Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Metod för att visualisera och analysera membraninteragerande proteiner genom transmissionselektronmikroskopi

Published: March 5, 2017 doi: 10.3791/55148
Automatic Translation
1, 2, 1,2, 1,2
1Department of Biosciences and Nutrition, Karolinska Institutet, 2School of Technology and Health, KTH Royal Institute of Technology

Introduction

I medicinsk forskning, är mycket uppmärksamhet inriktad på membranproteiner, antingen inneboende eller yttre, deltar i en mängd olika lipid interaktioner. Att arbeta med lipid-interagerande proteiner innefattar att antingen välja ett substitut för de lipider, såsom detergenter, amphipols 1, eller små proteiner 2, eller att hitta ett membran substitut som håller proteinet lösligt och aktivt. Lipoic membran substitut inkluderar liposomer och nanodiscs (ND) 3, 4.

Nanodiscs är nära främmande membranplattformar som utvecklats av ingenjörsproteindelen, ApoA-1, i high-density lipoprotein (HDL) finns naturligt i blodet. ApoA-1 är en 243 rest-lång kedja av korta amfipatiska a-helixar och har en lipid-fritt löslig konformation. In vitro i närvaro av lipider, två kopior av proteinet ApoA-1 spontant ordna att omringa hydrophobic acylkedja parti av ett lipiddubbelskikt patch 5. Manipulerade versioner av ApoA-1 kallas allmänt membran byggnadsställningar proteiner (MSP), och ett ökande antal är kommersiellt tillgängliga som plasmider eller som renade proteiner. Upprepningar eller deletioner av de a-helixar i ApoA-1 resulterar i längre 6 eller kortare 7 membran byggnadsställningar proteiner. Detta i sin tur gör det möjligt att bilda skivor runt 6 nm 7-17 nm åtta i diameter. Det finns olika typer av applikationer för nanodiscs 3, 9. Det mest använda ansökan är att tillhandahålla en nästan infödda membranmiljö för stabilisering av ett integralt membranprotein 8, tidigare 3, 9 över. En mindre utforskas användning är att tillhandahålla en nanoskala membranyta för studier avperifert membranprotein 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Avsnitt 1 i protokollet nedan visualiserar förfarandet för nanodiscs bestående av fosfolipider och membran byggnadsställningar protein.

Provberedning är en flaskhals i de flesta metoder. Metod specifika prover kan lägga särskild information, men de också göra jämförelser av resultaten svårt. Därför är det enklare när proverna är multimodala och kan användas direkt i ett flertal olika metoder. En fördel med användningen av nanodiscs är den lilla storleken på nanodisc i jämförelse med liposomer (t.ex., kan proverna direkt användas för både TEM och icke-denaturerande gelelektrofores, såsom i föreliggande protokoll).

18. Emellertid har ingen hög upplösning 3D-strukturen för en monotopic membranprotein inbäddade på en liposommembranet publicerad ännu, så vitt vi vet. Guld nanopartiklar eller antikroppar kan användas för att visualisera proteinerna binder till liposomer eller vesiklar med hjälp av TEM 19. Även om dessa prober är mycket specifika, kan de störa membranbindande proteiner genom döljande membranet bindningsstället eller genom att maskera intresseområden med de flexibla delarna. Guldmärkt eller antikroppskomplex proteiner skulle förmodligen kunna analyseras på en gel, men detta skulle öka kostnaden för experimentet.

Även liposomer är en utmärkt plattform, kan man inte vara säker på att poplering har ett speciellt förhållande av protein per liposom, en funktion som kan utforskas med hjälp av nanodiscs 20. I en liposom, kan kofaktorer och substrat vara instängd i den lösliga inre. Ämnen som är membranlösliga kommer att dela samma öde för båda typerna av membran mimetika. Icke desto mindre, eftersom dubbelskiktet arean är mindre i nanodiscs, är en mindre mängd substans som krävs för att mätta de nanodisc membranen.

Förståelse proteinfunktion genom fastställandet av den atomära strukturen har varit avgörande för många forskningsområden. Metoder för proteinstrukturbestämning inkluderar röntgen 21; kärnmagnetisk resonans (NMR) 22, 23; och transmissionselektronmikroskopi (TEM) 24 vid kryogena temperaturer, cryoEM. Upplösningen av cryoEM har på senare tid förbättrats avsevärt, främst på grund av användningen av direkt elektron detectors 25, 26. Makromolekylerna avbildas i tunn, glaskroppen is 27 i en nära-naturliga tillstånd. Men på grund av den låga kontrasten av biologiska molekyler, de blir svåra att upptäcka i storleksområdet på 100 - 200 kDa. För lämplig storlek prover, kan datainsamlingen göras och förfarandet för enda partikel återuppbyggnad kan tillämpas för att erhålla en struktur 28.

Emellertid är bestämningen av proteinstrukturen med TEM en flerstegsprocess. Det börjar oftast med utvärderingen av prov monodispersitet av negativ fläck TEM 29 användning av salter av tungmetaller som phosphotungsten (PT) 30 eller uran 31. Rekonstruktion av en lågupplöst modell av negativt färgad makromolekyl är vanligtvis gjord och kan ge viktig information om den molekylära strukturen 29. Parallellt,datainsamling med hjälp av cryoEM kan börja. Försiktighet bör iakttas vid bedömningen negativ fläck TEM uppgifter för att undvika feltolkning av artefakt bildning. En särskild artefakt är effekten av PT fläck på fosfolipider och liposomer 32, vilket resulterar i bildandet av långa stavar liknar staplar av sedd från sidan 33 mynt. Sådana "rouleau" eller "stackar" (nedan betecknade som "stackar") observerades tidigt för HDL 34, och senare även för nanodiscs 35.

Stapling och omformning av membran kan uppstå av många anledningar. Till exempel kan den framkallas genom co-faktorer som koppar, som visas av TEM avbildning i en ammoniummolybdat fläcken 36. En fraktion av de membranlipider i liposomer innehöll en iminodiättiksyra huvudgrupp mimicking metallkomplexbildning genom EDTA, således stapling liposomer efter tillsatsen av kopparjoner 37. Stapeln bildandet av fosfolipider av PT iakttogs tidigt; har dock senare arbete inriktat på att avlägsna eller avskaffa denna artefakt bildning 38.

Här föreslår vi en metod för att dra nytta av NAPT-inducerad nanodisc stapling för att studera membranbindande proteiner genom TEM. Kort sagt, skulle proteinbindning på nanodiscs hindra nanodiscs från stapling. Även om orsakerna för stapling är inte klart, föreslogs det 39 att det finns en elektrostatisk interaktion mellan fosfolipider och den fosforylgruppen av PT, vilket orsakar att skivorna att hålla sig till varandra (Figur 1A). Hypotesen bakom våra protokoll är att när ett protein binds till en nanodisc, är de flesta av de fosfolipidyta inte availa ble för interaktionen med PT på grund av steriskt hinder av proteinet. Detta skulle förhindra bunten bildning (Figur 1B). Två slutsatser kan dras. Först, förhindrande av stapling innebär att proteinet av intresse har bundit till membranet. För det andra kan det protein-ND-komplexet behandlas med standardenkelpartikelbearbetningsmetoder 24, 40 för att få en grov morfologi av komplexet. Vidare analyser medelst metoder som icke-denaturerande gelelektrofores eller dynamisk ljusspridning kan utföras.

