Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Metode til at visualisere og analysere membran interagerende proteiner af Transmission Electron Microscopy

Published: March 5, 2017 doi: 10.3791/55148
Automatic Translation
1, 2, 1,2, 1,2
1Department of Biosciences and Nutrition, Karolinska Institutet, 2School of Technology and Health, KTH Royal Institute of Technology

Introduction

I medicinsk forskning, er meget opmærksomhed fokuseret på membranproteiner, enten indre eller ydre, der er involveret i en række forskellige lipid interaktioner. Arbejde med lipid-interagerende proteiner indbefatter enten at vælge en erstatning for de lipider, såsom detergenter, amphipols 1, eller små proteiner 2, eller finde en membran substitut, der holder proteinet opløseligt og aktivt. Lipoic membran erstatninger omfatter liposomer og nanodiscs (ND) 3, 4.

Nanodiscs er nær-native membran platforme udviklet af engineering proteindelen, ApoA-1, af high-density lipoprotein (HDL) naturligt forekommende i blod. ApoA-1 er en 243-rest-lang kæde af korte amfipatiske a-helixer og har en lipid-fri opløselige konformation. In vitro, når i tilstedeværelsen af lipider, to kopier af proteinet ApoA-1 spontant omarrangere at omslutte hydrophobic acylkæde del af et lipiddobbeltlag patch 5. Konstruerede versioner af ApoA-1 kaldes generelt membran stilladser proteiner (MSP), og et stigende antal er kommercielt tilgængelige som plasmider eller som oprensede proteiner. Gentagelser eller deletioner af a-helixer i ApoA-1 resulterer i længere 6 eller kortere 7 membran stilladser proteiner. Det gør det muligt at danne diske omkring 6 nm 7.-17 nm 8 i diameter. Der findes forskellige typer af ansøgninger om nanodiscs 3, 9. Det mest almindeligt anvendte ansøgning er at tilvejebringe en nær-nativ membran miljø til stabilisering af et integreret membranprotein 8, revideret tidligere 3, 9. En mindre-udforskede anvendelse er at tilvejebringe en nanoskala membranoverflade for studiet afperifere membranproteiner 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. § 1 i protokollen nedenfor visualiserer proceduren for nanodiscs består af fosfolipider og membran stilladser protein.

Prøvefremstilling er en flaskehals i de fleste metoder. Metode-specifikke prøver kan tilføje særlige oplysninger, men de gør også sammenligninger af resultater vanskelig. Derfor er det enklere, når prøverne er multimodale og kan anvendes direkte i flere forskellige metoder. En fordel ved anvendelsen af nanodiscs er den lille størrelse af nanodisc i sammenligning med liposomer (fx kan prøverne direkte anvendes til både TEM og ikke-denaturerende gelelektroforese, som i den foreliggende protokol).

18. Der er imidlertid ikke høj opløsning 3D struktur af et monotopic membranprotein indlejret på en liposommembranen blevet offentliggjort, så vidt vi ved. Guld nanopartikler eller antistoffer kan anvendes til at visualisere proteiner binder til liposomer eller vesikler under anvendelse TEM 19. Selvom disse prober er meget specifikke, kan de forstyrre membran proteiner ved tilsløring membranen bindingssted eller ved at skjule områder af interesse med de fleksible dele. Guld-mærket eller antistof-kompleks proteiner kunne sandsynligvis analyseres på en gel, men dette ville øge omkostningerne af eksperimentet.

Selvom liposomer er en fremragende platform, kan man ikke være sikker på, at population har et bestemt forhold af protein pr liposom, en funktion, der kan udforskes ved brug af nanodiscs 20. I et liposom, kan cofaktorer og substrater blive fanget i den opløselige indre. Stoffer, der er membran-opløselige vil dele den samme skæbne for begge typer af membran mimetika. Ikke desto mindre, da dobbeltlaget område er mindre i nanodiscs, er en mindre mængde stof der kræves for at mætte nanodisc membraner.

Forståelse protein funktion gennem bestemmelse af den atomare struktur har været afgørende for mange forskningsområder. Metoder til proteinstruktur bestemmelse omfatter røntgen 21; kernemagnetisk resonans (NMR) 22, 23; og transmissionselektronmikroskopi (TEM) 24 ved kryogene temperaturer, cryoEM. Den beslutning cryoEM er sidst blevet væsentligt forbedret, primært som følge af brugen af ​​direkte elektron dedetektorer 25, 26. De makromolekyler er afbildet i tynde, glasagtige is 27 i en nær-oprindelige tilstand. Men på grund af den lave kontrast af biologiske molekyler, bliver de svært at opdage i størrelsesområdet fra 100 - 200 kDa. For passende størrelse prøver, kan dataindsamlingen foretages og kan anvendes metoden til genopbygning enkelt partikel at opnå en struktur 28.

Imidlertid bestemmelse af proteinstruktur ved TEM er en flertrinsproces. Det starter som regel med evalueringen af prøven monodispersitet af negativ-pletten TEM 29 ved hjælp af salte af tungmetaller som phosphotungsten (PT) 30 eller uran 31. Rekonstruktion af en lav opløsning model af negativt farvet makromolekyle er normalt lavet og kan give vigtig information om molekylstrukturen 29. Parallelt,dataindsamling ved hjælp cryoEM kan begynde. Der bør udvises forsigtighed ved vurderingen negativ-pletten TEM-data for at undgå fejlfortolkning af artefakt formation. En særlig artefakt er virkningen af PT plet på phospholipider og liposomer 32, hvilket resulterer i dannelsen af lange stænger ligner stakke af mønter set fra siden 33. Sådanne "rouleau" eller "stakke" (herefter betegnet som "stakke") blev observeret tidligt for HDL 34, og senere også for nanodiscs 35.

Den stabling og omlægning af membraner kan opstå af mange årsager. For eksempel kan den induceres af co-faktorer som kobber, vist ved TEM billeddannelse i en ammoniummolybdat plet 36. En fraktion af membranlipider i liposomer indeholdt en iminodieddikesyre hovedgruppe efterligner metal kompleksdannelse af EDTA, således stabling liposomer efter tilsætning af kobberioner 37. Stakken dannelse af phospholipider af PT blev observeret tidligt; har dog senere arbejde fokuseret på at fjerne eller afskaffe denne artefakt dannelse 38.

Her foreslår vi en metode til at drage fordel af NAPT-induceret nanodisc stabling til undersøgelse af membran-bindende proteiner ved TEM. Kort sagt, ville proteinbinding på nanodiscs forhindre nanodiscs fra stabling. Selvom årsagerne til stabling er ikke klare, blev det foreslået, 39 at der er en elektrostatisk interaktion mellem phospholipider og den phosphorylgruppe af PT, hvilket skiverne til at klæbe til hinanden (figur 1A). Hypotesen bag vores protokol er, at når et protein binder til en nanodisc, det meste af phospholipid overflade ikke til rådighed i ble for interaktionen med PT grund af sterisk hindring af proteinet. Dette ville forhindre stakken dannelse (figur 1B). To konklusioner kan drages. Første forebyggelse af stabling betyder, at proteinet af interesse er bundet til membranen. For det andet kan den proteinholdige ND kompleks behandles med standard single-partikel forarbejdningsmetoder 24, 40 for at få et groft morfologi af komplekset. Endvidere analyser ved metoder som ikke-denaturerende gelelektroforese eller dynamisk lysspredning, kan udføres.

For at demonstrere denne hypotese, brugte vi membranen protein 5-lipoxygenase (5LO), som er involveret i mange inflammatoriske sygdomme 41, 42. Denne 78-kDa proteinet kræver calciumioner til at binde til dens membran 43. Selvom denne membran association er blevet omfattende undersøgt ved anvendelse af liposomers = "xref"> 44, 45, 46 og membranfraktioner 47, kan disse ikke anvendes til TEM-analyse og strukturbestemmelse.

Udarbejdelsen af ​​nanodiscs starter ved at blande MSP med lipid resuspenderes i vaskemiddel natriumcholat. Efter inkubation på is i 1 time, er detergentet langsomt fjernes fra rekonstituering blandingen under anvendelse af en adsorberende harpiks. Denne form for materiale er ofte fremstillet af polystyren formes til små kugler. De er relativt hydrofobe og har en stærk præference for binding vaskemiddel i forhold til lipider 48. Efter fjernelse af hydrofobe perler og udførelse afklaring anvendelse af centrifugering, er nanodiscs oprenset ved gelpermeationskromatografi (SEC). De oprensede nanodiscs blandes med en monotopic membranprotein (og eventuelle cofaktorer) i et ækvimolært forhold (eller flere forhold for en titrering) og efterlades til rEACT (15 min). Analyse ved TEM udføres ved anvendelse af pi-mængder af prøven på glød-afladet, carbon-overtrukne gitre og derefter ved at udføre negativ farvning med NAPT. Den samme prøve fra når portioner blev påført TEM gitre kan anvendes til analyse ved ikke-denaturerende eller SDS PAGE gel-elektroforese, såvel som af forskellige former for aktivitetsmålinger, med ingen større ændringer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af nanodiscs

  1. Ekspression og oprensning af membranen stilladser protein 8, 35
    1. Udtrykke His-mærket MSP1E3D1 i E. coli BL21 (DE3) T1R pRARE2 stamme i kolber. Der fremstilles en 50-ml natten over starterkultur med LB-medium suppleret med 50 ug / ml kanamycin ved 37 ° C. Fortynd overnight starterkultur i 2 I Terrific Broth medium suppleret med 50 ug / ml kanamycin.
    2. Grow cellerne ved 37 ° C, indtil den optiske densitet ved 600 nm (OD600) når ca. 3. inducere proteinekspression med 0,5 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) i 3 timer ved 18 ° C.
    3. Forbered lysisbuffer (100 mM Tris-HCI, pH 8,0; 100 mM NaCI; og 10% glycerol). Tilsæt 1 mM TCEP umiddelbart før brug.
    4. Efter 3 timers induktion ved 18 ° C, Cellerne høstes ved centrifugering i 10 minutter ved 4.500 xgog 4 ° C. Supernatanten fjernes, vejes de høstede celler, og re-suspendere dem i lysepuffer i et forhold på 2 ml lysepuffer pr g celler.
    5. Lysere cellerne ved pulseret lydbehandling (gentagelseshastighed: 4 s ON, 4 s OFF) i 3 min ved 80% amplitude.
    6. Centrifuger lysaterne i 20 minutter ved 49.000 xg og 4 ° C. Kassér pellet fra denne centrifugering.
    7. Injicer supernatanten i en 5-ml Ni + chelaterende søjle forbundet til et automatiseret væskekromatografisystem fortrinsvis holdt ved 4 ° C.
    8. Før elueringen (trin 1.1.9), vaskes søjlen med puffere 1 - 3 nedenfor for at fjerne alle proteiner undtagen His-mærket MFP. Overvåg proteinindholdet ved 280 nm til at følge rensningsprocessen; UV-optagelse ved 280 nm skal gå tilbage til baseline efter hver vask.
      1. Vask med vaskepuffer 1: 40 mM Tris-HCI, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, og 1% Triton, pH 8,0.
      2. Vask med vaskepuffer 2: 40 mM Tris-HCI, 300 mMNaCl, 20 mM imidazol og 50 mM natriumcholat, pH 8,0.
      3. Vask med vaskebuffer 3: 40 mM Tris-HCI, 300 mM NaCl, og 50 mM imidazol, pH 8,0.
    9. Eluere MSP med 40 mM Tris-HCI, 300 mM NaCl og 500 mM imidazol, pH 8,0.
    10. Skift bufferen til MSP standard buffer (20 mM Tris-HCI, pH 7,5; 100 mM NaCI; og 0,5 mM EDTA) ved gelfiltrering 8, 35; udbyttet pr parti bør være omkring 7 mg L -1.
  2. Fremstilling af phospholipid stamopløsning
    1. Tilføj 305 pi af 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC) opløst i chloroform ved en koncentration på 25 mg / ml til et bægerglas og fordampe chloroform ved at tømme den med en blid strøm af nitrogen . Tør lipid natten over i et vakuumtørreskab. BEMÆRK: Dette trin udføres for at fjerne opløsningsmidlet fra lipidet, der efterlader en tynd film af lipid i bunden af ​​bægerglasset.
    2. Resuspender lipid kage i 200 pi MSP standard buffer indeholdende 100 mM natriumcholat ved hvirvelbehandling røret, indtil opløsningen bliver transparent; dette vil give en løsning med en POPC koncentration på 50 mM.
      BEMÆRK: Generelt bør molforholdet mellem lipid og detergent på dette tidspunkt være 1: 2 (lipid: detergent) 8. Denne lipid-opvaskemiddelblandingen kan opbevares ved -80 ° C i næsten 2 måneder.
  3. Fremstilling af hydrofobe perler til fjernelse detergent
    1. 5 g af perler (tør vægt) i en 50-ml rør.
    2. Vask perlerne med 30 ml 100% methanol og derefter med 40 ml ultrarent vand.
    3. Vask perlerne med 10 ml MSP standard buffer. Endelig opbevares perlerne med 15 ml MSP standard buffer ved 4 ° C.
  4. Nanodisc rekonstituering
    1. Dispensere 190 uL af MSP1E3D1 (0,124 mM) i et mikrofugerør, og der tilsættes 61,5 pi phospholipid stamopløsning (50 mM POPC) til det samme rør. Inkubér rekonstituering blandingen på våd is i 1 time. BEMÆRK: Dette er lig med en molforhold på 1: 130 (MSP1E3D1: POPC).
    2. Tilføj hydrofobe perler ved en koncentration på 0,5 g perler pr ml efter rekonstitution blanding at indlede selvsamlende proces. Inkuber i en roterende inkubator i 16 timer ved 4 ° C.
    3. Efter inkubation til centrifuger i 10 minutter ved 13.000 xg og 4 ° C fjerne bundfaldene og aggregater. Kassér pillen og gem supernatanten.
    4. Ækvilibrering af gelpermeationskromatografisøjle (monteret på et automatiseret væskekromatografi system) med MSP standard puffer, indtil absorbansen ved 280 nm er stabil. Injicer supernatanten i kolonnen og indsamle Topfraktionerne.
    5. Bestemmelse af koncentrationen af ​​nanodiscs i topfraktionerne ved 280 nm. Brug den molære ekstinktionskoefficient MSP1E3D1 (e = 29.910 cm-1 M-1) til beregning af den nanodisc koncentration. BEMÆRK:antal lipider pr nanodisc kan måles ved en kombination af radiomærkede lipider og phosphat analyse 4, eller ved phosphat analyse alene.

2. Forberedelse af Monotopic Protein 5-lipoxygenase 35

  1. Forbered en overnatning starterkultur. Supplement 50 ml LB-medium med 100 pg / ml ampicillin. Inokulere mediet med E. coli BL21 (DE3) indeholdende plasmidet af 5-lipoxygenase-genet (ALOX5). Fortynd overnight starterkultur i ekspression medium indeholdende 42 mM Na 2 HPO 4, 24 mM KH 2 PO 4, 9 mM NaCl, 19 mM NH4CI, 1 mM MgSO4, 0,1 mM CaCl2, 0,2% D-glucose, 0,1 %, 5 pM FeSO4, og 100 ug / ml ampicillin. Grow cellerne, indtil OD600 er ~ 0,5 ved 25 ° C. Inducere proteinekspression med 0,2 mM IPTG i 16 timer ved 20 ° C 35.
  2. Høst ved centrifugering i 10 minutter ved 7.000 xg og 4 ° C og supernatanten. Afvej pelleten fundet på bunden af ​​røret, der indeholder de høstede celler og resuspender høstede celler i lysisbuffer (100 mM Tris-HCI, pH 8,0; 100 mM NaCl; 10% glycerol; og 1 mM TCEP) indeholdende proteasehæmmer og 0,5 mg / ml 35 lysozym i et forhold på 2 ml lysisbuffer pr g celler.
  3. Lysere cellerne ved sonikering i 5 x 15 sekunder ved 80% amplitude. Fjern celledebris ved centrifugering i 10 minutter ved 7.000 xg og 4 ° C. Udfør ammoniumsulfatpræcipitation til 30 - 60% mætning for at udfælde proteinerne i opløsningen 35. Centrifuger i 15 minutter ved 16.000 xg og 4 ° C. BEMÆRK: 5LO pellet kan hurtigt nedfrosset og opbevaret ved -80 ° C i op til 6 måneder.
  4. Pelleten resuspenderes med 20 ml lysepuffer og centrifuger i 15 minutter ved 40.000 xg og 4 ° C.
  5. Inkubér supernatanten på en ATP-agarose-søjle ved 4 ° C i 30 minutter. Kolonnen udvaskes en gang med en kolonne-volumen af ​​lysebuffer indeholdende 0,5 M NaCl. Eluere 5LO med 20 mM ATP i lysepuffer indeholdende 10 uM FeSO4 og 20 ug / ml katalase. Udfør gelfiltreringskromatografi for at fjerne ATP 35.
    BEMÆRK: 5LO er ustabil og skal anvendes umiddelbart efter rensning. Ellers anbefales det at standse ved trinnet med ammoniumsulfatudfældning (se noten efter trin 2.1.3).

3. Fremstilling af Nanodisc-proteinkompleks

  1. Forbered et samlet volumen på 100 pi kompleks. Bland 0,8 uM ND og 0,8 uM 5LO med 1 mM Ca2 + til stede i MSP standard buffer (20 mM Tris-HCI, pH 7,5; 100 mM NaCI; 0,5 mM EDTA og 1,5 mM CaCl2) og inkuberes i 10 minutter på is. BEMÆRK: Prøven kan opbevares i op til en måned ved 4 ° C 35.
ove_title "> 4. analyse af prøverne

  1. gelelektroforese
    1. Ikke-denaturerende elektroforese
      1. Bland 15 pi af prøven med 5 pi loading buffer (50 mM BisTris, 6 N HCI, 50 mM NaCl, 10% (vægt / volumen) glycerol og 0,001% Ponceau S, pH 7,2) 49 og indlæse den på en 4 - 16% Bis-Tris-gel til at udføre elektroforese.
      2. Fyld katoden tank med lys katode buffer (50 mM Bis Tris, 50 mM tricin, pH 6,8, og 0,002% Coomassie G-250) og anoden tank med løbebuffer (50 mM Bis Tris og 50 mM tricin, pH 6,8). Start separation ved anvendelse af en konstant spænding på 150 V.
      3. Stop elektroforetisk separation når Coomassie fronten når enden af ​​gelen.
      4. Farv gelen med en standard Coomassie blue protokol.
    2. denaturering elektroforese
      1. Bland 40 pi af prøven med 10 pi loading buffer indeholdende SDS (0,05% (vægt / volumen) bromphenolblåt, 0,2 M Tris-HCl,pH 6,8; 20% (v / v) glycerol; 10% (vægt / volumen) SDS; og 10 mM 2-mercaptoethanol) og indlæse den på en 4 - 20% Tris glycin gel til at udføre elektroforese.
      2. Fyld katoden og anoden tanke med løbebuffer (25 mM Tris-HCI, pH 6,8; 200 mM glycin og 0,1% (vægt / volumen) SDS). Start separation ved anvendelse af en konstant spænding på 150 V.
      3. Stop elektroforetisk separation når læsning farvefronten når enden af ​​gelen.
      4. Farv gelen med en standard Coomassie blue protokol.
  2. Forberedelse af NAPT løsningen
    1. Opløs 1 g phosphotungstate natriumsalt i 50 ml vand ved omrøring ved stuetemperatur til opnåelse af en 2% (vægt / volumen) sur opløsning.
    2. PH justeres til 7,4 med 1 M NaOH. Fjern partiklerne ved anvendelse af en 0,22 um sprøjtefilter. opløsningen ved stuetemperatur eller ved 4 ° C lagre.
  3. Klargøring af prøven for TEM-analyse
    1. Glødeudladnings- carbon-coatet kobbergitre (400 mesh) i 20 sekunder ved 30 mA for at gøre nettene hydrofile før adsorption af prøven. Placer 3,5 pi af prøven (0,8 uM med hensyn til nanodiscs) på risten og inkuberes i 30 s. BEMÆRK: volumen anvendes, kan variere mellem 2,5 og 5 pi, afhængig af koncentrationen prøven. Et egnet koncentrationsområde nanodiscs er 0,5 - 1 uM.
    2. Blot off overskydende løsning med filtrerpapir.
    3. Umiddelbart pletten nettet med et fald på 2% NAPT i 30 s. Aftryk overskydende opløsning og lade gitteret til at lufttørre.
    4. Vurdere gitre ved TEM. Et mikroskop med 120-200 keV accelerationsspænding tilstrækkeligt at vurdere omfanget af stabling. BEMÆRK: den nuværende protokol blev en kalibreret transmission elektron mikroskop bruges, er udstyret med en 200-keV felt emission pistol.
    5. Optag TEM billeder. For billeder, der viser lange stakke, behandler ikke længere; billeder viser komplekset af nanodiscs, med extrinsiske protein, der kan indeholde et parkorte stakke, men de fleste partikler er i komplekset. Optag flere billeder og proces disse ifølge standardmetoder til opnåelse af klasse-gennemsnit og en lav opløsning, 3 dimensionel model af komplekset.
      BEMÆRK: indsamling af negativ-pletten data blev gitre foretaget på mindst tre forskellige dage. For hver dag blev frisk prøve inkubationer (som i trin 3.1) foretaget før den negative pletten blev anvendt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fremgangsmåden vi foreslår afhænger fremstillingen af ​​nanodiscs at tilvejebringe membranoverfladen for monotopic membran-proteinbinding. Da der ikke er nogen transmembrane protein indlejret i nanodisc lipiddobbeltlag, er nanodiscs her betegnet som "tomme nanodiscs" (figur 2A). Disse har en beregnet molekylvægt på 256 kDa for en sammensætning af to MSP1E3D1 stilladser proteiner og omkring 260 molekyler af POPC 8. Brug af dette protein: lipid-forhold til rekonstitution, en stor top (figur 2A) blev elueret under gelfiltrering. Topfraktionerne omkring 9 ml (figur 2A) blev undersøgt ved blå nativ gelelektroforese 49, der viser et bånd (figur 2B, bane 1). Selvom bånd svarer til en størrelse noget større end den beregnede 256 kDa, den nanodisc diameter måles i TEM billeder svarer til denforventede 13 nm ± 0,5 nm.

Den monotopic membranprotein 5-lipoxygenase (5LO) blev oprenset som beskrevet ovenfor (Protokol trin 2) og mere detaljeret tidligere 35. Homogenitet 78-kDa 5LO blev analyseret ved SDS PAGE-elektroforese (figur 2C, bane 1) og var fuldt funktionsdygtig 35 (ikke vist).

I denne protokol, er betingelser med vilje skabt, der fremmer stabling af nanodiscs. Det skal dog bemærkes, at denne stabling induceres kun i prøverne lavet til TEM imaging (såkaldte eksemplarer), specielt ved tilsætning af den negative pletten natrium phosphotungstate som det sidste trin, når alle andre behandlinger og tilføjelser var blevet foretaget. Faktisk billederne af NAPT-farvede nanodiscs viser de forventede stabling (figur 3A) meget tidligt for HDL 34 5, 50. Den "lange stakke af mønter set fra siden" (figur 3A) er de nanodiscs aggregerede med phosphotungstate indskudt mellem dobbeltlagene, som beskrevet skematisk i figur 1A og forslag Zhang et al. 32, 39.

Det er vigtigt at kontrollere, om forskellige tilføjelser i bufferne påvirker, forhindre eller endog inducere stabling, og som vil fremgå nedenfor, virkningerne af calciumioner kræves undersøgelse. I figur 3B, stablingen er stadig til stede i en prøve, hvor calciumioner blev tilsat til nanodisc opløsning før farvning med NAPT.

Det væsentlige trin i protokollen er vist i figur 4, hvor membranen-binding protein er til stede i opløsningerne. Stablingen kunne ikke induceres ved NAPT pletten når 5LO var bundet til membranoverfladen af nanodiscs (figur 4A). Til denne prøve, er molforholdet mellem 5LO til nanodiscs var 1: 1, som skematisk vist i figur 1 (figur 1B, nederst til højre). Som lipiddobbeltlaget af nanodiscs er tilgængelig fra begge sider, i modsætning til liposomer, prøver med forholdet mellem to 5LO til én nanodisc blev fremstillet, medens TEM billeder viser endnu mindre stabling (figur 4B).

Til binding, kunne nogle ydre membranproteiner afhænge af tilstedeværelsen af en specifik lipid i membranen, såsom phosphoinositols 10, 11, 12 eller phosphatidylserin 10. I tilfælde af 5LO, tilstedeværelsen af Ca2 + er nød-digt 43. I figur 4A og B, calciumioner var til stede i opløsningerne med nanodiscs og 5LO. Med andre ord, manglen på ikke blot stabling viser, at monotopic protein har bundet, men også, at den bindende afhænger Ca2 + -ioner. For at vise dette blev en opløsning indeholdende nanodiscs og 5LO men uden calcium farvet med NAPT og afbildes af TEM (figur 4C). Som forventet kan 5LO ikke binde til nanodiscs uden Ca2 + og efterlod 5LO frie i opløsning, så de nanodiscs stable stedet (figur 4C).

figur 1
Figur 1. Princip for Nanodisc stabling og Oversigt over metode. A. Princippet om nanodisc stabling. Tilsætningen af ​​den negative pletten natrium phosphotungstate til en opløsning af nanodiscs (venstre) fører til th e stabling af nanodiscs (højre) på grund af elektrostatiske kræfter (midten, pile) mellem phospholipid dobbeltlag og PT-molekyler (midterste, sorte prikker). B. Skematisk fremstilling af protokollen. Tomme nanodiscs (venstre) binder til en ydre membranprotein (grå) til dannelse af et kompleks, afbildet fra fire forskellige vinkler (lavere midten). Tilstedeværelsen af ​​monotopic protein sterisk forhindrer nanodiscs fra stabling når farvet med phosphotungstate salt (nederst til højre), i modsætning til stabling induceret i mangel af store objekter (øverst til højre). De drivhuse og orangefarvede ringe repræsenterer to MSP indpakning omkring phospholipid kerne, som er repræsenteret i lys brun. Klik her for at se en større version af dette tal.

jpg "/>
Figur 2. Homogenitet Analyse af nanodiscs og 5LO. A. Gelpermeationskromatografi af rekonstituerede tomme nanodiscs. Elueringen af ​​de nanodiscs toppe ved 9 ml. B. Ikke-denaturerende gel elektroforetisk analyse af Topfraktionens fra SEC vist i (A). Bane M indeholder markøren. Et enkelt bånd er til stede i bane 1, hvor topfraktionen ved 9 ml blev indlæst. C. Denaturering gel elektroforetisk analyse af oprenset 5LO. Den 78 kDa 5LO viser som et intenst bånd i bane 1. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Stak Dannelse af nanodiscs i fravær af protein Analyseret af TEM. A. Nanodisc stabling blev induceret whøne farvet med NAPT. De "stakke af mønter" er de stakke af nanodiscs når den ses fra siden. Hver nanodisc vises som en hvid bånd. B. Stabling var ikke forstyrres af tilstedeværelsen af calciumioner i nanodisc løsning, når farvet med NAPT. Skalaen barer er 100 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Forebyggelse Stack Stiftelse ved binding af protein i Tilstedeværelse af en cofaktor Analyseret af TEM. A. og B. Calciumioner var til stede i blandinger af 5LO og nanodiscs ved molære forhold på 1: 1 (A) eller 2: 1 (B). Jo mere 5LO binding til nanodiscs, jo færre nanodiscs er tilgængelige til stabling, som vist i (B). De enkelt-partikel komplekser i both (A) og (B) er egnede til videre forarbejdning 35. C. I fravær af calciumioner, kan 5LO ikke binde. NAPT farvning af denne prøve viser typiske stabling af nanodiscs, forlader 5LO ubundet. Skalaen barer er 100 nm. Billederne blev erhvervet af en 4K x 4K CCD-kamera ved en forstørrelse på 69,500x. Pixelstørrelsen af ​​CCD kameraet er 15 um, som giver en tilsvarende værdi på 2,16 Å på prøven niveau for EM-billeder. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fremgangsmåden kan opdeles i tre dele: rekonstituering af tomme nanodiscs, fremstillingen af ​​protein-nanodisc komplekser, og den negative farvning for TEM af disse komplekser. Hver del vil blive behandlet særskilt med hensyn begrænsninger af teknikken, kritiske trin, og nyttige modifikationer.

Rekonstituering af tomme nanodiscs. Kritiske trin og begrænsninger i produktion og anvendelse af nanodiscs.

Til fremstillingen af ​​de tomme nanodiscs, er det vigtigt at optimere MSP-til-lipid-forhold. For de mest almindelige MSP og lipider (ved anvendelse af cholat som et detergent), kan findes forslag til de optimale forhold i litteraturen (fx 125 - 130 POPC pr MSP1E3D1 8, 51, anvendes i den foreliggende protokol). Forskelle opnåede forhold til de offentliggjorte nøgletal kan afhænge af metoden til protein koncentrationsbestemmelse, effektiviteten af ​​lipid solvatisering i vaskemidlet, og fremgangsmåden til vaskemiddel fjernelse fra opløsningen.

Vi foreslår at udføre fjernelse rengøringsmiddel ved hjælp hydrofobe perler 48 (trin 1.3), mens mulige alternativer dialyse eller tilsætning af cyclodextrin 52, 53. Oprindeligt var dialyse anvendes til rekonstitution af HDL 5, 34 og er stadig foretrukket 54. Uanset hvilken fremgangsmåde til fjernelse detergent, hastighed er afgørende. Hvis fjernelsen er for hurtig (mængden af ​​hydrofobe perler er for stor), kan den spontane omlejring af MSP med lipiderne ikke tid til at forekomme. I stedet kan store mængder af liposomer og proteinaggregater dannes. Resultaterne fra gelpermeationskromatografi ville vise store mængder af liposomer i det tomme volumen, en suboptimal top af rekonstituerede nanodiscs, og en større top af ubrugtMSP 4, 6, 51. For alt for lille et volumen af ​​hydrofobe perler, kan fjernelse vaskemiddel være ufuldstændig, og nanodiscs der danner kan vise en variation i størrelser, hvor de fleste er mindre end forventet. Man kunne teste to tilføjelser af mindre mængder af hydrofobe perler i stedet for en stor tilgang til at bremse hastigheden af ​​rekonstituering.

Valget af lipider bør overvejes nøje 8, 9, 45, 46, 55, afhængigt af formålet for nanodisc forberedelse. Generelt for alle metoder med henblik på dannelse af membraner (rekonstitution af nanodiscs eller liposomer, såvel som for 2D krystallisationseksperimenter), skal lipiderne være i en "fluid" tilstand 56. Under en vis temperatur, the lipid er stiv. Over denne såkaldte overgangstemperatur (Tm), lipidet er flydende. Bemærk, at nogle almindeligt anvendte mættede lipider har en Tm godt stykke over stuetemperatur. Endvidere er det for lipidblandinger, blandbarheden af lipider muse overvejes 57. Den optimale temperatur for Nanodisc dannelse er omkring faseovergangen (Tm) af lipidet.

Vaskemidlet i denne protokol er natriumcholat 8. Hvis der skal bruges et andet detergent, de samme koncentrationer som dem, der anvendes til cholat ikke direkte kan anvendes. Visse milde rengøringsmidler opløse lipider mindre effektivt, og en højere koncentration kan være nødvendig. Lipidet kage opnået efter afdampning af chloroform (trin 1.2.2 i protokol) skal opløses til en klar opløsning ved detergent. Vortexbehandling, fryse-optøningscykler, ultralydsbade eller lydbehandling kan anvendes til at accelerere solubilisering.

For combinationer af lipid (-Blandinger), MSP og andre end dem, der anvendes her, titreringer at minimere store aggregater og liposomer eller overskydende MSP rengøringsmidler er nødvendige 4, 6, 51, 58. For nogle kombinationer af MSP og phospholipider, kan optimering være vanskeligere end for andre 4, 6, 51, og det bliver nødvendigt at bestemme indholdet af topfraktionerne. Den mest nøjagtige metode til analyse af nanodisc sammensætning og størrelse er at bestemme antallet af phospholipider pr MSP af phosphat analyse 4 og beregne molekylvægten nanodisc. Nanodisc størrelse kan estimeres ved godt løst, ikke-denaturerende gelelektroforese; dynamisk lysspredning (DLS) 59; eller negativ-plet TEM, for blot at nævne et par metoder. Som for negativ-plet-induceret stabling protokol præsenteres her, målingen af ​​bredden af ​​stablerne stede i TEM billeder giver diameteren af ​​nanodiscs.

Som for ekspression og oprensning af membranen stilladser protein, skal der tages alle sædvanlige forholdsregler og bekymringer for et opløseligt protein. Plasmiderne rådighed kan indeholde forskellige tags og proteasespaltningssites i tilfælde mærket skal fjernes før brug af MSP.

5LO, den monotopic protein anvendt i protokollen, inaktiverer hurtigt medmindre der tages forholdsregler, beskrevet andetsteds 35 og i referencer deri. Kort sagt er det katalytiske jern let tabt, og oxiderende betingelser kan forårsage dimerisering af 5LO. Som anført i note (protokol trin 2.1.3), kan rensning standses efter nedbør trin, og portioner er gemt til senere brug. Efter oprensningen af ​​en portion, skal proteinet anvendes inden for et par timer d ue til den hurtige inaktivering 35.

Kritiske trin i udarbejdelsen af ​​de protein-nanodisc komplekser.

Størrelsen af ​​den monotopic protein versus nanodisc område er af betydning. Længden af MSP1E3D1 proteinkæde svarer til en nanodisc med en 10,5-nm indre diameter og om en 8.900-Å 2 dobbeltlag område 8. Dette svarer godt til det område rapporteret for membranen-embedded del af 5LO 45. Således er vores forventede bindende forholdet var 1: 1 eller højst 2: 1 5LO pr nanodisc. Dette viste sig at være korrekt, som rapporteret i en titrering eksperiment 35. Imidlertid blev den maksimale binding af to 5LO pr nanodisc ikke opnået, som omtalt andetsteds 35. Et noget større nanodisc kunne eventuelt muliggøre en fuld 2: 1-binding til eksperimenter, hvor dette er ønskeligt, men i dette tilfælde er 1: 1-forhold er det vigtigste mål.

ove_content "> Valget af optimale lipider til protein-nanodisc kompleksdannelse kan hjælpes ved forudgående viden. Det var tilfældet i den foreliggende protokol, hvor valget af lipid var syntetisk POPC 35. Begge variationer i lipid hoved gruppe 46 og variationer i mætning af acylkæder 45 blev testet i liposom-5LO bindingsundersøgelser. 5LO aktivitet blev forøget med bindende for liposomer indeholdende cholin phospholipider umættede i sn-2 acylkæde position 45, 46. Hvis specifikke lipid krav ikke er kendte, men identiteten af den oprindelige membran er kendt, naturlige lipidekstrakter kunne testes først 55.

En cofaktor afhængighed var kendt for 5LO, som afhænger af Ca 2+ ioner for membranbinding 43. Det er udfordrende at helt at fjerne calcium fra løsninger. Her, det kompleksdannende middel EDTA er til stede i bufferne i mængder justeret til at give en kontrolleret mængde af frie Ca2 + -ioner. Beregninger af frie og bundne molekyler i bufferne blev foretaget af BAD 60 software til buffere, der indeholder mere end en type kompleksdanner 35. opføres ikke virkningen af ​​koncentrationen af ​​en cofaktor delvis opløselig i membranen for denne software.

Kritiske trin i negativ farvning af nanodiscs at fremme stak formation.

For protokollen ved hånden, hvor der ønskes maksimal stabling, bør pletten være natriumsaltet af phosphotungsten. Forskellige salte af wolfram er til rådighed, og vi observeret, at phosphowolframsyre var mindre effektive til stabling (ikke vist). Af uklare årsager, ser det ud til, at store mængder af natrium i PT farvning fremmer stabling. Også for den prøvepuffer blev det vist, at jo lavere natrium content, jo lavere mængde af induceret stabling 32. Af samme årsag, efter at prøven er blevet påført på EM gitter, bør ikke udføres vaskevand før farvning, da dette reducerer også stabling. På den anden side, blev nogle stabling altid fremkaldt, selv om aldrig at det nødvendige omfang for den bedste ydeevne af protokollen.

Selvfølgelig skal cofaktorer som Ca2 + -ioner her kontrolleres for interferens med negative plet eller med nanodiscs. For den nuværende protokol, ville calciumioner er udfældet en fosfatbuffer, så en Tris buffer blev brugt. De nanodiscs blev ikke stablet af Ca 2 + ioner per se, som kontrolleres ved hjælp af en anden negativ plet, uranyl formate 35, heller ikke calcium forhindrer NAPT-induceret stabling (figur 3B).

For en lille monotopic protein, den ekstra størrelse tilsat ved binding til en nanodisc kan gøre den påviselig i cryoEM. ENmeget store nanodisc forhold til proteinet er måske ikke optimale, da en lille protein på en stor nanodisc muligvis ikke forhindre stabling. formen af ​​den ydre protein, kan imidlertid have indflydelse. Selv om der ikke præcise forhold kan leveres allerede nu, er en nanodisc dobbeltlag overflade kun lidt større end den anslåede bindende proteinets overflade anbefales. Med denne begrænsning, ville den maksimale proteinbinding være ét protein på hver side af nanodisc.

Generelle begrænsninger og fordele ved fremgangsmåden.

Protokollen afhænger af tilgængeligheden af ​​en TEM og tilhørende udstyr, som ikke er tilgængelige i alle laboratorier. en 120- til 200-kV elektronmikroskop udstyret med en traditionel CCD-kamera, ville imidlertid være helt tilstrækkelig til påvisning af stabling. Den NAPT negativ farvning udføres ved stuetemperatur, og gitrene kan opbevares ved denne temperatur i senere gennemsyn.

TEM imagING vil hurtigt vise, om stabling er forhindret eller ikke. For billederne viser protein-nanodisc komplekser (fx figur 4A og B), yderligere behandling til opnåelse af strukturel information kunne udføres. Strukturelle detaljer af en negativt farvede prøve kan nå op på 1 nm og kan give nyttig strukturel information 29. I laboratorier dedikeret til at strukturere bestemmelse ved cryoEM, den negative farvning af prøver er standard procedure. Brugen af ​​vores protokol ville være en hurtig og enkel tilføjelse til almindelige procedurer.

Nogle monotopic proteiner er forankret til membranen ved myristoylering, palmitoylering, eller hydrofobe områder på proteinet overfladen, hvilket gør det nødvendigt at danne nanodisc-proteinkomplekset ved den samme fremgangsmåde som til inkorporering af et transmembrant protein ind nanodiscs 13. Her, en af ​​underenhederne i proteinkomplekset indeholder amyristoylation på et fleksibelt N-terminale hale for membranbinding. For uranylacetat-farvede TEM billeder blev det anført, at proteinet komplekset blev bundet vinkelret på membranen, og ikke på den side af nanodisc. Dette og andre resultater bekræftede en stiv struktur for membranen fastgørelse 13. Til denne binding, NAPT farvning i henhold til vores foreslåede protokol ville vise de samme jævnt fordelt enkelte partikler. Men hvis fastgørelsen havde været via et fleksibelt kæden, uranylacetat-farvning kunne ikke have givet et klart resultat. Vi spekulere, at for fleksibel kæde membran-vedhæftede proteinkomplekser kan NAPT farvning inducere nanodiscs at stable, viser den typiske "stak af mønter", men nu er udsmykket af vedlagte protein på siderne.

Hvorfor bruge nanodiscs hvis der kan bruges liposomer? Optimeringen af ​​lipider, cofaktorer eller andre parametre kunne meget vel blive testet i liposomer for bindingen af ​​pripheral proteiner (jf. 5LO). NAPT-induceret stabling af liposomer er blevet vist 32, så en monotopic protein kunne forhindre liposom stabling. Men for at størrelsen af ​​liposomer i sammenligning monotopic proteiner og nanodiscs også kommer i spil. En stor extrinsiske protein kan være i stand til at forhindre stabling af liposomer, hvorimod et lille protein, som 78-kDa 5LO, måske ikke medmindre stede i stort antal pr liposom. Små liposomer kan fremstilles, men jo mindre vesiklen, jo stærkere krumning dens membran. Den nanodisc dobbeltlag er flad. Test forskellige parametre ved hjælp nanodiscs kunne være mindre omkostningseffektive på grund af MSP. På den anden side, for liposomer, visse dyre cofaktorer eller substrater, der delvis fordeles i membranen og endvidere i det indre af liposomerne, kan være påkrævet i større mængder. Afslutningsvis tilvejebringer nanodisc platform mulighed for at vælge et defineret område for binding en præcis n sortjord af proteiner. Dobbeltlaget Området er tilgængeligt fra to sider og er flad.

Betydningen af ​​fremgangsmåden.

Bestemmelse af 3D struktur af proteiner eller komplekse makromolekyler visualiserer de indre funktioner i celler. I denne overfyldt miljø, specifikke proteiner er aktive på membranoverflader, alene eller i kompleks med andre proteiner, men normalt så at den fysiske interaktion med komponenter i lipiddobbeltlaget er en del af deres mekanistiske funktion. For nogle proteiner, er konformationen i opløsning ændret ved membran indlejring, mens andre er tøjret til membranen, men dog ændre konformation eller orientering på membranen på grund af en slags trigger. En hydrofob substrat entry bane kan derefter åbne, eller en konformation, der tillader binding til et transmembrant protein kan forekomme. For at opnå den struktur, eller i det mindste strukturel information, af sådanne perifere proteiner bundet til membranen er udfordrende.

jove_content "> nanodiscs blev anvendt i nogle undersøgelser vedrørende orientering og funktion på membraner 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. cytokrom P450, centralt i afgiftning, er forankret til membranen ved en α-helix og indeholder et hæm-gruppe i sin kugleformede del, hvilket muliggør lineære dikroisme målinger 15. resultaterne viste en orientering af hæm i forhold til membranen i nær overensstemmelse med simuleringer og dermed styrke andre konklusioner simuleringer af membranen-embedded cytochrom P450. for en GTPase forankret til membranen i en lille nanodisc kunne NMR-undersøgelser identificere to forskellige områder på proteinet med en membran grænseflade hver og længere, hvordan nucleo tidevand binding inducerede et skift fra en grænseflade til den anden 17. Mutationer og effektor binding, samt GTP bindende, blev undersøgt i en anden GTPase i Ras-superfamilien at finde en række effekter på aktivitet, der afhang af orienteringen på membranen, hvilket ville påvirke onkogene signalering 16. 5LO har en opløselig kropsbygning 61 og kræver calcium for bindende for nukleare membraner 43. Brug af gigantiske unilamellare liposomer, blev polariseret, svækket, total-refleksioner infrarøde eksperimenter udført 46. Resultatet underforstået, at den N-terminale β-tønde binder til membraner, med symmetriaksen af ​​β-tønden vippet cirka 45 grader fra membranen normal. Den 5LO C-terminale domæne er en næsten cylindrisk α-helix bundle, og dette blev foreslået at binde med den lange akse parallelt med membranen 45,= "xref"> 46. I vores tidligere arbejde med 5LO integreret på nanodiscs blev arealet af dobbeltlaget valgt at tillade en 5LO pr side med den ovenfor foreslåede orientering 35. De TEM billeder bekræftede denne målsætning, om end i lav opløsning 35. Hvis, for eksempel, blev kun den N-terminale β-tønde bundet, men ikke den C-terminale domæne, der ville være opnået et højere antal 5LO pr nanodisc. Endvidere kunne et andet protein ændre membranbinding og orientering 5LO, såsom en aktivator, det transmembrane protein 5-lipoxygenase aktiverende protein, FLAP. FLAP er blevet rekonstitueret i nanodiscs, og vi bruger TEM og andre metoder til at studere samspillet mellem 5LO og FLAP. Deres interaktion resulterer i endogen arachidonsyre omdannes til leukotrien A4, som er det første trin i syntesen af potente kemoattraktanter involveret i mange inflammatoriske sygdomme 41, 42 sup>, 62.

Den 5LO-nanodisc kompleks er beregnet til at have en molekylvægt på 334 kDa, nær grænsen for omkring 200 kDa for strukturel undersøgelse af cryoEM. Men som den atomare struktur af 5LO fås 61, dens docking til et medium-opløsning, 3-dimensionelle elektrontæthedskort ville give information om interaktion med nanodisc membran.

Nyskabelser i cryoEM teknologi er ikke kun presser beslutning til det atomare niveau 63, men også skubbe grænsen størrelse til mindre proteiner. Til strukturel bestemmelse ved NMR 22, er situationen den modsatte, da formålet er at øge størrelsesområde, som nu nærmer 200 kDa. For nylig blev membranen binding af små GTPase proteiner undersøgt ved NMR 16, 17. Disse proteiner, på kun omkring 20 kDa, vire bundet til små nanodiscs af et 7,6-nm indre diameter, der danner komplekser på ca. 130 kDa. I fremtiden kan tilsvarende størrelse komplekser blive undersøgt af både NMR og cryoEM at belyse forskellige aspekter af protein-membran-binding.

En udvidelse af protokollen kunne være at undersøge nanodiscs indeholder et transmembrant protein (TMP) i nanodisc dobbeltlag. NAPT-induceret stabling af TMP-nanodiscs kan sammenlignes med tomme nanodiscs indeholdende samme lipid sammensætning. Store extramembranous sløjfer ville forhindre stabling, mens korte løkker kan ikke forhindre stabling 64. Dette kan omdannes til en fordel, som den protokol kan anvendes til at undersøge proteiner specifikt binder til det transmembrane protein.

Fordelen ved denne metode er, at membranen interaktion kan visualiseres straks. Den relative enkelhed gør store mængder af tomme nanodiscs indebærer, at man kan strække sigdenne metode til at screene for forskellige tilstande som pH, temperatur, puffere, og cofaktor afhængighed af monotopic proteinbinding. Faktisk mens nanodisc platform 9 blev udviklet til stabilisering af transmembrane proteiner og i stigende grad anvendes til dette formål, dets potentiale for studier af det store antal mere eller mindre forbigående-bindende ydre proteiner til stede i celler bør klart holdes i tankerne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Forfatterne takker det svenske Forskningsråd, Stockholms Amt, og KI midler til deres støtte. Den ekspression og oprensning af MSP blev udført ved Karolinska Institutet / SciLifeLab Protein Science Core Facility (http://PSF.ki.se). Forfatterne vil også gerne takke Dr. Pasi Purhonen og Dr. Mathilda Sjöberg til deling deres tekniske ekspertise og for deres rettidig bistand.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transmission electron microscope: JEOL2100F JEOL
CCD camera Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany
Glow discharger Baltec
TEM grid: 400 mesh TAAB GM016/C
Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5 Agilent Technologies 5190-2526
Superdex 200 HR 10/300 GE Healthcare Life Sciences 17-5172-01
Plasmid: MSP1E3D1 Addgene 20066
Bacteria: BL21DE3 NEB C2527H
Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2 Protein Science Facility, KI, Solna
Purification Matrix: ATP agarose Sigma Aldrich A2767
Purification Matrix: HisTrap HP-5 mL GE Healthcare Life Sciences 17-5247-01
Lipid: POPC Avanti polar lipids 850457C 25 mg/mL in chloroform
Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin Bio-Rad 1523920
13 mm syringe filter: 0.2 μm Pall life sciences PN 4554T
Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate Sigma Aldrich 31648
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Bio-Rad 161-0301
Protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001
TCEP Sigma Aldrich 646547
Detergent: Sodium cholate hydrate Sigma Aldrich C6445-10G
Sodium Cholate 500 mM Sodium cholate. Resuspend in miliQ water and store at -20 °C.
Lipid Stock 50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl. Store at 4 °C for a week; or
Store -80 °C for a month, after purging the solution with nitrogen.
MSP standard buffer 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA.
Store at 4 °C.
Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer Thermo Fisher Scientific BN2001 50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8
Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer Thermo Fisher Scientific BN2002 50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8, 0.002% Coomassie G-250
Non-Denaturaing Electrophoresis 4x Sample loading Buffer Thermo Fisher Scientific BN2003 50 mM Bis-Tris, pH 7.2, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S
Denaturaing Electrophoresis Running Buffer In-house recipe: 25 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1% (w/v) SDS
Denaturaing Electrophoresis 5x Sample loading Buffer In-house recipe: 0.05% (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl, pH 6.8, 20% (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS, 10 mM 2-mercaptoethanol
Terrific broth Tryptone - 12.0 g, Yeast Extract - 24.0 g, 100 mL 0.17 M KH2PO4 and 0.72 M K2HPO4, Glycerol - 4 mL.
Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 mL and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kleinschmidt, J. H., Popot, J. L. Folding and stability of integral membrane proteins in amphipols. Arch Biochem Biophys. 564, 327-343 (2014).
  2. Frauenfeld, J., et al. A saposin-lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nat Methods. 13 (4), 345-351 (2016).
  3. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nat Struct Mol Biol. 23 (6), 481-486 (2016).
  4. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-Assembly of Discoidal Phospholipid Bilayer Nanoparticles with Membrane Scaffold Proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  5. Jonas, A., Steinmetz, A., Churgay, L. The number of amphipathic alpha-helical segments of apolipoproteins A-I, E, and A-IV determines the size and functional properties of their reconstituted lipoprotein particles. J Biol Chem. 268 (3), 1596-1602 (1993).
  6. Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers. Protein Eng Des Sel. 23 (11), 843-848 (2010).
  7. Hagn, F., Etzkorn, M., Raschle, T., Wagner, G. Optimized phospholipid bilayer nanodiscs facilitate high-resolution structure determination of membrane proteins. J Am Chem Soc. 135 (5), 1919-1925 (2013).
  8. Ritchie, T. K., et al. Methods in Enzymology. Duzgunes, N. ejat 464, Academic Press. 211-231 (2009).
  9. Schuler, M. A., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs as a new tool to examine lipid-protein interactions. Methods Mol Biol. 974, 415-433 (2013).
  10. Nasr, M. L., et al. Membrane phospholipid bilayer as a determinant of monoacylglycerol lipase kinetic profile and conformational repertoire. Protein Sci. 22 (6), 774-787 (2013).
  11. Yokogawa, M., et al. NMR analyses of the interaction between the FYVE domain of early endosome antigen 1 (EEA1) and phosphoinositide embedded in a lipid bilayer. J Biol Chem. 287 (42), 34936-34945 (2012).
  12. Wan, C., et al. Insights into the molecular recognition of the granuphilin C2A domain with PI(4,5)P2. Chem Phys Lipids. 186, 61-67 (2015).
  13. Zhang, P., et al. An Isoform-Specific Myristylation Switch Targets Type II PKA Holoenzymes to Membranes. Structure. 23 (9), 1563-1572 (2015).
  14. Grushin, K., Miller, J., Dalm, D., Stoilova-McPhie, S. Factor VIII organisation on nanodiscs with different lipid composition. Thromb Haemost. 113 (4), 741-749 (2015).
  15. Baylon, J. L., Lenov, I. L., Sligar, S. G., Tajkhorshid, E. Characterizing the membrane-bound state of cytochrome P450 3A4: structure, depth of insertion, and orientation. J Am Chem Soc. 135 (23), 8542-8551 (2013).
  16. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Oncogenic and RASopathy-associated K-RAS mutations relieve membrane-dependent occlusion of the effector-binding site. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), 6625-6630 (2015).
  17. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Membrane-dependent modulation of the mTOR activator Rheb: NMR observations of a GTPase tethered to a lipid-bilayer nanodisc. J Am Chem Soc. 135 (9), 3367-3370 (2013).
  18. Wang, L., Sigworth, F. J. Structure of the BK potassium channel in a lipid membrane from electron cryomicroscopy. Nature. 461 (7261), 292-295 (2009).
  19. Ackerson, C. J., Powell, R. D., Hainfeld, J. F. Site-specific biomolecule labeling with gold clusters. Methods Enzymol. 481, 195-230 (2010).
  20. Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (31), 11509-11514 (2006).
  21. Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. Membrane protein structure determination - the next generation. Biochim Biophys Acta. 1838 (1 Pt A), 78-87 (2014).
  22. Dias, D. M., Ciulli, A. NMR approaches in structure-based lead discovery: recent developments and new frontiers for targeting multi-protein complexes. Prog Biophys Mol Biol. 116 (2-3), 101-112 (2014).
  23. Viegas, A., Viennet, T., Etzkorn, M. The power, pitfalls and potential of the nanodisc system for NMR-based studies. Biol Chem. , (2016).
  24. Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A primer to single-particle cryo-electron microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
  25. Wu, S., Armache, J. P., Cheng, Y. Single-particle cryo-EM data acquisition by using direct electron detection camera. Microscopy (Oxf). 65 (1), 35-41 (2016).
  26. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  27. De Carlo, S., Adrian, M., Kalin, P., Mayer, J. M., Dubochet, J. Unexpected property of trehalose as observed by cryo-electron microscopy. J Microsc. 196 (1), 40-45 (1999).
  28. Nogales, E. The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nat Methods. 13 (1), 24-27 (2016).
  29. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).
  30. Forte, T. M., Nordhausen, R. W. Electron microscopy of negatively stained lipoproteins. Methods Enzymol. 128, 442-457 (1986).
  31. Zhao, F. Q., Craig, R. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. J Struct Biol. 141 (1), 43-52 (2003).
  32. Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. J Lipid Res. 52 (1), 175-184 (2011).
  33. Zhang, L., et al. An optimized negative-staining protocol of electron microscopy for apoE4 POPC lipoprotein. J Lipid Res. 51 (5), 1228-1236 (2010).
  34. Matz, C. E., Jonas, A. Micellar complexes of human apolipoprotein A-I with phosphatidylcholines and cholesterol prepared from cholate-lipid dispersions. J Biol Chem. 257 (8), 4535-4540 (1982).
  35. Kumar, R. B., et al. Structural and Functional Analysis of Calcium Ion Mediated Binding of 5-Lipoxygenase to Nanodiscs. PLoS One. 11 (3), e0152116 (2016).
  36. Waggoner, T. A., Last, J. A., Kotula, P. G., Sasaki, D. Y. Self-assembled columns of stacked lipid bilayers mediated by metal ion recognition. J Am Chem Soc. 123 (3), 496-497 (2001).
  37. Kovacs, E., et al. Analysis of the Role of the C-Terminal Tail in the Regulation of the Epidermal Growth Factor Receptor. Mol Cell Biol. 35 (17), 3083-3102 (2015).
  38. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy. J Vis Exp. (90), e51087 (2014).
  39. Zhang, L., Tong, H., Garewal, M., Ren, G. Optimized negative-staining electron microscopy for lipoprotein studies. Biochim Biophys Acta. 1830 (1), 2150-2159 (2013).
  40. Cong, Y., Ludtke, S. J. Single particle analysis at high resolution. Methods Enzymol. 482, 211-235 (2010).
  41. Radmark, O., Werz, O., Steinhilber, D., Samuelsson, B. 5-Lipoxygenase, a key enzyme for leukotriene biosynthesis in health and disease. Biochim Biophys Acta. 1851 (4), 331-339 (2015).
  42. Anwar, Y., Sabir, J. S., Qureshi, M. I., Saini, K. S. 5-lipoxygenase: a promising drug target against inflammatory diseases-biochemical and pharmacological regulation. Curr Drug Targets. 15 (4), 410-422 (2014).
  43. Radmark, O., Samuelsson, B. Regulation of the activity of 5-lipoxygenase, a key enzyme in leukotriene biosynthesis. Biochem Biophys Res Commun. 396 (1), 105-110 (2010).
  44. Noguchi, M., Miyano, M., Matsumoto, T., Noma, M. Human 5-lipoxygenase associates with phosphatidylcholine liposomes and modulates LTA4 synthetase activity. Biochim Biophys Acta. 1215 (3), 300-306 (1994).
  45. Pande, A. H., Qin, S., Tatulian, S. A. Membrane fluidity is a key modulator of membrane binding, insertion, and activity of 5-lipoxygenase. Biophys J. 88 (6), 4084-4094 (2005).
  46. Pande, A. H., et al. Modulation of human 5-lipoxygenase activity by membrane lipids. Biochemistry. 43 (46), 14653-14666 (2004).
  47. Wong, A., Hwang, S. M., Cook, M. N., Hogaboom, G. K., Crooke, S. T. Interactions of 5-lipoxygenase with membranes: studies on the association of soluble enzyme with membranes and alterations in enzyme activity. Biochemistry. 27 (18), 6763-6769 (1988).
  48. Rigaud, J. L., Levy, D., Mosser, G., Lambert, O. Detergent removal by non-polar polystyrene beads. European Biophysics Journal. 27 (4), 305-319 (1998).
  49. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  50. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. J Vis Exp. (90), e51087 (2014).
  51. Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size. J Am Chem Soc. 126 (11), 3477-3487 (2004).
  52. Hornschemeyer, P., Liss, V., Heermann, R., Jung, K., Hunke, S. Interaction Analysis of a Two-Component System Using Nanodiscs. PLoS One. 11 (2), 0149187 (2016).
  53. Degrip, W. J., Vanoostrum, J., Bovee-Geurts, P. H. Selective detergent-extraction from mixed detergent/lipid/protein micelles, using cyclodextrin inclusion compounds: a novel generic approach for the preparation of proteoliposomes. Biochem J. 330 (Pt 2), 667-674 (1998).
  54. Martin, D. D., Budamagunta, M. S., Ryan, R. O., Voss, J. C., Oda, M. N. Apolipoprotein A-I assumes a "looped belt" conformation on reconstituted high density lipoprotein. J Biol Chem. 281 (29), 20418-20426 (2006).
  55. Cerione, R. A., Ross, E. M. Reconstitution of receptors and G proteins in phospholipid vesicles. Methods Enzymol. 195, 329-342 (1991).
  56. Shaw, A. W., McLean, M. A., Sligar, S. G. Phospholipid phase transitions in homogeneous nanometer scale bilayer discs. FEBS Lett. 556 (1-3), 260-264 (2004).
  57. Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).
  58. Civjan, N. R., Bayburt, T. H., Schuler, M. A., Sligar, S. G. Direct solubilization of heterologously expressed membrane proteins by incorporation into nanoscale lipid bilayers. Biotechniques. 35 (3), 553-562 (2003).
  59. Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A step-by-step method for the reconstitution of an ABC transporter into nanodisc lipid particles. J Vis Exp. (66), e3910 (2012).
  60. Brooks, S. P., Storey, K. B. Bound and determined: a computer program for making buffers of defined ion concentrations. Anal Biochem. 201 (1), 119-126 (1992).
  61. Gilbert, N. C., et al. The structure of human 5-lipoxygenase. Science. 331 (6014), 217-219 (2011).
  62. Radmark, O. 5-lipoxygenase-derived leukotrienes: mediators also of atherosclerotic inflammation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (7), 1140-1142 (2003).
  63. Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature. 534 (7607), 347-351 (2016).
  64. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Self-assembly of single integral membrane proteins into soluble nanoscale phospholipid bilayers. Protein Sci. 12 (11), 2476-2481 (2003).

Tags

Biochemistry negativ farvning proteinkompleks TEM lipoxygenaser visualisering ikke-denaturerende gelelektroforese
Metode til at visualisere og analysere membran interagerende proteiner af Transmission Electron Microscopy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

B. Kumar, R., Zhu, L., Hebert, H.,… More

B. Kumar, R., Zhu, L., Hebert, H., Jegerschöld, C. Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (121), e55148, doi:10.3791/55148 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter