Neuroscience

Indlæsning af et calciumfarvestof i frøens nerveender gennem nervestumpen: Kalktransient registrering i Frog Neuromuscular Junction

Published: July 8, 2017 doi: 10.3791/55122

Dmitry V. Samigullin^1,2,3, Eduard F. Khaziev^1,2,3, Nikita V. Zhilyakov^1,2, Ellya A. Bukharaeva^1,2, Eugeny E. Nikolsky^1,2,4

¹Laboratory of Biophysics of Synaptic Processes, Kazan Scientific Centre, Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics, Russian Academy of Sciences, ²Open Laboratory of Neuropharmacology, Kazan Federal University, ³Department of Radiophotonics and Microwave Technologies, A.N. Tupolev Kazan National Research Technical University, ⁴Department of Medical and Biological Physics, Kazan State Medical University

Summary

Her beskriver vi en metode til indlæsning af et kalciumfølsomt farvestof gennem frøens nervestub i nerveenderne. Vi præsenterer også en protokol til optagelse og analyse af hurtige calciumtransienter i perifere nerveender.

Abstract

En af de mest gennemførlige metoder til måling af presynaptiske calciumniveauer i presynaptiske nerve terminaler er optisk optagelse. Den er baseret på brug af calciumfølsomme fluorescerende farvestoffer, der ændrer deres emissionsintensitet eller bølgelængde afhængigt af koncentrationen af frit calcium i cellen. Der findes flere metoder til at plette celler med calciumfarvestoffer. Mest almindelige er processerne til at indlæse farvestofferne gennem en mikropipette eller forinkubere med acetoxymethylesterformerne af farvestofferne. Disse metoder er imidlertid ikke helt gældende for neuromuskulære krydsninger (NMJ'er) på grund af metodologiske problemer, der opstår. I denne artikel præsenterer vi en metode til at indlæse et kalciumfølsomt farvestof gennem frøenes nervestub af frønerven i nerveenderne. Da indtrængen af eksternt calcium i nerve terminaler og den efterfølgende binding til calciumfarvestoffet forekommer inden for millisekundens tidsskala, er det nødvendigt at anvende et hurtigt billeddannelsessystem til registrering af disse interaktionerns. Her beskriver vi en protokol til optagelse af calciumtransienten med et hurtigt CCD kamera.

Introduction

Calciumioner (Ca ²⁺ ) deltager i mange neuronale signalprocesser, herunder initiering, vedligeholdelse og plasticitet af mediatorfrigivelse ¹ ^, ² ^, ³ ^, ⁴ ^, ⁵ . Ved ankomsten af handlingspotentialet indtræder ekstracellulær Ca2 ⁺ i nerve-terminalen og initierer frigivelse af neurotransmitter. I nogle synapser kan calciumstrømmen måles direkte ved elektrofysiologiske metoder ⁶ ^, ⁷ ^, ⁸ . I tilfælde af det neuromuskulære kryds (NMJ) kan man ikke anvende direkte patch clamp og to-elektrode spænding clamp teknikker på grund af minut størrelse af nerveenderne.

Optagelser af indadgående Ca ²⁺ strømme fra nerveenderne i NMJ kan udføres ved indirekte elektrofyserIologiske metoder ⁹ ^, ¹⁰ . Imidlertid kræver disse fremgangsmåder forbehandling af synapset med natrium- og kaliumionkanalblokkere. Optiske metoder kræver ikke den farmakologiske adskillelse af ionstrømme i nerveterminalen og tillader optagelser af Ca ²⁺ tilstrømning, udløst af aktionspotentialer og den efterfølgende forhøjelse af Ca ²⁺ ioner i axoplasma ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴ . Disse metoder er baseret på optagelser af ændringer i fluorescensen af specifikke Ca2 ⁺ -følsomme farvestoffer ved binding af frie Ca2 ⁺ -ioner ¹⁵ ^, ¹⁶ ^, ¹⁷ ^, ¹⁸ ^, ¹⁹ .

Ca ²⁺ indikatorer kan indlæses i cElls gennem en række forskellige metoder, afhængigt af formålet med eksperimentet. Forskere anvender badapplikationen af membran-permeable farvestofformer ²⁰ ^, ²¹ , indlæsning via patchpipette ²² eller mikroinjektion ²³ ^, ²⁴ ^, ²⁵ . Alle disse metoder har dog nogle begrænsninger i tilfælde af NMJ på grund af dets egenskaber i synaptisk arkitektonik. For NMJ er den mest hensigtsmæssige og vellykkede metode at indlæse farvestoffet gennem nervestubben, en fremfyldningsmetode ²⁶ ^, ²⁷ ^, ²⁸ ^og ²⁹ . Denne teknik kan anvendes til at ilægge forskellige fluorescensfarvestoffer ind i perifere nerveender. Denne metode blev med succes anvendt til Drosophila nerve terminaler ²⁸ , firben motor nerve²⁸ og frømotorens nerve terminaler ¹⁷ ^, ²⁶ ^, ²⁷ ^, ³⁰ . Afhængig af objektet under undersøgelse kan metodiske detaljer variere. En glasmikro-pipette kan anvendes til små nerver fra larver ²⁸ . Flere forskere har beskrevet en metode ²⁷ ^, ²⁸ , hvor en nyskåret ende af nerveinnovation af en muskel er nedsænket i en brønd, der er fyldt med et farvestof. Forberedelsen lades derefter i flere timer for at suge farvestoffet. Farvestoffet er gennemblødt af axonen og transporteret til nerve terminaler. I dette papir beskriver vi en metode til at indlæse en fluorescensindikator i frømotorens nerve terminaler gennem nervestubben. Vores protokol bruger en plastipipetip til inkubation af vævet med et farvestof. Vi beskriver også, hvordan man erhverver og analyserer Ca ²⁺ fluorescens transients.

Protocol

Eksperimenter blev udført på isolerede nerve-muskelpræparater af musculus kutan pectoris fra Rana ridibunda frøen. Størrelsen af begge køns dyr var ca. 5-9 cm. De eksperimentelle procedurer blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne for brug af laboratoriedyr fra Kazan Federal University og Kazan Medical University i overensstemmelse med NIH Guide for pleje og brug af laboratoriedyr. Den eksperimentelle protokol opfyldte kravene i Europarådets direktiv 86/609 / EØF og blev godkendt af det etiske udvalg i Kazan Medical University.

1. Forberedelse af løsningerne

Fremstilling af Ringers opløsning.
1. Forbered Ringer's opløsning: 113,0 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 3,0 mM NaHC03 og 1,8 mM CaCl2. Juster pH til 7,2-7,4.
2. Forbered Ringers opløsning med lav Ca ²⁺ + indhold: 113,0 mM NaCI, 2,5 mM KCI, 3,0 mM NaHC03, 6,0 mM MgCl2, 0,9 mM CaCl2. Juster pH til 7,2-7,4.
Fremstilling af farvestof-ladningsopløsningen.
1. Forbered den vandbaserede opløsning indeholdende HEPES-Na ved 10 mM (pH 7,2-7,4).
2. Tilsæt 14 μL HEPES-opløsningen til et hætteglas med farvestoffet ³⁰ .
  BEMÆRK: Ca ²⁺ indikatorfarvestoffet kommer i et 500 μl hætteglas med 500 μg pulver.
3. Vortex og spin ned for at blande grundigt.
4. Fortynd opløsningen for at bringe den endelige koncentration af Ca2 ⁺ -indikatoren ned til 30 mM. Undgå udsættelse for lys og opbevar ved -20 ° C.

2. Farvebelastningsprocedure

Dissect den kutane pectoris muskel med et stykke af pectoralis proprius nerve.
BEMÆRK: Dissektionsproceduren er tilgængeligI en gratis download af papiret af Blioch et al. , 1968 ³¹ .
1. Ved dissektionsproceduren anvendes to fine tang og hornhinde saks (se Materialetabellen ). Overfør det dissekerede væv til en siliciumelastomerbelagt petriskål, der er fyldt med Ringer's opløsning, og fastgør vævet med fint rustfrit stålstifter, så det er let strækket i fadet.
2. Genfyld Petri-skålen med en ny alikvot af Ringers løsning. Fjern bindevæv. Skader ikke nerverne.
Klargør påfyldningspipetten: Brug et knivblad, skåret et ~ 2 mm langt stykke af den koniske del af en standard plast 10 μL pipettespids.
Forbered et stykke modelleringslære for at montere fyldpipetten på Petri-skålen.
Tilslut bagsiden af påfyldningspipetten til en plastiksprøjte via siliconeslange og plastikforbindelsesadaptere fremstillet af pipettespidser.
Før dI indlæsningsproceduren fjernes Ringers opløsning fra Petriskålen ved hjælp af en plastpipette. Tør muskel-nervepræparatet med en fin sprøjte; Dette vil forhindre fortynding af Ca2 ⁺ farvestoffet efter den efterfølgende påfyldning af påfyldningspipetten.
Fjern hætteglasset Ca ²⁺ indikator fra fryseren og lad det optøne ved stuetemperatur på et mørkt sted.
Under stereomikroskop kontrol med lav forstørrelse (10 ×), opdage forbindelsen mellem muskel og nerve. Med fine pincet og sakse skærer du pectoralis propriusnerven tæt på muskeloverfladen (se trin 2.1). Lad en nervestubbe være omkring 2 mm lang.
Fastgør påfyldningspipetten fastgjort til rør og sprøjten på petriskålen ved hjælp af modellerings ler.
Flyt pipettens spids tæt på nervestubben.
Uden at klemme det, aspirere forsigtigt nervestubben i spidsen af påfyldningspipetten.
Fjern sugeslangen fra blunkenT ende af påfyldningspipetten.
Fjern forsigtigt overflødig opløsning fra fyldpipetten ved hjælp af en sprøjte med en lang nål (se Materialebordet ). Kniv ikke nervestubben.
Løft spidsen af fyldpipetten lidt lodret op, og hold nervestumpen aspireret i spidsen.
Isolér den aspirerede del af nervestubben udvendigt af påfyldningspipetipset ved hjælp af petroleumsgelé.
Tør op i nervestubben, som er isoleret i påfyldningspipetten, hvis det er nødvendigt: Sug forsigtigt overskydende opløsning fra påfyldningspipetten ved hjælp af en sprøjte med en lang nål.
Tegn 0,5 μL af farvestof-ladningsopløsningen (se trin 1) ved anvendelse af en pipette med en lang pipettespids.
Sæt forsigtigt pipettespidsen med påfyldningsopløsning i påfyldningspipetten. Udstød blandingen direkte på nervestubben.
Tæt den åbne ende af påfyldningspipetten med oliegelé.
Tilføj en lille alikvot af Ringers sOlution til petriskålen for at holde præparatet vådt.
Inkuber præparatet ved stuetemperatur under mørke og våde betingelser i 5 timer.
Fjern påfyldningspipetten med påfyldningsopløsning, skyll præparatet med Ringers opløsning og hold det natten over i køleskabet ved 8 ° C.

3. Forberedelse af væv til mikroskopi

Monter præparatet i det kiselelastomerbelagte kammer og fiks det med stålmikronåle, så det er lidt strakt.
Skyl vævet med en alikvot af frisk ringers opløsning.
Brug en sugelektrode til at stimulere nerven; Konstruktion af elektroden er tilgængelig fra den gratis download af papiret af Kazakov et al. , 2015 ³² . Placer elektrodespidsen tæt på den snitede ende af nerveen og aspirer nervestubben ind i elektrodeåbningen.
Monter forberedelseskammeret på mikroskopfasen. PlacE temperaturføleren og indløbs- og udløbsrøret i kammeret.
Tilslut netledningen til Peltier-elementet.
For at overføje præparatet skal du bruge et simpelt tyngdekraftsdrevet system. For at fjerne overskydende opløsning tændes perfusionssugepumpen.
Tænd for termokontrolenheden.
Indstil temperaturreguleringen til 20 ° C.
Monter det ultraviolette beskyttelsesskærm.
Tilslut den stimulerende ledningselektrode til den elektriske stimulator og observere de muskulære sammentrækninger under mikroskopet med en 4x objektivlins.
Fyld perfusionssystemet med Ringers opløsning med indhold af lavt Ca ²⁺ og højt Mg ²⁺ .
BEMÆRK: Denne løsning bruges til at forhindre muskulære sammentrækninger. Et fald i koncentrationen af eksternt calcium og en forhøjelse af eksternt magnesium resulterer i reduktionen af amplituden af Ca2 ⁺ transienter. På baggrund af tidligere erfaringer er 0,9 mM CaCl2 + -transienter. Det er værd at nævne, at der findes nogle andre måder at mindske muskulære sammentrækninger på uden at reducere Ca ²⁺ -koncentrationen. For eksempel vil brugen af d-tubocurarin eller alfa-bungarotoxin, specifikke blokkere af nikotinacetylcholinreceptorer helt eller delvis blokere muskelstrækninger ¹⁷ ^, ²⁷ ^, ²⁸ ^, ^30. Men tilsætningen af disse toksiner kan også påvirke presynaptisk calciumindgang ³³ . For at undgå dette kan μ-conotoxin GIIIA anvendes ²⁷ .
Tænd pumpen og start superfusion af præparatet med Ringers opløsning med lav Ca ²⁺ og høj Mg ²⁺ .
Skift til objektivet på 40 × objektiv på mikroskop.
Tænd t Han monokromator (se Materialebordet ).
Vælg en emissionsbølgelængde på 488 nm og en kontinuerlig lysindikation i monokromatorstyringssoftwaren.
Under høj forstørrelse i fluorescens-tilstand skal du sikre dig, at nerve terminalerne er fyldt med farvestoffet.

figur 1
Figur 1 : Nerve og terminaler med indlæst Ca ²⁺ indikator. ( A ) Nerve fyldt med Ca ²⁺ indikator efter indlæsningsproceduren. Skalestang = 200 μm. ( B ) Nerveendinger fyldt med Ca ²⁺ indikator. Skalbjælke = 20 μm. ( C ) Ca ²⁺ -indikatorfluorescens er tydeligt synlig i nerveenden. Skalbjælke = 20 μm._blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

Lad præparatet ligestille i mindst 30 minutter i low-Ca ²⁺ og high-Mg ²⁺ opløsningen.

4. Videooptagelse med det digitale CCD-kamera

Bemærk: Oplysningerne om indfangning af fluorescenssignaler er specifikke for hvert mikroskop og kameratype, men den vigtigste overvejelse er billedoptagelseshastigheden.

Brug 1 kHz som mindste optagelsesfrekvens til optagelse af enkelt Ca ²⁺ transienter i NMJ.
BEMÆRK: Hurtige digitale CCD-kameraer er nødvendige for fluorescensafbildning (se Materialebordet ). Dataopsamlingssystemet og softwaren (se Materialetabellen ) blev brugt her til synkronisering af kameraet, monochromatoren og stimulatoren. Kort sagt tillader denne protokol genereringen af synkroniseringsimpulser på digitale udgange af dataeneOpkøbssystem for at åbne lukkeren, optage videosignalet og indlede stimulation. Alle tidsmæssige parametre kan indstilles i protokollerne og / eller på apparaterne. En typisk protokol er en serie på 500 rammer erhvervet ved 1 kHz (80 x 80 pixel). Belysning med excitationslys kan blegge Ca ²⁺ -indikatoren og fotodamere cellevævet. Undgå således lange eksponeringer til excitationslys. I denne protokol er lukkeren åben kun for den tid, der er nødvendig for at fange videoen. Erhverve tyve serier pr. Specifik nerve terminal. Målet her er at overvåge de samme steder i kontrolgruppen og efter lægemiddellevering.
Under 4X objektivlinsen i et mikroskop skal du bruge lysfeltregimet til at visualisere muskel- og nervegrenene.
Skift til 40X objektivlinsen, og søg efter farvestofbelastede nerveender ved hjælp af epifluorescensregimet og en excitationsbølgelængde på 488 nm. Identificere en nerveendende region af interesse.
På trinokulært rør oF mikroskopet, vælg lysbaneudvekslingsniveauer: 100% lys til kamera.
Start overtagelsessoftwaren til CCD-kameraet.
Under "Live" -modus finder du ROI og justerer fokus.
Vælg menuen "Change" indstillinger.
Brug "Grundlæggende konfiguration" til 1.000 billeder pr. Sekund (fps) med en opløsning på 80 x 80.
Indstil antallet af indgangsrammer til 500.
Indtast navnet på eksperimentet.
Vælg "Ekstern Trigger".
Indstil pre-trigger-tiden til 10 ms.
Indstil antallet af gentagelser til 20.
I monochromator-styringssoftwaren skal du vælge en emissionsbølgelængde på 488 nm og "ekstern triggerbelysning" -tilstand.
Kør dataindsamlingssoftwaren.
Indlæs stimuleringsprotokollen.
Inden du optager videoen, skal du tage den mørke ramme op ved hjælp af videooptagelsessoftwaren.
Kør stimuleringsprotokollen.
Vælg afkastet og checK det optagne signal.

5. Data analyse

NoOTE: Til data analyse, brug CCD kamera software og ImageJ; Dataene er repræsenteret som en kurve i et regnearksprogram. I CCD-kamerasoftwaren gentages gennemsnittet 20 og eksporterer resultaterne til en ImageJ-supportfil. I ImageJ skal du vælge afkastet og baggrunden. Træk baggrunden fra ROI. Fremstil dataene som et forhold: (ΔF / F 0-1) x 100%, hvor ΔF er intensiteten af fluorescens under stimulering og F0 er intensiteten af fluorescens i hvile.

I købsprogrammet til CCD-kameraet skal du klikke på Filer> Gennemsnitlige filer. Vælg filerne og gennemsnittet dem.
Gem den gennemsnitlige fil som en .fit-fil ved at klikke på "Gem som pas fil."
Kør ImageJ-softwaren. Udfør følgende trin:
Klik på Billede> juster> lysstyrke / kontrast.
Klik på Billede> Stabler> Værktøjer>; Stack sorterer.
Klik på Analyse> værktøjer> ROI-manager.
Træk og slip den gennemsnitlige .fit-fil i ImageJ-vinduet.
Zoom ind på vinduet for at få et bedre billede.
Ved at flytte markøren skal du vælge den sidste ramme og slette den (dette er den mørke ramme)
Vælg et rektangulært ROI over det område, der anses for at være baggrunden. Tilføj det til ROI manager
Mål baggrunden ved at klikke på Mere> Multi Measure. Bemærk MEAN. Kopier dataene, eksporter den til et regnearksprogram og beregn gennemsnitsværdien af tærsklen for et forhold.
Træk tærsklen fra stablerne ved at klikke på Process> Main> Subtract. Indtast den gennemsnitlige værdi af tærsklen.
Vælg et rektangulært ROI omkring en nerve terminal. Tilføj det til ROI manager.
Foranstaltning ved at klikke på Mere> Multi Measure. Bemærk MEAN. Kopier og eksporter det til et regnearksprogram.
Gennemsnitlig forskydningen af signalerne.
BEMÆRK: BrugFørste flere dusin punkter viser basfarvestof fluorescens uden stimulering; Dette er fluorescens i ro.
Del signalerne ved fluorescens i hvile.
Træk "1" og multiplicer med 100%.
Plot signalet og beregne amplituden af Ca ²⁺ forbigående.

Representative Results

Efter farvestofbelastningen og ved motorisk nervestimulering kan en stigning i amplitude af det fluorescerende signal (Ca ²⁺ forbigående) detekteres i nerve terminalerne (se figur 2 ). Parametre for Ca ²⁺ transienter er vist i tabel 1 . Kvantitativt er parametrene for Ca ²⁺ -transienterne målt i vores undersøgelse tæt på dataene opnået af andre forskere ved synapser af koldblodede dyr ¹⁵ ^, ³⁴ . Parametrene for Ca2 ⁺ -transienterne afhænger af bindingshastigheden af Ca2 ⁺ med farvestoffet og den efterfølgende dissociation. Indgangshastigheden for Ca2 ⁺ i nerveenden, interaktion med farvestoffet og diffusion i cytoplasma påvirker alle stigningstiden for Ca2 ⁺ -transienten. Forfaldstidspunktet for det fluorescerende signal afhænger af farvestoffets affinitet,Hastigheden af Ca2 ⁺ interaktionen med intracellulære buffere og fjernelsen af ionpumper ³⁵ . Amplitudanalysen af Ca ²⁺ transienter kan anvendes til at studere indflydelsen af forskellige stoffer på calciumindgangen, der deltager i neurotransmitterfrigivelse ³³ .

Figur 2
Figur 2 : Den gennemsnitlige Ca ²⁺ Forbigående målt i frøen NMJ. Ca ²⁺ forbigående blev beregnet baseret på gennemsnittet af signaler fra 13 frø NMJ'er. Klik her for at se en større version af denne figur.

SpidsΔF / F (%)	Stigningstid 20% -80% (ms)	Τ (ms)
12,6 ± 1,1 (n = 13)	4,6 ± 0,5 (n = 13)	115,3 ± 8,3 (n = 13)

Tabel 1: De gennemsnitlige parametre for Ca ²⁺ forbigående. Dataene præsenteres som middelværdien ± SE; N er antallet af målinger i forskellige NMJ'er. Spidsen ΔF / F er den gennemsnitlige amplitude af ΔF / F.

Discussion

I dette papir fremlagde vi metoden til at udføre Ca ²⁺ -følsom farvestofbelastning i frø-nerveender gennem nervestubben. Ved afslutning af indlæsningsproceduren har alle terminaler i den proximale del af nerve betydelige niveauer af fluorescens. Det er blevet estimeret, at sondens intra-terminale koncentration varierer mellem 40 og 150 μM ¹⁷ .

Inkubationsproceduren udføres i to trin: ved stuetemperatur og derefter ved en lavere temperatur i køleskab. Det er vigtigt at kontrollere tiden for vævsinkubation med farvestoffet ved stuetemperatur. Afhængigt af den faktiske længde af nervestubben, det specifikke farvestof og temperaturen kan inkubationstiden variere. Hvis overeksponeret, kan terminaler i de proximale dele tæt på nervestubben overbelastes. I midten af nerven er det dog stadig muligt at finde terminaler, der er tilfredsstillende indlæst. Under thEn lang inkubation i køleskabet, farvestoffet er jævnt fordelt over nerveenderne.

Vores egne observationer ³³ ^, ³⁵ samt data fra andre forskere ³⁰ beviser manglen på nogen mærkbar indflydelse af indlæsningsproceduren på amplituden af det postsynaptiske respons eller på hyppigheden af miniature-endpladspotentialer. God levetid blev dokumenteret i de indlæste præparater. Der er nogle vigtige punkter, vi gerne vil henlede opmærksomheden på. Det er meget vigtigt at placere nervestubben i farvestofbelastningsopløsningen indenfor minutter efter udskæring for at gøre det muligt for farvestoffet at komme ind i axens afsnitsnerven. Forsinkelser kan forårsage ineffektive indlæsninger, formodentlig som følge af tilbagekoblingen af nerveaksoner ²⁷ ^, ³⁶ . Nogle efterforskere nedsænker nervestubben i 100 mM EDTA (en Ca ²⁺ - og Mg ²⁺ -chelator) Umiddelbart efter udskæring af nerveen for at forhindre udskårne axoner i at blive genindvundet. Bufferen fjernes efter 1-2 minutter og erstattes med en farvestof-opladningsløsning ³⁷ . Brugen af en petroleumsgelbrønd i stedet for plastrør til indlæsningsproceduren tillader brugen af en kortere nervestub. Under anvendelse af denne fremgangsmåde skæres nerveren, efter at den er nedsænket i HEPES-opløsningen med farvestof, og axonerne forceller ikke på grund af manglen på divalente ioner i farvestofopløsningen ²⁷ ^, ²⁸ .

I vores undersøgelse anvendte vi den vandopløselige saltform af Ca ²⁺ -indikatoren i stedet for dextran. Dextrankonjugaterne diffunderer i aksonen langsommere end saltformerne. Anvendelsen af dextran-konjugatet reducerer imidlertid farveskomponentalisering og håndtering af nerve og NMJ'er. Calcium Green 1-3.000 MW dextran-konjugat har en god diffusionshastighed og demonstrerer reduceret compartmentalisering Up class = "xref"> 38.

Det er meget vigtigt at undgå en lang periode med fluorescerende belysning af vævet, fordi det påvirker dets helbred og overlevelse. Vi bruger Nomarski optik i den synlige lys kanal til at søge efter nerve terminaler. Under optagelsen begrænser vi det belyste felt ved hjælp af en membran.

Det er bemærkelsesværdigt, at denne indlæsningsmetode kun er egnet til præparater, der kan modstå lange inkubationer. For at reducere farvestofbelastningstiden, når der udføres undersøgelser på mere skrøbelige væv ( f.eks. Synapser af varmblodede dyr), er det nødvendigt at nedskalere nervestublængden og bruge mikropipetter til indlæsning ²⁹ ^, ³⁹ .

Denne belastningsteknik er velegnet til billeddannelsesændringer i cytosolisk Ca ²⁺ med fluorescerende indikatorer under både enkeltnervenstimulering og rytmisk synaptisk aktivitetEf "> 17 ^, ²⁷ ^, ^35. Analysen af Ca ²⁺ -transient amplitude kan bruges til at studere indflydelsen af forskellige stoffer på calciumindgangen, der deltager i neurotransmitterfrigivelse ³³ .

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev udført under den russiske regerings program for konkurrencedygtig vækst i Kazan Federal University og et tilskud fra det russiske fundament for grundforskning (16-04-01051; 16-34-00817; 15-04-02983). Vi takker fire anonyme korrekturlæsere for at give nyttige kommentarer til tidligere udkast til manuskriptet. Vi udtrykker vores taknemmelighed til Yuliya Aratskaya til stemmeoptagelsen. Vi er taknemmelige for Dr. Victor Ilyin for de mange nyttige kommentarer og hjælpen med manuskriptets finale redigering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ca2+ indicator	Molecular Probes, USA	Oregon Green 488 BAPTA-1 hexapotassium salt, O6806	500 μg
Silicone Elastomer	Dow Corning, USA	Sylgard 184 elastomer
Pipette	Biohit, Russia	720210	0.5-10µL
Pipette tip	Fisher Scientific, USA	02-707-175	10µL
Pipette tip	Biohit, Russia	781349	10µL
Razor Blade	Fisher Scientific, USA	12-640
Minutien Pins	Fine scince tools, Canada	26002-20
Corneal Mini-Scissors	MT MEDI CORP, Canada	S-1111
Jeweler Forceps	MT MEDI CORP, Canada	F-9610
Jeweler Forceps	MT MEDI CORP, Canada	F-9611
Modelling clay	local producer		can be replaced by any local producer
Petroleum jelly	local producer		can be replaced by any local producer
Microspin FV 2400	Biosan, Latva	BS-010201-AAA
Multi-spin MSC 3000	Biosan, Latva	BS-010205-AAN
Single-use hypodermic needles	Bbraun	100 Sterican	0.4×40mm
Syrynge	local producer		0.5 ml
HEPES	Sigma-Aldrich, USA	H0887	100ml
Microscope, BX51	Olympus, Japan
Data acquisition system	Molecular Devices, USA	Digitdata 1550
software	Molecular Devices, USA	pClamp software, Version 10	protocol can be download from : http://kpfu.ru/portal/docs/F_230007060/Video.capture.with. RedShirt.Neuro.CCD.camera.pro
Bath and bath temperature controler	Experimental Builder		can be replaced by any chamber with temperature control. For example from https://www.warneronline.com/
Monochromator	Till Photonics, Germany	Polychrome V	no longer available, can be replaced by other sutable stable light source 488 nm
monochromator control software	Till Photonics, Germany	Polycon
Digital CCD camera	Redshirt imaging, USA	Neuro CCD SMQ
Model 2100 Isolated Pulse Stimulator	A-M Systems, USA
Acquisition software for CCD camera	Redshirt imaging, USA	Turbo SM software
ImageJ	National Institutes of Health, USA		http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Spreadsheet program	Microsoft, USA	Microsoft Office Excel

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Llinás, R., Sugimori, M., Silver, R. B. Microdomains of high calcium concentration in a presynaptic terminal. Science. 256, 677-679 (1992).
Augustine, G. J. How does calcium trigger neurotransmitter release? Curr Opin Neurobiol. 11, 320-326 (2001).
Burnashev, N., Rozov, A. Presynaptic Ca2+ dynamics, Ca2+ buffers and synaptic efficacy. Cell Calcium. 37, 489-495 (2005).
Schneggenburger, R., Neher, E. Presynaptic calcium and control of vesicle fusion. Curr Opin Neurobiol. 15, 266-274 (2005).
Pang, Z. P., Südhof, T. C. Cell biology of Ca2+-triggered exocytosis. Curr Opin Cell Biol. 22, 496-505 (2010).
Borst, J. G., Sakmann, B. Calcium influx and transmitter release in a fast CNS synapse. Nature. 383, 431-434 (1996).
Borst, J. G., Sakmann, B. Calcium current during a single action potential in a large presynaptic terminal of the rat brainstem. J Physiol. 506, 143-157 (1998).
Yazejian, B., DiGregorio, D. A., Vergara, J. L., Poage, R. E., Meriney, S. D., Grinnell, A. D. Direct measurements of presynaptic calcium and calcium-activated potassium currents regulating neurotransmitter release at cultured Xenopus nerve-muscle synapses. J Neurosci. 17, 2990-3001 (1997).
Molgó, J., Mallart, A. Effects of Anemonia sulcatatoxin II on presynaptic currents and evoked transmitter release at neuromuscular junctions of the mouse. Pflugers Arch. 405 (4), 349-353 (1985).
Slutsky, I., Rashkovan, G., Parnas, H., Parnas, I. Ca2+-independent feedback inhibition of acetylcholine release in frog neuromuscular junction. J Neurosci. 22 (9), 3426-3433 (2002).
Haugland, R. P. Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions. Handbook of fluorescent probes and research products. Gregory, J. , MolecularProbes. Eugene,Oregon. 771-826 (2002).
Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
Tsien, R. Y. Fluorescent indicators of ion concentrations. Methods Cell Biol. 30, 127-156 (1989).
Adams, S. R. How calcium indicators work. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (3), (2010).
DiGregorio, D. A., Vergara, J. L. Localized detection of action potential-induced presynaptic calcium transients at a Xenopus neuromuscular junction. J Physiol. 505, 585-592 (1997).
Sabatini, B. L., Regehr, W. G. Optical measurement of presynaptic calcium currents. Biophys J. 74, 1549-1563 (1998).
Suzuki, S. Ca2+ dynamics at the frog motor nerve terminal. Pflug Arch Eur J Phisiol. 440, 351-365 (2000).
Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. The life cycle of Ca2+ ions in dendritic spines. Neuron. 33, 439-452 (2002).
Luo, F., Dittrich, M., Stiles, J. R., Meriney, S. D. Single-pixel optical fluctuation analysis of calcium channel function in active zones of motor nerve terminals. J Neurosci. 31, 11268-11281 (2011).
Regehr, W. G. Monitoring presynaptic calcium dynamics with membrane-permeant indicators. Imaging in neuroscience and development: a laboratory manual. Yuste, R., Konnerth, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 307-314 (2005).
Macleod, G. T. Topical Application of Indicators for Calcium Imaging at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 786-790 (2012).
Eilers, J., Konnerth, A. Dye loading with Patch Pipettes. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (4), 277-281 (2009).
Coleman, W. L., Bill, C. A., Simsek-Duran, F., Lonart, G., Samigullin, D., Bykhovskaia, M. Synapsin II and calcium regulate vesicle docking and the cross-talk between vesicle pools at the mouse motor terminals. J Physiol. 586 (19), 4649-4673 (2008).
Macleod, G. T. Direct Injection of Indicators for Calcium Imaging at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 797-801 (2012).
Talbot, J. D., David, G., Barrett, E. F., Barrett, J. N. Calcium dependence of damage to mouse motor nerve terminals following oxygen/glucose deprivation. Exp Neurol. 234 (1), 95-104 (2012).
Peng, Y. Y., Zucker, R. S. Release of LHRH is linearly related to the time integral of presynaptic Ca2+ elevation above a threshold level in bullfrog sympathetic ganglia. Neuron. 10, 465-473 (1993).
Tsang, C. W., Elrick, D. B., Charlton, M. P. alpha-Latrotoxin releases calcium in frog motor nerve terminals. J Neurosci. 20 (23), 8685-8692 (2000).
Newman, Z., Malik, P., Wu, T. Y., Ochoa, C., Watsa, N., Lindgren, C. Endocannabinoids mediate muscarine-induced synaptic depression at the vertebrate neuromuscular junction. Eur J Neurosci. 25 (6), 1619-1630 (2007).
Macleod, G. T. Forward-filling of dextran-conjugated indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 3440-3450 (2012).
Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
Blioch, Z. L., Glagoleva, I. M., Liberman, E. A., Nenashev, V. A. A study of the mechanism of quantal transmitter release at a chemical synapse. J Physiol. (1), 11-35 (1968).
Kazakov, A., Aleksandrov, M., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Samigullin, D. V. A simple suction electrode for electrical stimulation of biological objects. Mezhdunarodnyj nauchno-issledovatel'skij zhurnal. 40 (9), In Russian 13-16 (2015).
Khaziev, E. Acetylcholine-induced inhibition of presynaptic calcium signals and transmitter release in the frog neuromuscular junction. Front Physiol. 7 (621), 1-10 (2016).
Bélair, E. L., Vallée, J., Robitaille, R. Long-term in vivo modulation of synaptic efficacy at the neuromuscular junction of Rana pipiens frogs. J Physiol. 569 (1), 163-178 (2005).
Samigullin, D., Fatikhov, N., Khaziev, E., Skorinkin, A., Nikolsky, E., Bukharaeva, E. Estimation of presynaptic calcium currents and endogenous calcium buffers at the frog neuromuscular junction with two different calcium fluorescent dyes. Front Synaptic Neurosci. 6 (29), 1-10 (2015).
Angleson, J. K., Betz, W. J. Intraterminal Ca2+ and spontaneous transmitter release at the frog neuromuscular junction. J Neurophysiol. 85 (1), 287-294 (2001).
Shahrezaei, V., Cao, A., Delaney, K. R. Ca2+ from one or two channels controls fusion of a single vesicle at the frog neuromuscular junction. J Neurosci. 26 (51), 13240-132499 (2006).
Troncone, L. R., et al. Promiscuous and reversible blocker of presynaptic calcium channels in frog and crayfish neuromuscular junctions from Phoneutria nigriventer spider venom. J Neurophysiol. 90 (5), 3529-3537 (2003).
Samigullin, D. V., Khaziev, E. F., Zhilyakov, N. V., Sudakov, I. A., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. Calcium transient registration in response to single stimulation and during train of pulses in mouse neuromuscular junction. BioNanoSci. 7 (1), 162-166 (2016).

Neuroscience

Indlæsning af et calciumfarvestof i frøens nerveender gennem nervestumpen: Kalktransient registrering i Frog Neuromuscular Junction

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.