För att visa denna hypotes använde vi membranbindande protein 5-lipoxygenas (5LO), som är involverat i många inflammatoriska sjukdomar 41, 42. Detta protein 78-kDa kräver kalciumjoner för att binda till dess membran 43. Även om detta membran förening har studerats i stor utsträckning med hjälp av liposomers = "xref"> 44, 45, 46 och membranfraktioner 47, dessa kan inte användas för TEM-analys och strukturbestämning.

Framställningen av nanodiscs börjar genom att blanda MSP med lipid suspenderades i tvättmedels natriumcholat. Efter inkubation på is under 1 h, detergenten avlägsnas långsamt från rekonstituering blandningen med användning av en adsorbent-harts. Denna typ av material är ofta gjorda av polystyren formas till små pärlor. De är relativt hydrofoba och har en stark preferens för att binda rengöringsmedel jämfört med lipider 48. Efter avlägsnande av de hydrofoba kulorna och utföra förtydligande med hjälp av centrifugering, är de nanodiscs renades genom storleksuteslutande kromatografi (SEC). De renade nanodiscs är blandade med en monotopic membranprotein (och eventuella kofaktorer) i ett ekvimolärt förhållande (eller flera förhållanden för en titrering) och lämnas att rEACT (15 min). Analys med TEM utförs av mikroliter-mängder prov applicering på glöd-urladdat, kolbelagda galler och sedan genom att utföra negativ färgning med NAPT. Samma prov från det att alikvoter applicerades på TEM galler kan användas för analys av icke-denaturering eller SDS PAGE-gel-elektrofores, samt av olika typer av aktivitetsmätningar, utan större förändringar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Framställning av Nanodiscs

  1. Expression och rening av membran byggnadsställningar protein 8, 35
    1. Uttrycka den His-märkt MSP1E3D1 i E. coli BL21 (DE3) T1R pRARE2 stammen i kolvar. Bered en 50-ml över natt-startkultur med LB-medium kompletterat med 50 | ig / ml kanamycin vid 37 ° C. Späd över natt-startkultur i 2 L av Terrific Broth-medium kompletterat med 50 | ig / ml kanamycin.
    2. Odla cellerna vid 37 ° C tills den optiska densiteten vid 600 nm (OD 600) når ungefär 3. inducera proteinexpression med 0,5 mM isopropyl-β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) under 3 timmar vid 18 ° C.
    3. Förbered lyseringsbuffert (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 100 mM NaCl; och 10% glycerol). Tillsätt 1 mM TCEP omedelbart före användning.
    4. Efter 3 h av induktion vid 18 ° C, skörda cellerna genom centrifugering under 10 min vid 4500 xgoch 4 ° C. Kassera supernatanten, väga de skördade cellerna och återsuspendera dem i lysbuffert vid ett förhållande av 2 ml lyseringsbuffert per g celler.
    5. Lyserar cellerna genom pulsad sonikering (repetitionshastighet: 4 s ON, 4 s FRÅN) under 3 min vid 80% amplitud.
    6. Centrifugera lysaten under 20 min vid 49000 xg och 4 ° C. Kasta pelleten från denna centrifugering.
    7. Injicera supernatanten i en 5-ml Ni + kelaterande kolonn ansluten till ett automatiserat vätskekromatografisystem företrädesvis hålls vid 4 ° C.
    8. Före elueringssteget (steg 1.1.9), tvätta kolonnen med buffertarna 1 - 3 nedan för att avlägsna alla proteiner utom His-märkt MSP. Övervaka proteinhalten vid 280 nm för att följa reningsförfarandet; UV-inspelning vid 280 nm bör gå tillbaka till baslinjen efter varje tvätt.
      1. Tvätta med tvättbuffert 1: 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, och 1% Triton, pH 8,0.
      2. Tvätta med tvättbuffert 2: 40 mM Tris-HCl, 300 mMNaCl, 20 mM imidazol, och 50 mM natriumcholat, pH 8,0.
      3. Tvätta med tvättbuffert 3: 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl och 50 mM imidazol, pH 8,0.
    9. Eluera MSP med 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl och 500 mM imidazol, pH 8,0.
    10. Ändra bufferten till MSP standardbuffert (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM NaCl; och 0,5 mM EDTA) genom gelfiltrering 8, 35; avkastningen per parti bör vara cirka 7 mg L -1.
  2. Framställning av fosfolipid-stamlösning
    1. Lägga 305 mikroliter av en-palmitoyl-2-oleoyl- sn-glycero-3-fosfokolin (POPC) upplöst i kloroform vid en koncentration av 25 mg / ml till en glasbägare och indunsta kloroformen genom spolning av den med en svag ström av kväve . Torka lipid över natten i en vakuumexsickator. Anmärkning: Detta steg utförs för att avlägsna lösningsmedlet från lipid, som lämnar en tunn film av lipid på botten av glasbägaren.
    2. Suspendera lipid kakan i 200 mikroliter av MSP standardbuffert innehållande 100 mM natriumcholat genom att vortexa röret tills lösningen blir transparent; detta kommer att ge en lösning med en POPC koncentration av 50 mM.
      OBS: I allmänhet bör det molära förhållandet mellan lipid och detergent vid denna punkt vara 1: 2 (lipid: detergent) 8. Denna lipid-rengöringsmedel blandning kan förvaras vid -80 ° C under nästan två månader.
  3. Framställning av hydrofoba pärlor för detergentavlägsnande
    1. Placera 5 g pärlor (torrvikt) i en 50-ml rör.
    2. Tvätta pärlorna med 30 ml 100% metanol och därefter med 40 ml ultrarent vatten.
    3. Tvätta pärlorna med 10 ml MSP standardbuffert. Slutligen, lagra pärlorna med 15 ml MSP standardbuffert vid 4 ° C.
  4. Nanodisc rekonstitution
    1. Dispensera 190 mikroliter av MSP1E3D1 (0,124 mM) i ett mikrofugrör och tillsätt 61,5 mikroliter av fosfolipid stamlösning (50 mM POPC) till samma rör. Inkubera rekonstitution blandningen på våt is under 1 h. OBS: Detta är lika med ett molärt förhållande av 1: 130 (MSP1E3D1: POPC).
    2. Lägg hydrofoba pärlor vid en koncentration av 0,5 g pärlor per ml efter beredning blandning för att initiera självorganiserande processen. Inkubera i en roterande inkubator under 16 h vid 4 ° C.
    3. Efter inkubation för att centrifugera i 10 minuter vid 13.000 xg och 4 ° C avlägsna fällningar och aggregat. Kasta pelleten och spara supernatanten.
    4. Jämvikta storleksuteslutande kromatografi kolonn (monterad på ett automatiserat kromatografisystem vätska) med MSP standardbuffert tills absorbansen vid 280 nm är stabil. Injicera supernatanten i kolonnen och samla toppfraktionerna.
    5. Mätning av koncentrationerna av nanodiscs i toppfraktionerna vid 280 nm. Använda den molära extinktionskoefficienten för MSP1E3D1 (e = 29910 cm -1 M -1) för beräkning av den nanodisc koncentrationen. OBS!antal lipider per nanodisc kan mätas genom en kombination av radiomärkta lipider och fosfatanalys 4 eller genom fosfatanalys ensam.

