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Biochemistry

Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine ​​durch Transmissionselektronenmikroskopie

Published: March 5, 2017 doi: 10.3791/55148
Automatic Translation
1, 2, 1,2, 1,2
1Department of Biosciences and Nutrition, Karolinska Institutet, 2School of Technology and Health, KTH Royal Institute of Technology

Introduction

In der medizinischen Forschung wird viel Aufmerksamkeit auf Membranproteine ​​fokussiert, entweder intrinsisch oder extrinsisch, in einer Vielzahl von Lipid-Wechselwirkungen beteiligt. Arbeiten mit lipidinteragierenden Proteinen enthält entweder einen Ersatz zu den Lipiden der Auswahl wie Detergenzien, amphipols 1 oder kleinen Proteinen 2 oder eine Membran Ersatz zu finden , die das Protein löslich und aktiv hält. Lipoic Membran Ersatzstoffe sind Liposomen und Nanoscheiben (ND) , 3, 4.

Nanoscheiben sind nahezu native Membranplattformen durch Engineering der Proteinteil entwickelt, ApoA-1, der High-Density-Lipoprotein (HDL) natürlich im Blut auftreten. ApoA-1 ist ein 243-Rest-langen Kette von kurzen amphipathische α-Helices und hat eine lipidfreie lösliche Konformation. In vitro , wenn in Gegenwart von Lipiden, zwei Kopien des Proteins Apo A-1 spontan neu ordnen die hydr einzukreisenophobic Acylkette Teil eines Lipid - Doppelschicht - Patch 5. Ausgeführt Versionen von ApoA-1 sind in der Regel Membrangerüstproteine ​​(MSP) genannt, und eine wachsende Zahl sind als Plasmide oder als gereinigte Proteine ​​im Handel erhältlich. Wiederholungen oder Deletionen der α-Helices in ApoA-1 Ergebnis in mehr 6 oder kürzer 7 Membrangerüstproteine. Dies wiederum macht es möglich , Scheiben etwa 6 nm 7-17 nm 8 im Durchmesser zu bilden. Es gibt verschiedene Arten von Anwendungen für den Nanoscheiben 3, 9. Die am häufigsten verwendete Anwendung ist für die Stabilisierung eines integralen Membranproteins 8, überprüft zuvor 3, 9 eine nahezu native Membranumgebung. Ein weniger erforschten Einsatz ist eine nanoskalige Membranoberfläche für die Studie zur Verfügung zu stellenperiphere Membranproteine 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Abschnitt 1 des Protokolls visualisiert unter das Verfahren für die Herstellung von Nanoscheiben, bestehend aus Phospholipiden und Membrangerüstprotein.

Die Probenvorbereitung ist ein Engpass bei den meisten Methoden. Methodenspezifische Proben können bestimmte Informationen hinzufügen, aber sie auch Vergleiche der Ergebnisse schwierig. Daher ist es einfacher, wenn Proben multimodal und kann in verschiedenen Verfahren unmittelbar verwendet werden. Ein Vorteil bei der Verwendung von Nanoscheiben ist die geringe Größe der nanodisc im Vergleich zu Liposomen (zB können die Proben direkt verwendet werden für sowohl TEM und nicht-denaturierenden Gelelektrophorese, wie in dem vorliegenden Protokoll).

18. keine hochauflösende 3D-Struktur eines monotopen Membranprotein auf einer Liposomenmembran eingebettet hat sich jedoch noch nicht veröffentlicht worden ist, soweit wir wissen. Gold - Nanopartikel oder Antikörper können verwendet werden , um Proteine zu visualisieren , um Liposomen oder Vesikel Bindung TEM 19. Obwohl diese Sonden sehr spezifisch sind, könnten sie mit membranbindende Proteine ​​stören, indem die Membran-Bindungsstelle Verschleierung oder Bereiche von Interesse mit den flexiblen Teilen maskieren. Gold-markierte Antikörper oder komplexierten Proteine ​​könnten wahrscheinlich auf einem Agarosegel analysiert werden, aber dies würde die Kosten des Experimentes zu erhöhen.

Obwohl Liposomen eine hervorragende Plattform sind, kann man nicht, dass der Pop sicher sein,ulation hat ein bestimmtes Verhältnis Protein pro Liposom, eine Funktion , die 20 durch die Verwendung von Nanoscheiben untersucht werden kann. In einem Liposom, Cofaktoren und Substrate können in dem löslichen Innenraum eingefangen werden. Substanzen, die Membran-löslich sind das gleiche Schicksal für beide Arten von Membran-Mimetika teilen. Dennoch, wie die Doppelschicht-Bereich kleiner in Nanoscheiben ist, wird eine geringere Menge an Substanz erforderlich, um die Membranen nanodisc zu sättigen.

Verständnis der Proteinfunktion durch die Bestimmung der Atomstruktur seit vielen Forschungsgebieten wesentlich gewesen. Verfahren zur Proteinstrukturbestimmung umfassen Röntgen 21; Kernspinresonanz (NMR) 22, 23; und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) 24 bei kryogenen Temperaturen, Kryo - EM. Die Auflösung von Kryo-EM hat in letzter Zeit stark verbessert, vor allem durch den Einsatz von direkten Elektronen detektoren 25, 26. Die Makromoleküle werden in dünnen, glasigen Eis 27 in einer nahezu nativen Zustand abgebildet. Jedoch aufgrund der geringen Kontrast von biologischen Molekülen, werden sie hart im Größenbereich von 100 zu erfassen - 200 kDa. Für geeignet bemessene Proben kann die Datenerfassung aus , und das Verfahren der einzelnen Partikels Rekonstruktion werden kann , eine Struktur zu erhalten , 28 angewendet werden.

Jedoch ist die Bestimmung der Proteinstruktur durch TEM ein mehrstufiger Prozess. Es beginnt in der Regel mit der Auswertung der Probe Monodispersität durch negative Flecken TEM 29 Salze von Schwermetallen wie phosphotungsten (PT) 30 oder Uran 31 verwendet wird . Rekonstruktion eines niedrigauflösenden Modell der negativ gefärbten Makromolekül ist in der Regel gemacht und kann wichtige Informationen über die molekulare Struktur 29 erhalten wird . Parallel zu,Datenerfassung mit Kryo-EM starten kann. Es sollte darauf geachtet werden, wenn die negative stain TEM Daten Auswertung der Fehlinterpretation von Artefaktbildung zu vermeiden. Ein besonderes Artefakt ist die Wirkung des PT Fleck auf Phospholipide und Liposomen 32, was zur Bildung von langen Stangen ähnlich Stapeln von Münzen von der Seite 33. Solche "Rouleau" oder "Stapel" (im Folgenden als "Stapel" bezeichnet) wurden für die HDL 34, früh beobachtet und später auch für die 35 - Nanoscheiben.

Die Stapelung und Überarbeitung von Membranen können aus vielen Gründen auftreten. Beispielsweise kann es durch Co-Faktoren wie Kupfer induziert werden, durch TEM - Bildgebung in einem Fleck Ammoniummolybdat 36 gezeigt. Eine Fraktion der Membranlipide in Liposome enthielten eine Iminodiessigsäure Kopfgruppe Metall Komplexierung durch EDTA nachahmt, wodurch Liposomen nach Zugabe von Kupferionen Stapeln 37. Die Stapelbildung von Phospholipiden von PT wurde schon früh beobachtet; jedoch hat später Arbeit konzentrierte sich auf die Beseitigung oder die Abschaffung dieses Artefaktbildung 38.

Hier schlagen wir eine Methode Vorteil der NAPT-induzierten nanodisc zu nehmen für die Untersuchung von membranbindenden Proteinen, die durch TEM Stapeln. Kurz gesagt, Protein auf der Nanoscheiben Bindung würde die Nanoscheiben aus Stapeln verhindern. Obwohl die Gründe für die Stapelung nicht klar sind, wurde es 39 vorgeschlagen , dass zwischen den Phospholipiden und der Phosphorylgruppe von PT, wodurch die Scheiben zu kleben aneinander (1A) eine elektrostatische Wechselwirkung ist. Die Hypothese hinter unserem Protokoll ist, dass, wenn ein Protein an ein nanodisc bindet, die meisten der Phospholipid-Oberfläche nicht Availa ist Ble für die Interaktion mit dem PT aufgrund der sterischen Hinderung durch das Protein. Dies würde verhindern , dass der Stapelbildung (1B). Zwei Schlussfolgerungen gezogen werden können. Erstens bedeutet die Verhinderung der Stapelung, dass das Protein von Interesse an die Membran gebunden ist. Zweitens kann das Protein-ND - Komplex mit Standard - Einzelpartikelverarbeitungsverfahren 24, 40 eine grobe Morphologie des Komplexes zu erhalten behandelt werden. Darüber hinaus können Analysen durch Methoden wie nicht denaturierenden Gelelektrophorese oder dynamische Lichtstreuung durchgeführt werden.

Um diese Hypothese zu belegen, haben wir die Membran-bindende Protein 5-Lipoxygenase (5LO), die 41 in vielen Entzündungskrankheiten beteiligt ist, 42. Dieses 78-kDa - Protein erfordert Ionen Calcium zu seiner Membran 43 zu binden. Obwohl diese Membranassoziation ausgiebig unter Verwendung von Liposomen untersucht wurdes = "Xref"> 44, 45, 46 und Membranfraktionen 47, können diese nicht für die TEM - Analyse und Strukturbestimmung verwendet werden.

Die Herstellung von Nanoscheiben beginnt mit MSP mit Lipid in dem Detergens Natriumcholat resuspendiert Mischen. Nach der Inkubation auf Eis für 1 h wird das Detergens aus der Rekonstitution Mischung unter Verwendung eines adsorbierenden Harzes langsam entfernt. Diese Art von Material wird häufig von Polystyrol in kleine Kügelchen geformt gemacht. Sie sind relativ hydrophob und haben eine starke Präferenz für Waschmittel - Bindung im Vergleich zu Lipiden 48. Nachdem die hydrophoben Kügelchen zu entfernen und die Durchführung Klärung Zentrifugation werden die Nanoscheiben durch Grßenausschlußchromatographie (SEC) gereinigt. Die gereinigten Nanoscheiben sind mit einem monotopen Membranprotein gemischt (und ggf. Co-Faktoren) in einem äquimolaren Verhältnis (oder mehrerer Verhältnisse für eine Titration) und an r linksEACT (15 min). Die Analyse mittels TEM wird durch Anlegen ul-Probenmengen auf glow-entladen, mit Kohlenstoff beschichteten Gitter und dann, indem eine negative Färbung mit NAPT durchgeführt. Die gleiche Probe aus, wenn die Aliquots auf die TEM Gitter aufgetragen wurden, können für die Analyse durch nicht-denaturierende PAGE oder SDS-Gelelektrophorese sowie durch verschiedene Arten von Aktivitätsmessungen verwendet werden, wobei keine wesentlichen Änderungen.

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Protocol

1. Herstellung von Nanoscheiben

  1. Expression und Reinigung des Membrangerüstprotein 8, 35
    1. Express das His-Tag MSP1E3D1 in den E. coli BL21 (DE3) T1R pRARE2 Stamm in Flaschen. Bereiten Sie eine 50-ml-Übernachtstarterkultur mit LB-Medium, ergänzt mit 50 ug / ml Kanamycin bei 37 ° C. Verdünnen Sie die über Nacht Starterkultur in 2 l Terrific Broth-Medium mit 50 ug / ml Kanamycin.
    2. Wachsen die Zellen bei 37 ° C , bis die optische Dichte bei 600 nm (OD 600) erreicht ca. 3 die Proteinexpression bei 18 ° C Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) für 3 h mit 0,5 mM Induce.
    3. Vorbereitung der Lysepuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 100 mM NaCl und 10% Glycerol). 1 mM TCEP unmittelbar vor der Verwendung.
    4. Nach 3 h Induktion bei 18 ° C, Ernte der Zellen durch Zentrifugation für 10 min bei 4500 xgund 4 ° C. Überstand verwerfen, wiegen die geernteten Zellen und resuspendieren sie in Lyse-Puffer bei einem Verhältnis von 2 ml Lysepuffer pro g Zellen.
    5. Lyse der Zellen durch gepulste Beschallung (Wiederholungsrate: 4 s ON, 4 s AUS) für 3 min bei 80% Amplitude.
    6. Zentrifugation der Lysate 20 min bei 49.000 xg und 4 ° C. Entsorgen Sie das Pellet aus dieser Zentrifugation.
    7. Injizieren Sie den Überstand in einen 5-ml - Ni + chelatbildende Säule zu einem automatisierten Flüssigkeits - Chromatographie - System angeschlossen vorzugsweise bei 4 ° C gehalten.
    8. Vor dem Elutionsschritt (Schritt 1.1.9), Waschen der Säule mit Puffer 1-3, um alle Proteine ​​zu entfernen, außer dem His-Tag MSP. Überwachen Sie den Proteingehalt bei 280 nm den Reinigungsprozess zu folgen; die UV-Aufzeichnung bei 280 nm sollte nach jeder Wäsche auf den Ausgangswert zurück.
      1. Waschen mit Waschpuffer 1: 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol und 1% Triton, pH 8,0.
      2. Waschen mit Waschpuffer 2: 40 mM Tris-HCl, 300 mMNaCl, 20 mM Imidazol und 50 mM Natriumcholat, pH 8,0.
      3. Waschen mit Waschpuffer 3: 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl und 50 mM Imidazol, pH 8,0.
    9. Eluieren die MSP mit 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl und 500 mM Imidazol, pH 8,0.
    10. Ändern des Pufferstandardpuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM NaCl und 0,5 mM EDTA) MSP durch Gelfiltration 8, 35; die Ausbeute pro Charge sollte um 7 mg L -1.
  2. Herstellung von Phospholipid-Stammlösung
    1. Hinzufügen 305 & mgr; l von 1-Palmitoyl-2-oleoyl- sn - glycero-3-phosphocholin (POPC) , gelöst in Chloroform bei einer Konzentration von 25 mg / mL in einem Becherglas und verdampfe das Chloroform indem sie mit einem leichten Stickstoffstrom gespült . Trocknen Sie das Lipid über Nacht in einem Vakuumexsikkator. HINWEIS: Dieser Schritt wird durchgeführt, um das Lösungsmittel aus dem Lipid zu entfernen, die sich am Boden des Becherglases eine dünne Lipidfilm verläßt.
    2. Resuspendieren Lipidkuchen in 200 ul MSP Standardpuffer, enthaltend 100 mM Natriumcholat durch Vortexen das Rohr, bis die Lösung transparent wird; Dies wird eine Lösung mit einer Konzentration von POPC 50 mM bereitzustellen.
      HINWEIS: In der Regel sollte das molare Verhältnis von Lipid zu Detergens an dieser Stelle 1: 2 (Lipid: Detergens) 8. Diese Lipid-Detergens-Mischung kann für fast 2 Monate bei -80 ° C gelagert werden.
  3. Herstellung von hydrophoben Perlen für Waschmittel Entfernung
    1. Platz 5 g Perlen (Trockengewicht) in einem 50-ml-Röhrchen.
    2. Waschen der Kügelchen mit 30 ml 100% igem Methanol und dann mit 40 ml Reinstwasser.
    3. Waschen Sie die Perlen mit 10 ml MSP Standardpuffer. Schließlich speichern Sie die Perlen mit 15 ml MSP Standardpuffer bei 4 ° C.
  4. Nanodisc Rekonstitution
    1. Dispense 190 & mgr; l MSP1E3D1 (0,124 mM) in ein Mikrozentrifugenröhrchen und fügen 61,5 ul von Phospholipid-Stammlösung (50 mM POPC) auf das gleiche Rohr. Inkubieren Sie die Rekonstitution Mischung auf nassem Eis für 1 Stunde. ANMERKUNG: Dies entspricht einem molaren Verhältnis von 1: 130 (MSP1E3D1: POPC).
    2. In hydrophobe Kügelchen in einer Konzentration von 0,5 g Kügelchen pro ml Rekonstitution Mischung die Selbstorganisationsprozess zu initiieren. Inkubieren in einem Rotations Inkubator für 16 h bei 4 ° C.
    3. Nach der Inkubation Zentrifuge für 10 min bei 13.000 xg und 4 ° C, um die Ausfällungen und Aggregate zu entfernen. Entsorgen Sie das Pellet und der Überstand speichern.
    4. Äquilibrieren der Grßenausschluß-Chromatographie-Säule (montiert auf einem automatisierten Flüssigkeits-Chromatographie-System) mit Puffer MSP-Standard, bis die Absorption bei 280 nm stabil ist. Injizieren Sie den Überstand in die Kolonne und sammeln Sie die Peakfraktionen.
    5. Messung der Konzentrationen von Nanoscheiben in den Peak-Fraktionen bei 280 nm. Verwenden des molaren Extinktionskoeffizienten von MSP1E3D1 (ε = 29.910 cm -1 M -1) für die Berechnung der Konzentration nanodisc. Beachten Sie dasAnzahl von Lipiden pro nanodisc kann allein durch eine Kombination von radiomarkiertem Lipiden und Phosphatanalyse 4 oder durch Phosphat - Analyse gemessen werden.

2. Herstellung des monotopen Protein 5-Lipoxygenase 35

  1. Bereiten Sie eine Nacht Starterkultur. Supplement 50 ml LB-Medium mit 100 ug / ml Ampicillin. Beimpfen des Mediums mit E. coli BL21 (DE3) , der das Plasmid des 5-Lipoxygenase - Gens (ALOX5) enthält. Verdünne die über Nacht Starterkultur in Expressionsmedium , enthaltend 42 mM Na 2 HPO 4, 24 mM KH 2 PO 4, 9 mM NaCl, 19 mM NH 4 Cl, 1 mM MgSO 4, 0,1 mM CaCl 2, 0,2% D-Glucose, 0,1 %, 5 & mgr; M FeSO 4 und 100 & mgr; g / ml Ampicillin. Die Zellen wachsen , bis die OD 600 ~ 0,5 bei 25 ° C. Induzieren Proteinexpression mit 0,2 mM IPTG für 16 h bei 20 ° C 35.
  2. Ernte durch Zentrifugation für 10 min bei 7000 × g und 4 ° C und den Überstand verwerfen. Wiegen Sie das Pellet am Boden des Röhrchens enthält die geernteten Zellen und Resuspendieren der geernteten Zellen in Lysepuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 100 mM NaCl; 10% Glycerin und 1 mM TCEP), enthaltend Proteaseinhibitor und 0,5 mg / ml Lysozym 35 in einem Verhältnis von 2 ml Lysepuffer pro g Zellen.
  3. Lyse der Zellen durch Beschallung für 5 x 15 s bei 80% Amplitude. Entfernen der Zelldebris durch Zentrifugation für 10 min bei 7000 xg und 4 ° C. Führen Ammoniumsulfatfällung bis 30 - 60% Sättigung 35 , die Proteine in der Lösung auszufällen. Zentrifuge für 15 min bei 16.000 xg und 4 ° C. HINWEIS: Die 5LO Pellet schnell eingefroren und bei -80 ° C gelagert werden kann für bis zu 6 Monate.
  4. Das Pellet mit 20 ml Lyse-Puffer und zentrifugieren für 15 min bei 40.000 xg und 4 ° C.
  5. Inkubieren der Überstand auf eine ATP-Agarose-Säule bei 4 ° C für 30 min. Die Säule wird einmal mit einem Säulenvolumen Lysepuffer enthaltend 0,5 M NaCl. Eluieren die 5LO mit 20 mM ATP in Lysepuffer , enthaltend 10 & mgr; M FeSO 4 und 20 ug / ml Katalase. Führen Gelfiltrationschromatographie , um das ATP 35 entfernen.
    HINWEIS: Die 5LO instabil ist und sollte sofort nach der Reinigung verwendet werden. Ansonsten empfiehlt es sich bei dem Schritt des Ammoniumsulphatfällung zu stoppen (siehe Hinweis nach Schritt 2.1.3).

3. Herstellung der Nanodisc-Protein-Komplex

  1. Bereiten Sie ein Gesamtvolumen von 100 & mgr; l-Komplex. Mischungs 0,8 uM ND und 0,8 uM 5LO mit der 1 mM Ca 2+ in dem MSP Standardpuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM NaCl; 0,5 mM EDTA und 1,5 mM CaCl 2) und Inkubation für 10 min auf Eis. ANMERKUNG: Die Probe kann für bis zu einem Monat bei 4 ° C 35 gespeichert werden.
ove_title "> 4. Die Analyse der Proben

  1. Die Gel-Elektrophorese
    1. Nicht-denaturierenden Elektrophorese
      1. Mischungs 15 & mgr; l der Probe mit 5 & mgr; l Ladepuffer (50 mM BisTris, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w / v) Glycerin und 0,001% Ponceau S, pH 7,2) 49 und laden sie auf ein 4 - 16% bis-Tris-Gel-Elektrophorese durchzuführen.
      2. Füllen der Kathodentank mit Lichtkathodenpuffer (50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricin, pH 6,8, und 0,002% Coomassie G-250) und die Anodentank mit Laufpuffer (50 mM Bis-Tris und 50 mM Tricin, pH 6,8). Starten Sie die Trennung durch eine konstante Spannung bei 150 V unter Verwendung von
      3. Stoppen Sie die elektrophoretische Trennung, wenn die Coomassie Front das Ende des Gels erreicht.
      4. Stain das Gel mit einem Standard-Coomassie-Blau-Protokoll.
    2. denaturierende Elektrophorese
      1. Mischungs 40 & mgr; l der Probe mit 10 & mgr; l Beladungspuffer, enthaltend SDS (0,05% (w / v) Bromphenolblau, 0,2 M Tris-HCl,pH 6,8; 20% (v / v) Glycerin; 10% (w / v) SDS; und 10 mM 2-Mercaptoethanol) und laden Sie es auf einem 4 - 20% Tris Glycin-Gelelektrophorese durchzuführen.
      2. Füllt die Kathoden- und Anodentanks mit Laufpuffer (25 mM Tris-HCl, pH 6,8; 200 mM Glycin und 0,1% (w / v) SDS). Starten Sie die Trennung durch eine konstante Spannung bei 150 V unter Verwendung von
      3. Stoppen Sie die elektrophoretische Trennung, wenn der Ladefarbstofffront das Ende des Gels erreicht.
      4. Stain das Gel mit einem Standard-Coomassie-Blau-Protokoll.
  2. Vorbereitung der NAPT-Lösung
    1. Man löst 1 g Phosphorwolframat Natriumsalz in 50 ml Wasser durch Rühren bei Raumtemperatur eine 2% ige (w / v) saure Lösung zu ergeben.
    2. Den pH-Wert auf 7,4 mit 1 M NaOH. Entfernen der Teilchen mit einer 0,22 um-Spritzenfilter. Bewahren Sie die Lösung bei Raumtemperatur oder bei 4 ° C.
  3. Vorbereitung der Probe für die TEM-Analyse
    1. Glimmentladungsspektrometer Kohlenstoff beschichteten Kupfergitter (400 mesh) für 20 s bei 30 mA die Gitter hydrophilen vor der Adsorption der Probe zu machen. Place 3,5 & mgr; l der Probe (0,8 & mgr; M in Bezug auf die Nanoscheiben) auf dem Gitter und inkubiere für 30 s. HINWEIS: Das Volumen angewendet kann zwischen 2,5 und 5 & mgr; l variieren, in Abhängigkeit von der Probenkonzentration. Ein geeigneter Konzentrationsbereich für Nanoscheiben ist 0,5-1 uM.
    2. Abtupfen überschüssige Lösung Filterpapier.
    3. Unmittelbar färben das Gitter mit einem Rückgang von 2% NAPT für 30 s. Abtupfen überschüssige Lösung und lassen Sie das Gitter an der Luft trocknen.
    4. Bewerten Sie die Gitter durch TEM. Ein Mikroskop mit 120-200 keV Beschleunigungsspannung ausreicht, um das Ausmaß der Stapelung zu schätzen. HINWEIS: Für das vorliegende Protokoll wird ein kalibrierter Transmissions-Elektronenmikroskop verwendet wurde, ausgerüstet mit einem 200 keV Feldemissionsquelle.
    5. Notieren Sie sich die TEM-Aufnahmen. Für die Bilder lange Stapel zeigt, verarbeiten nicht weiter; Bilder zeigen den Komplex von Nanoscheiben, mit extrinsischen Protein, das ein paar enthaltenShort-Stacks, aber die meisten Teilchen sind in der Anlage. Nehmen Sie mehrere Bilder und verarbeiten diese nach Standardmethoden Klasse-Mittelwerte und eine niedrige Auflösung, 3-dimensionale Modell des Komplexes zu erhalten.
      HINWEIS: Für die Sammlung von negativen Fleckdaten, Gitter an mindestens drei verschiedenen Tagen hergestellt wurden. Für jeden Tag, frische Probe Inkubationen (wie in Schritt 3.1) gemacht wurden, bevor die Negativfärbung angewendet wurde.

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Representative Results

Die Methode, die wir vorschlagen, ist abhängig von der Herstellung von Nanoscheiben Bindung der Membranoberfläche für monotopen Membran-Protein bereitzustellen. Da es keine Transmembranprotein in die Lipid - Doppelschicht nanodisc eingebettet ist, werden die Nanoscheiben hier als "leere Nanoscheiben" (2A) bezeichnet. Diese weisen ein berechnetes Molekulargewicht von 256 kDa für eine Zusammensetzung von zwei MSP1E3D1 Gerüstproteine und etwa 260 Moleküle von POPC 8. Unter Verwendung dieses Protein: Lipid - Verhältnis für die Rekonstitution wurde ein Hauptpeak (2A) während der Gelfiltration eluiert. Die Peakfraktionen etwa 9 ml (2A) wurden 49 durch blaue native Gelelektrophorese untersucht, ein Band (2B, Spur 1) zeigt. Obwohl das Band auf eine Größe etwas größer als der berechnete 256 kDa entspricht, entspricht die nanodisc Durchmesser in den TEM-Bildern gemessen an dererwartete 13 nm 0,5 nm ±.

Die monotopen membrane protein 5-Lipoxygenase (5LO) wurde oben (Protocol Schritt 2) , wie beschrieben , gereinigt und in detaillierter zuvor 35. Die Homogenität des 78-kDa 5LO wurde durch SDS - PAGE - Elektrophorese (2C, Spur 1) und war voll funktions 35 (nicht gezeigt) analysiert.

In diesem Protokoll werden die Bedingungen absichtlich geschaffen, die die Stapelung der Nanoscheiben fördern. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass diese Stapelung nur in den für die TEM-Bildgebung aus Proben induziert wird (sog Proben), und zwar durch die Zugabe des Negativfärbung Natriumphosphowolframat als letzter Schritt nach allen anderen Behandlungen und Hinzufügungen gemacht worden. In der Tat zeigen die Bilder der NAPT-gefärbten Nanoscheiben die erwartete Stapel (3A) sehr früh für HDL 34 5, 50. Die "langen Stapel von der Seite betrachtet Münzen" (3A) sind die Nanoscheiben mit Phosphowolframat zwischen den Doppelschichten interkaliert aggregiert, wie schematisch in Figur 1A und vorgeschlagen von Zhang et al. 32, 39.

Es ist wichtig, ob verschiedene Ergänzungen in den Puffern zu überprüfen, beeinflussen, zu verhindern oder sogar Stapel induzieren, und wie weiter unten deutlich wird, die Auswirkungen von Calciumionen erforderlich Untersuchung. In 3B ist die Stapelung noch vorhanden in einer Probe , wobei Calciumionen zu der Lösung gegeben nanodisc wurden , bevor sie mit NAPT Anfärbung.

Der wesentliche Schritt in dem Protokoll ist in Abbildung 4, wobei die Membran-bin gezeigtding-Protein ist in den Lösungen vorhanden. Die Stapelung kann nicht durch die NAPT stain induziert werden , wenn 5LO zur Membranoberfläche der Nanoscheiben (4A) gebunden war. Für diese Probe wurde das Molverhältnis von 5LO zu Nanoscheiben 1: 1, wie schematisch in Figur 1 (1B, unten rechts) gezeigt. Außerdem ist , wie die Lipiddoppelschicht der Nanoscheiben von beiden Seiten zugänglich ist, im Gegensatz zu Liposomen, Proben mit einem Verhältnis von zwei 5LO einem nanodisc hergestellt, während die TEM - Aufnahmen zeigen noch weniger Stapelung (4B).

Für die Bindung einige extrinsischen Membranproteine könnte auf der Anwesenheit eines spezifischen Lipid abhängen , in der Membran, wie phosphoinositols 10, 11, 12 oder 10 Phosphatidylserin. Im Falle von 5LO, ist die Anwesenheit von Ca 2+ erforwendigen 43. In 4A und B wurden Calciumionen in den Lösungen mit Nanoscheiben und 5LO. Mit anderen Worten, zeigt der Mangel nicht nur der Stapelung , dass das Protein auch monotopen gebunden hat , daß aber die Bindungs ist abhängig von Ca 2+ -Ionen. Um dies zu zeigen, wurde eine Lösung Nanoscheiben und 5LO aber ohne Calcium enthält , wurde durch TEM (4C) mit NAPT und bebildert gefärbt. Wie erwartet, kann 5LO an die Nanoscheiben ohne Ca 2+ binden nicht, die 5LO frei in der Lösung verlassen, so stapeln sich die Nanoscheiben statt (4C).

Abbildung 1
Abbildung 1. Prinzip der Nanodisc Stacking und Überblick über die Methode. A. Prinzip der nanodisc Stapeln. Die Zugabe der Negativfärbung Natriumphosphowolframat zu einer Lösung von Nanoscheiben (links) führt zu th e Stapelung der Nanoscheiben (rechts) durch elektrostatische Kräfte (Mitte, Pfeile) zwischen der Phospholipid-Doppelschicht und der PT-Moleküle (Mitte, schwarze Punkte). B. Schematische Darstellung des Protokolls. Leere Nanoscheiben (links) binden an einer extrinsischen Membranprotein (grau) einen Komplex zu bilden, aus vier verschiedenen Winkeln (unten Mitte) dargestellt. Die Anwesenheit des Proteins verhindert monotopen sterisch die Nanoscheiben aus Stapeln, wenn sie mit dem Phosphorwolframat-Salz (unten rechts), im Gegensatz zu der Stapelung induziert in Abwesenheit jeglicher großer Objekte (rechts oben) gefärbt. Die grün- und orangefarbene Ringe repräsentieren die beiden MSP Umhüllung um den Phospholipid-Kern, der in hellbraun dargestellt wird. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2. Homogenitätsanalyse von Nanoscheiben und 5LO. A. Grßenausschlußchromatographie rekonstituierter leer Nanoscheiben. Die Elution der Peaks bei Nanoscheiben 9 mL. B. nicht-denaturierenden Gel - elektrophoretische Analyse der Peakfraktion aus der SEC in (A) gezeigt ist . Spur M enthält den Marker. Eine einzelne Bande ist in Spur 1, wobei der Peakfraktion in 9 mL geladen wurde. C. denaturierende Gelelektrophorese - Analyse von gereinigtem 5LO. Die 78 kDa 5LO zeigt als eine intensive Bande in Spur 1. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Stapel Bildung von Nanoscheiben in Abwesenheit von Protein durch TEM analysiert. A. Nanodisc Stapel induziert wHenne gefärbt mit NAPT. Die "Stapel von Münzen" sind die Stapel von Nanoscheiben, wenn sie von der Seite betrachtet. Jede nanodisc erscheint als ein weißes Band. B. Stacking wurde durch die Anwesenheit von Calciumionen in der Lösung nanodisc nicht gestört , wenn sie mit NAPT gefärbt. Die Maßstabsbalken sind 100 nm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Verhindern Stapel Formation durch die Bindung von Protein in Gegenwart eines Cofaktors durch TEM analysiert. A. und B. Calcium - Ionen wurden in Mischungen von 5LO und Nanoscheiben bei Molverhältnissen von 1: 1 (A) oder 2: 1 (B). Je mehr 5LO den Nanoscheiben Bindung sind die weniger Nanoscheiben zum Stapeln, wie in (B) gezeigt. Die Einzelpartikel-Komplexe in both (A) und (B) sind für die Weiterverarbeitung 35 geeignet. C. In Abwesenheit von Calciumionen, 5LO nicht binden. NAPT-Färbung dieser Probe zeigt typische Stapelung von Nanoscheiben, ungebunden die 5LO verlassen. Die Maßstabsbalken sind 100 nm. Die Bilder wurden durch eine 4K x 4K CCD-Kamera bei einer Vergrößerung von 69,500x erworben. Die Pixelgröße der CCD-Kamera 15 um, die auf der Probenpegel für die EM-Bilder einen entsprechenden Wert von 2,16 Å ergibt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Das Verfahren kann in drei Teile unterteilt werden: die Rekonstitution von leeren Nanoscheiben, die Herstellung von Protein-nanodisc Komplexe und die negative Färbung für die TEM dieser Komplexe. Jeder Teil wird separat in Bezug auf Beschränkungen der Technik, wichtige Schritte, und nützliche Änderungen gerichtet.

Die Rekonstitution von leeren Nanoscheiben. Kritische Schritte und Einschränkungen in der Herstellung und Verwendung von Nanoscheiben.

Für die Herstellung der leeren Nanoscheiben, ist es wesentlich, den MSP-zu-Lipid-Verhältnis zu optimieren. Für die am häufigsten MSP und Lipiden (mit Cholat als Waschmittel), Vorschläge für die optimalen Verhältnisse in der Literatur (zB 125-130 POPC pro MSP1E3D1 8, 51 verwendet , die in der vorliegenden Protokoll) zu finden. Unterschiede erhaltenen Vergleich zu den veröffentlichten Verhältnisse können für die Proteinkonzentrationsbestimmung von dem Verfahren ab, die Effizienz der lIPID Solvatisierung in dem Detergens und das Verfahren zur Entfernung des Detergens aus der Lösung.

Wir schlagen vor, Waschmittel Entfernung mit hydrophoben Perlen 48 (Schritt 1.3), während mögliche Alternativen sind Dialyse oder die Zugabe von Cyclodextrin 52, 53 durchführen. Zunächst wurde der Dialyse für die Rekonstitution von HDL verwendet , um 5, 34 und 54 immer noch bevorzugt. Unabhängig von dem Verfahren zur Entfernung des Detergens, ist die Geschwindigkeit wesentlich. Wenn die Entfernung zu schnell ist (das Volumen des hydrophoben Kügelchen zu groß ist), die spontane Umlagerung von MSP mit den Lipiden haben keine Zeit auftreten. Stattdessen kann große Mengen an Liposomen und Protein-Aggregate bilden. Die Ergebnisse von Grßenausschlußchromatographie würde zeigen, große Mengen an Liposomen in dem Hohlraumvolumen, ein suboptimales Spitze rekonstituierter Nanoscheiben, und eine größere Spitze ungenutzter4 MSP, 6, 51. Für zu kleinen Volumen von hydrophoben Perlen kann die Detergensentfernung unvollständig sein, und die Nanoscheiben, die in Größen eine Variation bilden, wobei die meisten sind kleiner als erwartet aufweisen kann. Man könnte prüfen, zwei Zugaben von kleineren Mengen an hydrophoben Perlen statt einer großen zusätzlich die Geschwindigkeit der Rekonstitution zu verlangsamen.

Die Auswahl von Lipiden sollte sorgfältig betrachtet werden 8, 9, 45, 46, 55, je nach dem Zweck , für den nanodisc Zubereitung. Im Allgemeinen für alle Methoden bei der Bildung von Membranen (Rekonstitution von Nanoscheiben oder Liposomen als auch für 2D Kristallisationsexperimenten) gerichtet sind die Lipide in einem "Fluid" 56 - Zustand sein. Unterhalb einer bestimmten Temperatur, the Lipid ist starr. Oberhalb dieser sogenannten Übergangstemperatur (Tm) ist die Lipidflüssigkeit. Beachten Sie, dass einige häufig verwendete gesättigte Lipide eine Tm deutlich über Raumtemperatur haben. Weiterhin für die Lipid - Gemischen ist die Mischbarkeit von Lipiden Muse 57 betrachtet. Die optimale Temperatur für Nanodisc Bildung ist um den Phasenübergang (Tm) des Lipids.

Das Waschmittel im vorliegenden Protokoll ist Natriumcholat 8. Wenn ein anderes Reinigungsmittel verwendet werden, wie die die gleichen Konzentrationen für Cholat verwendet nicht direkt verwendet werden können. Bestimmte milden Reinigungsmitteln auflösen Lipiden weniger effizient, und eine höhere Konzentration erforderlich sein kann. Die Lipidkuchen nach der Verdampfung des Chloroforms (Schritt 1.2.2 im protocol) erhalten muss durch das Detergens in eine klare Lösung aufgelöst werden. Vortexen, Gefrier-Auftau-Zyklen, Ultraschallbäder, oder Beschallung verwendet werden könnten, um die Auflösung zu beschleunigen.

Für combinatIonen von Lipid (-mischungen), MSP und Detergenzien andere als die hier verwendet wird , Titrationen große Aggregate und Liposomen oder überschüssige MSP sind notwendig 4, 6, 51, 58 zu minimieren. Für einige Kombinationen von MSP und Phospholipiden, kann die Optimierung schwieriger sein als für andere 4, 6, 51, und es wird wichtig , den Gehalt der Peakfraktionen zu bestimmen. Die genaue Methode für die Analyse von nanodisc Zusammensetzung und Größe ist , die Anzahl von Phospholipiden pro MSP durch Phosphat - Analyse 4 und berechnen die nanodisc Molekulargewicht zu bestimmen. Nanodisc Größe kann durch gut aufgelöste, nicht-denaturierende Gelelektrophorese abgeschätzt werden; dynamische Lichtstreuung (DLS) 59; oder Negativ-Fleck TEM, um nur ein paar Methoden. Wie für den negative-stain-induzierter Stapelprotokoll hier vorgestellte, die Messung der Breite der Stapel in den TEM-Bildern, den Durchmesser der Nanoscheiben ergibt.

Wie für die Expression und Reinigung des Membrangerüstprotein, alle üblichen Vorsichtsmaßnahmen und Sorgen für ein lösliches Protein sollte genommen werden. Die Plasmide verfügbar sind, können verschiedene Tags und Proteaseschnittstellen für den Fall enthalten die Tag muss vor der Verwendung des MSP entfernt werden.

5LO, das monotopen Protein in das verwendete Protokoll, inaktiviert schnell ohne besondere Vorsichtsmaßnahmen, die darin an anderer Stelle 35 und in den Referenzen beschrieben. Kurz gesagt, ist das katalytische Eisen leicht verloren und oxidierenden Bedingungen Dimerisierung des 5LO verursachen. Wie in der Anmerkung (Protokollschritt 2.1.3) angegeben ist, kann die Reinigung nach dem Fällungsschritt und Aliquots, bis eine spätere Verwendung gespeichert gestoppt werden. Nach der Reinigung eines Aliquots, muss das Protein in wenigen Stunden d verwendet werden, ue auf die rasche Inaktivierung 35.

Kritischsten Schritte in der Herstellung der Protein-Komplexe nanodisc.

Die Größe des monotopen Protein gegenüber dem nanodisc Bereich von Bedeutung. Die Länge der MSP1E3D1 Proteinkette entspricht einem nanodisc mit einem 10,5-nm Innendurchmesser und etwa 8.900-Å 2 bilayer Bereich 8. Dies entspricht gut dem Bereich für die Membran eingebetteten Teil 5LO berichtet 45. Somit war das erwartete Bindungsverhältnis 1: 1, oder höchstens 2: 1 5LO pro nanodisc. Dies erwies sich als richtig, als 35 in einem Titrationsexperiment berichtet. Jedoch wurde die maximale Bindung von zwei 5LO pro nanodisc nicht erhalten, wie an anderer Stelle 35 diskutiert. Eine etwas größere nanodisc könnte möglicherweise erlauben eine vollständige 2: 1 für Experimente Bindung, wo dies erwünscht ist, aber in diesem Fall ist das Verhältnis 1: 1 ist das Hauptziel.

ove_content "> Die Wahl der optimalen Lipide für Protein-nanodisc Komplexbildung durch Vorwissen unterstützt werden kann. Dies war der Fall in der vorliegenden Protokoll, wobei die Auswahl der Lipid synthetischen POPC 35 war. Beide Varianten in der Lipidkopfgruppe 46 und Variationen in der Sättigung der Acylketten 45 wurden in Liposomen 5LO Bindungsstudien getestet. 5LO - Aktivität durch Bindung an Liposomen , die Cholin - Phospholipide in der sn-2 Acylkette Position 45, ungesättigt erhöht wurde 46. Wenn bestimmte Lipid Anforderungen nicht bekannt sind, aber die Identität der ursprünglichen Membran ist bekannt, natürliche Lipidextrakte ersten 55 getestet werden konnten.

Ein Cofaktor Abhängigkeit wurde für 5LO bekannt, die für 2+ -Ionen auf Ca ab 43 Membranbindung. Es ist eine Herausforderung, um vollständig Kalzium aus Lösungen entfernen. Hier ist der Komplexbildner EDTA in den Puffern in Mengen eingestellt , um eine kontrollierte Menge an freien Ca 2+ -Ionen zu verlassen. Berechnungen der freien und gebundenen Moleküle in den Puffern wurden von der BAD 60 Software für Puffer , die mehr als eine Art von Komplexbildners 35 hergestellt. Die Wirkung auf die Konzentration eines Cofaktor teilweise löslich in der Membran ist nicht von dieser Software berücksichtigt.

Kritische Schritte in die negative Färbung von Nanoscheiben Stapelbildung zu fördern.

Für das Protokoll auf der Hand, wo die maximale Stapel gewünscht wird, sollte der Fleck das Natriumsalz der phosphotungsten sein. Verschiedene Salze von Wolfram zur Verfügung stehen, und wir beobachteten, daß Phosphowolframsäure war weniger effizient bei der Stapelung (nicht gezeigt). Aus bisher ungeklärten Gründen scheint es, dass hohe Mengen an Natrium während PT-Färbung Stapel fördert. Auch für den Probenpuffer wurde gezeigt, dass je niedriger die Natrium-conthno, desto geringer ist die Menge der induzierten 32 zu stapeln. Aus dem gleichen Grund, nachdem die Probe auf dem Gitter EM angewendet wurde, Waschen mit Wasser vor der Färbung sollte nicht durchgeführt werden, wie dies auch Stapelung reduziert. Auf der anderen Seite wurde eine gewisse Stapel immer induziert, wenn auch nicht in dem Maße für die beste Leistung des Protokolls benötigt.

Natürlich Kofaktoren wie die Ca 2+ -Ionen hier muss für Interferenzen mit dem negativen Fleck oder mit den Nanoscheiben überprüft werden. Für das vorliegende Protokoll wäre Calciumionen einen Phosphatpuffer gefällt, so wurde ein Tris-Puffer verwendet. Die Nanoscheiben wurden gestapelt nicht durch Ca 2+ -Ionen per se, als 35 mit einem anderen negativen Fleck, Uranyl Formiat überprüft, noch Kalzium tat NAPT-induzierte Stapel (3B) zu verhindern.

Für ein kleines monotopen Protein, die zusätzliche Größe hinzugefügt von zu einer nanodisc Bindung es in Kryo-EM nachweisbar machen kann. EINsehr große nanodisc im Vergleich zu dem Protein ist möglicherweise nicht optimal, da ein kleines Protein auf einem großen nanodisc kann Stapeln nicht verhindern. Jedoch könnte die Form des extrinsischen Protein einen Einfluß haben. Obwohl keine genaue Verhältnis nur geringfügig größer als die geschätzte Bindungsoberfläche des Proteins ab jetzt eine nanodisc bilayer Oberfläche versehen werden empfohlen. Mit dieser Einschränkung Bindung die maximale Protein wäre ein Protein auf jeder Seite des nanodisc.

Allgemeine Einschränkungen und Vorteile des Verfahrens.

Das Protokoll, hängt von der Verfügbarkeit eines TEM und der damit verbundenen Ausrüstung, die in allen Laboratorien nicht verfügbar sind. Jedoch ist ein 120- bis 200-kV-Elektronenmikroskop mit einer herkömmlichen CCD-Kamera ausgestattet würde zum Nachweis von Stapel durchaus ausreichend sein. Die NAPT negative Färbung wird bei Raumtemperatur durchgeführt, und die Gitter können bei dieser Temperatur für eine spätere Betrachtung gespeichert werden.

TEM imaging würde schnell zeigen, ob die Stapelung verhindert worden ist oder nicht. Für die Bilder protein nanodisc Komplexe (beispielsweise 4A und B), die weitere Verarbeitung zeigt Strukturinformationen zu erhalten , könnte durchgeführt werden. Strukturelle Details eines negativ gefärbten Probe 1 nm erreichen und nützliche Strukturinformationen 29 zur Verfügung stellen kann. In Laboratorien Bestimmung durch Kryo-EM zu strukturieren gewidmet ist die negative Färbung von Proben Standardverfahren. Die Nutzung unserer Protokoll würde eine schnelle und einfache zusätzlich zu den regulären Verfahren sein.

Einige monotopen Proteine an die Membran durch Myristoylierung verankert, Palmitoylierung, oder hydrophobe Flecken auf der Proteinoberfläche, wodurch es notwendig wird nach dem gleichen Verfahren wie für die Aufnahme eines Transmembranproteins in Nanoscheiben 13 die nanodisc-Protein - Komplex zu bilden. Hier wird eine der Untereinheiten in dem Protein-Komplex enthält amyristoylation auf einem flexiblen N-terminalen Schwanz für die Membranbindung. Für Uranylacetat gebeiztes TEM-Aufnahmen wurde festgestellt, dass das Protein-Komplex wurde senkrecht an die Membran gebunden, und nicht auf der Seite des nanodisc. Diese und weitere Ergebnisse bestätigten eine starre Struktur für die Membranbefestigung 13. Für diese Bindung, Färbung NAPT nach unserem vorgeschlagene Protokoll die gleichen gleichmäßig verteilt einzelne Partikel zeigen würde. Wenn jedoch die Befestigung über eine flexible Kette war, könnte die Uranylacetat Färbung haben kein klares Ergebnis erbracht. Wir spekulieren, dass, für die flexible Kette Membran-Attached-Protein-Komplexe, die NAPT-Färbung der Nanoscheiben induzieren kann, stapeln die typische demonstrieren "Stapel Münzen," aber jetzt durch den beigefügten Protein an den Seiten verziert.

Warum Nanoscheiben verwenden, wenn Liposomen verwendet werden können? Die Optimierung von Lipiden, Cofaktoren oder andere Parameter könnte sehr gut in Liposomen für die Bindung von pro getestet werden,ipheral Proteine (vgl. 5LO). NAPT-induzierte Stapelung von Liposomen wurde 32 gezeigt, so dass ein monotopen Protein könnte Liposom Stapelung verhindern. Allerdings sind die Größen von Liposomen im Vergleich monotopen Proteinen und Nanoscheiben auch ins Spiel kommt. Eine große extrinsische Protein in der Lage sein das Stapeln von Liposomen, während ein kleines Protein, wie der 78-kDa 5LO, vielleicht auch nicht, es sei denn, die in hohen Stückzahlen pro Liposom zu verhindern. Kleine Liposomen können hergestellt werden, aber je kleiner die Vesikel, desto stärker die Krümmung seiner Membran. Die nanodisc Bilayer ist flach. verschiedene Parameter testen Nanoscheiben mit könnte weniger kosteneffizient aufgrund der MSP. Auf der anderen Seite, für Liposomen, bestimmte teure Cofaktoren oder Substrate, die teilweise in die Membran partitionieren und weiter in das Innere der Liposomen kann in größeren Mengen benötigt werden. Abschließend stellt die nanodisc Plattform die Möglichkeit, einen definierten Bereich der Auswahl eines genauen n für die Bindung Umbra von Proteinen. Die Doppelschichtbereich ist von zwei Seiten zugänglich und ist flach.

Bedeutung des Verfahrens.

Die Bestimmung der 3D-Struktur von Proteinen oder komplexe Makromoleküle visualisiert die Funktionsweise von Zellen. In diesem überfüllten Umgebung sind spezifische Proteine ​​aktiv auf Membranoberflächen, die allein oder im Komplex mit anderen Proteinen, aber in der Regel so, dass die physikalische Wechselwirkung mit den Komponenten in der Lipiddoppelschicht Teil ihrer mechanistische Funktion ist. Bei einigen Proteinen ist die Konformation in Lösung auf Membraneinbettungs geändert, während andere an die Membran gebunden sind, aber dennoch Konformation oder Orientierung auf der Membran ändern aufgrund irgendeiner Art von Trigger. Eine hydrophobe Substrat Eintrittsbahn kann dann zu öffnen, oder eine Konformation, die zu einem Transmembranprotein ermöglicht Bindung auftreten kann. Um die Struktur oder zumindest strukturelle Informationen solcher peripherer Proteine ​​erhalten an die Membran gebunden ist anspruchsvoll.

jove_content "> Nanoscheiben wurden in einigen Studien bezüglich Orientierung und Funktion auf Membranen 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Cytochrome P450, zentral in der Entgiftung verwendet wird , wird durch eine α-Helix auf der Membran verankert und enthält eine Häm - Gruppe in ihrer globulären Teil, so dass für Lineardichroismus Messungen 15. die Ergebnisse lassen eine Orientierung des Häm in Bezug auf die Membran in enger Abstimmung mit gemacht Simulationen, damit andere Schlüsse aus Simulationen der Membran eingebetteten Cytochrom P450 gezogen zu stärken. für eine GTPase an die Membran in einem kleinen nanodisc verankert konnte NMR Studien identifizieren zwei verschiedene Bereiche auf dem Protein mit einer Membran jeder Schnittstelle und ferner, wie Nucleo Flut einen Schalter von einer Schnittstelle zu den anderen 17 induzierte Bindung. Mutationen und Effektor - Bindung sowie GTP - Bindungs wurden in einem anderen GTPase in der Ras-Superfamilie untersuchten eine Reihe von Auswirkungen auf die Aktivität zu finden , die von der Ausrichtung auf der Membran abhängig, die onkogene Signalisierungs 16 beeinflussen würde. 5LO hat eine lösliche Konformation 61 und erfordert Kalzium für 43 auf Kernmembranen zu binden. Mit riesigen unilamellaren Liposomen, polarisiert, gedämpft wurden insgesamt Reflexion Infrarot - Experimente 46 durchgeführt. Das Ergebnis impliziert, dass die N-terminalen β-barrel an Membranen bindet, wobei die Symmetrieachse der β-Faß geneigt ungefähr 45 Grad von der Membran normal. Die 5LO C-terminale Domäne , eine nahezu zylindrische α-helikalen Bündels, und dieses wurde mit der Längsachse parallel zur Membran 45 zu binden vorgeschlagen,= "xref"> 46. In unserer früheren Arbeit an 5LO auf Nanoscheiben eingebettet ist , wurde der Bereich der Doppelschicht gewählt einem 5LO pro Seite mit dem oben vorgeschlagenen Orientierungs 35 zu ermöglichen. Die TEM - Aufnahmen diese Ausrichtung bestätigt, wenn auch in geringer Auflösung 35. Wenn zum Beispiel nur die N-terminalen β-barrel gebunden war, aber nicht die C-terminale Domäne, eine höhere Anzahl von 5LO pro nanodisc erhalten worden wäre. Weiterhin könnte ein anderes Protein mit der Membran verändern Bindung und Orientierung der 5LO, wie beispielsweise ein Aktivator, das Transmembranprotein 5-Lipoxygenase-aktivierende Protein, FLAP. FLAP wurde in Nanoscheiben Rekonstitution und wir verwenden TEM und andere Methoden, um die Interaktion zwischen 5LO und FLAP zu studieren. Ihre Wechselwirkung führt in endogenen Arachidonsäure wird umgewandelt A4 Leukotrien, das ist der erste Schritt in der Synthese von potent beteiligt Lockstoffe in vielen Entzündungskrankheiten 41, 42 sup>, 62.

Der 5LO-nanodisc Komplex wird berechnet mit einem Molekulargewicht von 334 kDa zu haben, in der Nähe der Grenze von etwa 200 kDa für die strukturelle Untersuchung von Kryo-EM. Nichtsdestoweniger, da die atomare Struktur von 5LO verfügbar ist 61, der Docking in ein mittlerer Auflösung, 3-dimensionales Elektronendichtekarte würde Informationen über die Wechselwirkung mit der Membran nanodisc ergeben.

Innovationen in der Kryo - EM - Technologie werden nicht nur Auflösung auf atomarer Ebene 63 drückt , sondern auch die Größenbegrenzung für kleinere Proteine schieben. Für die Strukturbestimmung von 22 NMR ist die Situation umgekehrt, wie das Ziel , den Größenbereich zu erhöhen , ist, die nun 200 kDa nähert. Vor kurzem wurden die Membranbindung von kleinen GTPase - Proteinen durch NMR 16 untersucht, 17. Diese Proteine, von nur etwa 20 kDa, wirre gebunden an kleine Nanoscheiben eines 7,6-nm Innendurchmesser, Komplexe von etwa 130 kDa bilden. In Zukunft könnte ähnlich großen Komplexe sowohl von NMR und Kryo-EM untersucht werden, um verschiedene Aspekte der Proteinmembran erläutern binden.

Eine Erweiterung des Protokolls könnte Nanoscheiben, die ein Transmembranprotein (TMP) in der nanodisc Bilayer zu untersuchen. NAPT-induzierte Stapelung der TMP-Nanoscheiben könnten leer Nanoscheiben verglichen werden, um die gleiche Lipidzusammensetzung enthält. Große extramembranösen Schleifen würde Stapeln verhindern, während kurze Schleifen nicht 64 Stapeln zu verhindern. Dies könnte in einen Vorteil verwandelt werden, da das Protokoll verwendet werden könnten Proteine ​​zu untersuchen, spezifisch an das Transmembran-Protein binden.

Der Vorteil dieses Verfahrens ist, dass die Membran Wechselwirkung sofort sichtbar gemacht werden kann. Die relative Einfachheit große Mengen an leeren Nanoscheiben zu machen bedeutet, dass man verlängerndieses Verfahren für verschiedene Bedingungen, wie pH, Temperatur, Puffer und Cofaktor-Abhängigkeit der monotopen Proteinbindung zu screenen. In der Tat, während 9 die nanodisc Plattform entwickelt wurde für diesen Zweck für die Stabilisierung von Transmembranproteinen und wird zunehmend verwendet, das Potential für Untersuchungen der eine große Anzahl von mehr oder weniger transient bindenden extrinsische Proteine in Zellen sollte klar gehalten werden , im Auge behalten.

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Acknowledgments

Die Autoren danken der schwedischen Research Council, Stockholm County Council, und KI Mittel für ihre Unterstützung. Die Expression und Reinigung von MSP wurde am Karolinska Institutet / SciLifeLab Protein Science Core Facility (http://PSF.ki.se) durchgeführt. Die Autoren möchten sich auch Dr. Pasi Purhonen und Dr. Mathilda Sjöberg für die gemeinsame Nutzung ihrer technischen Know-how und für ihre rechtzeitige Unterstützung zu danken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transmission electron microscope: JEOL2100F JEOL
CCD camera Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany
Glow discharger Baltec
TEM grid: 400 mesh TAAB GM016/C
Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5 Agilent Technologies 5190-2526
Superdex 200 HR 10/300 GE Healthcare Life Sciences 17-5172-01
Plasmid: MSP1E3D1 Addgene 20066
Bacteria: BL21DE3 NEB C2527H
Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2 Protein Science Facility, KI, Solna
Purification Matrix: ATP agarose Sigma Aldrich A2767
Purification Matrix: HisTrap HP-5 mL GE Healthcare Life Sciences 17-5247-01
Lipid: POPC Avanti polar lipids 850457C 25 mg/mL in chloroform
Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin Bio-Rad 1523920
13 mm syringe filter: 0.2 μm Pall life sciences PN 4554T
Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate Sigma Aldrich 31648
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Bio-Rad 161-0301
Protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001
TCEP Sigma Aldrich 646547
Detergent: Sodium cholate hydrate Sigma Aldrich C6445-10G
Sodium Cholate 500 mM Sodium cholate. Resuspend in miliQ water and store at -20 °C.
Lipid Stock 50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl. Store at 4 °C for a week; or
Store -80 °C for a month, after purging the solution with nitrogen.
MSP standard buffer 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA.
Store at 4 °C.
Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer Thermo Fisher Scientific BN2001 50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8
Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer Thermo Fisher Scientific BN2002 50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8, 0.002% Coomassie G-250
Non-Denaturaing Electrophoresis 4x Sample loading Buffer Thermo Fisher Scientific BN2003 50 mM Bis-Tris, pH 7.2, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S
Denaturaing Electrophoresis Running Buffer In-house recipe: 25 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1% (w/v) SDS
Denaturaing Electrophoresis 5x Sample loading Buffer In-house recipe: 0.05% (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl, pH 6.8, 20% (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS, 10 mM 2-mercaptoethanol
Terrific broth Tryptone - 12.0 g, Yeast Extract - 24.0 g, 100 mL 0.17 M KH2PO4 and 0.72 M K2HPO4, Glycerol - 4 mL.
Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 mL and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium.

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Biochemie Heft 121 negative Färbung Protein-Komplex TEM Lipoxygenasen Visualisierung nicht denaturierenden Gelelektrophorese
Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine ​​durch Transmissionselektronenmikroskopie
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B. Kumar, R., Zhu, L., Hebert, H.,… More

B. Kumar, R., Zhu, L., Hebert, H., Jegerschöld, C. Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (121), e55148, doi:10.3791/55148 (2017).

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