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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Méthode pour visualiser et analyser membrane protéines interagissant par microscopie électronique à transmission

Published: March 5, 2017 doi: 10.3791/55148
Automatic Translation
1, 2, 1,2, 1,2
1Department of Biosciences and Nutrition, Karolinska Institutet, 2School of Technology and Health, KTH Royal Institute of Technology

Introduction

Dans la recherche médicale, une grande attention est focalisée sur des protéines membranaires, soit intrinsèques ou extrinsèques, impliqués dans une variété d'interactions lipidiques. En travaillant avec des protéines interagissant lipides comprend soit la sélection d' un substitut aux lipides, tels que les détergents, amphipols 1 ou 2 petites protéines ou de trouver un substitut à membrane qui maintient la protéine soluble et active. Substituts de la membrane lipoïque comprennent des liposomes et nanodiscs (ND) 3, 4.

Nanodiscs sont des plates-formes de membranes quasi-native développée par ingénierie de la partie protéique, ApoA-1, de la lipoprotéine de haute densité (HDL) dans le sang d'origine naturelle. ApoA-1 est un résidu 243-longue chaîne de courtes hélices a amphipathiques et présente une conformation soluble délipidé. In vitro lorsqu'ils sont en présence de lipides, de deux copies de la protéine d' ApoA-1 réarranger spontanément à entourer le hydrpartie de la chaîne acyle ophobic d'un bicouche lipidique correctif 5. versions d'ingénierie de ApoA-1 sont généralement appelés échafaudages de protéines membranaires (MSP), et un nombre croissant sont disponibles dans le commerce sous forme de plasmides ou des protéines purifiées. Répétitions ou suppressions des hélices dans ApoA-1 résultat à plus ou moins 6 protéines d'échafaudage 7 membranaires. Ceci à son tour permet de former des disques d' environ 6 nm à 17 nm à 7 8 de diamètre. Il existe différents types d'applications pour le nanodiscs 3, 9. L'application la plus couramment utilisée est de fournir un environnement membranaire quasi-native pour la stabilisation d'une protéine membranaire intégrale 8, examiné précédemment 3, 9. Une utilisation moins explorée est de fournir une surface de la membrane à l'échelle nanométrique pour l'étude demembrane périphérique des protéines 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. L'article 1 du protocole ci-dessous permet de visualiser la procédure de prise de nanodiscs composé de phospholipides et de protéines d'échafaudage de la membrane.

La préparation des échantillons est un goulot d'étranglement dans la plupart des méthodes. échantillons spécifiques Méthode peuvent ajouter des informations particulières, mais ils font également la comparaison des résultats difficile. Par conséquent, il est plus simple lorsque les échantillons sont multimodaux et peuvent être utilisés directement dans plusieurs méthodes différentes. Un avantage à l'utilisation de nanodiscs est la petite taille de l'nanodisc par rapport aux liposomes (par exemple, les échantillons peuvent être directement utilisés pour les TEM et électrophorèse sur gel non dénaturant, comme dans le présent protocole).

18 est disponible. Cependant, aucune structure 3D à haute résolution d'une protéine de membrane monotopique embarqué sur une membrane de liposome a été encore publié, pour autant que nous le savons. Des nanoparticules d' or ou d' anticorps peuvent être utilisés pour visualiser les protéines de liaison à des liposomes ou des vésicules en utilisant TEM 19. Même si ces sondes sont très spécifiques, ils pourraient interférer avec les protéines membranaires de liaison en voilant le site de liaison de la membrane ou en masquant les zones d'intérêt avec les parties flexibles. Or marqué ou des protéines d'anticorps complexée pourrait probablement être analysé sur un gel, mais cela augmenterait le coût de l'expérience.

Bien que les liposomes sont une excellente plate-forme, on ne peut être certain que la population a un rapport particulier de protéines par liposome, une caractéristique qui peut être explorée par l'utilisation de nanodiscs 20. Dans un liposome, des cofacteurs et des substrats peuvent être piégés à l'intérieur soluble. Les substances qui sont solubles dans la membrane se partageront le même sort pour les deux types de mimétiques membranaires. Cependant, comme la zone à deux couches est inférieure à nanodiscs, une petite quantité de substance nécessaire pour saturer les membranes nanodisc.

Comprendre la fonction des protéines grâce à la détermination de la structure atomique a été essentielle pour de nombreux domaines de la recherche. Méthodes de détermination de la structure des protéines comprennent des rayons X 21; résonance magnétique nucléaire (RMN) , 22, 23; et par microscopie électronique à transmission (MET) 24 à des températures cryogéniques, cryoEM. La résolution par cryoEM a récemment été grandement améliorée, principalement en raison de l'utilisation d'électrons de directetecteurs 25, 26. Les macromolécules sont imagés dans mince, glace vitreuse 27 dans un état quasi-native. Toutefois, en raison du faible contraste entre les molécules biologiques, elles deviennent difficiles à détecter dans la gamme de tailles de 100-200 kDa. Pour les échantillons de taille appropriée, la collecte des données peut être effectuée et le procédé de reconstruction de la particule peut être appliquée pour obtenir une structure 28.

Cependant, la détermination de la structure protéique par MET est un processus en plusieurs étapes. Elle débute généralement par l'évaluation de l' échantillon monodispersité par coloration négative TEM 29 en utilisant des sels de métaux lourds comme phosphotungsten (PT) 30 ou de l' uranium 31. Reconstruction d'un modèle à faible résolution de la macromolécule colorées négativement est généralement faite et peut fournir des informations importantes sur la structure moléculaire 29. En parallèle,la collecte de données en utilisant cryoEM peut commencer. Des précautions doivent être prises lors de l'évaluation des données TEM coloration négative pour éviter la mauvaise interprétation de la formation artefact. Un artefact particulier est l'effet de la tache de PT sur des phospholipides et des liposomes 32, ce qui entraîne la formation de longues tiges ressemblant à des piles de pièces de monnaie vues du côté 33. Un tel "rouleau" ou "piles" (ci - après désigné par "piles") ont été observées au début de HDL 34, et plus tard aussi pour nanodiscs 35.

L'empilement et un remodelage des membranes peuvent se produire pour de nombreuses raisons. Par exemple, elle peut être induite par des co-facteurs tels que le cuivre, montré par imagerie MET dans un molybdate d' ammonium 36 tache. Une fraction des lipides de la membrane dans des liposomes contient un groupe de tête iminodiacétique mimant complexation des métaux par l'EDTA, l'empilement ainsi des liposomes après l'addition d'ions cuivre 37. La formation de la pile de phospholipides par PT a été observée dès le début; Cependant, le travail plus tard , a mis l' accent sur la suppression ou la suppression de cette formation d'artefact 38.

Ici, nous proposons une méthode pour tirer parti de la nanodisc NaPT induite par empilement pour l'étude des protéines membranaires de liaison par MET. En bref, la liaison sur les protéines nanodiscs empêcherait les nanodiscs d'empilement. Bien que les raisons de l'empilement ne sont pas claires, il a été proposé 39 qu'il y ait une interaction électrostatique entre les phospholipides et le groupe phosphoryle du PT, ce qui provoque les disques à coller à l'autre (figure 1A). L'hypothèse derrière notre protocole est que, quand une protéine se lie à une nanodisc, la majeure partie de la surface phospholipide est non disponi ble pour l'interaction avec le terminal en raison de l'encombrement stérique de la protéine. Cela permettrait d' éviter la formation pile (figure 1B). Deux conclusions peuvent être tirées. En premier lieu, la prévention de l'empilement signifie que la protéine d'intérêt est liée à la membrane. En second lieu , le complexe protéine-ND peut être traitée par des procédés classiques de traitement unique de particules 24, 40 pour obtenir une morphologie grossière du complexe. En outre, des analyses par des méthodes telles que la non-dénaturant électrophorèse sur gel ou la diffusion dynamique de la lumière peut être réalisée.

Pour démontrer cette hypothèse, nous avons utilisé la protéine de liaison à la membrane 5-lipoxygénase (5LO), qui est impliqué dans de nombreuses maladies inflammatoires 41, 42. Cette protéine de 78 kDa nécessite des ions calcium à se lier à la membrane 43. Bien que cette association de la membrane a été largement étudiée en utilisant des liposomess = "référence externe"> 44, 45, 46 et des fractions de membrane 47, ceux - ci ne peuvent pas être utilisées pour une analyse TEM et la détermination de la structure.

La préparation de nanodiscs commence par le mélange MSP avec des lipides remis en suspension dans le cholate détergent de sodium. Après incubation sur de la glace pendant 1 h, le détergent est lentement éliminé du mélange de reconstitution à l'aide d'une résine adsorbante. Ce type de matériel est souvent faite de forme en petites billes de polystyrène. Ils sont relativement hydrophobes et ont une forte préférence pour un détergent de liaison par rapport aux lipides 48. Après avoir retiré les billes hydrophobes et effectuer une clarification par centrifugation, les nanodiscs sont purifiés par chromatographie d'exclusion stérique (SEC). Les nanodiscs purifiés sont mélangés avec une protéine de membrane monotopique (et cofacteurs possibles) dans un rapport équimolaire (ou plusieurs rapports pour un titrage) et on laisse rEACT (15 min). L'analyse par TEM est effectuée en appliquant ul-quantités d'échantillon sur, grilles revêtues de carbone lueur déchargée puis en effectuant une coloration négative avec NaPT. Le même échantillon à partir de laquelle les aliquotes ont été appliqués aux grilles de MET peut être utilisé pour l'analyse des non-dénaturant ou une électrophorèse sur gel de SDS-PAGE, ainsi que par divers types de mesures d'activité, sans changements majeurs.

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Protocol

1. Préparation de Nanodiscs

  1. Expression et purification de la protéine d'échafaudage membranaire 8, 35
    1. Exprimer le MSP1E3D1 His-tagged dans le E. coli BL21 (DE3) souche T1R pRARE2 dans des flacons. Préparer une culture de départ pendant la nuit de 50 ml avec un milieu LB additionné de 50 pg / ml de kanamycine à 37 ° C. Diluer la culture starter pendant une nuit dans 2 litres de milieu de bouillon super supplémenté avec 50 pg / ml de kanamycine.
    2. Faire croître les cellules à 37 ° C jusqu'à ce que la densité optique à 600 nm (DO 600) atteint environ 3. induire l'expression de la protéine avec 0,5 mM de β-D-thiogalactopyranoside d' isopropyle 1-(IPTG) pendant 3 h à 18 ° C.
    3. Préparer le tampon de lyse (100 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM de NaCl et 10% de glycerol). Ajouter 1 mM PTCE immédiatement avant utilisation.
    4. Après 3 h d'induction à 18 ° C, de récolter les cellules par centrifugation pendant 10 min à 4500 x get 4 ° C. Jeter le surnageant, on pèse les cellules récoltées, et les remettre en suspension dans un tampon de lyse à un rapport de 2 ml de tampon de lyse par gramme de cellules.
    5. Lyse des cellules par sonication pulsée (taux de répétition: 4 de l'ON, 4 s OFF) pendant 3 min à 80% d'amplitude.
    6. Centrifuger les lysats pendant 20 min à 49000 xg et 4 ° C. Jeter le culot de cette centrifugation.
    7. Injecter le surnageant dans un 5 mL Ni + colonne chélatant connecté à un système de chromatographie en phase liquide automatisée de préférence maintenue à 4 ° C.
    8. Avant l'étape d'élution (étape 1.1.9), laver la colonne avec des tampons 1 - 3 ci-dessous pour éliminer toutes les protéines à l'exception du marquage His MSP. Surveiller la teneur en protéines à 280 nm pour suivre le processus de purification; l'enregistrement UV à 280 nm devrait revenir à la ligne de base après chaque lavage.
      1. Laver avec un tampon de lavage 1: 40 mM de Tris-HCl, 300 mM de NaCl, 10 mM d'imidazole, et 1% de Triton, pH 8,0.
      2. Laver avec un tampon de lavage 2: 40 mM Tris-HCl, 300 mMDe NaCl, 20 mM imidazole, et le cholate de sodium 50 mM, pH 8,0.
      3. Laver avec un tampon de lavage 3: 40 mM de Tris-HCl, 300 mM de NaCl et 50 mM d'imidazole, pH 8,0.
    9. Éluer le MSP avec 40 mM Tris-HCl, 300 mM de NaCl et 500 mM d'imidazole, pH 8,0.
    10. Changer le tampon MSP tampon standard (20 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM de NaCl et 0,5 mM d' EDTA) par filtration sur gel , 8, 35; le rendement par lot devrait être d' environ 7 mg L -1.
  2. Préparation de la solution mère de phospholipides
    1. Ajouter 305 pi de 1-palmitoyl-2-oléoyl - sn - glycéro-3-phosphocholine (POPC) dissous dans du chloroforme à une concentration de 25 mg / mL dans un bêcher en verre et on évapore le chloroforme en le purgeant avec un courant doux d'azote . Sécher pendant toute une nuit lipidique dans un dessicateur sous vide. Remarque: Cette étape est réalisée pour éliminer le solvant à partir du lipide, ce qui laisse un film mince de lipide au fond du bêcher en verre.
    2. Remettre en suspension le gâteau de lipides dans 200 ul de tampon standard contenant MSP cholate de sodium 100 mM, vortexer le tube jusqu'à ce que la solution devienne transparente; ceci fournira une solution avec une concentration de 50 mM POPC.
      NOTE: En général, le rapport molaire de lipide au détergent à ce point doit être de 1: 2 (lipides: détergent) 8. Ce mélange lipide-détergent peut être stocké à -80 ° C pendant environ 2 mois.
  3. Préparation de billes hydrophobes pour l'élimination du détergent
    1. Placer 5 g de billes (poids sec) dans un tube de 50 ml.
    2. Laver les billes avec 30 ml de methanol à 100%, puis avec 40 ml d'eau ultrapure.
    3. Laver les billes avec un tampon standard de 10 ml de MSP. Enfin, stocker les perles avec 15 ml de tampon standard MSP à 4 ° C.
  4. Nanodisc reconstitution
    1. Distribuer 190 ul de MSP1E3D1 (0,124 mM) dans un tube à centrifuger et ajouter 61,5 pi de solution mère de phospholipides (50 mM POPC) dans le même tube. Incuber le mélange de reconstitution sur de la glace pendant 1 h. NOTE: Ce qui correspond à un rapport molaire de 1: 130 (MSP1E3D1: POPC).
    2. Ajouter des billes hydrophobes à une concentration de 0,5 g de billes par ml de mélange de reconstitution pour lancer le processus d'auto-assemblage. Incuber dans un incubateur rotatif pendant 16 heures à 4 ° C.
    3. Après incubation, on centrifuge pendant 10 min à 13 000 x g et 4 ° C pour éliminer les précipités et les agrégats. Jeter le culot et enregistrez le surnageant.
    4. Equilibrer la colonne de chromatographie d'exclusion stérique (monté sur un système de chromatographie en phase liquide automatisée) avec un tampon de type MSP jusqu'à ce que l'absorbance à 280 nm est stable. Injecter le liquide surnageant dans la colonne et recueillir les fractions de pic.
    5. Mesurer les concentrations de nanodiscs dans les fractions de pic à 280 nm. En utilisant le coefficient d'extinction molaire de MSP1E3D1 (e = 29910 M -1 cm -1) pour le calcul de la concentration en nanodisc. Noter lanombre de lipides par nanodisc peut être mesurée par une combinaison de lipides radiomarqués et l' analyse des phosphates 4 ou par analyse du phosphate seul.

2. Préparation de la protéine monotopiques 5-lipoxygénase 35

  1. Préparer une culture de départ pendant la nuit. Supplément de 50 ml de milieu LB avec 100 ug / ml d'ampicilline. Inoculer le milieu avec de E. coli BL21 (DE3) contenant le plasmide du gène de la 5-lipoxygénase (ALOX5). Diluer la culture starter pendant une nuit dans du milieu d'expression contenant 42 mM de Na 2 HPO 4 mM KH 2 PO 4, 9 mM de NaCl, 19 mM de NH 4 Cl, 1 mM MgSO4, 0,1 mM CaCl2, 0,2% de D-glucose 24 0,1 %, 5 uM de FeSO 4 et 100 pg / ml d' ampicilline. Cultiver les cellules jusqu'à ce que la DO 600 est ~ 0,5 à 25 ° C. Induire l' expression de protéines avec 0,2 mM d' IPTG pendant 16 heures à 20 ° C 35.
  2. Récolte par centrifugation pendant 10 min à 7000 xg et 4 ° C et jeter le surnageant. Peser le culot trouve au fond du tube contenant les cellules récoltées et remettre en suspension des cellules récoltées dans un tampon de lyse (100 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM de NaCl, 10% de glycerol et 1 mM de TCEP) contenant un inhibiteur de protéase et 0,5 mg / ml 35 de lysozyme à raison de 2 ml de tampon de lyse par gramme de cellules.
  3. Lyse des cellules par sonication pendant 5 x 15 s à 80% d'amplitude. Éliminer les débris cellulaires par centrifugation pendant 10 min à 7000 x g et 4 ° C. Effectuer une précipitation au sulfate d' ammonium à 30-60% de saturation pour précipiter les protéines dans la solution 35. Centrifugeuse pendant 15 min à 16 000 xg et 4 ° C. REMARQUE: La pastille 5LO peut être rapidement congelée et stockée à -80 ° C pendant jusqu'à 6 mois.
  4. Remettre en suspension le culot avec 20 ml de tampon de lyse et on centrifuge pendant 15 min à 40 000 x g et 4 ° C.
  5. Incuber le surnageant sur une colonne d'agarose ATP à 4 ° C pendant 30 min. Laver la colonne une fois avec une colonne volume de tampon de lyse contenant 0,5 M de NaCl. Éluer le 5LO avec 20 mM d' ATP dans un tampon de lyse contenant 10 uM de FeSO 4 et 20 pg / ml de catalase. Effectuer une Chromatographie par filtration sur gel pour éliminer l'ATP 35.
    NOTE: Le 5LO est instable et doit être utilisé immédiatement après purification. Dans le cas contraire, il est recommandé de mettre fin à l'étape de précipitation du sulfate d'ammonium (voir la note après l'étape 2.1.3).

3. Préparation du complexe protéine-Nanodisc

  1. Préparer un volume total de 100 ul de complexe. Mélanger 0,8 pM ND et 0,8 pM 5LO avec le présent du mM de Ca 1 dans le tampon standard MSP (20 mM de Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 0,5 mM et 1,5 mM de CaCl2) et incuber pendant 10 min sur la glace. NOTE: L'échantillon peut être stocké pendant jusqu'à un mois à 4 ° C 35.
ove_title "> 4. L'analyse des échantillons

  1. L'électrophorèse sur gel
    1. électrophorèse non dénaturante
      1. Mélanger 15 ul de l'échantillon avec 5 pi de tampon de charge (mM BisTris 50, 6 N HCl, 50 mM de NaCl, 10% (p / v) de glycerol et 0,001% de Ponceau S, pH 7,2) 49 et le charger sur un 4 - 16% de gel Bis-Tris pour effectuer l'électrophorèse.
      2. Remplir le réservoir de cathode avec un tampon lumière de cathode (50 bis mM de Tris; mM Tricine 50, pH 6,8 et 0,002% de Coomassie G-250) et le réservoir d'anode avec un tampon (50 mM de Bis Tris mM Tricine 50, pH 6,8) en cours d'exécution. Commencez la séparation en utilisant une tension constante à 150 V.
      3. Arrêter la séparation électrophorétique lorsque le front arrive à la fin de Coomassie du gel.
      4. Colorer le gel avec un protocole bleu norme Coomassie.
    2. électrophorèse dénaturant
      1. Mélanger 40 ul de l'échantillon avec 10 pl de tampon de charge contenant du SDS (0,05% (p / v) de bleu de bromophénol, 0,2 M de Tris-HCl,pH 6,8; 20% (v / v) de glycerol; 10% (p / v) de SDS; et 10 mM de 2-mercaptoéthanol) et le charger sur une 4 - gel à 20% de Tris glycine pour effectuer une électrophorèse.
      2. Remplir les réservoirs d'anode et de cathode avec un tampon de roulement (25 mM de Tris-HCl, pH 6,8, 200 mM de glycine et 0,1% (p / v) de SDS). Commencez la séparation en utilisant une tension constante à 150 V.
      3. Arrêter la séparation électrophorétique lorsque le front de chargement du colorant arrive à la fin du gel.
      4. Colorer le gel avec un protocole bleu norme Coomassie.
  2. Préparation de la solution NaPT
    1. Dissoudre 1 g de sel phosphotungstate de sodium dans 50 ml d'eau par agitation à la température ambiante pour donner une 2% (p / v) de solution acide.
    2. Ajuster le pH à 7,4 avec 1 M de NaOH. Enlever les particules en utilisant un filtre à seringue de 0,22 um. Conserver la solution à la température ambiante ou à 4 ° C.
  3. Préparation de l'échantillon pour l'analyse TEM
    1. Glow-décharge des grilles de cuivre revêtues de carbone (400 mesh) pendant 20 s à 30 mA pour rendre hydrophiles les grilles avant l'adsorption de l'échantillon. Placer 3,5 ul de l'échantillon (0,8 uM par rapport aux nanodiscs) sur la grille et laisser incuber pendant 30 s. NOTE: Le volume appliqué peut varier entre 2,5 et 5 pl, en fonction de la concentration de l'échantillon. Une gamme de concentration appropriée pour nanodiscs est de 0,5 - 1 uM.
    2. Éponger solution excédentaire en utilisant du papier filtre.
    3. Immédiatement tacher la grille avec une baisse de 2% NaPT pendant 30 s. Éponger l'excès de solution et de laisser la grille sécher à l'air.
    4. Évaluer les grilles par TEM. Un microscope à 120-200 keV tension d'accélération suffit d'estimer l'ampleur de l'empilement. NOTE: Pour le présent protocole, un microscope électronique à transmission calibré a été utilisé, équipé d'une émission de champ canon de 200 keV.
    5. Enregistrez les images TEM. Pour les images montrant de longues piles, ne traite pas plus loin; images montrent le complexe de nanodiscs, avec une protéine extrinsèque qui peut contenir quelquesshort stacks, mais la plupart des particules sont dans le complexe. Enregistrer plusieurs images et processus ces selon les méthodes standard pour obtenir la classe-moyenne et basse résolution, 3 modèle tridimensionnel du complexe.
      NOTE: Pour la collecte de données négatives-taches, les grilles ont été faites sur au moins trois jours différents. Pour chaque jour, incubations des échantillons frais (comme dans l'étape 3.1) ont été faites avant que la tache négative a été appliquée.

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Representative Results

La méthode que nous proposons dépend de la préparation de nanodiscs pour fournir la surface de la membrane pour la liaison protéine-membrane monotopique. Comme il n'y a pas de protéine transmembranaire incorporé dans la bicouche nanodisc lipidique, les nanodiscs sont ici désignés comme «nanodiscs vides» (figure 2A). Ceux - ci ont un poids moléculaire calculé de 256 kDa , pour une composition de deux protéines d'échafaudage et MSP1E3D1 environ 260 molécules de POPC 8. L' utilisation de ce rapport protéine: lipide pour la reconstitution, un pic majeur (figure 2A) a été élue pendant la filtration sur gel. Les fractions de pic autour de 9 ml (figure 2A) ont été examinés par le bleu électrophorèse sur gel natif 49, montrant une bande (figure 2B, piste 1). Bien que la bande correspond à une taille légèrement plus grande que la valeur calculée de 256 kDa, le diamètre nanodisc mesuré dans les images TEM correspond à laattendu 13 nm ± 0,5 nm.

Monotopique la protéine de la membrane 5-lipoxygénase (5LO) a été purifié comme décrit ci - dessus (protocole étape 2) et de façon plus détaillée 35 plus tôt. L'homogénéité de la 78 kDa 5LO a été analysé par électrophorèse SDS PAGE (figure 2C, piste 1) et est complètement fonctionnel 35 (non représenté).

Dans ce protocole, les conditions sont intentionnellement créées qui favorisent l'empilement des nanodiscs. Toutefois, il convient de noter que cet empilement est induite seulement dans les échantillons préparés pour l'imagerie par MET (dits échantillons), en particulier par l'addition de la phosphotungstate tache de sodium négatif dans la dernière étape après que tous les autres traitements et additions ont été faites. En fait, les images de nanodiscs NaPT colorées montrent l'empilement attendu (figure 3A) très tôt pour HDL 34 5, 50. Les "piles de pièces longues , vu de côté» (figure 3A) sont regroupées avec les nanodiscs phosphotungstate intercalée entre les bicouches, comme il est décrit schématiquement sur la figure 1A et proposé par Zhang et al. 32, 39.

Il est important de vérifier si divers ajouts dans les tampons affectent, prévenir ou même induire l'empilage, et comme cela deviendra évident ci-dessous, les effets des ions calcium nécessaire enquête. La figure 3B, l'empilement est toujours présent dans un échantillon , où les ions calcium sont ajoutés à la solution avant la coloration avec nanodisc NaPT.

L'étape essentielle du protocole est représentée sur la figure 4, où la membrane Poubelleprotéines ding est présent dans les solutions. L'empilement n'a pas pu être induite par la tache NaPT lorsque 5LO est lié à la surface membranaire des nanodiscs (figure 4A). Pour cet échantillon, le rapport molaire de 5LO à nanodiscs était de 1: 1, tel que représenté schématiquement sur la figure 1 (figure 1B, en bas à droite). En outre, comme la double couche lipidique des nanodiscs est accessible des deux côtés, par opposition à des liposomes, des échantillons avec un rapport de deux à un 5LO nanodisc ont été préparées, tandis que les images MET montrent encore moins d' empilage (figure 4B).

Pour la liaison, certaines protéines membranaires extrinsèques peuvent dépendre de la présence d'un lipide dans la membrane spécifique, tel que phosphoinositols 10, 11, 12 ou 10 phosphatidylsérine. Dans le cas de 5LO, la présence de Ca 2+ est nécesné- 43. La figure 4A et B, les ions calcium sont présents dans les solutions à nanodiscs et 5LO. En d' autres termes, l'absence d'empilage montre non seulement que la protéine est liée monotopique mais aussi que la liaison dépend des ions Ca 2+. Pour montrer cela, une solution contenant nanodiscs et 5LO mais sans calcium a été colorée avec NaPT et imagée par TEM (figure 4C). Comme prévu, 5LO ne peut pas se lier aux nanodiscs sans Ca2 +, en laissant le 5LO libre dans la solution, de sorte que la pile nanodiscs place (figure 4C).

Figure 1
Figure 1. Principe de Nanodisc Stacking et vue d' ensemble de la méthode. A. Principe de nanodisc empilage. L'addition de la coloration négative phosphotungstate de sodium à une solution de nanodiscs (à gauche) conduit à th e empilement des nanodiscs (à droite) en raison de forces électrostatiques (milieu, flèches) entre la bicouche de phospholipides et les molécules de PT (milieu, points noirs). B. Représentation schématique du protocole. nanodiscs vide (à gauche) se lient à une protéine de membrane extrinsèque (gris) pour former un complexe, représenté sous quatre angles différents (milieu du bas). La présence de la protéine monotopique empêche stériquement la nanodiscs de l'empilement lorsqu'ils sont colorés avec le sel phosphotungstate (en bas à droite), contrairement à l'empilement induit en l'absence d'objets de grande taille (en haut à droite). Les anneaux serre et orange représentent les deux emballage MSP autour du noyau phospholipides, qui est représenté en brun clair. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2. Analyse des Homogénéité Nanodiscs et 5LO. Chromatographie d'exclusion A. Taille de nanodiscs vides reconstitués. L'élution des pics nanodiscs à 9 ml. B. non dénaturant analyse électrophorétique en gel de la fraction de pic de la SEC représenté en (A). Lane M contient le marqueur. Une seule bande est présente dans la voie 1, où la fraction de pic à 9 ml a été chargé. C. Dénaturation analyse électrophorétique en gel purifié 5LO. Le 78 kDa 5LO montre comme une bande intense dans le couloir 1. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure 3
Figure 3. Formation Pile de Nanodiscs en l'absence de la protéine Analysé par MET. A. Nanodisc empilement a été induite wpoule colorée avec NaPT. Les "piles de pièces" sont les piles de nanodiscs lorsqu'elle est vue depuis le côté. Chaque nanodisc apparaît comme une bande blanche. B. Empilage n'a pas été perturbée par la présence d'ions calcium dans la solution de nanodisc lorsqu'ils sont colorés avec NaPT. Les barres d'échelle sont 100 nm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Prévention Formation Stack par la liaison de la protéine en présence d'un cofacteur analysé par MET. A. et B. Les ions calcium sont présents dans les mélanges de 5LO et nanodiscs à des rapports molaires de 1: 1 (A) ou 2: 1 (B). Plus 5LO se liant aux nanodiscs, moins nanodiscs sont disponibles pour le gerbage, comme illustré dans (B). Les complexes mono-particules dans boe (A) et (B) sont appropriés pour un traitement ultérieur 35. C. En l'absence d'ions calcium, 5LO peut pas se lier. NaPT coloration de cet échantillon montre empilement typique de nanodiscs, laissant le 5LO non lié. Les barres d'échelle sont 100 nm. Les images ont été acquises par une caméra 4K x 4K CCD à un grossissement de 69,500x. La taille des pixels de la caméra CCD est de 15 um, ce qui donne une valeur correspondante de 2,16 Å sur le niveau de l'échantillon pour les images EM. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

La méthode peut être séparée en trois parties: la reconstitution de nanodiscs vides, la préparation de complexes protéine-nanodisc, et la coloration négative pour le TEM de ces complexes. Chaque partie sera traitée séparément en ce qui concerne les limites de la technique, des étapes critiques, et des modifications utiles.

Reconstitution des nanodiscs vides. étapes et les limites critiques dans la production et l'utilisation de nanodiscs.

Pour la préparation des nanodiscs vides, il est indispensable d'optimiser le rapport MSP-à-lipide. Pour le MSP et les lipides ( en utilisant cholate comme détergent) la plus courante, des suggestions pour les rapports optimaux peuvent être trouvés dans la littérature (par exemple, 125-130 POPC par MSP1E3D1 8, 51 utilisé dans le présent protocole). Les différences obtenus par rapport aux rapports publiés peut dépendre de la méthode de détermination de la concentration en protéines, le rendement de lipid solvatation dans le détergent, et le procédé d'élimination du détergent de la solution.

Nous vous proposons d'effectuer l' élimination de détergent en utilisant des billes hydrophobes 48 (étape 1.3), tandis que les solutions possibles sont la dialyse ou l'addition de cyclodextrine 52, 53. Dans un premier temps , la dialyse a été utilisée pour la reconstitution des HDL 5, 34 et 54 est encore préféré. Quel que soit le procédé d'élimination du détergent, la vitesse est indispensable. Si le retrait est trop rapide (le volume de billes hydrophobes est trop importante), la transposition spontanée de MSP avec les lipides peuvent ne pas avoir le temps de se produire. Au contraire, de grandes quantités de liposomes et des agrégats de protéines peuvent se former. Les résultats de chromatographie d'exclusion stérique montreraient de grandes quantités de liposomes dans le volume vide, un pic suboptimale de nanodiscs reconstituées, et un plus grand pic de inutiliséMSP 4, 6, 51. Pour trop petit un volume de billes hydrophobes, l'élimination du détergent peut être incomplète, et les nanodiscs qui forment peut montrer une variation de tailles, où la plupart sont plus petit que prévu. On pourrait tester deux additions de petits volumes de perles hydrophobes au lieu d'une grande addition à ralentir la vitesse de reconstitution.

Le choix des lipides doit être soigneusement examinée 8, 9, 45, 46, 55, en fonction du but pour la préparation de nanodisc. En général, pour toutes les méthodes visant à la formation des membranes (reconstitution de nanodiscs ou de liposomes, ainsi que pour des expériences de cristallisation 2D), les lipides doivent être dans un "fluide" état 56. En dessous d'une certaine température, ee lipide est rigide. Au-dessus de ce que l'on appelle la température de transition (Tm), le lipide est fluide. On notera que certains lipides saturés couramment utilisés ont une Tf bien supérieure à la température ambiante. En outre, pour les mélanges de lipides, la miscibilité de lipides muse être considérée 57. La température optimale pour la formation Nanodisc est de l'ordre de la transition de phase (Tf) du lipide.

Le détergent dans le présent protocole est le cholate de sodium 8. Si un autre détergent doit être utilisé, les mêmes concentrations que celles utilisées pour le cholate ne peuvent pas être utilisés directement. Certains détergents doux dissolvent les lipides moins efficacement, et une concentration plus élevée peut être nécessaire. Le gâteau lipidique obtenu après l'évaporation du chloroforme (étape 1.2.2 dans le protocole) doit être dissous dans une solution limpide par le détergent. Tourbillonnement, gel-dégel cycles, des bains à ultrasons, ou sonication pourrait être utilisé pour accélérer la solubilisation.

Pour combinations de lipides (-Mélanges), MSP et détergents autres que ceux qui sont utilisés ici, les titrages pour minimiser les grands agrégats et des liposomes ou excès de MSP sont nécessaires 4, 6, 51, 58. Pour certaines combinaisons de MSP et les phospholipides, l'optimisation peut être plus difficile que pour les autres 4, 6, 51, et il devient indispensable de déterminer la teneur des fractions de pic. La méthode la plus précise pour l'analyse de la composition de nanodisc et la taille est de déterminer le nombre de phospholipides par MSP par analyse phosphate 4 et calculer le poids moléculaire nanodisc. taille de Nanodisc peut être estimée par bien résolue électrophorèse, gel non dénaturant; diffusion de lumière dynamique (DLS) 59; ou négatif-tache TEM, pour ne nommer que quelques méthodes. Quant à la négaProtocole d'empilement tive-tache induite présentée ici, la mesure de la largeur des empilements présentes dans les images MET donne le diamètre des nanodiscs.

En ce qui concerne l'expression et la purification de la protéine d'échafaudage membranaire, toutes les précautions habituelles et les préoccupations pour une protéine soluble doivent être prises. Les plasmides disponibles peuvent contenir différentes balises et les sites de clivage de protéase dans le cas où l'étiquette doivent être enlevés avant d'utiliser le MSP.

5LO, la protéine monotopique utilisé dans le protocole, inactive rapidement à moins que des précautions sont prises, décrites ailleurs 35 et dans les références qui y sont. En bref, le fer catalytique se perd facilement, et les conditions oxydantes peut provoquer la dimérisation du 5LO. Comme indiqué dans la note (protocole étape 2.1.3), la purification peut être arrêtée après l'étape de précipitation et des aliquotes stockées jusqu'à une utilisation ultérieure. Après la purification d'une aliquote, la protéine doit être utilisée dans quelques heures d ue l'inactivation rapide 35.

Les étapes critiques dans la préparation des complexes protéine-nanodisc.

La taille de la protéine monotopique par rapport à la zone de nanodisc est importante. La longueur de la chaîne protéique MSP1E3D1 correspond à un nanodisc avec un diamètre interne de 10,5 nm et environ 8900 Å zone 2 8 bicouches. Cela correspond bien à la superficie déclarée pour la partie de la membrane intégrée de 5LO 45. Ainsi, notre ratio de liaison prévu était de 1: 1, ou au plus 2: 1 5LO par nanodisc. Cela a prouvé être correctes, tel que rapporté dans une expérience de titrage 35. Cependant, la liaison de deux 5LO par nanodisc maximale n'a pas été obtenu, comme décrit ailleurs 35. Un peu plus grand nanodisc pourrait éventuellement permettre une pleine 2: 1 liaison pour des expériences où cela est souhaitable, mais dans ce cas, le ratio 1: 1 est l'objectif principal.

ove_content "> Le choix de lipides optimaux pour la protéine-nanodisc formation du complexe peut être facilité par la connaissance précédente. Ce fut le cas dans le présent protocole, où le choix des lipides était POPC synthétique 35. Les deux variations dans le groupe de tête lipidique 46 et variations à la saturation des chaînes acylés 45 ont été testés dans des études de liaison des liposomes 5LO. l' activité 5LO a été augmentée par la liaison à des liposomes contenant des phospholipides de choline insaturé dans le groupe acyle position sn-2 de la chaîne 45, 46. Si les exigences de lipides spécifiques ne sont pas connues, mais l'identité de la membrane d' origine est connu, des extraits de lipides naturels peut être testé pour la première 55.

Une dépendance cofacteur était connu pour 5LO, qui dépend des ions calcium pour la liaison de la membrane 43. Il est difficile de supprimer complètement le calcium des solutions. Ici, l'agent complexant EDTA est présent dans les tampons en quantités ajustées de laisser une quantité contrôlée de libre ions Ca 2+. Les calculs de molécules libres et liés dans les tampons ont été faites par le logiciel BAD 60 pour les tampons contenant plus d'un type d'agent complexant 35. L'effet sur la concentration d'un cofacteur partiellement soluble dans la membrane ne soit pas comptabilisée par ce logiciel.

Les étapes critiques dans la coloration négative de nanodiscs pour promouvoir la formation pile.

Pour le protocole à portée de main, où l'empilement maximale est souhaitée, la tache devrait être le sel de sodium de phosphotungsten. Différents sels de tungstène sont disponibles, et on a observé que l'acide phosphotungstique était moins efficace pour l'empilement (non représenté). Pour des raisons obscures, il semble que des quantités élevées de sodium lors de PT coloration favorise l'empilement. En outre, le tampon d'échantillon, on a montré que plus la suite de sodiument, plus la quantité d'empilement induite 32. Pour la même raison, après que l'échantillon a été appliqué à la grille EM, lavage à l'eau avant que la coloration ne doit pas être effectué, car cela réduit également l'empilage. D'autre part, certains empilage a toujours été induite, bien que jamais dans la mesure nécessaire pour la meilleure performance du protocole.

Bien sûr, cofacteurs comme les ions Ca 2+ ici doivent être vérifiés pour l' interférence avec la tache négative ou avec les nanodiscs. Pour le présent protocole, les ions calcium auraient précipité un tampon phosphate, de sorte qu'un tampon Tris a été utilisé. Les nanodiscs ne sont pas empilés par des ions Ca 2+ en soi, comme vérifié en utilisant une autre coloration négative, uranyle formate 35, ni ne calcium empêchent l' empilement NaPT-induite (figure 3B).

Pour une petite protéine monotopique, la taille supplémentaire ajoutée par liaison à un nanodisc peut le rendre détectable dans cryoEM. UNEnanodisc très grande par rapport à la protéine peut ne pas être optimale, car une petite protéine sur une grande nanodisc ne peut pas empêcher l'empilage. Cependant, la forme de la protéine extrinsèque pourrait avoir une influence. Bien qu'aucun rapport précis peut être fourni à partir de maintenant, une surface de bicouche nanodisc légèrement plus grande que la surface de liaison estimée de la protéine est recommandée. Avec cette restriction, la protéine de liaison maximale serait une protéine de chaque côté de la nanodisc.

Limitations générales et avantages de la méthode.

Le protocole dépend de la disponibilité d'un TEM et l'équipement connexe, qui ne sont pas disponibles dans tous les laboratoires. Cependant, un microscope électronique à 120- 200 kV équipé d'une caméra CCD classique serait tout à fait suffisant pour la détection d'empilement. La coloration négative NaPT est effectuée à la température ambiante, et les grilles peuvent être stockées à cette température pour une visualisation ultérieure.

TEM imaging montrerait rapidement si l'empilement a été empêchée ou non. Pour les images montrant des complexes protéine-nanodisc (par exemple, la figure 4A et B), un traitement ultérieur pour obtenir des informations structurales peuvent être effectuées. Détails structurels d'un échantillon négatif teinté peut atteindre 1 nm et peuvent fournir des informations structurelles utiles 29. Dans les laboratoires dédiés à la détermination de structure par cryoEM, la coloration négative des échantillons est une procédure standard. L'utilisation de notre protocole serait un ajout rapide et simple à des procédures régulières.

Certaines protéines monotopiques sont ancrées à la membrane par une myristoylation, une palmitoylation, ou des taches hydrophobes sur la surface de la protéine, ce qui rend nécessaire pour former le complexe protéique nanodisc par le même mode opératoire que pour l'incorporation d'une protéine transmembranaire dans nanodiscs 13. Ici, l'un des sous-unités dans le complexe protéique contient amyristoylation sur une queue N-terminale flexible pour la liaison membrane. Pour uranyle images TEM acétate colorées, on a dit que le complexe de protéine est liée perpendiculairement à la membrane, et non pas sur le côté de la nanodisc. Ceci et d' autres résultats ont confirmé une structure rigide pour la fixation de la membrane 13. Pour cette liaison, NaPT coloration selon notre protocole proposé montrerait les mêmes particules individuelles uniformément réparties. Cependant, si la pièce jointe a été par une chaîne flexible, la coloration de l'acétate d'uranyle pourrait ne pas avoir donné un résultat clair. Nous pensons que, pour des complexes de protéines membranaires-joint la chaîne flexible, la coloration NaPT peut induire les nanodiscs à empiler, ce qui démontre la typique "pile de pièces," mais maintenant décoré par la protéine fixée sur les côtés.

Pourquoi utiliser nanodiscs si liposomes peuvent être utilisés? L'optimisation des lipides, des cofacteurs, ou d'autres paramètres pourraient très bien être testé dans des liposomes pour la liaison de pprotéines ipheral (cf. 5LO). Empilement NaPT induite par des liposomes a été démontrée 32, donc une protéine monotopique pourrait empêcher liposome empilement. Cependant, les tailles des liposomes par rapport aux protéines monotopiques et nanodiscs vient également en jeu. Une grande protéine extrinsèque peut être en mesure d'empêcher l'empilement des liposomes, tandis qu'une petite protéine, comme le 78-kDa 5LO, peut-être pas moins présent dans nombre élevé par liposome. De petits liposomes peuvent être préparés, mais plus la vésicule, plus la courbure de sa membrane. La bicouche nanodisc est plat. Tester les différents paramètres en utilisant nanodiscs pourrait être moins rentable en raison de la MSP. D'autre part, pour certains liposomes, des cofacteurs ou des substrats coûteux qui cloison partiellement dans la membrane, et en outre, à l'intérieur des liposomes, peuvent être nécessaires en plus grandes quantités. En conclusion, la plate-forme nanodisc offre la possibilité de choisir une zone définie pour la liaison d'une précision n mbre de protéines. La zone de bicouche est accessible à partir de deux côtés et est plat.

Importance de la méthode.

La détermination de la structure 3D des protéines ou des macromolécules complexes de visualiser le fonctionnement interne des cellules. Dans cet environnement encombré, des protéines spécifiques sont actifs sur les surfaces de la membrane, seuls ou en complexe avec d'autres protéines, mais habituellement de telle sorte que l'interaction physique avec les composants dans la bicouche lipidique est une partie de leur fonction mécanique. Pour certaines protéines, la conformation en solution est modifiée lors de l'incorporation de la membrane, tandis que d'autres sont attachés à la membrane, mais néanmoins de modifier la conformation ou de l'orientation sur la membrane due à une sorte de gâchette. Un chemin d'entrée du substrat hydrophobe peut alors s'ouvrir, ou une conformation qui permet la liaison à une protéine transmembranaire peut se produire. Pour obtenir la structure, ou au moins des informations de structure, de telles protéines périphériques liés à la membrane est difficile.

jove_content "> Nanodiscs ont été utilisées dans des études relatives à l' orientation et de la fonction sur les membranes 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Cytochrome P450, central dans la désintoxication, est ancré à la membrane par une α-hélice et contient un groupe hème dans sa partie globulaire, ce qui permet des mesures de dichroïsme linéaire 15. les résultats indiquent une orientation de l'hème par rapport à la membrane en étroite accord avec les simulations effectuées, renforçant ainsi les autres conclusions tirées des simulations du cytochrome P450 membrane intégré. pour une GTPase ancrée à la membrane dans une petite nanodisc, des études de RMN ont pu identifier deux zones différentes de la protéine avec une membrane d'interface et chacun en outre, comment nucléo marée liaison induit un commutateur d'une interface à l'autre 17. Mutations et liaison effecteur, ainsi que la liaison GTP, ont été étudiés dans un autre GTPase dans les Ras-superfamille de trouver un certain nombre d'effets sur l' activité qui dépendaient de l'orientation sur la membrane, ce qui aurait une incidence sur oncogénique de signalisation 16. 5LO a une conformation soluble 61 et nécessite du calcium pour la liaison sur les membranes nucléaires 43. En utilisant des liposomes unilamellaires géantes, des expériences à infrarouge polarisé, atténué, à réflexion totale ont été effectuées 46. Le résultat implique que la β-baril N-terminal se lie aux membranes, avec l'axe de symétrie de la β-cylindre incliné d'environ 45 degrés par rapport à la membrane normale. Le domaine C-terminal 5LO est un faisceau d'α-hélicoïdale presque cylindrique, ce qui a été proposé de se lier avec le grand axe parallèle à la membrane 45,= "xref"> 46. Dans nos travaux antérieurs sur 5LO embarqué sur nanodiscs, la zone de la bicouche a été choisi pour permettre une 5LO de chaque côté de l'orientation suggérée ci-dessus 35. Les images TEM ont confirmé cette orientation, mais à faible résolution 35. Si, par exemple, seule l'extrémité N-terminale β-canon est liée, mais pas le domaine C-terminal, un nombre plus élevé de 5LO par nanodisc aurait été obtenue. En outre, une autre protéine pourrait modifier la liaison de la membrane et l'orientation de 5LO, comme un activateur de la protéine transmembranaire 5-lipoxygénase protéine d'activation, FLAP. FLAP a été reconstitué dans nanodiscs, et nous utilisons TEM et d'autres méthodes pour étudier l'interaction entre 5LO et FLAP. Les résultats d'interaction dans l' acide arachidonique endogène étant converti en leucotriène A4, qui est la première étape dans la synthèse d'agents chimio - attractifs puissants impliqués dans de nombreuses maladies inflammatoires , 41, 42 sup>, 62.

Le complexe 5LO-nanodisc est calculée pour avoir un poids moléculaire de 334 kDa, près de la limite d'environ 200 kDa pour enquête structurelle par cryoEM. Cependant, comme la structure atomique de 5LO 61 est disponible, son ancrage dans un moyen de résolution, en 3 dimensions d' électrons carte de densité donnerait des informations sur l'interaction avec la membrane nanodisc.

Les innovations dans la technologie cryoEM ne sont pas seulement pousser la résolution à l'échelle atomique 63 , mais aussi pousser la limite de taille des protéines plus petites. Pour la détermination de structure par RMN 22, la situation est à l'opposé, le but est d'augmenter la gamme de taille, qui est maintenant approche de 200 kDa. Récemment, la liaison des protéines de petites GTPases membrane ont été étudiées par RMN 16, 17. Ces protéines, de seulement environ 20 kDa, nousre attaché aux petites nanodiscs d'un diamètre intérieur de 7,6 nm, la formation de complexes d'environ 130 kDa. Dans le futur, les complexes de taille similaire peuvent être étudiés à la fois par RMN et cryoEM pour élucider les différents aspects de la membrane de la protéine de liaison.

Une extension du protocole pourrait être d'enquêter sur nanodiscs contenant une protéine transmembranaire (TMP) dans la bicouche nanodisc. empilement NaPT induite par des TMP-nanodiscs pourrait être comparé à nanodiscs vides contenant la même composition lipidique. Grandes boucles extramembranaires empêcheraient l' empilage, tandis que des boucles courtes ne peut pas empêcher l' empilement 64. Cela pourrait être transformé en un avantage, car le protocole pourrait être utilisé pour étudier les protéines se liant spécifiquement à la protéine transmembranaire.

L'avantage de cette méthode est que l'interaction de la membrane peut être visualisée immédiatement. La relative simplicité de fabrication de grandes quantités de nanodiscs vides implique que l'on peut étendreCette méthode pour cribler pour des conditions différentes, comme le pH, la température, des tampons, et la dépendance à cofacteur de la protéine de liaison à monotopique. En effet, alors que la plate - forme de nanodisc 9 a été mis au point pour la stabilisation des protéines transmembranaires et est de plus en plus utilisé à cet effet, son potentiel d'études sur les grands nombres de plus ou moins de protéines extrinsèques transitoirement se liant à l' intérieur des cellules présentes doit clairement être conservé à l'esprit.

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Acknowledgments

Les auteurs remercient le Conseil suédois de la recherche, Conseil du comté de Stockholm, et les fonds KI pour leur soutien. L'expression et la purification de MSP a été réalisée au Karolinska Institutet / SciLifeLab Protein Science de base Facility (http://PSF.ki.se). Les auteurs tiennent également à remercier le Dr Pasi Purhonen et le Dr Sjöberg Mathilda pour partager leur expertise technique et leur aide en temps opportun.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transmission electron microscope: JEOL2100F JEOL
CCD camera Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany
Glow discharger Baltec
TEM grid: 400 mesh TAAB GM016/C
Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5 Agilent Technologies 5190-2526
Superdex 200 HR 10/300 GE Healthcare Life Sciences 17-5172-01
Plasmid: MSP1E3D1 Addgene 20066
Bacteria: BL21DE3 NEB C2527H
Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2 Protein Science Facility, KI, Solna
Purification Matrix: ATP agarose Sigma Aldrich A2767
Purification Matrix: HisTrap HP-5 mL GE Healthcare Life Sciences 17-5247-01
Lipid: POPC Avanti polar lipids 850457C 25 mg/mL in chloroform
Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin Bio-Rad 1523920
13 mm syringe filter: 0.2 μm Pall life sciences PN 4554T
Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate Sigma Aldrich 31648
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Bio-Rad 161-0301
Protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001
TCEP Sigma Aldrich 646547
Detergent: Sodium cholate hydrate Sigma Aldrich C6445-10G
Sodium Cholate 500 mM Sodium cholate. Resuspend in miliQ water and store at -20 °C.
Lipid Stock 50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl. Store at 4 °C for a week; or
Store -80 °C for a month, after purging the solution with nitrogen.
MSP standard buffer 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA.
Store at 4 °C.
Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer Thermo Fisher Scientific BN2001 50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8
Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer Thermo Fisher Scientific BN2002 50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8, 0.002% Coomassie G-250
Non-Denaturaing Electrophoresis 4x Sample loading Buffer Thermo Fisher Scientific BN2003 50 mM Bis-Tris, pH 7.2, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S
Denaturaing Electrophoresis Running Buffer In-house recipe: 25 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1% (w/v) SDS
Denaturaing Electrophoresis 5x Sample loading Buffer In-house recipe: 0.05% (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl, pH 6.8, 20% (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS, 10 mM 2-mercaptoethanol
Terrific broth Tryptone - 12.0 g, Yeast Extract - 24.0 g, 100 mL 0.17 M KH2PO4 and 0.72 M K2HPO4, Glycerol - 4 mL.
Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 mL and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium.

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B. Kumar, R., Zhu, L., Hebert, H.,… More

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