2. Beredning av Monotopic Protein 5-lipoxygenas 35

  1. Förbereda en över natten startkultur. Supplement 50 ml LB-medium med 100 | j, g / ml ampicillin. Inokulera mediet med E. coli BL21 (DE3) innehållande plasmiden enligt 5-lipoxygenas-genen (ALOX5). Späd över natt-startkultur i expressionsmedium innehållande 42 mM Na 2 HPO 4, 24 mM KH 2 PO 4, 9 mM NaCl, 19 mM NH4CI, 1 mM MgSO 4, 0,1 mM CaCl2, 0,2% D-glukos, 0,1 %, 5 ^ M FeSO 4, och 100 ug / ml ampicillin. Odla cellerna tills OD 600 är ~ 0,5 vid 25 ° C. Inducera proteinuttryck med 0,2 mM IPTG under 16 timmar vid 20 ° C 35.
  2. Skörd genom centrifugering under 10 min vid 7000 xg och 4 ° C och kasta bort supernatanten. Väg pelleten finns längst ned i rör som innehåller de skördade cellerna och återsuspendera de skördade cellerna i lysbuffert (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 100 mM NaCl; 10% glycerol; och 1 mM TCEP) innehållande proteashämmare och 0,5 mg / ml 35 lysozym i ett förhållande av 2 ml lyseringsbuffert per g celler.
  3. Lyserar cellerna genom sonikering i 5 x 15 s vid 80% amplitud. Avlägsna celldebris genom centrifugering under 10 min vid 7000 xg och 4 ° C. Utföra ammoniumsulfatutfällning till 30-60% mättnad för att fälla ut proteinerna i lösningen 35. Centrifugera i 15 minuter vid 16.000 xg och 4 ° C. OBS: 5LO pelleten snabbt kan frysas och förvaras vid -80 ° C i upp till 6 månader.
  4. Suspendera pelleten med 20 ml lyseringsbuffert och centrifugera i 15 minuter vid 40.000 xg och 4 ° C.
  5. Inkubera supernatanten på en ATP-agaros-kolonn vid 4 ° C under 30 min. Tvätta kolonnen en gång med en kolonn-volym av lysbuffert innehållande 0,5 M NaCl. Eluera 5LO med 20 mM ATP i lysbuffert innehållande 10 ^ M FeSO 4 och 20 mikrogram / ml katalas. Utför gelfiltreringskromatografi för att avlägsna ATP 35.
    OBS! 5LO är instabil och bör användas omedelbart efter rening. Annars, är det rekommenderat att stoppa vid steget av ammoniumsulfatutfällning (se anmärkningen efter steg 2.1.3).

3. Beredning av Nanodisc-proteinkomplexet

  1. Förbereda en total volym av 100 mikroliter av komplexet. Blanda 0,8 | iM ND och 0,8 pM 5LO med 1 mM Ca 2 + närvarande i MSP standardbuffert (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM NaCl; 0,5 mM EDTA; och 1,5 mM CaCl2) och inkubera i 10 min på is. OBS: Provet kan förvaras i upp till en månad vid 4 ° C 35.
ove_title "> 4. Analys av prover

  1. Gelelektrofores
    1. Icke-denaturering elektrofores
      1. Blanda 15 mikroliter av provet med 5 mikroliter av laddningsbuffert (50 mM BisTris, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (vikt / volym) glycerol och 0,001% Ponceau S, pH 7,2) 49 och ladda den på en 4 - 16% Bis-Tris-gel för att utföra elektrofores.
      2. Fylla katodtanken med ljus katodbuffert (50 mM Bis Tris; 50 mM tricin, pH 6,8; och 0,002% Coomassie G-250) och anoden tanken med rinnande buffert (50 mM Bis Tris och 50 mM tricin, pH 6,8). Starta separation med hjälp av en konstant spänning på 150 V.
      3. Stoppa den elektroforetiska separationen när Coomassie front når slutet av gelén.
      4. Fläcka gelén med en standard Coomassie blue protokoll.
    2. Denaturerande elektrofores
      1. Blanda 40 mikroliter av provet med 10 mikroliter av laddningsbuffert innehållande SDS (0,05% (vikt / vol) bromfenolblått; 0,2 M Tris-HCl,pH 6,8; 20% (volym / volym) glycerol; 10% (vikt / volym) SDS; och 10 mM 2-merkaptoetanol) och ladda den på en 4-20% Tris glycin gel för att utföra elektrofores.
      2. Fyll katod- och anod- tankar med rinnande buffert (25 mM Tris-HCl, pH 6,8; 200 mM glycin; och 0,1% (vikt / volym) SDS). Starta separation med hjälp av en konstant spänning på 150 V.
      3. Stoppa den elektroforetiska separationen när lastningen färgfronten når slutet av gelén.
      4. Fläcka gelén med en standard Coomassie blue protokoll.
  2. Beredning av NAPT lösning
    1. Lös 1 g phosphotungstate natriumsalt i 50 ml vatten genom omröring vid rumstemperatur för att ge en 2% (vikt / volym) sur lösning.
    2. Justera pH till 7,4 med 1 M NaOH. Ta bort partiklar med hjälp av en 0,22-um sprutfilter. Lagra lösningen vid rumstemperatur eller vid 4 ° C.
  3. Beredning av provet för TEM-analys
    1. Glödurladdning kolbelagda koppargaller (400 mesh) i 20 s vid 30 mA för att göra gallren hydrofila före adsorptionen av provet. Placera 3,5 mikroliter av provet (0,8 | iM med avseende på de nanodiscs) på gallret och inkubera i 30 s. OBS! Volym appliceras kan variera mellan 2,5 och 5 | il, beroende på provkoncentration. Ett lämpligt koncentrationsintervall för nanodiscs är 0,5 - 1 iM.
    2. Blot bort överskottslösning med användning av filterpapper.
    3. Omedelbart fläcken gallret med en droppe 2% NAPT i 30 sek. Blot bort överskottslösning och lämna gallret till lufttorka.
    4. Utvärdera gallren av TEM. Ett mikroskop med 120-200 keV accelererande spänning tillräcklig för att uppskatta omfattningen av stapling. OBS: För det nuvarande protokollet, var en kalibrerad transmissionselektronmikroskop används, utrustad med en 200-keV fältemissions pistol.
    5. Registrera TEM-bilder. För bilder som visar långa staplar, inte bearbeta vidare; Bilderna visar komplex av nanodiscs, med yttre protein som kan innehålla ett fåtalshortstacks, men de flesta partiklar är i komplexet. Spela in flera bilder och process dessa enligt standardmetoder för att få klass medelvärden och en låg upplösning, 3 dimensionell modell av komplexet.
      OBS: För insamling av negativ fläckdata har galler på åtminstone tre olika dagar. För varje dag, var färskt prov inkubationer (som i steg 3,1) gjorde innan negativa fläcken tillämpades.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den metod vi föreslår beror på framställningen av nanodiscs att åstadkomma membranytan för monotopic membranproteinbindning. Eftersom det inte finns någon transmembranprotein inbäddade i nanodisc lipiddubbelskiktet, är nanodiscs här betecknad som "tomma nanodiscs" (Figur 2A). Dessa har en beräknad molekylvikt på 256 kDa för en sammansättning av två MSP1E3D1 byggnadsställningar proteiner och omkring 260 molekyler av POPC 8. Med användning av detta protein: lipid-förhållande för rekonstitution, en huvudtopp (figur 2A) eluerades under gelfiltrering. Toppfraktionerna cirka 9 ml (Figur 2A) undersöktes genom blå nativ gelelektrofores 49, som visar ett band (figur 2B, spår 1). Trots att bandet motsvarar en storlek något större än den beräknade 256 kDa, den nanodisc diametern mätt i TEM-bilder motsvarar denförväntade 13 nm ± 0,5 nm.

Den monotopic membranproteinet 5-lipoxygenas (5LO) renades såsom beskrivits ovan (Protokollsteg 2) och mer detaljerat tidigare 35. Homogeniteten hos det 78-kDa-5LO analyserades genom SDS PAGE-elektrofores (Figur 2C, rad 1) och var fullt funktionell 35 (ej visad).

I detta protokoll är villkor avsiktligt skapas för att stapling av de nanodiscs. Emellertid bör det noteras att denna stapling induceras endast i proverna som gjorts för TEM imaging (så kallade prover), specifikt genom tillsats av den negativa fläcken natrium phosphotungstate som det sista steget efter det att alla andra behandlingar och tillägg hade gjorts. I själva verket, bilderna av NAPT-färgade nanodiscs visar den förväntade stapling (figur 3A) mycket tidigt för HDL 34 5, 50. De "långa staplar av betraktas från sidan mynt" (figur 3A) är de nanodiscs aggregerade med phosphotungstate inskjutna mellan de dubbla skikten, såsom beskrivs schematiskt i fig 1A och föreslagits av Zhang et al. 32, 39.

Det är viktigt att kontrollera om olika tillägg i buffertarna påverkar, förhindra, eller till och med inducera stapling, och såsom kommer att framgå nedan, effekterna av kalciumjoner som krävs undersökning. I figur 3B, är staplingen fortfarande närvarande i ett prov, där kalciumjoner tillsattes till nanodisc lösningen före färgning med NAPT.

Det väsentliga steget i protokoll visas i figur 4, där membranet-binding proteinet är närvarande i lösningarna. Staplingen kunde inte induceras av NAPT fläcken när 5LO var bunden till membranytan av de nanodiscs (Figur 4A). För detta prov, var molförhållandet mellan 5LO till nanodiscs 1: 1, såsom schematiskt visas i figur 1 (Figur 1B, nederst till höger). Dessutom, som lipiddubbelskiktet i de nanodiscs är tillgänglig från båda sidor, i motsats till liposomer genom prover med förhållandet två 5LO till en nanodisc framställdes, medan de TEM-bilder visar ännu mindre stapling (Figur 4B).

För bindning, skulle vissa yttre membranproteiner att bero på närvaron av en specifik lipid i membranet, såsom phosphoinositols 10, 11, 12 eller fosfatidylserin 10. I fallet med 5LO, är nödvän närvaro av Ca 2 +vändigt 43. I figur 4A och B, kalciumjoner var närvarande i lösningarna med nanodiscs och 5LO. Med andra ord, avsaknaden av stapling inte bara visar att monotopic proteinet har bundit, utan också att bindnings beror på Ca2 + -joner. För att visa detta framställdes en lösning innehållande nanodiscs och 5LO men utan kalcium färgades med NAPT och avbildas med TEM (Figur 4C). Som väntat, kan 5LO inte binder till de nanodiscs utan Ca2 + och lämnade 5LO fritt i lösningen, så de nanodiscs stapla stället (Figur 4C).

Figur 1
Figur 1. Principen om Nanodisc stapling och översikt av metoden. A. Princip för nanodisc stapling. Tillsatsen av den negativa fläcken natrium phosphotungstate till en lösning av nanodiscs (vänster) leder till th e stapling av nanodiscs (höger) på grund av elektrostatiska krafter (mitten, pilar) mellan fosfolipid tvåskiktsmembran och PT molekyler (mitt, svarta prickar). B. Schematisk bild av protokollet. Tomma nanodiscs (vänster) binder till en yttre membranprotein (grå) för att bilda ett komplex, som avbildas från fyra olika vinklar (lägre mitten). Närvaron av monotopic proteinet förhindrar steriskt de nanodiscs från stapling när färgades med phosphotungstate salt (nere till höger), i motsats till stapling induceras i avsaknad av stora objekt (uppe till höger). Växthus och orangefärgade ringarna representerar de två MSP omslag runt fosfolipid kärna, som är representerad i ljusbrun. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

jpg "/>
Figur 2. homogenitet Analys av Nanodiscs och 5LO. A. storleksuteslutningskromatografi av rekonstituerade tomma nanodiscs. Elueringen av de nanodiscs toppar vid 9 ml. B. Icke-denaturerande gel elektroforetisk analys av toppfraktionen från SEC visas i (A). Lane M innehåller markören. Ett enda band är närvarande i spår 1, där toppfraktionen vid 9 ml laddades. C. Denaturerande gel elektroforetisk analys av renat 5LO. Den 78 kDa 5LO visar som ett intensivt band i bana 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Stack Bildning av Nanodiscs i frånvaro av protein Analyseras av TEM. A. Nanodisc stapling inducerades whöna färgades med NAPT. De "högar av mynt" är staplarna av nanodiscs när den betraktas från sidan. Varje nanodisc visas som ett vitt band. B. Stacking var inte störs av närvaron av kalciumjoner i nanodisc lösningen när färgas med NAPT. Skal barer är 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. Förhindra Stack Bildning av bindningen av protein i närvaro av en kofaktor Analyseras av TEM. A. och B. Kalciumjoner var närvarande i blandningar av 5LO och nanodiscs vid molära förhållanden av 1: 1 (A) eller 2: 1 (B). Ju mer 5LO bindning till nanodiscs, desto färre nanodiscs finns tillgängliga för stapling, såsom visas i (B). De enda partikel komplex i bote (A) och (B) är lämpligt för vidare bearbetning 35. C. I frånvaro av kalciumjoner, 5LO kan inte binda. NAPT färgning av detta prov visar typiska stapling av nanodiscs, lämnar 5LO obundna. Skal barer är 100 nm. Bilderna förvärvades av en 4K x 4K CCD-kamera vid en förstoring av 69,500x. Pixelstorlek av CCD-kameran är 15 | j, m, vilket ger ett motsvarande värde av 2,16 Å på preparatnivå för EM-bilder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden kan separeras i tre delar: den rekonstitution av tomma nanodiscs, framställning av protein-nanodisc komplex, och negativ färgning för TEM av dessa komplex. Varje del kommer att behandlas separat när det gäller begränsningar av tekniken, kritiska steg, och användbara modifieringar.

Beredning av tomma nanodiscs. Kritiska steg och begränsningar i produktionen och användningen av nanodiscs.

För framställningen av de tomma nanodiscs, är det viktigt att optimera MSP-till-lipid. För de vanligaste MSP och lipider (med cholat som ett rengöringsmedel), kan förslag på de optimala förhållandena hittas i litteraturen (t.ex. 125-130 POPC per MSP1E3D1 8, 51 som används i det nuvarande protokollet). Skillnader erhållits jämfört med de publicerade förhållanden kan bero på metoden för proteinkoncentrationsbestämning, effektivitet lIPID solvatisering i tvättmedels, och metoden för detergentavlägsnande från lösningen.

Vi föreslår att utföra avlägsnande detergent med användning av hydrofoba pärlor 48 (steg 1,3), medan möjliga alternativ är dialys eller tillsats av cyklodextrin 52, 53. Inledningsvis var dialys används för beredning av HDL 5, 34 och är fortfarande att föredra 54. Oavsett vilken metod för att avlägsna rengöringsmedel, är hastigheten avgörande. Om borttagningen är alltför snabb (volymen av hydrofoba pärlor är alltför stor), kan den spontana ombildning av MSP med lipider inte hinner inträffa. I stället kan stora mängder av liposomer och proteinaggregat bildas. Resultaten från storleksuteslutande kromatografi skulle visa stora mängder av liposomer i voidvolymen, en suboptimal topp på rekonstituerade nanodiscs, och en större topp av oanväntMSP 4, 6, 51. För alltför liten volym av hydrofoba pärlor, kan avlägsnandet tvättmedel vara ofullständig och nanodiscs som bildar kan visa en variation i storlek, där de flesta är mindre än väntat. Man kan testa två tillsatser av mindre volymer av hydrofoba pärlor i stället för en stor Förutom att bromsa hastigheten på beredning.

Valet av lipider bör noga övervägas 8, 9, 45, 46, 55, beroende på syftet för nanodisc beredningen. I allmänhet, för alla metoder som syftar till bildandet av membran (rekonstitution av nanodiscs eller liposomer, såväl som för 2D-kristallisationsexperiment), måste lipiderna vara i en "fluid" tillstånd 56. Under en viss temperatur, the lipid är stel. Ovanför denna så kallade övergångstemperaturen (Tm), är lipiden vätska. Observera att vissa ofta använda mättade lipider har en Tm väl över rumstemperatur. Vidare för lipidblandningar, blandbarheten av lipider muse vägas 57. Den optimala temperaturen för Nanodisc bildning är runt fasövergång (Tm) för lipiden.

Diskmedlet i det nuvarande protokollet är natriumkolat 8. Om en annan rengöringsmedel måste användas, kan samma koncentrationer som de som används för kolat inte användas direkt. Vissa milda detergenter upplösa lipider mindre effektivt, och en högre koncentration kan behövas. Lipid kakan som erhölls efter avdunstning av kloroform (steg 1.2.2 i protokollet) måste lösas upp till en klar lösning av detergenten. Virvling, frysupptiningscykler, ultraljud bad, eller sonikering skulle kunna användas för att påskynda solubilisering.

för combinatjoner av lipid (-Blandningar), MSP och andra än de som används här, titreringar för att minimera stora aggregat och liposomer eller överskott MSP tvättmedel är nödvändiga 4, 6, 51, 58. För vissa kombinationer av MSP och fosfolipider, kan optimeringen vara svårare än för andra 4, 6, 51, och det blir nödvändigt att bestämma innehållet i toppfraktionerna. Den mest exakta metoden för analys av nanodisc sammansättning och storlek är att bestämma antalet fosfolipider per MSP genom fosfatanalys 4 och beräkna nanodisc molekylvikt. Nanodisc storlek kan uppskattas genom väl löst, icke-denaturerande gelelektrofores; dynamisk ljusspridning (DLS) 59; eller negativ fläck TEM, för att bara nämna några metoder. Som för den negativ-bets-inducerad stapling Protokollet presenteras här, mätning av bredden av staplarna är närvarande i TEM-bilder ger diametern på nanodiscs.

När det gäller uttryck och rening av membran byggnadsställningar protein bör alla vanliga försiktighetsåtgärder och oro för ett lösligt protein tas. Plasmiderna tillgängliga kan innehålla olika taggar och proteas klyvningsställen i fall etiketten måste tas bort innan du använder MSP.

5LO den monotopic protein som används i protokollet, inaktiverar snabbt om inte försiktighetsåtgärder vidtas, beskrivs på annat håll 35 och referenser däri. Kort sagt, den katalytiska järn lätt förlorad, och oxiderande förhållanden kan orsaka dimerisering av 5LO. Såsom anges i not (protokoll steg 2.1.3), kan reningen stoppas efter fällningssteget och alikvoter lagras tills senare användning. Efter rening av en alikvot, måste proteinet användas inom några timmar d ue till snabb inaktivering 35.

Kritiska steg i framställningen av de protein-nanodisc komplex.

Storleken på den monotopic proteinet kontra nanodisc område är av betydelse. Längden av MSP1E3D1 proteinkedjan motsvarar en nanodisc med en 10,5-nm innerdiameter och om en 8900-Å två dubbelskikt området 8. Detta stämmer väl överens med det område som rapporteras för membran inbäddade delen av 5LO 45. Således var vår förväntade bindande förhållandet 1: 1, eller högst 2: 1 5LO per nanodisc. Detta visade sig vara korrekt, som rapporterats i en titrering experiment 35. Emellertid var den maximala bindningen av två 5LO per nanodisc inte erhålles, såsom diskuteras på annan plats 35. En något större nanodisc kan eventuellt möjliggöra en fullständig 2: 1-bindning för experiment där detta är önskvärt, men i detta fall, den 1: är ett förhållande huvudsyftet.

ove_content "> Valet av optimala lipider för protein nanodisc komplexbildning kan underlättas genom förkunskaper. Detta var fallet i det nuvarande protokollet, där valet av lipid var syntetisk POPC 35. Båda variationer i lipid huvudgruppen 46 och variationer i mättnaden av acylkedjorna 45 testades i liposomer 5LO bindningsstudier. 5LO aktivitet ökade med bindande liposomer innehållande kolin fosfolipider omättade i sn-2 acylkedja position 45, 46. Om specifika lipid krav inte är kända, men identiteten för den ursprungliga membranet är känd, naturliga lipid extrakt kunde testas först 55.

En kofaktor beroendet var känd för 5LO, vilket beror på Ca2 + -joner för membranbindning 43. Det är utmanande att helt ta bort kalcium från lösningar. Här, är det komplexbildande medlet EDTA närvarande i buffertarna i mängder justerade för att lämna en reglerad mängd av fria Ca2 + -joner. Beräkningar av fria och bundna molekyler i buffertarna gjordes av BAD 60 programvara för buffertar som innehåller mer än en typ av komplexbildande medel 35. Effekten på koncentrationen av en kofaktor delvis löslig i membranet inte förklaras av denna programvara.

Kritiska steg i negativ färgning av nanodiscs att främja stacken bildning.

För protokollet till hands, där maximal stapling önskas, bör fläcken vara natriumsaltet av phosphotungsten. Olika salter av volfram är tillgängliga, och vi observerat att fosforvolframsyra var mindre effektiv vid stapling (ej visad). På oklara grunder, verkar det som om höga halter av natrium under PT färgning främjar stapling. Också, för provbufferten, visades det att ju lägre natrium fortsent, desto lägre mängd inducerad stapla 32. Av samma skäl, efter att provet har applicerats till den EM diagram bör vattentvättning före färgning inte utföras, eftersom detta minskar också stapling. Å andra sidan, var några stapling alltid inducerade, men aldrig i den utsträckning som behövs för bästa prestanda av protokollet.

Naturligtvis måste kofaktorer som de Ca2 + joner här kontrolleras för störningar med den negativa fläcken eller med nanodiscs. För det nuvarande protokollet skulle kalciumjoner fällts en fosfatbuffert, så en Tris-buffert användes. De nanodiscs inte staplas av Ca2 + joner per se, som kontrolleras med hjälp av en annan negativ fläck, AUC formiat 35, och inte heller gjorde kalcium förhindrar NAPT-inducerad stapling (Figur 3B).

För en liten monotopic protein, den extra storlek sattes genom bindning till ett nanodisc kan göra det detekterbart i cryoEM. enmycket stor nanodisc jämfört med proteinet kan inte vara optimal, som ett litet protein på en stor nanodisc får inte hindra stapling. Emellertid kan formen av den yttre proteinet har en påverkan. Även om ingen exakt förhållande kan tillhandahållas som nu är en nanodisc tvåskiktsmembran yta endast något större än den beräknade bindande proteinets yta rekommenderas. Med denna begränsning, skulle den maximala proteinbindning vara ett protein på varje sida av nanodisc.

Allmänna begränsningar och fördelar med förfarandet.

Protokollet beror på tillgången på en TEM och tillhörande utrustning, som inte är tillgängliga i alla laboratorier. Däremot skulle en 120- till 200-kV elektronmikroskop utrustad med en traditionell CCD-kamera vara fullt tillräckligt för att upptäcka stapling. NAPT negativ färgning utförs vid rumstemperatur, och gallren kan lagras vid denna temperatur för senare granskning.

TEM imagIng skulle snabbt visa om stapling har förhindrats eller inte. För de bilder som visar protein-nanodisc komplex (t.ex., Figur 4A och B), ytterligare bearbetning för att erhålla strukturell information kunde utföras. Konstruktionsdetaljer av en negativt färgade provet kan nå en nm och kan ge värdefull strukturell information 29. I laboratorier tillägnad strukturera bestämning genom cryoEM, är negativ färgning av prover standardförfarande. Användningen av våra protokoll skulle vara en snabb och enkel utöver ordinarie rutiner.

Vissa monotopic proteiner är förankrade till membranet genom myristoylering, palmitoylering, eller hydrofoba fläckar på proteinytan, vilket gör det nödvändigt att bilda den nanodisc-proteinkomplexet genom samma procedur som för inkorporering av ett transmembranprotein i nanodiscs 13. Här, en av subenheterna i proteinet komplexet innehåller amyristoylation på en flexibel N-terminal svans för membranbindning. För uranylacetat-färgade TEM-bilder, konstaterades att proteinkomplexet bands vinkelrätt mot membranet, och inte på sidan av nanodisc. Detta och andra resultat bekräftade en styv struktur för fäster vid membranet 13. För denna bindning, NAPT färgning enligt vår föreslagna protokollet skulle visa samma jämnt fördelade enstaka partiklar. Men om den bifogade filen hade varit via en flexibel kedja, uranylacetat färgning kanske inte har gett ett tydligt resultat. Vi spekulerar att, för flexibel kedja membran fäst proteinkomplex kan NAPT färgning förmå nanodiscs att stapla, vilket visar den typiska "stack mynt", men nu dekorerad med bifogade protein på sidorna.

Varför använda nanodiscs om liposomer kan användas? Optimeringen av lipider, kofaktorer eller andra parametrar kan mycket väl testas i liposomer för bindningen av peripheral proteiner (jfr. 5LO). NAPT-inducerad stapling av liposomer har visats 32, så en monotopic protein kan förhindra liposomer stapling. Men för att storleken på liposomerna i jämförelse monotopic proteiner och nanodiscs också kommer in i bilden. En stor yttre protein kan ha möjlighet att förhindra stapling av liposomer, medan ett litet protein, som 78-kDa 5LO, kanske inte om närvarande i stora mängder per liposom. Små liposomer kan framställas, men den mindre vesikeln, desto starkare krökningen hos dess membran. Den nanodisc biskikt är platt. Testa olika parametrar med nanodiscs kan vara mindre kostnadseffektiv på grund av MSP. Å andra sidan, för liposomer, vissa dyra kofaktorer eller substrat som delvis fördelning in i membranet och vidare in i det inre av liposomerna, kan erfordras i större mängder. Sammanfattningsvis ger nanodisc plattformen möjlighet att välja ett definierat område för bindning av en exakt n umbra av proteiner. Dubbelskiktet området är åtkomlig från två sidor och är platt.

Betydelsen av metoden.

Fastställande av 3D-strukturen av proteiner eller komplexa makromolekyler visualiserar det inre arbetet i celler. I detta trångt miljö, specifika proteiner är aktiva på membranytor, ensamma eller i komplex med andra proteiner, men vanligtvis så att den fysiska interaktion med komponenterna i det dubbla lipidskiktet är en del av deras mekanistiska funktion. För vissa proteiner, är den konformation i lösning byts på membran inbäddning, medan andra är bundna till membranet men dock förändras konforma eller orientering på membranet på grund av någon form av avtryckaren. En hydrofoba underlaget inträde Banan kan öppna, eller en konformation som tillåter bindning till ett transmembranprotein kan förekomma. För att erhålla strukturen, eller åtminstone strukturell information, av sådana perifera proteiner bundna till membranet är en utmaning.

jove_content "> Nanodiscs användes i vissa studier avseende orientering och funktion på membran 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Cytokrom P450, centralt i avgiftning, är förankrad till membranet genom en α-helix och innehåller en heme grupp i sin klotformiga delen, vilket möjliggör linjära dikroism mätningar 15. resultaten visade en orientering av heme i förhållande till membranet i nära överensstämmelse med simuleringar som görs och därigenom stärka andra slutsatser som dragits från simuleringar av membranet inbäddade cytokrom P450. för en GTPas förankrad till membranet i en liten nanodisc kunde NMR-studier identifiera två olika områden på proteinet med ett membran gränssnitt var och vidare, hur Nucleo tidvattnet bindning inducerade en övergång från ett gränssnitt till den andra 17. Mutationer och effektor bindande, liksom GTP-bindande, studerades i en annan GTPas i Ras-super att hitta ett antal effekter på aktivitet som berodde på orienteringen på membranet, vilket skulle påverka onkogen signalering 16. 5LO har en löslig konforma 61 och kräver kalcium för bindning av kärnmembran 43. Använda jätte unilamellära liposomer, var polariserad försvagat, total reflektion IR experiment 46. Resultatet antydde att den N-terminala β-fat binder till membran, med symmetriaxeln för β-fat lutade ungefär 45 grader från membranet normalt. Den 5LO C-terminala domänen är en nästan cylindrisk α-helixknippet, och detta föreslogs att binda med den långa axeln parallell med membranet 45,= "xref"> 46. I vårt tidigare arbete med 5LO inbäddad på nanodiscs var området av dubbelskiktet valt att tillåta en 5LO per sida med ovan föreslagna orienteringen 35. TEM bilder bekräftas denna strategi, om än i låg upplösning 35. Om, till exempel, var endast den N-terminala β-fat bundet men inte den C-terminala domänen, ett högre antal 5LO per nanodisc skulle ha erhållits. Vidare skulle ett annat protein ändra membranbindning och orienteringen av 5LO, såsom en aktivator, transmembranproteinet 5-lipoxigenas aktiverande protein, FLAP. FLAP har rekonstituerats in nanodiscs, och vi använder TEM och andra metoder för att studera interaktionen mellan 5LO och FLAP. Deras interaktion resulterar i endogen arakidonsyra omvandlas till leukotrien A4, som är det första steget i syntesen av potenta kemoattraherande ämnen involverade i många inflammatoriska sjukdomar 41, 42 sup>, 62.

Den 5LO-nanodisc komplex beräknas ha en molekylvikt av 334 kDa, nära gränsen på cirka 200 kDa för strukturell undersökning av cryoEM. Men som den atomära strukturen av 5LO finns 61, dess dockning i ett medium upplösning, 3-dimensionella elektrondensitetskarta skulle ge information om interaktion med nanodisc membranet.

Innovationer i cryoEM teknik inte bara driver upplösning på atomnivå 63 utan också driver storleksgränsen till mindre proteiner. För strukturell bestämning av NMR 22, är situationen den omvända, eftersom syftet är att öka storleken serien, som nu närmar sig 200 kDa. Nyligen var membranet bindning av små GTPas-proteiner undersöktes genom NMR 16, 17. Dessa proteiner, av endast cirka 20 kDa, vire bundna till små nanodiscs av ​​en 7,6-nm innerdiameter, bilda komplex på cirka 130 kDa. I framtiden kan lika stora komplex undersökas av både NMR och cryoEM att belysa olika aspekter av proteinmembranbindning.

En förlängning av protokollet skulle kunna vara att undersöka nanodiscs innehåller ett transmembranprotein (TMP) i nanodisc dubbelskiktet. NAPT-inducerad staplingen av TMP-nanodiscs kunde jämföras med tomma nanodiscs innehåller samma lipidkomposition. Stora extramembranous slingor skulle förhindra stapling, medan korta loopar inte kan förhindra stapling 64. Detta kan vändas till en fördel, eftersom protokollet kan användas för att undersöka proteiner som specifikt binder till transmembranproteinet.

Fördelen med denna metod är att membranet interaktion kan visualiseras direkt. Den relativa enkelheten av att göra stora mängder av tomma nanodiscs innebär att en kan sträcka sigdenna metod för att screena med avseende på olika förhållanden såsom pH, temperatur, buffertämnen, och cofaktor beroendet av monotopic proteinbindning. I själva verket, medan nanodisc plattformen 9 var utvecklad för stabilisering av transmembranproteiner och alltmer används för detta ändamål, dess potential för studier av det stora antalet mer eller mindre tillfälligt bindande yttre proteiner närvarande inuti celler bör tydligt hållas i åtanke.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Författarna tackar svenska Vetenskapsrådet, Stockholms läns landsting, och KI medel för deras stöd. Uttrycket och rening av MSP genomfördes på Karolinska Institutet / SciLifeLab Protein Science Core Facility (http://PSF.ki.se). Författarna vill också tacka Dr Pasi Purhonen och Dr. Mathilda Sjöberg för att dela deras tekniska kompetens och för deras snabb hjälp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transmission electron microscope: JEOL2100F JEOL
CCD camera Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany
Glow discharger Baltec
TEM grid: 400 mesh TAAB GM016/C
Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5 Agilent Technologies 5190-2526
Superdex 200 HR 10/300 GE Healthcare Life Sciences 17-5172-01
Plasmid: MSP1E3D1 Addgene 20066
Bacteria: BL21DE3 NEB C2527H
Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2 Protein Science Facility, KI, Solna
Purification Matrix: ATP agarose Sigma Aldrich A2767
Purification Matrix: HisTrap HP-5 mL GE Healthcare Life Sciences 17-5247-01
Lipid: POPC Avanti polar lipids 850457C 25 mg/mL in chloroform
Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin Bio-Rad 1523920
13 mm syringe filter: 0.2 μm Pall life sciences PN 4554T
Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate Sigma Aldrich 31648
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Bio-Rad 161-0301
Protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001
TCEP Sigma Aldrich 646547
Detergent: Sodium cholate hydrate Sigma Aldrich C6445-10G
Sodium Cholate 500 mM Sodium cholate. Resuspend in miliQ water and store at -20 °C.
Lipid Stock 50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl. Store at 4 °C for a week; or
Store -80 °C for a month, after purging the solution with nitrogen.
MSP standard buffer 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA.
Store at 4 °C.
Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer Thermo Fisher Scientific BN2001 50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8
Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer Thermo Fisher Scientific BN2002 50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8, 0.002% Coomassie G-250
Non-Denaturaing Electrophoresis 4x Sample loading Buffer Thermo Fisher Scientific BN2003 50 mM Bis-Tris, pH 7.2, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S
Denaturaing Electrophoresis Running Buffer In-house recipe: 25 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1% (w/v) SDS
Denaturaing Electrophoresis 5x Sample loading Buffer In-house recipe: 0.05% (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl, pH 6.8, 20% (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS, 10 mM 2-mercaptoethanol
Terrific broth Tryptone - 12.0 g, Yeast Extract - 24.0 g, 100 mL 0.17 M KH2PO4 and 0.72 M K2HPO4, Glycerol - 4 mL.
Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 mL and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kleinschmidt, J. H., Popot, J. L. Folding and stability of integral membrane proteins in amphipols. Arch Biochem Biophys. 564, 327-343 (2014).
  2. Frauenfeld, J., et al. A saposin-lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nat Methods. 13 (4), 345-351 (2016).
  3. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nat Struct Mol Biol. 23 (6), 481-486 (2016).
  4. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-Assembly of Discoidal Phospholipid Bilayer Nanoparticles with Membrane Scaffold Proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  5. Jonas, A., Steinmetz, A., Churgay, L. The number of amphipathic alpha-helical segments of apolipoproteins A-I, E, and A-IV determines the size and functional properties of their reconstituted lipoprotein particles. J Biol Chem. 268 (3), 1596-1602 (1993).
  6. Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers. Protein Eng Des Sel. 23 (11), 843-848 (2010).
  7. Hagn, F., Etzkorn, M., Raschle, T., Wagner, G. Optimized phospholipid bilayer nanodiscs facilitate high-resolution structure determination of membrane proteins. J Am Chem Soc. 135 (5), 1919-1925 (2013).
  8. Ritchie, T. K., et al. Methods in Enzymology. Duzgunes, N. ejat 464, Academic Press. 211-231 (2009).
  9. Schuler, M. A., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs as a new tool to examine lipid-protein interactions. Methods Mol Biol. 974, 415-433 (2013).
  10. Nasr, M. L., et al. Membrane phospholipid bilayer as a determinant of monoacylglycerol lipase kinetic profile and conformational repertoire. Protein Sci. 22 (6), 774-787 (2013).
  11. Yokogawa, M., et al. NMR analyses of the interaction between the FYVE domain of early endosome antigen 1 (EEA1) and phosphoinositide embedded in a lipid bilayer. J Biol Chem. 287 (42), 34936-34945 (2012).
  12. Wan, C., et al. Insights into the molecular recognition of the granuphilin C2A domain with PI(4,5)P2. Chem Phys Lipids. 186, 61-67 (2015).
  13. Zhang, P., et al. An Isoform-Specific Myristylation Switch Targets Type II PKA Holoenzymes to Membranes. Structure. 23 (9), 1563-1572 (2015).
  14. Grushin, K., Miller, J., Dalm, D., Stoilova-McPhie, S. Factor VIII organisation on nanodiscs with different lipid composition. Thromb Haemost. 113 (4), 741-749 (2015).
  15. Baylon, J. L., Lenov, I. L., Sligar, S. G., Tajkhorshid, E. Characterizing the membrane-bound state of cytochrome P450 3A4: structure, depth of insertion, and orientation. J Am Chem Soc. 135 (23), 8542-8551 (2013).
  16. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Oncogenic and RASopathy-associated K-RAS mutations relieve membrane-dependent occlusion of the effector-binding site. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), 6625-6630 (2015).
  17. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Membrane-dependent modulation of the mTOR activator Rheb: NMR observations of a GTPase tethered to a lipid-bilayer nanodisc. J Am Chem Soc. 135 (9), 3367-3370 (2013).
  18. Wang, L., Sigworth, F. J. Structure of the BK potassium channel in a lipid membrane from electron cryomicroscopy. Nature. 461 (7261), 292-295 (2009).
  19. Ackerson, C. J., Powell, R. D., Hainfeld, J. F. Site-specific biomolecule labeling with gold clusters. Methods Enzymol. 481, 195-230 (2010).
  20. Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (31), 11509-11514 (2006).
  21. Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. Membrane protein structure determination - the next generation. Biochim Biophys Acta. 1838 (1 Pt A), 78-87 (2014).
  22. Dias, D. M., Ciulli, A. NMR approaches in structure-based lead discovery: recent developments and new frontiers for targeting multi-protein complexes. Prog Biophys Mol Biol. 116 (2-3), 101-112 (2014).
  23. Viegas, A., Viennet, T., Etzkorn, M. The power, pitfalls and potential of the nanodisc system for NMR-based studies. Biol Chem. , (2016).
  24. Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A primer to single-particle cryo-electron microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
  25. Wu, S., Armache, J. P., Cheng, Y. Single-particle cryo-EM data acquisition by using direct electron detection camera. Microscopy (Oxf). 65 (1), 35-41 (2016).
  26. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  27. De Carlo, S., Adrian, M., Kalin, P., Mayer, J. M., Dubochet, J. Unexpected property of trehalose as observed by cryo-electron microscopy. J Microsc. 196 (1), 40-45 (1999).
  28. Nogales, E. The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nat Methods. 13 (1), 24-27 (2016).
  29. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).
  30. Forte, T. M., Nordhausen, R. W. Electron microscopy of negatively stained lipoproteins. Methods Enzymol. 128, 442-457 (1986).
  31. Zhao, F. Q., Craig, R. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. J Struct Biol. 141 (1), 43-52 (2003).
  32. Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. J Lipid Res. 52 (1), 175-184 (2011).
  33. Zhang, L., et al. An optimized negative-staining protocol of electron microscopy for apoE4 POPC lipoprotein. J Lipid Res. 51 (5), 1228-1236 (2010).
  34. Matz, C. E., Jonas, A. Micellar complexes of human apolipoprotein A-I with phosphatidylcholines and cholesterol prepared from cholate-lipid dispersions. J Biol Chem. 257 (8), 4535-4540 (1982).
  35. Kumar, R. B., et al. Structural and Functional Analysis of Calcium Ion Mediated Binding of 5-Lipoxygenase to Nanodiscs. PLoS One. 11 (3), e0152116 (2016).
  36. Waggoner, T. A., Last, J. A., Kotula, P. G., Sasaki, D. Y. Self-assembled columns of stacked lipid bilayers mediated by metal ion recognition. J Am Chem Soc. 123 (3), 496-497 (2001).
  37. Kovacs, E., et al. Analysis of the Role of the C-Terminal Tail in the Regulation of the Epidermal Growth Factor Receptor. Mol Cell Biol. 35 (17), 3083-3102 (2015).
  38. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy. J Vis Exp. (90), e51087 (2014).
  39. Zhang, L., Tong, H., Garewal, M., Ren, G. Optimized negative-staining electron microscopy for lipoprotein studies. Biochim Biophys Acta. 1830 (1), 2150-2159 (2013).
  40. Cong, Y., Ludtke, S. J. Single particle analysis at high resolution. Methods Enzymol. 482, 211-235 (2010).
  41. Radmark, O., Werz, O., Steinhilber, D., Samuelsson, B. 5-Lipoxygenase, a key enzyme for leukotriene biosynthesis in health and disease. Biochim Biophys Acta. 1851 (4), 331-339 (2015).
  42. Anwar, Y., Sabir, J. S., Qureshi, M. I., Saini, K. S. 5-lipoxygenase: a promising drug target against inflammatory diseases-biochemical and pharmacological regulation. Curr Drug Targets. 15 (4), 410-422 (2014).
  43. Radmark, O., Samuelsson, B. Regulation of the activity of 5-lipoxygenase, a key enzyme in leukotriene biosynthesis. Biochem Biophys Res Commun. 396 (1), 105-110 (2010).
  44. Noguchi, M., Miyano, M., Matsumoto, T., Noma, M. Human 5-lipoxygenase associates with phosphatidylcholine liposomes and modulates LTA4 synthetase activity. Biochim Biophys Acta. 1215 (3), 300-306 (1994).
  45. Pande, A. H., Qin, S., Tatulian, S. A. Membrane fluidity is a key modulator of membrane binding, insertion, and activity of 5-lipoxygenase. Biophys J. 88 (6), 4084-4094 (2005).
  46. Pande, A. H., et al. Modulation of human 5-lipoxygenase activity by membrane lipids. Biochemistry. 43 (46), 14653-14666 (2004).
  47. Wong, A., Hwang, S. M., Cook, M. N., Hogaboom, G. K., Crooke, S. T. Interactions of 5-lipoxygenase with membranes: studies on the association of soluble enzyme with membranes and alterations in enzyme activity. Biochemistry. 27 (18), 6763-6769 (1988).
  48. Rigaud, J. L., Levy, D., Mosser, G., Lambert, O. Detergent removal by non-polar polystyrene beads. European Biophysics Journal. 27 (4), 305-319 (1998).
  49. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  50. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. J Vis Exp. (90), e51087 (2014).
  51. Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size. J Am Chem Soc. 126 (11), 3477-3487 (2004).
  52. Hornschemeyer, P., Liss, V., Heermann, R., Jung, K., Hunke, S. Interaction Analysis of a Two-Component System Using Nanodiscs. PLoS One. 11 (2), 0149187 (2016).
  53. Degrip, W. J., Vanoostrum, J., Bovee-Geurts, P. H. Selective detergent-extraction from mixed detergent/lipid/protein micelles, using cyclodextrin inclusion compounds: a novel generic approach for the preparation of proteoliposomes. Biochem J. 330 (Pt 2), 667-674 (1998).
  54. Martin, D. D., Budamagunta, M. S., Ryan, R. O., Voss, J. C., Oda, M. N. Apolipoprotein A-I assumes a "looped belt" conformation on reconstituted high density lipoprotein. J Biol Chem. 281 (29), 20418-20426 (2006).
  55. Cerione, R. A., Ross, E. M. Reconstitution of receptors and G proteins in phospholipid vesicles. Methods Enzymol. 195, 329-342 (1991).
  56. Shaw, A. W., McLean, M. A., Sligar, S. G. Phospholipid phase transitions in homogeneous nanometer scale bilayer discs. FEBS Lett. 556 (1-3), 260-264 (2004).
  57. Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).
  58. Civjan, N. R., Bayburt, T. H., Schuler, M. A., Sligar, S. G. Direct solubilization of heterologously expressed membrane proteins by incorporation into nanoscale lipid bilayers. Biotechniques. 35 (3), 553-562 (2003).
  59. Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A step-by-step method for the reconstitution of an ABC transporter into nanodisc lipid particles. J Vis Exp. (66), e3910 (2012).
  60. Brooks, S. P., Storey, K. B. Bound and determined: a computer program for making buffers of defined ion concentrations. Anal Biochem. 201 (1), 119-126 (1992).
  61. Gilbert, N. C., et al. The structure of human 5-lipoxygenase. Science. 331 (6014), 217-219 (2011).
  62. Radmark, O. 5-lipoxygenase-derived leukotrienes: mediators also of atherosclerotic inflammation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (7), 1140-1142 (2003).
  63. Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature. 534 (7607), 347-351 (2016).
  64. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Self-assembly of single integral membrane proteins into soluble nanoscale phospholipid bilayers. Protein Sci. 12 (11), 2476-2481 (2003).

Tags

Biokemi negativ färgning proteinkomplex TEM lipoxygenaser visualisering icke-denaturerande gelelektrofores
Metod för att visualisera och analysera membraninteragerande proteiner genom transmissionselektronmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

B. Kumar, R., Zhu, L., Hebert, H.,… More

B. Kumar, R., Zhu, L., Hebert, H., Jegerschöld, C. Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (121), e55148, doi:10.3791/55148 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter