Summary

Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine ​​durch Transmissionselektronenmikroskopie

Published: March 05, 2017
doi:

Summary

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Abstract

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Introduction

In der medizinischen Forschung wird viel Aufmerksamkeit auf Membranproteine ​​fokussiert, entweder intrinsisch oder extrinsisch, in einer Vielzahl von Lipid-Wechselwirkungen beteiligt. Arbeiten mit lipidinteragierenden Proteinen enthält entweder einen Ersatz zu den Lipiden der Auswahl wie Detergenzien, amphipols 1 oder kleinen Proteinen 2 oder eine Membran Ersatz zu finden , die das Protein löslich und aktiv hält. Lipoic Membran Ersatzstoffe sind Liposomen und Nanoscheiben (ND) , 3, 4.

Nanoscheiben sind nahezu native Membranplattformen durch Engineering der Proteinteil entwickelt, ApoA-1, der High-Density-Lipoprotein (HDL) natürlich im Blut auftreten. ApoA-1 ist ein 243-Rest-langen Kette von kurzen amphipathische α-Helices und hat eine lipidfreie lösliche Konformation. In vitro , wenn in Gegenwart von Lipiden, zwei Kopien des Proteins Apo A-1 spontan neu ordnen die hydr einzukreisenophobic Acylkette Teil eines Lipid – Doppelschicht – Patch 5. Ausgeführt Versionen von ApoA-1 sind in der Regel Membrangerüstproteine ​​(MSP) genannt, und eine wachsende Zahl sind als Plasmide oder als gereinigte Proteine ​​im Handel erhältlich. Wiederholungen oder Deletionen der α-Helices in ApoA-1 Ergebnis in mehr 6 oder kürzer 7 Membrangerüstproteine. Dies wiederum macht es möglich , Scheiben etwa 6 nm 7-17 nm 8 im Durchmesser zu bilden. Es gibt verschiedene Arten von Anwendungen für den Nanoscheiben 3, 9. Die am häufigsten verwendete Anwendung ist für die Stabilisierung eines integralen Membranproteins 8, überprüft zuvor 3, 9 eine nahezu native Membranumgebung. Ein weniger erforschten Einsatz ist eine nanoskalige Membranoberfläche für die Studie zur Verfügung zu stellenperiphere Membranproteine 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Abschnitt 1 des Protokolls visualisiert unter das Verfahren für die Herstellung von Nanoscheiben, bestehend aus Phospholipiden und Membrangerüstprotein.

Die Probenvorbereitung ist ein Engpass bei den meisten Methoden. Methodenspezifische Proben können bestimmte Informationen hinzufügen, aber sie auch Vergleiche der Ergebnisse schwierig. Daher ist es einfacher, wenn Proben multimodal und kann in verschiedenen Verfahren unmittelbar verwendet werden. Ein Vorteil bei der Verwendung von Nanoscheiben ist die geringe Größe der nanodisc im Vergleich zu Liposomen (zB können die Proben direkt verwendet werden für sowohl TEM und nicht-denaturierenden Gelelektrophorese, wie in dem vorliegenden Protokoll).

<p class = "jove_content"> Vesikeln und Liposomen sind seit langem verwendet worden, um die Funktion von membraninteragierende Proteine ​​zu verstehen. Für Strukturuntersuchungen und Visualisierung, ein Beispiel für die Strukturbestimmung eines Transmembranproteins in Liposomen verfügbar ist 18. keine hochauflösende 3D-Struktur eines monotopen Membranprotein auf einer Liposomenmembran eingebettet hat sich jedoch noch nicht veröffentlicht worden ist, soweit wir wissen. Gold – Nanopartikel oder Antikörper können verwendet werden , um Proteine zu visualisieren , um Liposomen oder Vesikel Bindung TEM 19. Obwohl diese Sonden sehr spezifisch sind, könnten sie mit membranbindende Proteine ​​stören, indem die Membran-Bindungsstelle Verschleierung oder Bereiche von Interesse mit den flexiblen Teilen maskieren. Gold-markierte Antikörper oder komplexierten Proteine ​​könnten wahrscheinlich auf einem Agarosegel analysiert werden, aber dies würde die Kosten des Experimentes zu erhöhen.

Obwohl Liposomen eine hervorragende Plattform sind, kann man nicht, dass der Pop sicher sein,ulation hat ein bestimmtes Verhältnis Protein pro Liposom, eine Funktion , die 20 durch die Verwendung von Nanoscheiben untersucht werden kann. In einem Liposom, Cofaktoren und Substrate können in dem löslichen Innenraum eingefangen werden. Substanzen, die Membran-löslich sind das gleiche Schicksal für beide Arten von Membran-Mimetika teilen. Dennoch, wie die Doppelschicht-Bereich kleiner in Nanoscheiben ist, wird eine geringere Menge an Substanz erforderlich, um die Membranen nanodisc zu sättigen.

Verständnis der Proteinfunktion durch die Bestimmung der Atomstruktur seit vielen Forschungsgebieten wesentlich gewesen. Verfahren zur Proteinstrukturbestimmung umfassen Röntgen 21; Kernspinresonanz (NMR) 22, 23; und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) 24 bei kryogenen Temperaturen, Kryo – EM. Die Auflösung von Kryo-EM hat in letzter Zeit stark verbessert, vor allem durch den Einsatz von direkten Elektronen detektoren 25, 26. Die Makromoleküle werden in dünnen, glasigen Eis 27 in einer nahezu nativen Zustand abgebildet. Jedoch aufgrund der geringen Kontrast von biologischen Molekülen, werden sie hart im Größenbereich von 100 zu erfassen – 200 kDa. Für geeignet bemessene Proben kann die Datenerfassung aus , und das Verfahren der einzelnen Partikels Rekonstruktion werden kann , eine Struktur zu erhalten , 28 angewendet werden.

Jedoch ist die Bestimmung der Proteinstruktur durch TEM ein mehrstufiger Prozess. Es beginnt in der Regel mit der Auswertung der Probe Monodispersität durch negative Flecken TEM 29 Salze von Schwermetallen wie phosphotungsten (PT) 30 oder Uran 31 verwendet wird . Rekonstruktion eines niedrigauflösenden Modell der negativ gefärbten Makromolekül ist in der Regel gemacht und kann wichtige Informationen über die molekulare Struktur 29 erhalten wird . Parallel zu,Datenerfassung mit Kryo-EM starten kann. Es sollte darauf geachtet werden, wenn die negative stain TEM Daten Auswertung der Fehlinterpretation von Artefaktbildung zu vermeiden. Ein besonderes Artefakt ist die Wirkung des PT Fleck auf Phospholipide und Liposomen 32, was zur Bildung von langen Stangen ähnlich Stapeln von Münzen von der Seite 33. Solche "Rouleau" oder "Stapel" (im Folgenden als "Stapel" bezeichnet) wurden für die HDL 34, früh beobachtet und später auch für die 35 – Nanoscheiben.

Die Stapelung und Überarbeitung von Membranen können aus vielen Gründen auftreten. Beispielsweise kann es durch Co-Faktoren wie Kupfer induziert werden, durch TEM – Bildgebung in einem Fleck Ammoniummolybdat 36 gezeigt. Eine Fraktion der Membranlipide in Liposome enthielten eine Iminodiessigsäure Kopfgruppe Metall Komplexierung durch EDTA nachahmt, wodurch Liposomen nach Zugabe von Kupferionen Stapeln <sup class = "xref"> 36. Stacking könnte auch durch eine Protein-Protein – Wechselwirkung durch ein Protein in oder auf den Lipid – Doppelschichten (die Beize verwendet wird nicht erwähnt) 37. Die Stapelbildung von Phospholipiden von PT wurde schon früh beobachtet; jedoch hat später Arbeit konzentrierte sich auf die Beseitigung oder die Abschaffung dieses Artefaktbildung 38.

Hier schlagen wir eine Methode Vorteil der NAPT-induzierten nanodisc zu nehmen für die Untersuchung von membranbindenden Proteinen, die durch TEM Stapeln. Kurz gesagt, Protein auf der Nanoscheiben Bindung würde die Nanoscheiben aus Stapeln verhindern. Obwohl die Gründe für die Stapelung nicht klar sind, wurde es 39 vorgeschlagen , dass zwischen den Phospholipiden und der Phosphorylgruppe von PT, wodurch die Scheiben zu kleben aneinander (1A) eine elektrostatische Wechselwirkung ist. Die Hypothese hinter unserem Protokoll ist, dass, wenn ein Protein an ein nanodisc bindet, die meisten der Phospholipid-Oberfläche nicht Availa ist Ble für die Interaktion mit dem PT aufgrund der sterischen Hinderung durch das Protein. Dies würde verhindern , dass der Stapelbildung (1B). Zwei Schlussfolgerungen gezogen werden können. Erstens bedeutet die Verhinderung der Stapelung, dass das Protein von Interesse an die Membran gebunden ist. Zweitens kann das Protein-ND – Komplex mit Standard – Einzelpartikelverarbeitungsverfahren 24, 40 eine grobe Morphologie des Komplexes zu erhalten behandelt werden. Darüber hinaus können Analysen durch Methoden wie nicht denaturierenden Gelelektrophorese oder dynamische Lichtstreuung durchgeführt werden.

Um diese Hypothese zu belegen, haben wir die Membran-bindende Protein 5-Lipoxygenase (5LO), die 41 in vielen Entzündungskrankheiten beteiligt ist, 42. Dieses 78-kDa – Protein erfordert Ionen Calcium zu seiner Membran 43 zu binden. Obwohl diese Membranassoziation ausgiebig unter Verwendung von Liposomen untersucht wurdes = "Xref"> 44, 45, 46 und Membranfraktionen 47, können diese nicht für die TEM – Analyse und Strukturbestimmung verwendet werden.

Die Herstellung von Nanoscheiben beginnt mit MSP mit Lipid in dem Detergens Natriumcholat resuspendiert Mischen. Nach der Inkubation auf Eis für 1 h wird das Detergens aus der Rekonstitution Mischung unter Verwendung eines adsorbierenden Harzes langsam entfernt. Diese Art von Material wird häufig von Polystyrol in kleine Kügelchen geformt gemacht. Sie sind relativ hydrophob und haben eine starke Präferenz für Waschmittel – Bindung im Vergleich zu Lipiden 48. Nachdem die hydrophoben Kügelchen zu entfernen und die Durchführung Klärung Zentrifugation werden die Nanoscheiben durch Grßenausschlußchromatographie (SEC) gereinigt. Die gereinigten Nanoscheiben sind mit einem monotopen Membranprotein gemischt (und ggf. Co-Faktoren) in einem äquimolaren Verhältnis (oder mehrerer Verhältnisse für eine Titration) und an r linksEACT (15 min). Die Analyse mittels TEM wird durch Anlegen ul-Probenmengen auf glow-entladen, mit Kohlenstoff beschichteten Gitter und dann, indem eine negative Färbung mit NAPT durchgeführt. Die gleiche Probe aus, wenn die Aliquots auf die TEM Gitter aufgetragen wurden, können für die Analyse durch nicht-denaturierende PAGE oder SDS-Gelelektrophorese sowie durch verschiedene Arten von Aktivitätsmessungen verwendet werden, wobei keine wesentlichen Änderungen.

Protocol

1. Herstellung von Nanoscheiben Expression und Reinigung des Membrangerüstprotein 8, 35 Express das His-Tag MSP1E3D1 in den E. coli BL21 (DE3) T1R pRARE2 Stamm in Flaschen. Bereiten Sie eine 50-ml-Übernachtstarterkultur mit LB-Medium, ergänzt mit 50 ug / ml Kanamycin bei 37 ° C. Verdünnen Sie die über Nacht Starterkultur in 2 l Terrific Broth-Medium mit 50 ug / ml Kanamycin. Wachsen die Zellen bei 37 ° C , bis die op…

Representative Results

Die Methode, die wir vorschlagen, ist abhängig von der Herstellung von Nanoscheiben Bindung der Membranoberfläche für monotopen Membran-Protein bereitzustellen. Da es keine Transmembranprotein in die Lipid – Doppelschicht nanodisc eingebettet ist, werden die Nanoscheiben hier als "leere Nanoscheiben" (2A) bezeichnet. Diese weisen ein berechnetes Molekulargewicht von 256 kDa für eine Zusammensetzung von zwei MSP1E3D1 Gerüstproteine und etwa 260 Moleküle vo…

Discussion

Das Verfahren kann in drei Teile unterteilt werden: die Rekonstitution von leeren Nanoscheiben, die Herstellung von Protein-nanodisc Komplexe und die negative Färbung für die TEM dieser Komplexe. Jeder Teil wird separat in Bezug auf Beschränkungen der Technik, wichtige Schritte, und nützliche Änderungen gerichtet.

Die Rekonstitution von leeren Nanoscheiben. Kritische Schritte und Einschränkungen in der Herstellung und Verwendung von Nanoscheiben.

Für die Hers…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken der schwedischen Research Council, Stockholm County Council, und KI Mittel für ihre Unterstützung. Die Expression und Reinigung von MSP wurde am Karolinska Institutet / SciLifeLab Protein Science Core Facility (http://PSF.ki.se) durchgeführt. Die Autoren möchten sich auch Dr. Pasi Purhonen und Dr. Mathilda Sjöberg für die gemeinsame Nutzung ihrer technischen Know-how und für ihre rechtzeitige Unterstützung zu danken.

Materials

Transmission electron microscope: JEOL2100F JEOL
CCD camera Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany
Glow discharger Baltec
TEM grid: 400 mesh TAAB GM016/C
Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5 Agilent Technologies 5190-2526
Superdex 200 HR 10/300 GE Healthcare Life Sciences 17-5172-01
Plasmid:MSP1E3D1 Addgene 20066
Bacteria: BL21DE3 NEB C2527H
Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2 Protein Science Facility, KI, Solna
Purification Matrix: ATP agarose Sigma Aldrich A2767
Purification Matrix: HisTrap HP-5 ml GE Healthcare Life Sciences 17-5247-01
Lipid:POPC Avanti polar lipids 850457C 25 mg/ml in chloroform
Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin Bio-Rad 1523920
13 mm syringe filter: 0.2 μm Pall life sciences PN 4554T
Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate Sigma Aldrich 31648
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Bio-Rad 161-0301
Protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001
TCEP Sigma Aldrich 646547
Detergent: Sodium cholate hydrate Sigma Aldrich C6445-10G
Sodium Cholate 500 mM Sodium cholate Resuspend in miliQ water and store at -20°C
Lipid Stock 50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl Store at 4°C for a week or
Store -80°C for a month, after purging the solution with nitrogen
MSP standard buffer 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mMEDTA Store at 4°C
Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer 50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6.8 BN2001 Purchased from Thermofisher Scientific
Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer 50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6.8 0.002% Coomassie G-250 BN2002 Purchased from Thermofisher Scientific
Non-Denaturaing Electrophoresis 4X Sample loading Buffer 50 mM BisTrispH 7.2, 6N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S BN2003 Purchased from Thermofisher Scientific
Denaturaing Electrophoresis Running Buffer 25 mM Tris-HCl pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1 % (w/v) SDS Inhouse receipe
Denaturaing Electrophoresis 5X Sample loading Buffer 0.05 % (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl pH 6.8, 20 % (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS,10 mM 2-mercaptoethanol Inhouse receipe
Terrific broth Tryptone – 12.0g
Yeast Extract – 24.0g
100 mL 0.17M KH2PO4 and 0.72M K2HPO4
Glycerol – 4 mL
Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 ml and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium

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B. Kumar, R., Zhu, L., Hebert, H., Jegerschöld, C. Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (121), e55148, doi:10.3791/55148 (2017).

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