Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

طريقة لتصور وتحليل غشاء متبادلة البروتينات التي نقل المجهر

Published: March 5, 2017 doi: 10.3791/55148
Automatic Translation
1, 2, 1,2, 1,2
1Department of Biosciences and Nutrition, Karolinska Institutet, 2School of Technology and Health, KTH Royal Institute of Technology

Introduction

في البحوث الطبية، وتركز الكثير من الاهتمام على بروتينات الغشاء، داخلية كانت أم خارجية، والمشاركة في مجموعة متنوعة من التفاعلات الدهون. العمل مع البروتينات التفاعل الدهون يتضمن إما اختيار بديلا عن الدهون، مثل المنظفات، amphipols 1، أو بروتينات صغيرة 2، أو إيجاد بديل غشاء التي تحافظ على بروتين قابل للذوبان ونشطة. وتشمل بدائل غشاء ليبويك الجسيمات الشحمية وnanodiscs (ND) 3، 4.

Nanodiscs هي منصات غشاء شبه الأم التي وضعتها الهندسة الجزء البروتين، وبرنامج عمل ألماتي-1، من البروتين الدهني عالي الكثافة (HDL) التي تحدث بشكل طبيعي في الدم. برنامج عمل ألماتي-1 هو سلسلة 243 بقايا طويلة من قصيرة متقابلة الزمر α-اللوالب، ولها التشكل للذوبان خالية من الدهون. في المختبر في وجود الدهون، نسختين من البروتين برنامج عمل ألماتي-1 إعادة ترتيب تلقائيا إلى تطويق HYDRophobic جزء سلسلة أسيل من الدهن طبقة ثنائية التصحيح 5. النسخ المهندسة لبرنامج عمل ألماتي-1 وتسمى عادة بروتينات الغشاء السقالات (MSP)، وعدد متزايد متاح تجاريا باسم البلازميدات أو تنقية البروتينات. التكرار أو الحذف من α-اللوالب في برنامج عمل ألماتي-1 نتيجة في أطول 6 أو أقصر البروتينات السقالات 7 الغشاء. وهذا بدوره يجعل من الممكن لتشكيل أقراص حوالي 6 نانومتر إلى 17 نانومتر 7 8 في قطر. وهناك أنواع مختلفة من التطبيقات لnanodiscs 3 و 9. التطبيق الأكثر شيوعا هو لتوفير بيئة غشاء شبه أصلي لتحقيق الاستقرار في بروتين الغشاء لا يتجزأ 8، سبق استعراضها 3 و 9. واستخدام أقل استكشافها هو لتوفير سطح غشاء النانو لدراسة البروتينات 10، 11، 12، 13، 14، 15، 16، 17 غشاء الطرفية. المادة 1 من البروتوكول يتصور تحت الإجراء لصنع nanodiscs تتألف من الدهون الفوسفاتية والبروتين غشاء السقالات.

تحضير عينات هو عنق الزجاجة في معظم الطرق. عينات طريقة محددة قد تضيف معلومات معينة، ولكنها أيضا إجراء مقارنات النتائج صعوبة. وبالتالي، فمن أبسط عندما العينات المتعدد الوسائط، ويمكن استخدامها مباشرة في العديد من الطرق المختلفة. ميزة واحدة مع استخدام nanodiscs هي صغر حجم nanodisc بالمقارنة مع الجسيمات الشحمية (على سبيل المثال، وعينات يمكن استخدامها مباشرة لكل من تيم وعدم تغيير طبيعة الكهربائي للهلام، كما هو الحال في هذا البروتوكول).

الصورة = "jove_content"> وقد استخدمت الحويصلات والجسيمات الشحمية وقتا طويلا لفهم وظيفة من البروتينات التفاعل الغشاء. للدراسات الهيكلية والتصور، ومثال على تقرير الهيكلي للبروتين الغشاء في الجسيمات الشحمية متاح 18. ومع ذلك، فقد تم نشر أية عالية الدقة هيكل 3D من بروتين الغشاء monotopic جزءا لا يتجزأ من على غشاء الحويصلية بعد، بقدر ما نعرف. جزيئات الذهب أو الأجسام المضادة يمكن استخدامها لتصور البروتينات ملزمة لالليبوزومات أو حويصلات باستخدام تيم 19. على الرغم من أن هذه التحقيقات هي محددة للغاية، لأنها قد تتداخل مع البروتينات ملزم الغشاء الحجاب الموقع غشاء ملزم أو عن طريق اخفاء المجالات ذات الاهتمام مع أجزاء مرنة. الذهب المسمى أو ربما يمكن أن تحلل البروتينات المعقد الأجسام المضادة على هلام، ولكن هذا من شأنه أن يزيد من تكلفة التجربة.

على الرغم من الجسيمات الشحمية هي منصة ممتازة، لا يمكن للمرء أن يكون على يقين من أن البوبulation لديها نسبة معينة من البروتين لكل الحويصلية، وهي الميزة التي يمكن استكشافها عن طريق استخدام nanodiscs 20. في الحويصلية، العوامل المساعدة وركائز يمكن محاصرين في الداخل القابلة للذوبان. والمواد التي هي غشاء للذوبان في مشاركة نفس مصير لكلا النوعين من محاكيات الغشاء. على الرغم من ذلك، حيث أن منطقة طبقة ثنائية أصغر في nanodiscs، مطلوب كمية أقل من مادة لتشبع الأغشية nanodisc.

وكانت وظيفة البروتين فهم من خلال تحديد التركيب الذري أساسيا للعديد من مجالات البحث. وتشمل وسائل لتحديد بنية البروتين الأشعة السينية 21؛ الرنين المغناطيسي النووي (NMR) 22، 23؛ وانتقال المجهر الإلكتروني (تيم) 24 في درجات الحرارة المبردة، cryoEM. القرار الذي cryoEM تمت في الآونة الأخيرة قد تحسنت إلى حد كبير، ويرجع ذلك أساسا إلى استخدام المباشر الإلكترون ديtectors 25 و 26. يتم تصوير الجزيئات في رقيقة، زجاجي الجليد 27 في حالة شبه الأصلي. ولكن نظرا لتباين منخفض الجزيئات البيولوجية، فإنها تصبح من الصعب كشف في حجم مجموعة من 100-200 كيلو دالتون. للحصول على عينات بحجم مناسب، وجمع البيانات يمكن أن تكون وسيلة لإعادة الإعمار جسيم واحد يمكن تطبيقها للحصول على هيكل 28.

ومع ذلك، فإن تحديد بنية البروتين عن طريق تيم هو عملية متعددة الخطوات. وعادة ما يبدأ تقييم عينة monodispersity بواسطة وصمة عار السلبية تيم 29 باستخدام أملاح المعادن الثقيلة مثل phosphotungsten (PT) 30 أو اليورانيوم 31. إعادة بناء نموذج منخفضة الدقة من جزيء ملطخة سلبا يتم عادة ويمكن أن تسفر عن معلومات هامة عن التركيب الجزيئي 29. بالتوازي،جمع البيانات باستخدام cryoEM قد تبدأ. ينبغي توخي الحذر عند تقييم البيانات تيم وصمة عار السلبية لتجنب سوء الفهم من تشكيل الحرفية. واحد الحرفية خاص هو تأثير وصمة عار PT على الدهون الفوسفاتية والجسيمات الشحمية 32، مما أدى إلى تشكيل قضبان طويلة تشبه رزمة من النقود ينظر اليها من الجانب 33. وقد لوحظت هذه "رولو" أو "أكوام" (الرمز الآخرة بأنها "أكوام") في وقت مبكر لHDL 34، وبعد ذلك أيضا لnanodiscs 35.

قد يحدث التراص وإعادة تشكيل الأغشية لأسباب عديدة. على سبيل المثال، يمكن أن تحدثها العوامل المشتركة مثل النحاس ويتضح من التصوير تيم في الأمونيوم كربونات صمة عار 36. وجزء من نسبة الدهون في غشاء في الجسيمات الشحمية احتوى على مجموعة حمض رئيس iminodiacetic محاكاة complexation المعدنية بنسبة EDTA، وبالتالي التراص الجسيمات الشحمية بعد إضافة أيونات النحاس 37. وقد لوحظ تشكيل كومة من الدهون الفوسفاتية من قبل حزب العمال في وقت مبكر. ومع ذلك، فقد تركز العمل في وقت لاحق على إزالة أو إلغاء هذا التشكيل قطعة أثرية 38.

هنا، نقترح طريقة للاستفادة من nanodisc يسببها نابت التراص لدراسة البروتينات ملزم الغشاء بواسطة تيم. وباختصار، فإن بروتين ملزمة على nanodiscs منع nanodiscs من التراص. على الرغم من أن أسباب التراص ليست واضحة، اقترح 39 أن هناك تفاعل الكهربائي بين الدهون الفوسفاتية ومجموعة فسفوريل من حزب العمال، مما تسبب في أقراص التمسك بعضها البعض (الشكل 1A). فرضية وراء بروتوكول لدينا هي أنه عندما يتحد بروتين لnanodisc، معظم سطح فوسفورية ليس عن توافر بليه للتفاعل مع حزب العمال بسبب عائق الفراغية من البروتين. وهذا من شأنه منع تشكيل كومة (الشكل 1B). نتيجتين يمكن استخلاصها. أولا، منع التراص يعني أن البروتين من الفائدة وبد أن الغشاء. ثانيا، مجمع البروتين ND يمكن علاجها مع أساليب المعالجة جسيم واحد القياسية 24 و 40 للحصول على التشكل الخام من المجمع. وعلاوة على ذلك، يحلل بأساليب مثل عدم تغيير طبيعة هلام الكهربائي أو ديناميكية تشتت الضوء لا يمكن أن يؤديها.

لإثبات هذه الفرضية، استخدمنا ملزم غشاء البروتين 5 أكسيجيناز شحمية (5LO)، التي تشارك في العديد من الأمراض الالتهابية 41، 42. يتطلب هذا البروتين 78 كيلو دالتون أيونات الكالسيوم إلى ربط الغشاء 43. على الرغم من هذا الارتباط غشاء وقد درس على نطاق واسع باستخدام الجسيمات الشحميةالصورة = "XREF"> 44، 45، 46 و كسور غشاء 47، وهذه لا يمكن استخدامها لتحليل تيم وتقرير الهيكل.

إعداد nanodiscs يبدأ عن طريق خلط MSP مع الدهون معلق في كوليت المنظفات الصوديوم. بعد مرور فترة الحضانة على الجليد لمدة 1 ساعة، وإزالة المنظفات ببطء من خليط إعادة استخدام الراتنج مكثف. في كثير من الأحيان يتم إجراء هذا النوع من المواد من البوليسترين شكل إلى حبات صغيرة. هم مسعور نسبيا ولها تفضيل قوي لالمنظفات ملزمة مقارنة مع الدهون 48. بعد إزالة حبات مسعور وأداء توضيح باستخدام الطرد المركزي، وتنقية nanodiscs بواسطة اللوني حجم الاستبعاد (SEC). يتم خلط nanodiscs تنقيته مع بروتين monotopic غشاء (والعوامل المساعدة الممكنة) في نسبة متساوي المولية (أو عدة نسب لالمعايرة) ويترك إلى react (15 دقيقة). ويتم تحليلها من قبل تيم من خلال تطبيق ميكرولتر كميات من العينة على وشبكات الكربون المغلفة يتوهج تفريغها ومن ثم عن طريق أداء تلطيخ السلبية مع نابت. نفس العينة من عندما طبقت قسامات إلى شبكات تيم يمكن استخدامها لتحليل من قبل غير تغيير طبيعة أو SDS PAGE هلام الكهربائي، فضلا عن أنواع مختلفة من قياسات النشاط، دون أي تغييرات جوهرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد Nanodiscs

  1. التعبير وتنقية البروتين الغشاء السقالات 8، 35
    1. تعبير عن MSP1E3D1 صاحب الموسومة في كولاي BL21 (DE3) T1R pRARE2 السلالة في قوارير. إعداد ثقافة 50 مل بداية ليلة وضحاها مع متوسط ​​LB تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل الكانامايسين عند 37 درجة مئوية. تمييع الثقافة بداية ليلة وضحاها في 2 لتر من مرق المتوسطة رائع تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل الكانامايسين.
    2. تنمو الخلايا عند 37 درجة مئوية حتى الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD 600) يبلغ حوالي 3. الحث على التعبير البروتين مع 0.5 ملي الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) لمدة 3 ساعات في 18 درجة مئوية.
    3. إعداد العازلة تحلل (100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0؛ 100 مم كلوريد الصوديوم، و 10٪ الجلسرين). إضافة 1 ملم TCEP مباشرة قبل الاستعمال.
    4. بعد 3 ساعات من تحريض على 18 درجة مئوية، وحصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 4500 x جو 4 درجات مئوية. تجاهل طاف، وزن الخلايا تحصد، وإعادة تعليق عليها في تحلل العازلة على نسبة 2 مل من تحلل العازلة في غرام من الخلايا.
    5. ليز الخلايا عن طريق صوتنة نابض (معدل التكرار: 4 ق ON، 4 ثانية OFF) لمدة 3 دقائق في 80٪ السعة.
    6. الطرد المركزي لست] لمدة 20 دقيقة في 49000 x ج و 4 درجات مئوية. تجاهل بيليه من هذا الطرد المركزي.
    7. حقن طاف في 5 مل ني + عمود مخلبية متصلة النظام اللوني السائل الآلي أبقى يفضل عند 4 درجات مئوية.
    8. قبل الخطوة شطف (الخطوة 1.1.9)، وغسل العمود مع مخازن 1-3 أدناه لإزالة جميع البروتينات باستثناء صاحب الموسومة-MSP. رصد محتوى البروتين في 280 نانومتر لمتابعة عملية تنقية. تسجيل الأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر يجب أن تعود إلى خط الأساس بعد كل غسل.
      1. يغسل غسل العازلة 1: 40 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 300 ملي مول كلوريد الصوديوم، ايميدازول 10 ملم، و 1٪ تريتون، ودرجة الحموضة 8.0.
      2. يغسل غسل العازلة 2: 40 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 300 مليكلوريد الصوديوم، و 20 ملي ايميدازول، و 50 ملي كوليت الصوديوم، ودرجة الحموضة 8.0.
      3. يغسل مع العازلة غسل 3: 40 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 300 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 50 ملي إيميدازول، ودرجة الحموضة 8.0.
    9. أزل MSP مع 40 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 300 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 500 ملي ايميدازول، ودرجة الحموضة 8.0.
    10. تغيير عازلة لحركة مجتمع السلم عازلة معيار (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5؛ 100 مم كلوريد الصوديوم، و 0.5 ملي EDTA) من هلام الترشيح 8، 35؛ يجب أن يكون العائد لكل دفعة نحو 7 ملغم لتر -1.
  2. إعداد محلول المخزون فوسفورية
    1. إضافة 305 ميكرولتر من 1 بالميتويل-2-oleoyl- التعطيل -glycero-3-phosphocholine (POPC) الذائب في الكلوروفورم بتركيز 25 ملغ / مل إلى الدورق الزجاجي وتتبخر الكلوروفورم قبل تطهيره مع تيار لطيف من النيتروجين . تجف ليلة وضحاها الدهون في مجفف فراغ. ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة لإزالة المذيب من الدهون، مما يترك طبقة رقيقة من الدهون في الجزء السفلي من كوب زجاجي.
    2. Resuspend وكعكة الدهون في 200 ميكرولتر من العازلة القياسية MSP تحتوي على 100 ملي كوليت الصوديوم قبل vortexing الأنبوب حتى يصبح الحل شفافة. هذا سيوفر الحل مع تركيز POPC من 50 ملم.
      ملاحظة: بشكل عام، يجب أن تكون نسبة المولي من الدهون إلى المنظفات في هذه المرحلة 1: 2 (الدهون: المنظفات) 8. هذا المزيج الدهون المنظفات يمكن تخزينها في -80 درجة مئوية لمدة ما يقرب من 2 أشهر.
  3. إعداد حبات مسعور لإزالة المنظفات
    1. ضع 5 غرام من حبات (الوزن الجاف) في أنبوب 50 مل.
    2. تغسل حبات مع 30 مل من الميثانول بنسبة 100٪ وبعد ذلك مع 40 مل من الماء عالى النقاء.
    3. تغسل حبات مع 10 مل من MSP عازلة القياسية. وأخيرا، تخزين حبات مع 15 مل من العازلة مستوى MSP في 4 درجات مئوية.
  4. Nanodisc إعادة
    1. الاستغناء عن 190 ميكرولتر من MSP1E3D1 (0.124 ملم) في أنبوب microfuge وإضافة 61.5 ميكرولتر من محلول المخزون فوسفورية (50 ملي فOPC) إلى نفس الأنبوب. احتضان الخليط إعادة على الجليد الرطب لمدة 1 ساعة. ملاحظة: هذا يساوي نسبة المولي 1: 130 (MSP1E3D1: POPC).
    2. إضافة حبات مسعور عند تركيز 0.5 غرام من حبات لكل مليلتر من خليط إعادة لبدء عملية التجميع الذاتي. احتضان في حاضنة دوارة لمدة 16 ساعة عند 4 درجات مئوية.
    3. بعد الحضانة، الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 13000 x ج و 4 درجات مئوية لإزالة الرواسب والركام. تجاهل بيليه وحفظ طاف.
    4. تتوازن العمود حجم الإقصاء اللوني (التي شنت على نظام اللوني السائل الآلي) مع العازلة MSP مستوى حتى الامتصاصية في 280 نانومتر مستقرة. حقن طاف في العمود وجمع الكسور الذروة.
    5. قياس تركيزات nanodiscs في الكسور الذروة عند 280 نانومتر. استخدام معامل الانقراض المولي من MSP1E3D1 (ε = 29910 سم -1 م -1) لحساب تركيز nanodisc. لاحظ الويمكن قياس عدد من الدهون في nanodisc من خلال مزيج من الدهون رديولبلد وتحليل فوسفات 4 أو عن طريق تحليل الفوسفات وحدها.

2. إعداد البروتين Monotopic 5 أكسيجيناز شحمية 35

  1. إعداد الثقافة بداية ليلة وضحاها. تكملة 50 مل من المتوسط ​​LB مع 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين. تطعيم المتوسطة مع كولاي BL21 (DE3) التي تحتوي على البلازميد من الجين 5-أكسيجيناز شحمية (ALOX5). تمييع الثقافة بداية ليلة وضحاها في المتوسط التعبير التي تحتوي على 42 ملي نا 2 هبو 4، 24 ملم KH 2 PO 4، 9 مم كلوريد الصوديوم، و 19 ملي NH 4 CL، 1 ملي MgSO 4، 0.1 ملي CaCl 2، 0.2٪ D-الجلوكوز، 0.1 ٪ و 5 ميكرومتر FeSO 4، و 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين. تنمو الخلايا حتى OD 600 غير ~ 0.5 عند 25 درجة مئوية. حمل تعبير البروتين مع 0.2 ملي IPTG لمدة 16 ساعة عند 20 درجة مئوية (35).
  2. الحصاد بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 7000 x ج و 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف. وزن بيليه وجدت في الجزء السفلي من الأنبوب الذي يحتوي على خلايا المقطوع و resuspend الخلايا التي تحصد في تحلل العازلة (100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0؛ 100 مم كلوريد الصوديوم، و 10٪ الجلسرين، و 1 ملي TCEP) التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني و 0.5 ملغ / مل 35 الليزوزيم في نسبة 2 مل من تحلل العازلة في غرام من الخلايا.
  3. ليز الخلايا عن طريق صوتنة ل5 × 15 ثانية في 80٪ السعة. إزالة الحطام الخلية بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 7000 x ج و 4 درجات مئوية. أداء الأمونيوم كبريتات هطول الأمطار إلى 30 - 60٪ التشبع لترسيب البروتينات في حل 35. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 16000 x ج و 4 درجات مئوية. ملاحظة: بيليه 5LO يمكن تجميد بسرعة وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  4. Resuspend وبيليه مع 20 مل من تحلل العازلة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 40000 x ج و 4 درجات مئوية.
  5. احتضان طاف على عمود الاغاروز اعبي التنس المحترفين في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. غسل العمود مرة واحدة مع العمود حجم واحد من تحلل العازلة التي تحتوي على 0.5 M كلوريد الصوديوم. أزل 5LO مع 20 ملي اعبي التنس المحترفين في تحلل العازلة التي تحتوي على 10 ميكرومتر FeSO 4 و 20 ميكروغرام / مل الكاتلاز. أداء هلام الترشيح اللوني لإزالة ATP 35.
    ملاحظة: إن 5LO غير مستقرة، وينبغي استخدامها على الفور بعد تنقيتها. خلاف ذلك، فمن المستحسن أن وقف في خطوة لهطول الأمطار كبريتات الأمونيوم (راجع الملاحظة بعد الخطوة 2.1.3).

3. إعداد مجمع Nanodisc البروتين

  1. إعداد إجمالي حجم 100 ميكرولتر من المجمع. خلط 0.8 ميكرومتر ND و 0.8 ميكرومتر 5LO مع الحاضر ملي كا 2+ 1 في المخزن المؤقت القياسية MSP (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5؛ 100 مم كلوريد الصوديوم، 0.5 ملي EDTA، و 1.5 ملي CaCl 2)، واحتضان لمدة 10 دقيقة على الجليد. ملاحظة: يمكن تخزين عينة لمدة تصل إلى شهر واحد في 4 درجات مئوية (35).
ove_title "> 4. تحليل العينات

  1. هلام الكهربائي
    1. غير تغيير طبيعة-الكهربائي
      1. مزيج 15 ميكرولتر من العينة مع 5 ميكرولتر من العازلة تحميل (50 ملي BisTris، 6 N حمض الهيدروكلوريك، 50 مم كلوريد الصوديوم، و 10٪ (ث / ت) الجلسرين، و 0.001٪ الشقائقية S، ودرجة الحموضة 7.2) 49 وتحميله على 4 - 16٪ مكرر تريس هلام لأداء الكهربائي.
      2. ملء خزان الكاثود مع العازلة ضوء الكاثود (50 ملي مكرر تريس و 50 ملي Tricine، ودرجة الحموضة 6.8، و 0.002٪ Coomassie G-250) وخزان الأنود مع العازلة تشغيل (50 ملي مكرر تريس و 50 ملي Tricine، ودرجة الحموضة 6.8). بدء الفصل باستخدام التيار الكهربائي المستمر في 150 V.
      3. وقف الفصل الكهربي عندما تصل الجبهة Coomassie نهاية هلام.
      4. وصمة عار الجل مع معيار بروتوكول الأزرق Coomassie.
    2. تغيير طبيعة الكهربائي
      1. مزيج 40 ميكرولتر من العينة مع 10 ميكرولتر من العازلة تحميل تحتوي على SDS (0.05٪ (ث / ت) برموفينول الأزرق؛ 0.2 M تريس، حمض الهيدروكلوريك،الرقم الهيدروجيني 6.8. 20٪ (ت / ت) الجلسرين. 10٪ (ث / ت) SDS. و10 ملم 2-المركابتويثانول) وتحميله على 4-20٪ تريس هلام الجلايسين لأداء الكهربائي.
      2. ملء الكاثود والأنود الدبابات مع العازلة تشغيل (25 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 6.8 و 200 ملي الجلايسين، و 0.1٪ (ث / ت) SDS). بدء الفصل باستخدام التيار الكهربائي المستمر في 150 V.
      3. وقف الفصل الكهربي عندما تصل الجبهة صبغ تحميل نهاية هلام.
      4. وصمة عار الجل مع معيار بروتوكول الأزرق Coomassie.
  2. إعداد الحل نابت
    1. حل 1 غرام من الملح فسفوتنغستات الصوديوم في 50 مل من الماء عن طريق التحريض في درجة حرارة الغرفة لتعطي 2٪ (ث / ت) المحاليل الحمضية.
    2. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع 1 M هيدروكسيد الصوديوم. إزالة الجسيمات باستخدام فلتر حقنة 0.22 ميكرون. تخزين الحل في درجة حرارة الغرفة أو في 4 درجات مئوية.
  3. إعداد عينة للتحليل تيم
    1. توهج التفريغ شبكات النحاس المطلي الكربون (400 شبكة) لمدة 20 ق في 30 مللي أمبير لتقديم شبكات ماء قبل الامتزاز من العينة. ضع 3.5 ميكرولتر من العينة (0.8 ميكرومتر فيما يتعلق nanodiscs) على الشبكة، واحتضان لمدة 30 ثانية. ملاحظة: حجم تطبيقها قد تختلف بين 2.5 و 5 ميكرولتر، اعتمادا على تركيز العينة. مجموعة تركيز مناسب لnanodiscs هو 0،5-1 ميكرومتر.
    2. وصمة عار من فائض الحل باستخدام ورق الترشيح.
    3. وصمة عار على الفور الشبكة مع انخفاض بنسبة 2٪ نابت لمدة 30 ثانية. وصمة عار قبالة حل الزائدة وترك الشبكة على الهواء الجاف.
    4. تقييم الشبكات التي كتبها تيم. المجهر مع 120-200 كيلو يتسارع الجهد يكفي لتقدير مدى التراص. ملاحظة: للحصول على هذا البروتوكول، تم استخدام معايرة انتقال المجهر الالكتروني، ومجهزة على بعد 200 كيلو بندقية انبعاث المجال.
    5. تسجيل صور تيم. للصور تظهر مداخن طويلة، لا عملية أخرى. الصور تظهر مجمع nanodiscs، مع بروتين خارجي التي قد تحتوي على عدد قليلأكوام قصيرة، ولكن معظم الجسيمات في المجمع. سجل العديد من الصور والعملية هذه وفقا للطرق القياسية للحصول على الدرجة المتوسطات ومنخفضة الدقة، 3 نموذج الأبعاد للمجمع.
      ملاحظة: للحصول على جمع البيانات وصمة عار السلبية، أدلى الشبكات على الأقل في ثلاث أيام مختلفة. كل يوم، أدلى حضانات عينة جديدة (كما في الخطوة 3.1) قبل تطبيق وصمة عار السلبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

طريقة نقترح يعتمد على إعداد nanodiscs لتوفير سطح الغشاء لmonotopic ملزمة غشاء من البروتين. حيث لا يوجد بروتين الغشاء جزءا لا يتجزأ في طبقة ثنائية nanodisc الدهون، وهنا يرمز لnanodiscs باسم "nanodiscs فارغة" (الشكل 2A). هذه لها حساب الوزن الجزيئي 256 كيلو دالتون لتكوين اثنين من البروتينات MSP1E3D1 السقالات ونحو 260 من جزيئات POPC 8. باستخدام هذا البروتين: نسبة الدهون لإعادة، ذروة رئيسية واحدة (الشكل 2A) ومزال خلال الترشيح هلام. تم فحص الكسور الذروة حوالي 9 مل (الشكل 2A) بواسطة الأزرق الأصلي الكهربائي للهلام 49، والتي تبين فرقة واحدة (الشكل 2B، حارة 1). على الرغم من أن الفرقة يتوافق مع حجم أكبر إلى حد ما من حساب 256 كيلو دالتون، قطر nanodisc قياسها في صور تيم يناظريتوقع 13 نانومتر ± 0.5 نانومتر.

وتنقيته من monotopic بروتين الغشاء 5 أكسيجيناز شحمية (5LO) كما هو موضح أعلاه (بروتوكول الخطوة 2) وبمزيد من التفصيل في وقت سابق 35. تم تحليل تجانس 78 كيلو دالتون 5LO بواسطة SDS PAGE الكهربائي (الشكل 2C، حارة 1) وكان تعمل بكامل طاقتها 35 (لا يظهر).

في هذا البروتوكول، وتهيئة الظروف عمدا أن تعزيز التراص من nanodiscs. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن هذا التراص ويتسبب فقط في العينات جعلت للتصوير تيم (ما يسمى العينات)، وتحديدا من خلال إضافة سلبية فسفوتنغستات وصمة عار الصوديوم كخطوة أخيرة بعد أن بذلت كل العلاجات والإضافات الأخرى. في الواقع، وصور nanodiscs الملون نابت-تظهر التراص المتوقع (الشكل 3A) في وقت مبكر جدا لHDL 34 5، 50. و"مداخن طويلة من العملات ينظر اليها من الجانب" (الشكل 3A) هي nanodiscs تجميعها مع فسفوتنغستات مقحم بين طبقات ثنائية، كما هو موضح تخطيطي في الشكل 1A، واقترح تشانغ وآخرون. 32، 39.

ومن المهم أن تحقق ما إذا كان الإضافات المختلفة في مخازن تؤثر، ومنع، أو حتى إحداث التراص، وكما سيتضح أدناه، وآثار أيونات الكالسيوم المطلوبة التحقيق. في الشكل 3B، التراص لا تزال موجودة في عينة حيث تم إضافة أيونات الكالسيوم إلى حل nanodisc قبل تلطيخ مع نابت.

يظهر خطوة أساسية في البروتوكول في الشكل (4)، حيث غشاء بنالبروتين دينغ موجود في الحلول. لا يمكن أن يكون ذلك حافزا التراص بواسطة وصمة عار نابت عندما كان لا بد 5LO على سطح غشاء nanodiscs الشكل (4A). لهذه العينة، كانت نسبة المولي من 5LO إلى nanodiscs 1: 1، كما هو مبين تخطيطي في الشكل 1 (الشكل 1B، أسفل اليمين). وعلاوة على ذلك، وطبقة ثنائية المادة الدهنية من nanodiscs يمكن الوصول إليها من كلا الجانبين، وعلى النقيض من الجسيمات الشحمية، عينات مع أعدت نسبة اثنين إلى واحد 5LO nanodisc، بينما تظهر الصور تيم حتى أقل التراص (الشكل 4B).

للربط، يمكن أن بعض بروتينات غشاء خارجي يعتمد على وجود الدهون محددة في الغشاء، مثل phosphoinositols 10، 11، 12 أو 10 فسفاتيديل. في حالة 5LO، ووجود الكالسيوم 2+ هو necesلزم 43. في الشكل 4A وباء، وكانت أيونات الكالسيوم الموجودة في الحلول مع nanodiscs و5LO. وبعبارة أخرى، فإن عدم التراص ليس فقط يظهر أن البروتين monotopic وملزمة ولكن أيضا أن يعتمد الربط حول Ca 2+ الأيونات. من أجل إظهار هذا، كانت ملطخة محلول يحتوي على nanodiscs و5LO ولكن من دون الكالسيوم مع نابت والتقط بواسطة تيم (الشكل 4C). كما هو متوقع، 5LO لا يمكن ربط nanodiscs دون الكالسيوم 2+، وترك 5LO مجانا في الحل، وبالتالي فإن nanodiscs كومة بدلا من ذلك (الشكل 4C).

شكل 1
الشكل 1. مبدأ Nanodisc التراص ونظرة عامة على الطريقة. A. مبدأ التراص nanodisc. إضافة سلبية فسفوتنغستات وصمة عار الصوديوم إلى محلول nanodiscs (اليسار) يؤدي إلى th البريد التراص من nanodiscs (يمين) بسبب القوى الكهروستاتيكية (الوسط السهام) بين طبقة ثنائية فوسفورية والجزيئات PT (الوسط النقط السوداء). B. تمثيل تخطيطي للبروتوكول. nanodiscs فارغة (يسار) ربط إلى البروتين غشاء خارجي (الرمادي) لتشكيل مجمع، يصور من أربع زوايا مختلفة (أقل وسط). وجود البروتين monotopic يمنع sterically وnanodiscs من التراص عندما ملطخة الملح فسفوتنغستات (أسفل اليمين)، وعلى النقيض من التراص يتسبب في عدم وجود أي أجسام كبيرة (أعلى اليمين). تمثل حلقات الدفيئة وبرتقالية اللون التفاف MSP اثنين في جميع أنحاء الأساسية فوسفورية، والتي تتمثل في البني الفاتح. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

JPG "/>
الشكل 2. تحليل تجانس Nanodiscs و5LO. ألف الحجم الاستبعاد اللوني من nanodiscs فارغة تشكيلها. شطف من قمم nanodiscs في 9 مل. ب عدم تغيير طبيعة هلام التحليل الكهربي من ذروة جزء من المجلس الأعلى للتعليم هو مبين في الفقرة (أ). حارة M يحتوي على علامة. وفرقة واحدة موجودة في حارة 1، حيث تم تحميل الذروة جزء في 9 مل. C. تغيير طبيعة هلام التحليل الكهربي من 5LO تنقيته. يظهر كيلو دالتون 5LO 78 باعتبارها الفرقة مكثفة في حارة 1. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3. كومة تشكيل Nanodiscs في غياب البروتين تحليلها من قبل تيم. وكان المستحث A. Nanodisc التراص ثالدجاجة ملطخة نابت. و"رزمة من النقود" هي أكوام من nanodiscs عندما ينظر اليها من الجانب. يبدو كل nanodisc باعتباره الشريط الأبيض. لم بالانزعاج ب التراص من وجود أيونات الكالسيوم في حل nanodisc عندما ملطخة نابت. قضبان نطاق 100 نانومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. منع المكدس تشكيل من قبل تجليد البروتين في وجود عامل مساعد تحليلها من قبل تيم. وكانت أ و ب أيونات الكالسيوم الموجودة في خليط من 5LO وnanodiscs في نسب المولي 1: 1 (أ) أو 2: 1 (B). أكثر 5LO ملزما للnanodiscs، هي أقل nanodiscs متاحة للالتراص، كما هو مبين في الفقرة (ب). المجمعات-جسيم واحد في بوال (A) و (B) هي مناسبة لمزيد من المعالجة 35. ج- في حالة عدم وجود أيونات الكالسيوم، 5LO لا يمكن الربط. نابت تلطيخ من هذه العينة يظهر التراص نموذجية من nanodiscs، وترك 5LO غير منضم. قضبان نطاق 100 نانومتر. تم الحصول على الصور بواسطة كاميرا 4K X 4K CCD في التكبير من 69،500x. حجم بكسل للكاميرا CCD هو 15 ميكرون، والذي يعطي القيمة المقابلة من 2.16 Å على مستوى العينة للصور EM. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يمكن فصل طريقة إلى ثلاثة أجزاء: إعادة تشكيل nanodiscs فارغة، وإعداد المجمعات البروتين nanodisc، وتلطيخ السلبية للتيم من هذه المجمعات. وسيتم تناول كل جزء بشكل منفصل بشأن القيود المفروضة على هذه التقنية، والخطوات الحاسمة، وتعديلات مفيدة.

إعادة تشكيل nanodiscs فارغة. الخطوات والحدود الحرجة في إنتاج واستخدام nanodiscs.

لإعداد nanodiscs فارغة، لا بد من تحسين نسبة MSP إلى دهون. لMSP الأكثر شيوعا والدهون (باستخدام كوليت كما المنظفات)، اقتراحات لنسب الأمثل ويمكن العثور عليها في الأدب (على سبيل المثال، 125-130 POPC في MSP1E3D1 8، 51 المستخدمة في هذا البروتوكول). الخلافات الحصول عليها مقارنة مع النسب المنشورة قد تعتمد على طريقة لتحديد تركيز البروتين، وكفاءة لاذابة IPID في المنظفات، وطريقة إزالة المنظفات من الحل.

نقترح لأداء إزالة المنظفات باستخدام الخرز مسعور 48 (الخطوة 1.3)، في حين أن البدائل الممكنة لغسيل الكلى أو إضافة سيكلودكسترين 52 و 53. في البداية، كان يستخدم لغسيل الكلى لإعادة هيكلة HDL 5 و 34 و ما زال يفضل 54. بغض النظر عن طريقة لإزالة المنظفات والسرعة ضرورية. إذا كانت إزالة سريع جدا (حجم حبات مسعور كبير جدا)، وإعادة ترتيب عفوية من MSP مع الدهون قد لا يكون الوقت لتحدث. بدلا من ذلك، كميات كبيرة من الجسيمات الشحمية والمجاميع البروتين قد تشكل. ان نتائج اللوني حجم الإقصاء تظهر كميات كبيرة من الجسيمات الشحمية في حجم باطلة، ذروة دون المستوى الأمثل من nanodiscs تشكيلها، وذروة أكبر من غير المستخدمةMSP 4 و 6 و 51. لحجم جدا صغير من الخرز مسعور، قد تكون إزالة المنظفات غير مكتملة، وnanodiscs التي تشكل قد تظهر الاختلاف في الأحجام، حيث أن معظمها أصغر مما كان متوقعا. يمكن للمرء أن اختبار اثنين من الإضافات كميات صغيرة من حبات مسعور بدلا من إضافة واحدة كبيرة لإبطاء سرعة إعادة.

الاختيار من الدهون وينبغي النظر بعناية 8، 9، 45، 46، 55، وهذا يتوقف على الغرض من إعداد nanodisc. بشكل عام، لجميع الطرق الرامية إلى تشكيل الأغشية (إعادة تشكيل nanodiscs أو الجسيمات الشحمية، فضلا عن التجارب تبلور 2D)، يجب أن تكون نسبة الدهون في "السائل" الدولة 56. تحت درجة حرارة معينة، الالبريد الدهون غير جامدة. فوق هذا ما يسمى درجة حرارة التحول (TM)، والدهون هو السائل. لاحظ أن بعض الدهون المشبعة شائعة الاستخدام لديها تيم أعلى بكثير من درجة حرارة الغرفة. وعلاوة على ذلك، لالخلطات الدهون، اعتبار امتزاج الدهون موسى 57. درجة الحرارة المثلى لتشكيل Nanodisc هي حول مرحلة انتقالية (تيم) من المادة الدهنية.

المنظفات في هذا البروتوكول هو كوليت الصوديوم 8. إذا كان يجب استخدام المنظفات آخر، بنفس التركيزات التي استخدمت لكوليت لا يمكن استخدامها مباشرة. بعض المنظفات خفيفة تذوب الدهون بكفاءة أقل، وربما تكون هناك حاجة إلى تركيز أعلى. يجب حل الكعكة الدهون التي تم الحصول عليها بعد تبخر الكلوروفورم (الخطوة 1.2.2 في البروتوكول) إلى حل واضح من قبل المنظفات. vortexing ل، وتجميد لاذابة دورات والحمامات بالموجات فوق الصوتية، أو صوتنة يمكن استخدامها لتسريع ذوبان.

لcombinatالأيونات من الدهون (-mixtures)، MSP، والمنظفات الأخرى من تلك المستخدمة هنا، معايرات للحد من وحدات العمل والجسيمات الشحمية كبيرة أو الزائد MSP هي ضرورية 4، 6، 51، 58. بالنسبة لبعض مجموعات من حركة مجتمع السلم والدهون الفوسفاتية، قد يكون الأمثل أكثر صعوبة من أجل الآخرين 4 و 6 و 51، ويصبح من الضروري تحديد المحتوى من الكسور الذروة. الطريقة الأكثر دقة لتحليل تكوين nanodisc وحجم ما لتحديد عدد من الفوسفاتية في وزارة الصحة العامة عن طريق تحليل الفوسفات 4 وحساب nanodisc الوزن الجزيئي. يمكن تقدير حجم Nanodisc التي تحل جيدا غير تغيير طبيعة الكهربائي، هلام. ديناميكية تشتت الضوء (DLS) 59. أو وصمة عار السلبية تيم، على سبيل المثال لا قليل من الطرق. أما بالنسبة للنيجاقدم يسببها TIVE وصمة عار بروتوكول التراص هنا، وقياس عرض مداخن الموجودة في الصور تيم غلة قطر nanodiscs.

أما بالنسبة للالتعبير وتنقية البروتين الغشاء السقالات، وينبغي اتخاذ جميع الاحتياطات والمخاوف المعتادة لبروتين قابل للذوبان. البلازميدات المتاحة قد تحتوي على علامات مختلفة ومواقع البروتيني انشقاق في حالة يجب إزالة علامة قبل استخدام MSP.

5LO، البروتين monotopic المستخدمة في البروتوكول، ويعطل بسرعة ما لم تتخذ الاحتياطات اللازمة، وصفت في أماكن أخرى 35 والمراجع فيها. وباختصار، فإن الحديد الحفاز تضيع بسهولة، والظروف المؤكسدة قد يسبب dimerization من 5LO. كما جاء في المذكرة (بروتوكول خطوة 2.1.3)، قد أوقف تنقية بعد خطوة هطول الأمطار وقسامات المخزنة حتى استخدامها لاحقا. بعد تنقية قسامة، يجب استخدام البروتين في غضون ساعات قليلة د رق إلى تعطيل السريع 35.

خطوات حاسمة في إعداد المجمعات البروتين nanodisc.

حجم البروتين monotopic مقابل منطقة nanodisc له أهمية. طول سلسلة البروتين MSP1E3D1 يتوافق مع nanodisc مع القطر الداخلي 10.5 نانومتر وحول منطقة طبقة ثنائية 8900-A 2 8. وهذا يتوافق جيدا إلى منطقة ذكرت بالنسبة للجزء جزءا لا يتجزأ من غشاء 5LO 45. وهكذا، كانت نسبة ملزمة توقعاتنا 1: 1، أو على الأكثر 2: 1 5LO في nanodisc. أثبت هذا أن يكون صحيحا، كما ورد في تجربة المعايرة 35. ومع ذلك، لم يتم الحصول على الحد الأقصى ربط اثنين 5LO في nanodisc، كما نوقش في أماكن أخرى 35. وnanodisc أكبر إلى حد ما ربما قد تسمح لكامل 2: 1 ملزمة للتجارب حيث هذا أمر مرغوب فيه، ولكن في هذه الحالة، فإن نسبة 1: 1 هو الهدف الرئيسي.

ove_content "> اختيار الدهون الأمثل للبروتين nanodisc تشكيل معقد يمكن بمساعدة من معرفة سابقة، وكان هذا هو الحال في هذا البروتوكول، حيث كان اختيار الدهون POPC الاصطناعية 35. كل الاختلافات في المجموعة رئيس الدهون 46 والاختلافات في تشبع من سلاسل أسيل 45 تم اختبارها في الدراسات ملزمة الحويصلية-5LO. وقد ازداد النشاط 5LO عن طريق الربط على الجسيمات الشحمية التي تحتوي على الدهون الفوسفاتية الكولين غير المشبعة في SN-2 أسيل سلسلة موقف 45، 46. وإذا لم يعرف متطلبات الدهون محددة، ولكن ومن المعروف أن هوية غشاء الأصلي، يمكن اختبار مقتطفات الدهون الطبيعية الأولى 55.

كان معروفا والاعتماد العامل المساعد ل5LO، والتي تعتمد على أيونات الكالسيوم 2+ لغشاء ملزمة 43. ومن الصعب تماما لإزالة الكالسيوم من الحلول. هنا، وكيل كومبليكسينج EDTA موجود في المخازن بكميات تعديلها لترك كمية تسيطر عليها مجانا الكالسيوم 2+ الأيونات. وقدمت حسابات جزيئات الحرة والمرتبطة في المخازن قبل 60 برنامج BAD للمخازن تحتوي على أكثر من نوع واحد من وكيل كومبليكسينج 35. لم يتم احتساب تأثير على تركيز العامل المساعد للذوبان جزئيا في الغشاء عن طريق هذا البرنامج.

خطوات حاسمة في تلطيخ السلبية من nanodiscs لتشجيع تشكيل المكدس.

للبروتوكول في متناول اليد، حيث هو المطلوب التراص القصوى، وينبغي أن يكون وصمة عار على ملح الصوديوم من phosphotungsten. هي أملاح مختلفة من التنغستن المتاحة، ونحن لاحظ أن حمض الفسفوتنغستيك كان أقل كفاءة في التراص (لا يظهر). لأسباب غير واضحة، ويبدو ان كميات عالية من الصوديوم خلال PT تلطيخ يعزز التراص. أيضا، لعينة العازلة، وقد تبين أن انخفاض تابع الصوديوموالأنف والحنجرة، وانخفاض كمية الناجم عن تكديس 32. لنفس السبب، وبعد عينة تم تطبيقه على الشبكة EM، غسل الماء قبل تلطيخ لا ينبغي أن يؤديها، وهذا يقلل من التراص. من ناحية أخرى، كان المستحث بعض التراص دائما، ولكن ليس إلى حد اللازمة للحصول على أفضل أداء للبروتوكول.

بالطبع، العوامل المساعدة مثل أيونات الكالسيوم 2+ هنا يجب فحص للتدخل مع وصمة عار سلبية أو مع nanodiscs. لهذا البروتوكول، فإن أيونات الكالسيوم قد عجلت منطقة عازلة الفوسفات، لذلك تم استخدام منطقة عازلة تريس. لم مكدسة nanodiscs ب Ca 2+ الأيونات في حد ذاته، والتأكد من ذلك باستخدام وصمة عار سلبية أخرى، اليورانيل فورمات 35، ولم الكالسيوم منع التراص يسببها نابت (الشكل 3B).

لبروتين monotopic صغير، وحجم اضافية تضاف من خلال الربط إلى nanodisc قد جعلها قابلة للكشف في cryoEM. اnanodisc كبيرة جدا مقارنة مع البروتين قد لا تكون الأمثل، كما بروتين صغير على nanodisc كبيرة قد لا يمنع التراص. ومع ذلك، يمكن للشكل بروتين خارجي يكون لها تأثير. على الرغم من عدم نسبة محددة يمكن توفيرها حتى الآن، فمن المستحسن nanodisc طبقة ثنائية السطح فقط أكبر قليلا من سطح ملزمة المقدرة للبروتين. مع هذا القيد، فإن البروتين القصوى ملزم أن يكون البروتين واحدة على كل جانب من nanodisc.

القيود العامة ومزايا هذه الطريقة.

يعتمد البروتوكول على توافر تيم والمعدات ذات الصلة، والتي لا تتوفر في جميع المختبرات. ومع ذلك، فإن 120- إلى 200 كيلو فولت المجهر الالكتروني مزودة بكاميرا CCD التقليدية ستكون كافية تماما للكشف عن التراص. يتم تنفيذ تلطيخ السلبية نابت في درجة حرارة الغرفة، ويمكن تخزين الشبكات في درجة الحرارة هذه لمشاهدتها لاحقا.

تيم ايماجان جي تظهر بسرعة ما إذا كان التراص وقد منعت أم لا. للصور تظهر المجمعات البروتين nanodisc (على سبيل المثال، الشكل 4A وباء)، مزيد من المعالجة للحصول على معلومات الهيكلية يمكن أن يؤديها. تفاصيل الهيكلية للعينة ملطخة سلبا يمكن أن تصل إلى 1 نانومتر ويمكن أن توفر المعلومات الهيكلية مفيدة 29. في مختبرات مخصصة لهيكلة تقرير من قبل cryoEM، وتلطيخ السلبية العينات هو الإجراء المعتاد. إن استخدام بروتوكول لدينا أن يكون إضافة سريعة وبسيطة لإجراءات العادية.

وترسو بعض البروتينات monotopic إلى غشاء من myristoylation، palmitoylation، أو بقع مسعور على سطح البروتين، مما يجعل من الضروري لتشكيل مجمع nanodisc البروتين من قبل نفس إجراءات إدماج بروتين عبر الغشاء إلى nanodiscs 13. هنا، واحدة من وحدات فرعية في مجمع البروتين يحتوي صباحاyristoylation على ذيل N-محطة مرنة لغشاء ملزمة. لاليورانيل الملطخة خلات صور تيم، وذكر أن مجمع البروتين كان لا بد عموديا على الغشاء، وليس على جانب nanodisc. هذا والنتائج الأخرى أكد هيكل صلب للمرفق غشاء 13. لهذا الربط، نابت تلطيخ وفقا لبروتوكول مقترح لدينا سوف تظهر نفس الجسيمات واحدة موزعة بالتساوي. ومع ذلك، إذا كان مرفق كان عبر سلسلة مرنة، وتلطيخ اليورانيل خلات قد لا أعطت نتيجة واضحة. نحن نفترض أن لمجمعات البروتين المرفقة غشاء سلسلة مرنة، وتلطيخ نابت قد تحفز nanodiscs إلى كومة، مما يدل على نموذجي "كومة من القطع النقدية"، ولكن زينت الآن من البروتين تعلق على الجانبين.

لماذا استخدام nanodiscs إذا الجسيمات الشحمية التي يمكن استخدامها؟ من الممكن جدا أن تختبر الاستفادة المثلى من الدهون، والعوامل المساعدة، أو غيرها من المعالم في الجسيمات الشحمية للربط فيالبروتينات ipheral (راجع. 5LO). وقد تجلى التراص يسببها نابت من الجسيمات الشحمية 32، لذلك البروتين monotopic يمكن منع الحويصلية التراص. ومع ذلك، فإن أحجام الجسيمات الشحمية بالمقارنة مع monotopic البروتينات وnanodiscs يأتي أيضا في اللعب. بروتين خارجي كبير قد تكون قادرة على منع التراص من الجسيمات الشحمية، في حين أن بروتين صغير، مثل 78 كيلو دالتون 5LO، قد لا ما لم تكون موجودة بأعداد كبيرة في الجسيمات الشحمية. الجسيمات الشحمية الصغيرة يمكن أن تكون على استعداد، ولكن أصغر الحويصلة، وأقوى من انحناء الغشاء. طبقة ثنائية nanodisc مسطحة. يمكن اختبار مختلف المعلمات باستخدام nanodiscs تكون أقل نظرا لMSP فعالة من حيث التكلفة. من ناحية أخرى، لالجسيمات الشحمية، بعض العوامل المساعدة باهظة الثمن أو ركائز أن تقسيم جزئيا في غشاء وأبعد من ذلك، إلى المناطق الداخلية من الجسيمات الشحمية، قد تكون هناك حاجة في كميات أكبر. في الختام، تقدم منصة nanodisc إمكانية اختيار منطقة محددة ملزمة للتطبيق غير دقيق بني مصفر من البروتينات. منطقة طبقة ثنائية يمكن الوصول إليها من الجانبين ومسطحة.

أهمية هذه الطريقة.

تحديد هيكل 3D من البروتينات أو الجزيئات المعقدة يتصور الأعمال الداخلية للخلايا. في هذه البيئة المزدحمة، بروتينات معينة تنشط على أسطح الأغشية، وحدها أو في المجمع مع بروتينات أخرى، ولكن عادة بحيث التفاعل الجسدي مع المكونات الموجودة في طبقة ثنائية الدهون هو جزء من وظيفتها الآلية. بالنسبة لبعض البروتينات، يتم تغيير التشكل في حل على تضمين غشاء، في حين أن البعض الآخر المربوطة إلى الغشاء ولكن مع ذلك تغيير التشكل أو التوجه على الغشاء بسبب نوع من الزناد. ثم قد فتح مسار دخول الركيزة مسعور، أو قد تحدث التشكل الذي يسمح ملزمة لبروتين الغشاء. للحصول على بنية، أو على الأقل المعلومات الهيكلية، هذه البروتينات الطرفية ملزمة لغشاء يشكل تحديا.

jove_content "> استخدمت Nanodiscs في بعض الدراسات المتعلقة التوجيه وظيفة على الأغشية 10، 11، 12، 13، 14، 15، 16، 17. السيتوكروم P450، المركزي في إزالة السموم، وترتكز على غشاء من قبل α حلزون ويحتوي على . وأشارت مجموعة الهيم في جزء كروي، والسماح لقياسات ازدواج اللون الخطية 15 النتائج وجود توجه الهيم فيما يتعلق الغشاء في وثيقة الاتفاق مع المحاكاة بها، وبالتالي تعزيز استنتاجات أخرى مستمدة من عمليات المحاكاة للالسيتوكروم P450 جزءا لا يتجزأ من الغشاء. لGTPase ترتكز على الغشاء في nanodisc صغيرة، يمكن أن الدراسات NMR تحديد مجالين مختلفين على البروتين مع غشاء اجهة كل وأبعد من ذلك، كيف نواة المد ملزمة بفعل التحول من واجهة واحدة على 17 آخرين. الطفرات والمستجيب ملزم، وكذلك GTP ملزمة، وقد درس في GTPase آخر في رأس عائلية فائقة إلى العثور على عدد من الآثار المترتبة على النشاط الذي يعتمد على التوجه على الغشاء، والتي من شأنها أن تؤثر أنكجنيك يشير 16. 5LO ديه التشكل للذوبان 61 و يتطلب الكالسيوم للربط على الأغشية النووية 43. باستخدام الجسيمات الشحمية unilamellar العملاقة، أجريت الاستقطاب، الموهن، ومجموع انعكاس التجارب الأشعة تحت الحمراء 46. تعني النتيجة أن N-محطة β برميل يربط الأغشية، مع محور التماثل للβ برميل يميل 45 درجة تقريبا من الغشاء العادي. المجال 5LO C-المحطة هو أسطواني ما يقرب من α حلزونية حزمة، وهذا اقترح ربط مع موازية المحور الطويل لغشاء 45،= "XREF"> 46. في عملنا في وقت سابق على 5LO جزءا لا يتجزأ من على nanodiscs، وقد تم اختيار منطقة طبقة ثنائية للسماح 5LO واحدة لكل جانب مع التوجه المذكور اقترح 35. وأكدت الصور تيم هذا التوجه، وإن كان ذلك على دقة منخفضة 35. إذا، على سبيل المثال، كان لا بد سوى N-محطة β برميل ولكن لا مجال C-المحطة، قد تم الحصول على عدد أكبر من 5LO في nanodisc. وعلاوة على ذلك، يمكن أن بروتين آخر تغيير غشاء ملزمة وتوجه 5LO، مثل المنشط، وبروتين الغشاء 5 أكسيجيناز شحمية تفعيل البروتين، رفرفة. وقد أعاد رفرفة إلى nanodiscs، ونحن نستخدم تيم وغيرها من الأساليب لدراسة التفاعل بين 5LO ورفرفة. نتائجها التفاعل في حمض الأراكيدونيك الذاتية تحويلها إلى الليكوترين A4، التي هي الخطوة الأولى في تركيب chemoattractants قوية تشارك في العديد من الأمراض الالتهابية 41، 42 سوب>، 62.

يتم حساب مجمع 5LO-nanodisc أن يكون الوزن الجزيئي من 334 كيلو دالتون، بالقرب من حدود حوالي 200 كيلو دالتون للتحقيق الهيكلي التي كتبها cryoEM. ومع ذلك، والتركيب الذري من 5LO متاح 61، لرسو السفن فيها إلى متوسطة القرار، 3-الأبعاد الإلكترون خريطة كثافة ستسفر معلومات عن التفاعل مع غشاء nanodisc.

الابتكارات في مجال تكنولوجيا cryoEM لا تدفع سوى قرار إلى المستوى الذري 63 ولكن تدفع أيضا الحد الأقصى لحجم للبروتينات صغيرة. لتحديد الهيكلية التي كتبها NMR 22، فإن الوضع هو العكس، حيث أن الهدف من ذلك هو زيادة مدى حجم، الذي يقترب الآن 200 كيلو دالتون. مؤخرا، تم التحقيق الغشاء ملزمة من البروتينات GTPase صغيرة التي كتبها NMR 16 و 17. هذه البروتينات، التي لا تتعدى 20 كيلو دالتون، ونحنإعادة المربوطة إلى nanodiscs صغيرة يبلغ قطرها الداخلي 7.6 نانومتر، وتشكيل المجمعات حوالي 130 كيلو دالتون. في المستقبل، يمكن أن يتم التحقيق المجمعات ذات الحجم المماثل من قبل كل من NMR وcryoEM لتوضيح جوانب مختلفة من غشاء بروتين ملزمة.

امتدادا للبروتوكول يمكن أن تكون التحقيق nanodiscs تحتوي على بروتين الغشاء (TMP) في طبقة ثنائية nanodisc. يمكن مقارنة التراص يسببها نابت للTMP-nanodiscs إلى nanodiscs فارغة تحتوي على نفس التركيب الدهون. ان حلقات extramembranous كبيرة منع التراص، في حين حلقات قصيرة قد لا تمنع التراص 64. يمكن أن تحول هذا إلى ميزة، كما يمكن استخدام بروتوكول للتحقيق البروتينات ملزمة على وجه التحديد إلى بروتين الغشاء.

وميزة هذه الطريقة هي أن التفاعل غشاء يمكن تصور فورا. البساطة النسبية لجعل كميات كبيرة من nanodiscs فارغة يعني أن واحدا يمكن أن تمتدهذه الطريقة للكشف عن ظروف مختلفة مثل درجة الحموضة، ودرجة الحرارة، ومخازن، والاعتماد العامل المساعد من البروتين monotopic ملزمة. في الواقع، في حين تم تطوير منصة nanodisc 9 لتحقيق الاستقرار من البروتينات عبر الغشاء، ويستخدم بشكل متزايد لهذا الغرض، قدرته على دراسات لأعداد كبيرة من أكثر أو أقل عابر ملزم البروتينات خارجي يجب أن تكون واضحة وأبقى داخل الخلايا الحالية في عين الاعتبار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

المؤلفان بالشكر إلى مجلس السويدية بحوث، مجلس مقاطعة ستوكهولم، وصناديق KI لدعمهم. تم إجراء التعبير وتنقية MSP في معهد كارولينسكا / SciLifeLab البروتين مرفق العلوم الأساسية (http://PSF.ki.se). فإن الكتاب أود أيضا أن أشكر الدكتور باسي Purhonen والدكتور ماتيلدا سوبيرغ لتبادل الخبرات الفنية ولما قدموه من مساعدة في الوقت المناسب.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transmission electron microscope: JEOL2100F JEOL
CCD camera Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany
Glow discharger Baltec
TEM grid: 400 mesh TAAB GM016/C
Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5 Agilent Technologies 5190-2526
Superdex 200 HR 10/300 GE Healthcare Life Sciences 17-5172-01
Plasmid: MSP1E3D1 Addgene 20066
Bacteria: BL21DE3 NEB C2527H
Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2 Protein Science Facility, KI, Solna
Purification Matrix: ATP agarose Sigma Aldrich A2767
Purification Matrix: HisTrap HP-5 mL GE Healthcare Life Sciences 17-5247-01
Lipid: POPC Avanti polar lipids 850457C 25 mg/mL in chloroform
Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin Bio-Rad 1523920
13 mm syringe filter: 0.2 μm Pall life sciences PN 4554T
Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate Sigma Aldrich 31648
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Bio-Rad 161-0301
Protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001
TCEP Sigma Aldrich 646547
Detergent: Sodium cholate hydrate Sigma Aldrich C6445-10G
Sodium Cholate 500 mM Sodium cholate. Resuspend in miliQ water and store at -20 °C.
Lipid Stock 50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl. Store at 4 °C for a week; or
Store -80 °C for a month, after purging the solution with nitrogen.
MSP standard buffer 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA.
Store at 4 °C.
Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer Thermo Fisher Scientific BN2001 50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8
Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer Thermo Fisher Scientific BN2002 50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8, 0.002% Coomassie G-250
Non-Denaturaing Electrophoresis 4x Sample loading Buffer Thermo Fisher Scientific BN2003 50 mM Bis-Tris, pH 7.2, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S
Denaturaing Electrophoresis Running Buffer In-house recipe: 25 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1% (w/v) SDS
Denaturaing Electrophoresis 5x Sample loading Buffer In-house recipe: 0.05% (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl, pH 6.8, 20% (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS, 10 mM 2-mercaptoethanol
Terrific broth Tryptone - 12.0 g, Yeast Extract - 24.0 g, 100 mL 0.17 M KH2PO4 and 0.72 M K2HPO4, Glycerol - 4 mL.
Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 mL and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kleinschmidt, J. H., Popot, J. L. Folding and stability of integral membrane proteins in amphipols. Arch Biochem Biophys. 564, 327-343 (2014).
  2. Frauenfeld, J., et al. A saposin-lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nat Methods. 13 (4), 345-351 (2016).
  3. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nat Struct Mol Biol. 23 (6), 481-486 (2016).
  4. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-Assembly of Discoidal Phospholipid Bilayer Nanoparticles with Membrane Scaffold Proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  5. Jonas, A., Steinmetz, A., Churgay, L. The number of amphipathic alpha-helical segments of apolipoproteins A-I, E, and A-IV determines the size and functional properties of their reconstituted lipoprotein particles. J Biol Chem. 268 (3), 1596-1602 (1993).
  6. Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers. Protein Eng Des Sel. 23 (11), 843-848 (2010).
  7. Hagn, F., Etzkorn, M., Raschle, T., Wagner, G. Optimized phospholipid bilayer nanodiscs facilitate high-resolution structure determination of membrane proteins. J Am Chem Soc. 135 (5), 1919-1925 (2013).
  8. Ritchie, T. K., et al. Methods in Enzymology. Duzgunes, N. ejat 464, Academic Press. 211-231 (2009).
  9. Schuler, M. A., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs as a new tool to examine lipid-protein interactions. Methods Mol Biol. 974, 415-433 (2013).
  10. Nasr, M. L., et al. Membrane phospholipid bilayer as a determinant of monoacylglycerol lipase kinetic profile and conformational repertoire. Protein Sci. 22 (6), 774-787 (2013).
  11. Yokogawa, M., et al. NMR analyses of the interaction between the FYVE domain of early endosome antigen 1 (EEA1) and phosphoinositide embedded in a lipid bilayer. J Biol Chem. 287 (42), 34936-34945 (2012).
  12. Wan, C., et al. Insights into the molecular recognition of the granuphilin C2A domain with PI(4,5)P2. Chem Phys Lipids. 186, 61-67 (2015).
  13. Zhang, P., et al. An Isoform-Specific Myristylation Switch Targets Type II PKA Holoenzymes to Membranes. Structure. 23 (9), 1563-1572 (2015).
  14. Grushin, K., Miller, J., Dalm, D., Stoilova-McPhie, S. Factor VIII organisation on nanodiscs with different lipid composition. Thromb Haemost. 113 (4), 741-749 (2015).
  15. Baylon, J. L., Lenov, I. L., Sligar, S. G., Tajkhorshid, E. Characterizing the membrane-bound state of cytochrome P450 3A4: structure, depth of insertion, and orientation. J Am Chem Soc. 135 (23), 8542-8551 (2013).
  16. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Oncogenic and RASopathy-associated K-RAS mutations relieve membrane-dependent occlusion of the effector-binding site. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), 6625-6630 (2015).
  17. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Membrane-dependent modulation of the mTOR activator Rheb: NMR observations of a GTPase tethered to a lipid-bilayer nanodisc. J Am Chem Soc. 135 (9), 3367-3370 (2013).
  18. Wang, L., Sigworth, F. J. Structure of the BK potassium channel in a lipid membrane from electron cryomicroscopy. Nature. 461 (7261), 292-295 (2009).
  19. Ackerson, C. J., Powell, R. D., Hainfeld, J. F. Site-specific biomolecule labeling with gold clusters. Methods Enzymol. 481, 195-230 (2010).
  20. Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (31), 11509-11514 (2006).
  21. Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. Membrane protein structure determination - the next generation. Biochim Biophys Acta. 1838 (1 Pt A), 78-87 (2014).
  22. Dias, D. M., Ciulli, A. NMR approaches in structure-based lead discovery: recent developments and new frontiers for targeting multi-protein complexes. Prog Biophys Mol Biol. 116 (2-3), 101-112 (2014).
  23. Viegas, A., Viennet, T., Etzkorn, M. The power, pitfalls and potential of the nanodisc system for NMR-based studies. Biol Chem. , (2016).
  24. Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A primer to single-particle cryo-electron microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
  25. Wu, S., Armache, J. P., Cheng, Y. Single-particle cryo-EM data acquisition by using direct electron detection camera. Microscopy (Oxf). 65 (1), 35-41 (2016).
  26. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  27. De Carlo, S., Adrian, M., Kalin, P., Mayer, J. M., Dubochet, J. Unexpected property of trehalose as observed by cryo-electron microscopy. J Microsc. 196 (1), 40-45 (1999).
  28. Nogales, E. The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nat Methods. 13 (1), 24-27 (2016).
  29. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).
  30. Forte, T. M., Nordhausen, R. W. Electron microscopy of negatively stained lipoproteins. Methods Enzymol. 128, 442-457 (1986).
  31. Zhao, F. Q., Craig, R. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. J Struct Biol. 141 (1), 43-52 (2003).
  32. Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. J Lipid Res. 52 (1), 175-184 (2011).
  33. Zhang, L., et al. An optimized negative-staining protocol of electron microscopy for apoE4 POPC lipoprotein. J Lipid Res. 51 (5), 1228-1236 (2010).
  34. Matz, C. E., Jonas, A. Micellar complexes of human apolipoprotein A-I with phosphatidylcholines and cholesterol prepared from cholate-lipid dispersions. J Biol Chem. 257 (8), 4535-4540 (1982).
  35. Kumar, R. B., et al. Structural and Functional Analysis of Calcium Ion Mediated Binding of 5-Lipoxygenase to Nanodiscs. PLoS One. 11 (3), e0152116 (2016).
  36. Waggoner, T. A., Last, J. A., Kotula, P. G., Sasaki, D. Y. Self-assembled columns of stacked lipid bilayers mediated by metal ion recognition. J Am Chem Soc. 123 (3), 496-497 (2001).
  37. Kovacs, E., et al. Analysis of the Role of the C-Terminal Tail in the Regulation of the Epidermal Growth Factor Receptor. Mol Cell Biol. 35 (17), 3083-3102 (2015).
  38. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy. J Vis Exp. (90), e51087 (2014).
  39. Zhang, L., Tong, H., Garewal, M., Ren, G. Optimized negative-staining electron microscopy for lipoprotein studies. Biochim Biophys Acta. 1830 (1), 2150-2159 (2013).
  40. Cong, Y., Ludtke, S. J. Single particle analysis at high resolution. Methods Enzymol. 482, 211-235 (2010).
  41. Radmark, O., Werz, O., Steinhilber, D., Samuelsson, B. 5-Lipoxygenase, a key enzyme for leukotriene biosynthesis in health and disease. Biochim Biophys Acta. 1851 (4), 331-339 (2015).
  42. Anwar, Y., Sabir, J. S., Qureshi, M. I., Saini, K. S. 5-lipoxygenase: a promising drug target against inflammatory diseases-biochemical and pharmacological regulation. Curr Drug Targets. 15 (4), 410-422 (2014).
  43. Radmark, O., Samuelsson, B. Regulation of the activity of 5-lipoxygenase, a key enzyme in leukotriene biosynthesis. Biochem Biophys Res Commun. 396 (1), 105-110 (2010).
  44. Noguchi, M., Miyano, M., Matsumoto, T., Noma, M. Human 5-lipoxygenase associates with phosphatidylcholine liposomes and modulates LTA4 synthetase activity. Biochim Biophys Acta. 1215 (3), 300-306 (1994).
  45. Pande, A. H., Qin, S., Tatulian, S. A. Membrane fluidity is a key modulator of membrane binding, insertion, and activity of 5-lipoxygenase. Biophys J. 88 (6), 4084-4094 (2005).
  46. Pande, A. H., et al. Modulation of human 5-lipoxygenase activity by membrane lipids. Biochemistry. 43 (46), 14653-14666 (2004).
  47. Wong, A., Hwang, S. M., Cook, M. N., Hogaboom, G. K., Crooke, S. T. Interactions of 5-lipoxygenase with membranes: studies on the association of soluble enzyme with membranes and alterations in enzyme activity. Biochemistry. 27 (18), 6763-6769 (1988).
  48. Rigaud, J. L., Levy, D., Mosser, G., Lambert, O. Detergent removal by non-polar polystyrene beads. European Biophysics Journal. 27 (4), 305-319 (1998).
  49. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  50. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. J Vis Exp. (90), e51087 (2014).
  51. Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size. J Am Chem Soc. 126 (11), 3477-3487 (2004).
  52. Hornschemeyer, P., Liss, V., Heermann, R., Jung, K., Hunke, S. Interaction Analysis of a Two-Component System Using Nanodiscs. PLoS One. 11 (2), 0149187 (2016).
  53. Degrip, W. J., Vanoostrum, J., Bovee-Geurts, P. H. Selective detergent-extraction from mixed detergent/lipid/protein micelles, using cyclodextrin inclusion compounds: a novel generic approach for the preparation of proteoliposomes. Biochem J. 330 (Pt 2), 667-674 (1998).
  54. Martin, D. D., Budamagunta, M. S., Ryan, R. O., Voss, J. C., Oda, M. N. Apolipoprotein A-I assumes a "looped belt" conformation on reconstituted high density lipoprotein. J Biol Chem. 281 (29), 20418-20426 (2006).
  55. Cerione, R. A., Ross, E. M. Reconstitution of receptors and G proteins in phospholipid vesicles. Methods Enzymol. 195, 329-342 (1991).
  56. Shaw, A. W., McLean, M. A., Sligar, S. G. Phospholipid phase transitions in homogeneous nanometer scale bilayer discs. FEBS Lett. 556 (1-3), 260-264 (2004).
  57. Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).
  58. Civjan, N. R., Bayburt, T. H., Schuler, M. A., Sligar, S. G. Direct solubilization of heterologously expressed membrane proteins by incorporation into nanoscale lipid bilayers. Biotechniques. 35 (3), 553-562 (2003).
  59. Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A step-by-step method for the reconstitution of an ABC transporter into nanodisc lipid particles. J Vis Exp. (66), e3910 (2012).
  60. Brooks, S. P., Storey, K. B. Bound and determined: a computer program for making buffers of defined ion concentrations. Anal Biochem. 201 (1), 119-126 (1992).
  61. Gilbert, N. C., et al. The structure of human 5-lipoxygenase. Science. 331 (6014), 217-219 (2011).
  62. Radmark, O. 5-lipoxygenase-derived leukotrienes: mediators also of atherosclerotic inflammation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (7), 1140-1142 (2003).
  63. Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature. 534 (7607), 347-351 (2016).
  64. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Self-assembly of single integral membrane proteins into soluble nanoscale phospholipid bilayers. Protein Sci. 12 (11), 2476-2481 (2003).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 121، تلطيخ السلبية، بروتين معقد، تيم، lipoxygenases، والتصور، غير تغيير طبيعة الكهربائي للهلام
طريقة لتصور وتحليل غشاء متبادلة البروتينات التي نقل المجهر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

B. Kumar, R., Zhu, L., Hebert, H.,… More

B. Kumar, R., Zhu, L., Hebert, H., Jegerschöld, C. Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (121), e55148, doi:10.3791/55148 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter