamertemperatuur te controleren. Afhankelijk van de werkelijke lengte van de zenuwstomp, de specifieke kleurstof en de temperatuur kan de incubatietijd variëren. Als u overbelicht bent, kunnen terminals in de proximale delen dicht bij de zenuwstomp overbelast worden. In het midden van de zenuw is het echter nog steeds mogelijk om terminals te vinden die bevredigend geladen zijn. Tijdens de thEen lange incubatie in de koelkast, de kleurstof is gelijkmatig verdeeld over de zenuwuitgangen.
Onze eigen waarnemingen 33 , 35 , evenals de gegevens van andere onderzoekers 30 , bewijzen dat er geen significante invloed is op de laadprocedure op de amplitude van de postsynaptische respons of op de frequentie van miniatuur eindplaatpotenties. Goede levensduur werd gedocumenteerd in de geladen voorbereidingen. Er zijn enkele belangrijke punten waaraan we aandacht willen vestigen. Het is essentieel om de zenuwstomp in de kleurstofoplossingsoplossing binnen een paar minuten na de excisie te plaatsen om de kleurstof in de axonen van de gesneden zenuw in te gaan. Vertragingen kunnen ondoeltreffend laden veroorzaken, vermoedelijk door de wederopening van zenuwassons 27 , 36 . Sommige onderzoekers dompelen de zenuwstomp in 100 mM EDTA (een Ca 2+ - en Mg 2+ -chelator) Onmiddellijk na het uitsnijden van de zenuw om te voorkomen dat de gesneden axonen opnieuw worden afgesloten. De buffer wordt na 1-2 minuten verwijderd en vervangen door een kleurstofoplossingsoplossing 37 . Het gebruik van een petroleumgelputje in plaats van plastic buizen voor de laadprocedure maakt het gebruik van een kortere zenuwstomp mogelijk. Tijdens het gebruik van deze aanpak wordt de zenuw gesneden nadat het in de HEPES-oplossing met kleurstof is gedompeld, en de axonen worden niet teruggeteld door het gebrek aan tweewaardige ionen in de kleurstofoplossing 27 , 28 .
In onze studie gebruikte we de in water oplosbare zoutvorm van de Ca 2+ indicator in plaats van dextran. De dextranconjugaten diffunderen langzamer in de axon dan de zoutvormen. Echter, het gebruik van het dextranconjugaat vermindert kleurstofcompartmentalisatie en behandeling door de zenuw en NMJ's. Calcium Groen 1-3000 MW dextran conjugaat heeft een goede diffusie snelheid en demonstreert verminderde compartimentalisatie
Het is erg belangrijk om een lang periode van fluorescerende verlichting van het weefsel te vermijden, omdat dit de gezondheid en het overleven beïnvloedt. We gebruiken Nomarski-optica in het zichtbare lichtkanaal om te zoeken naar zenuwterminals. Tijdens de opname beperken we het verlichte veld met behulp van een diafragma.
Het is opmerkelijk dat deze laadmethode alleen geschikt is voor preparaten die lange incubaties kunnen weerstaan. Om de kleurstof te beperken wanneer studies worden uitgevoerd op meer kwetsbare weefsels ( bijv. Synaptes van warmbloedige dieren), is het nodig om de zenuwstomplengte te verkleinen en micropipetten te gebruiken voor het laden van 29 , 39 .
Deze laadtechniek is goed geschikt voor beeldvormende veranderingen in cytosolische Ca 2+ , met fluorescentie-indicatoren onder zowel enkel-zenuwstimulatie als ritmische synaptische activiteitEf "> 17 , 27 , 35. De analyse van de Ca 2+ transient amplitude kan gebruikt worden om de invloed van verschillende stoffen op de calciuminvoer te onderzoeken die deelneemt aan neurotransmitter vrijgave 33 .
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek is uitgevoerd onder het Russische Stichting Program voor Concurrerende Groei van de Kazan Federale Universiteit en een subsidie van de Russische Stichting voor Basisonderzoek (16-04-01051; 16-34-00817; 15-04-02983). We bedanken vier anonieme recensenten voor het geven van nuttige opmerkingen over eerdere ontwerpen van het manuscript. Wij danken Yuliya Aratskaya voor de stemopname. Wij zijn dankbaar voor Dr. Victor Ilyin voor de vele nuttige opmerkingen en de hulp bij de finale bewerking van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ca2+ indicator | Molecular Probes, USA | Oregon Green 488 BAPTA-1 hexapotassium salt, O6806 | 500 μg |
| Silicone Elastomer | Dow Corning, USA | Sylgard 184 elastomer | |
| Pipette | Biohit, Russia | 720210 | 0.5-10µL |
| Pipette tip | Fisher Scientific, USA | 02-707-175 | 10µL |
| Pipette tip | Biohit, Russia | 781349 | 10µL |
| Razor Blade | Fisher Scientific, USA | 12-640 | |
| Minutien Pins | Fine scince tools, Canada | 26002-20 | |
| Corneal Mini-Scissors | MT MEDI CORP, Canada | S-1111 | |
| Jeweler Forceps | MT MEDI CORP, Canada | F-9610 | |
| Jeweler Forceps | MT MEDI CORP, Canada | F-9611 | |
| Modelling clay | local producer | can be replaced by any local producer | |
| Petroleum jelly | local producer | can be replaced by any local producer | |
| Microspin FV 2400 | Biosan, Latva | BS-010201-AAA | |
| Multi-spin MSC 3000 | Biosan, Latva | BS-010205-AAN | |
| Single-use hypodermic needles | Bbraun | 100 Sterican | 0.4×40mm |
| Syrynge | local producer | 0.5 ml | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, USA | H0887 | 100ml |
| Microscope, BX51 | Olympus, Japan | ||
| Data acquisition system | Molecular Devices, USA | Digitdata 1550 | |
| software | Molecular Devices, USA | pClamp software, Version 10 | protocol can be download from : http://kpfu.ru/portal/docs/F_230007060/Video.capture.with. RedShirt.Neuro.CCD.camera.pro |
| Bath and bath temperature controler | Experimental Builder | can be replaced by any chamber with temperature control. For example from https://www.warneronline.com/ | |
| Monochromator | Till Photonics, Germany | Polychrome V | no longer available, can be replaced by other sutable stable light source 488 nm |
| monochromator control software | Till Photonics, Germany | Polycon | |
| Digital CCD camera | Redshirt imaging, USA | Neuro CCD SMQ | |
| Model 2100 Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems, USA | ||
| Acquisition software for CCD camera | Redshirt imaging, USA | Turbo SM software | |
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | |
| Spreadsheet program | Microsoft, USA | Microsoft Office Excel |
References
- Llinás, R., Sugimori, M., Silver, R. B. Microdomains of high calcium concentration in a presynaptic terminal. Science. 256, 677-679 (1992).
- Augustine, G. J. How does calcium trigger neurotransmitter release? Curr Opin Neurobiol. 11, 320-326 (2001).
- Burnashev, N., Rozov, A. Presynaptic Ca2+ dynamics, Ca2+ buffers and synaptic efficacy. Cell Calcium. 37, 489-495 (2005).
- Schneggenburger, R., Neher, E. Presynaptic calcium and control of vesicle fusion. Curr Opin Neurobiol. 15, 266-274 (2005).
- Pang, Z. P., Südhof, T. C.
- Borst, J. G., Sakmann, B. Calcium influx and transmitter release in a fast CNS synapse. Nature. 383, 431-434 (1996).
- Borst, J. G., Sakmann, B. Calcium current during a single action potential in a large presynaptic terminal of the rat brainstem. J Physiol. 506, 143-157 (1998).
- Yazejian, B., DiGregorio, D. A., Vergara, J. L., Poage, R. E., Meriney, S. D., Grinnell, A. D. Direct measurements of presynaptic calcium and calcium-activated potassium currents regulating neurotransmitter release at cultured Xenopus nerve-muscle synapses. J Neurosci. 17, 2990-3001 (1997).
- Molgó, J., Mallart, A. Effects of Anemonia sulcatatoxin II on presynaptic currents and evoked transmitter release at neuromuscular junctions of the mouse. Pflugers Arch. 405 (4), 349-353 (1985).
- Slutsky, I., Rashkovan, G., Parnas, H., Parnas, I. Ca2+-independent feedback inhibition of acetylcholine release in frog neuromuscular junction. J Neurosci. 22 (9), 3426-3433 (2002).
- Haugland, R. P. Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions. Handbook of fluorescent probes and research products. Gregory, J. , MolecularProbes. Eugene,Oregon. 771-826 (2002).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Tsien, R. Y. Fluorescent indicators of ion concentrations. Methods Cell Biol. 30, 127-156 (1989).
- Adams, S. R. How calcium indicators work. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (3), (2010).
- DiGregorio, D. A., Vergara, J. L. Localized detection of action potential-induced presynaptic calcium transients at a Xenopus neuromuscular junction. J Physiol. 505, 585-592 (1997).
- Sabatini, B. L., Regehr, W. G. Optical measurement of presynaptic calcium currents. Biophys J. 74, 1549-1563 (1998).
- Suzuki, S. Ca2+ dynamics at the frog motor nerve terminal. Pflug Arch Eur J Phisiol. 440, 351-365 (2000).
- Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. The life cycle of Ca2+ ions in dendritic spines. Neuron. 33, 439-452 (2002).
- Luo, F., Dittrich, M., Stiles, J. R., Meriney, S. D. Single-pixel optical fluctuation analysis of calcium channel function in active zones of motor nerve terminals. J Neurosci. 31, 11268-11281 (2011).
- Regehr, W. G. Monitoring presynaptic calcium dynamics with membrane-permeant indicators. Imaging in neuroscience and development: a laboratory manual. Yuste, R., Konnerth, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 307-314 (2005).
- Macleod, G. T. Topical Application of Indicators for Calcium Imaging at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 786-790 (2012).
- Eilers, J., Konnerth, A. Dye loading with Patch Pipettes. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (4), 277-281 (2009).
- Coleman, W. L., Bill, C. A., Simsek-Duran, F., Lonart, G., Samigullin, D., Bykhovskaia, M. Synapsin II and calcium regulate vesicle docking and the cross-talk between vesicle pools at the mouse motor terminals. J Physiol. 586 (19), 4649-4673 (2008).
- Macleod, G. T. Direct Injection of Indicators for Calcium Imaging at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 797-801 (2012).
- Talbot, J. D., David, G., Barrett, E. F., Barrett, J. N. Calcium dependence of damage to mouse motor nerve terminals following oxygen/glucose deprivation. Exp Neurol. 234 (1), 95-104 (2012).
- Peng, Y. Y., Zucker, R. S. Release of LHRH is linearly related to the time integral of presynaptic Ca2+ elevation above a threshold level in bullfrog sympathetic ganglia. Neuron. 10, 465-473 (1993).
- Tsang, C. W., Elrick, D. B., Charlton, M. P. alpha-Latrotoxin releases calcium in frog motor nerve terminals. J Neurosci. 20 (23), 8685-8692 (2000).
- Newman, Z., Malik, P., Wu, T. Y., Ochoa, C., Watsa, N., Lindgren, C. Endocannabinoids mediate muscarine-induced synaptic depression at the vertebrate neuromuscular junction. Eur J Neurosci. 25 (6), 1619-1630 (2007).
- Macleod, G. T. Forward-filling of dextran-conjugated indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 3440-3450 (2012).
- Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
- Blioch, Z. L., Glagoleva, I. M., Liberman, E. A., Nenashev, V. A. A study of the mechanism of quantal transmitter release at a chemical synapse. J Physiol. (1), 11-35 (1968).
- Kazakov, A., Aleksandrov, M., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Samigullin, D. V. A simple suction electrode for electrical stimulation of biological objects. Mezhdunarodnyj nauchno-issledovatel'skij zhurnal. 40 (9), In Russian 13-16 (2015).
- Khaziev, E. Acetylcholine-induced inhibition of presynaptic calcium signals and transmitter release in the frog neuromuscular junction. Front Physiol. 7 (621), 1-10 (2016).
- Bélair, E. L., Vallée, J., Robitaille, R. Long-term in vivo modulation of synaptic efficacy at the neuromuscular junction of Rana pipiens frogs. J Physiol. 569 (1), 163-178 (2005).
- Samigullin, D., Fatikhov, N., Khaziev, E., Skorinkin, A., Nikolsky, E., Bukharaeva, E. Estimation of presynaptic calcium currents and endogenous calcium buffers at the frog neuromuscular junction with two different calcium fluorescent dyes. Front Synaptic Neurosci. 6 (29), 1-10 (2015).
- Angleson, J. K., Betz, W. J. Intraterminal Ca2+ and spontaneous transmitter release at the frog neuromuscular junction. J Neurophysiol. 85 (1), 287-294 (2001).
- Shahrezaei, V., Cao, A., Delaney, K. R. Ca2+ from one or two channels controls fusion of a single vesicle at the frog neuromuscular junction. J Neurosci. 26 (51), 13240-132499 (2006).
- Troncone, L. R., et al. Promiscuous and reversible blocker of presynaptic calcium channels in frog and crayfish neuromuscular junctions from Phoneutria nigriventer spider venom. J Neurophysiol. 90 (5), 3529-3537 (2003).
- Samigullin, D. V., Khaziev, E. F., Zhilyakov, N. V., Sudakov, I. A., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. Calcium transient registration in response to single stimulation and during train of pulses in mouse neuromuscular junction. BioNanoSci. 7 (1), 162-166 (2016).
