Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Metode for å visualisere og analysere Membran samspill proteiner av transmisjonselektronmikroskopi

Published: March 5, 2017 doi: 10.3791/55148
Automatic Translation
1, 2, 1,2, 1,2
1Department of Biosciences and Nutrition, Karolinska Institutet, 2School of Technology and Health, KTH Royal Institute of Technology

Introduction

I medisinsk forskning, er mye oppmerksomhet rettet mot membranproteiner, enten indre eller ytre, som er involvert i en rekke lipid-interaksjoner. Arbeide med lipid-samspill proteiner inneholder enten velge en erstatning til de lipider, som vaskemidler, amphipols en eller små proteiner 2, eller finne en membran erstatning som holder proteinet løselig og aktiv. Lipoic membran erstatninger inkluderer liposomer og nanodiscs (ND) 3, 4.

Nanodiscs er i nærheten av fremmedmembran plattformer som er utviklet ved å konstruere proteindelen, ApoA-1, av high-density lipoprotein (HDL) forekommer naturlig i blod. ApoA-1 er et 243 rest-lang kjede av korte amfipatiske a-helikser og har en lipid-oppløselig fri konformasjon. In vitro når i nærvær av lipider, to kopier av proteinet ApoA-1 spontant ordne til å omgi den hydrophobic acylkjede parti av et lipidbilag lapp 5. Konstruerte versjoner av ApoA-1 er vanligvis kalles membran stillas proteiner (MSP), og et økende antall er kommersielt tilgjengelige som plasmider eller som rensede proteiner. Repetisjoner eller slettinger av a-helikser i ApoA-1 resultat i lengre 6 eller kortere 7 membranstillasproteiner. Dette i sin tur gjør det mulig å danne plater rundt 6 nm 7 til 17 nm 8 i diameter. Det finnes ulike typer av applikasjoner for nanodiscs 3, 9. Den mest brukte søknad er å tilveiebringe en tilnærmet opprinnelig membran miljø for stabilisering av et integrert membranprotein 8, vurdert tidligere 3, 9. En mindre-utforsket bruk er å tilveiebringe et nanoskala membranoverflate for å studereperifere membran-proteiner 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Del 1 av protokollen under visualiserer prosedyren for å lage nanodiscs består av fosfolipider og membran stillas protein.

Prøveopparbeidelse er en flaskehals i de fleste metoder. Metode spesifikke prøver kan legge spesiell informasjon, men de kan også gjøre sammenligninger av resultater vanskelig. Derfor er det enklere når prøvene er multimodal og kan anvendes direkte i flere forskjellige fremgangsmåter. En fordel med bruk av nanodiscs er den lille størrelsen på nanodisc i forhold til liposomer (f.eks, kan prøvene bli direkte anvendt for både TEM og ikke-denaturerende gel-elektroforese, som i den foreliggende protokoll).

18. Imidlertid har ingen høyoppløselig 3D-struktur av en monotopic membran protein innebygd på en liposommembranen publisert ennå, så vidt vi vet. Gull nanopartikler eller antistoffer kan anvendes for å visualisere proteiner som bindes til liposomer eller vesikler ved hjelp av TEM 19. Selv om disse probene er svært spesifikke, kan de forstyrre membranbindende proteiner ved tilsløring membranbindingssetet eller ved å maskere områder av interesse med de fleksible delene. Gull-merket eller antistoff-kompleksproteiner sannsynligvis kunne bli analysert på en gel, men dette vil øke kostnadene av forsøket.

Selv liposomer er en utmerket plattform, kan man ikke være sikker på at popgler har et spesielt forhold av protein per liposomer, en funksjon som kan utforskes ved bruk av nanodiscs 20. I et liposom, kan kofaktorer og substrater være fanget i den oppløselige indre. Stoffer som er membran-løselig skal dele samme skjebne for begge typer membran etterligninger. Likevel, som bilaget området er mindre i nanodiscs, blir en mindre mengde stoff som kreves for å mette de nanodisc membraner.

Forståelse protein funksjon gjennom fastsettelse av atom-strukturen har vært viktig for mange forskningsfelt. Metoder for proteinstrukturbestemmelse inkluderer X-ray 21; kjernemagnetisk resonans (NMR) 22, 23; og transmisjonselektronmikroskopi (TEM) 24 ved kryogene temperaturer, cryoEM. Oppløsningen av cryoEM har den siste tiden blitt kraftig forbedret, hovedsakelig på grunn av bruk av direkte elektron devarslere 25, 26. De makromolekyler er avbildet i tynn, glasslegemet is 27 i en tilnærmet opprinnelig tilstand. Men på grunn av den lave kontrasten av biologiske molekyler, blir de vanskelige å oppdage i størrelsesområdet på 100 - 200 kD. For passende store prøver, kan innsamling av data gjøres og kan anvendes fremgangsmåten ifølge enkelt partikkel rekonstruksjon for å oppnå en struktur 28.

Imidlertid bestemmelse av proteinstruktur ved TEM er en flertrinns prosess. Det begynner som regel med evalueringen av prøve monodispersitet av negativ-flekken TEM 29 ved hjelp av salt i tungmetaller som phosphotungsten (PT) 30 eller uran 31. Rekonstruksjon av en lav-oppløsning modell av negativt farget makromolekyl er vanligvis laget, og kan gi viktig informasjon om molekylstrukturen 29. Parallelt,datainnsamling ved hjelp cryoEM kan starte. Forsiktighet bør utvises ved vurdering av negativ-flekk TEM data for å unngå feiltolkning av gjenstanden formasjon. En spesiell gjenstand er effekten av PT flekk på fosfolipider og liposomer 32, noe som resulterer i dannelsen av lange staver som likner stabler av mynter sett fra siden 33. Slike "rouleau" eller "stabler" (heretter benevnt som "stabler") ble observert tidlig for HDL 34, og senere også for nanodiscs 35.

Stabling og omforming av membraner kan oppstå av mange grunner. For eksempel kan det bli indusert ved ko-faktorer som kobber, som er vist ved TEM avbildning i et ammoniummolybdat flekk 36. En fraksjon av membranlipider i liposomer inneholdt en iminodieddiksyre hodegruppe ligne metallkompleksering av EDTA, således stabling liposomer etter tilsetning av kobberioner 37. Stabelen dannelsen av fosfolipider fra PT ble observert tidlig på; men har senere arbeidet fokusert på å fjerne eller avskaffe denne gjenstanden formasjon 38.

Her, foreslår en metode for å dra fordel av den NAPT-indusert nanodisc stabling for studiet av membran-bindende proteiner ved TEM. Kort sagt, vil proteinbinding på nanodiscs hindre nanodiscs fra stabling. Selv om grunnene for stabling er ikke klar, ble det foreslått 39 at det er en elektrostatisk interaksjon mellom fosfolipider og den fosforyl gruppe PT, forårsaker plater for å holde seg til hverandre (figur 1 A). Hypotesen bak vårt protokoll er at når et protein som binder seg til en nanodisc, de fleste av fosfolipidet overflaten ikke er tilgjenge gelig for interaksjonen med PT på grunn av sterisk hindring av proteinet. Dette vil forhindre stabel dannelse (figur 1B). To konklusjoner kan trekkes. Først, forebygging av stable betyr at proteinet av interesse har blitt bundet til membranen. For det andre kan det protein ND kompleks behandles med standard enkeltpartikkel prosesseringsmetoder 24, 40 for å få en grov morfologi av komplekset. Videre analyser av metoder som ikke-denaturerende gelelektroforese eller dynamisk lysspredning kan utføres.

For å demonstrere denne hypotesen, brukte vi membran-bindende protein 5-lipoksygenase (5LO), som er involvert i mange inflammatoriske sykdommer 41, 42. Dette 78 kDa proteinet krever kalsiumioner til å binde seg til sin membran 43. Selv om denne membranen foreningen har blitt studert ved hjelp av liposomers = "xref"> 44, 45, 46 og membranfraksjoner 47, kan disse ikke brukes til TEM-analyse og strukturbestemmelse.

Utarbeidelse av nanodiscs starter ved å blande MSP med lipid resuspendert i vaskemiddel natriumcholat. Etter inkubering på is i 1 time, blir vaskemiddel langsomt fjernet fra rekonstituering blandingen ved hjelp av en adsorbentharpiks. Denne type materiale er ofte laget av polystyren formes til små kuler. De er relativt hydrofobe, og har en sterk preferanse for binding vaskemiddel i forhold til lipider 48. Etter å ha fjernet de hydrofobe perlene og utfører klargjøring ved hjelp av sentrifugering, blir nanodiscs renses ved størrelse-utelukkelses-kromatografi (SEC). De rensede nanodiscs blandes med en monotopic membranprotein (og mulige kofaktorer) i et ekvimolart forhold (eller flere forholdstall for en titrering) og er igjen for å react (15 min). Analyse ved TEM er utført ved å anvende mL-mengder av prøven på gløde-utladet, karbon-belagte gittere, og deretter ved å utføre negativ farging med NAPT. Den samme prøve fra når alikvotene ble anvendt på TEM-gitrene kan anvendes for analyse ved ikke-denaturerende eller SDS PAGE-gel-elektroforese, så vel som av ulike typer aktivitetsmålinger, uten større endringer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av Nanodiscs

  1. Ekspresjon og rensing av membranen stillas proteinet 8, 35
    1. Uttrykk Hans-merket MSP1E3D1 i E. coli BL21 (DE3) T1R pRARE2 belastning i kolber. Fremstille en 50 ml over natten starterkultur med LB-medium supplert med 50 ug / ml kanamycin ved 37 ° C. Fortynn natten over startkulturen i 2 liter strålende medium medium supplert med 50 ug / ml kanamycin.
    2. Dyrke cellene ved 37 ° C inntil den optiske tetthet ved 600 nm (OD 600) når omtrent 3. indusere proteinekspresjon med 0,5 mM isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) i 3 timer ved 18 ° C.
    3. Klargjør lyseringsbuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 100 mM NaCl, og 10% glycerol). Tilsett 1 mM TCEP umiddelbart før bruk.
    4. Etter 3 timer med induksjon ved 18 ° C, høsting av cellene ved sentrifugering i 10 min ved 4500 xgog 4 ° C. Kast supernatanten, veie de høstede cellene, og re-suspendere dem i lyseringsbuffer ved et forhold på 2 ml lyseringsbuffer per g av celler.
    5. Lyse cellene ved pulset ultralydbehandling (repetisjonshastighet: 4 s ON, 4 s OFF) i 3 minutter ved 80% amplitude.
    6. Sentrifuger lysatene i 20 minutter ved 49000 xg og 4 ° C. Kasser pelleten fra denne sentrifugering.
    7. Injiser supernatanten i en 5 ml Ni + chelaterende kolonne koblet til et automatisk væskekromatografi system fortrinnsvis holdes ved 4 ° C.
    8. Før elueringstrinnet (trinn 1.1.9), vask av kolonnen med buffere 1 - 3 nedenfor for å fjerne alle proteiner med unntak av His-merket MSP. Overvåke proteininnhold ved 280 nm for å følge renseprosessen; UV-opptak på 280 nm bør gå tilbake til utgangsverdien etter hver vask.
      1. Vask med en vaskebuffer: 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, og 1% Triton, pH 8,0.
      2. Vask med vaskebuffer 2: 40 mM Tris-HCl, 300 mMNaCl, 20 mM imidazol, 50 mM og natriumcholat, pH 8,0.
      3. Vask med vaskebuffer 3: 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, og 50 mM imidazol, pH 8,0.
    9. Eluer MSP med 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl og 500 mM imidazol, pH 8,0.
    10. Forandre bufferen til MSP standard-buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM NaCl, og 0,5 mM EDTA) ved gelfiltrering 8, 35; utbytte per batch bør være rundt 7 mg L -1.
  2. Utarbeidelse av fosfolipid stamløsning
    1. Legge til 305 ul av 1-palmitoyl-2-oleoyl- sn -glycero-3-fosfokolin (POPC) oppløst i kloroform ved en konsentrasjon på 25 mg / ml til et glassbeger og fordampe kloroformen ved å spyle den med en forsiktig strøm av nitrogen . Tørk det lipid over natten i en vakuum-eksikator. MERK: Dette trinnet utføres for å fjerne løsningsmidlet fra lipid, som etterlater en tynn film av lipid på bunnen av den begerglass.
    2. Resuspender lipidkaken i 200 mL av MSP standard buffer inneholdende 100 mM natriumcholat ved å virvle i røret inntil løsningen blir gjennomsiktig; Dette vil gi en løsning med en POPC konsentrasjon på 50 mM.
      MERK: Generelt er det molare forholdet mellom lipid til vaskemiddel ved dette punktet bør være 1: 2 (lipid: vaskemiddel) 8. Dette lipid-detergentblanding kan lagres ved -80 ° C i nesten 2 måneder.
  3. Utarbeidelse av hydrofobe perler for fjerning vaskemiddel
    1. Plasser 5 g kuler (tørrvekt) i en 50-ml tube.
    2. Vaske perlene med 30 ml 100% metanol og deretter med 40 ml ultrarent vann.
    3. Vaske perlene med 10 ml av MSP standard buffer. Endelig lagre perlene med 15 ml MSP standard buffer ved 4 ° C.
  4. Nanodisc tilberedning
    1. Tilsett 190 ul av MSP1E3D1 (0,124 mm) inn en mikro rør og tilsett 61,5 mL av fosfolipid stamløsning (50 mM POPC) til det samme røret. Inkuber rekonstituering blandingen på våt is i 1 time. MERK: Dette tilsvarer et molart forhold på 1: 130 (MSP1E3D1: POPC).
    2. Legg hydrofobe perler ved en konsentrasjon av 0,5 g perler per ml etter oppløsning blandingen for å starte selvmonteringsprosessen. Inkuber i en roterende inkubator i 16 timer ved 4 ° C.
    3. Etter inkubering i sentrifuge i 10 minutter ved 13000 xg og 4 ° C fjerne bunnfallet og aggregater. Kast pelleten og lagre supernatanten.
    4. Ekvilibrere størrelseseksklusjonskromatografi kolonne (montert på en automatisert væskekromatografi system) med MSP standard buffer inntil absorbansen ved 280 nm er stabil. Injiser supernatanten inn i kolonnen og samle toppfraksjoner.
    5. Måle konsentrasjonene av nanodiscs i toppfraksjonene ved 280 nm. Bruke den molare ekstinksjonskoeffisient på MSP1E3D1 (e = 29910 cm-1 M-1) for beregning av nanodisc konsentrasjon. MERK:antall lipider pr nanodisc kan måles ved en kombinasjon av radioaktivt merkede lipider og fosfat analyse fire eller ved fosfatanalyse alene.

2. Utarbeidelse av Monotopic Protein 5-Lipoxyqenase 35

  1. Forbered en overnatting startkultur. Supplement 50 ml LB-medium med 100 pg / ml ampicillin. Inokulere mediet med E. coli BL21 (DE3) inneholdende plasmidet på 5-lipoksygenase-genet (ALOX5). Fortynn natten over startkulturen i ekspresjons-medium inneholdende 42 mM Na2 HPO 4, 24 mM KH 2PO 4, 9 mM NaCl, 19 mM NH4CI, 1 mM MgSO4, 0,1 mM CaCl2, 0,2% D-glukose, 0,1 %, 5 uM FeSO 4, og 100 pg / ml ampicillin. Dyrke cellene til OD 600 er ~ 0,5 ved 25 ° C. Indusere proteinekspresjon med 0,2 mM IPTG i 16 timer ved 20 ° C 35.
  2. Avling ved sentrifugering i 10 minutter ved 7000 xg og 4 ° C og kast supernatanten. Veie pellet funnet på bunnen av røret som inneholdt de høstede cellene og resuspender de høstede celler i lyseringsbuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 100 mM NaCl, 10% glyserol, og 1 mM TCEP) inneholdende protease inhibitor og 0,5 mg / ml 35 lysozym i et forhold på 2 ml lyseringsbuffer per g av celler.
  3. Lysere cellene ved ultralydbehandling i 5 x 15-s ved 80% amplitude. Fjerne celleavfall ved sentrifugering i 10 minutter ved 7000 xg og 4 ° C. Utføre ammoniumsulfatutfelling til 30 - 60% metning for å utfelle proteinene i oppløsningen 35. Sentrifuger i 15 minutter ved 16000 xg og 4 ° C. MERK: 5LO pellet kan raskt frosset og lagret ved -80 ° C i opp til 6 måneder.
  4. Resuspender pelleten med 20 ml lyseringsbuffer og sentrifuger i 15 minutter ved 40000 xg og 4 ° C.
  5. Inkuber supernatanten på en ATP-agarose-kolonne ved 4 ° C i 30 minutter. Vask kolonnen med en gang en kolonne-volum av lyseringsbuffer inneholdende 0,5 M NaCl. Eluer 5LO med 20 mM ATP i lyseringsbuffer inneholdende 10 uM FeSO 4 og 20 mikrogram / ml katalase. Utføre gelfiltreringskromatografi for å fjerne ATP-35.
    MERK: 5LO er ustabil og bør brukes umiddelbart etter rensing. Hvis ikke, er det anbefalt å stanse ved trinnet med ammoniumsulfatfelling (se note etter trinn 2.1.3).

3. Utarbeidelse av Nanodisc-protein Complex

  1. Fremstille et totalvolum på 100 ul av komplekset. Bland 0,8 uM ND og 0,8 uM 5LO med 1 mM Ca2 + er til stede i MSP standard buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM NaCl; 0,5 mM EDTA, og 1,5 mM CaCl2) og inkuberes i 10 min på is. MERK: Prøven kan oppbevares i opptil en måned ved 4 ° C 35.
ove_title "> 4. analysen av prøvene

  1. gel elektroforese
    1. Ikke-denaturerende elektroforese
      1. Bland 15 ul av prøven med 5 mL av ladningsbuffer (50 mM BisTris, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w / v) glycerol og 0,001% Ponceau S, pH 7,2) 49 og legger den på en fire - 16% Bis-Tris gel å utføre elektroforese.
      2. Fyll katoden tank med lys katode-buffer (50 mM Bis Tris, 50 mM Tricine, pH 6,8, og 0,002% Coomassie G-250) og anoden tank med rennende buffer (50 mM Bis Tris og 50 mM Tricine, pH 6,8). Start separasjon ved hjelp av en konstant spenning på 150 V.
      3. Stoppe den elektroforetiske atskillelse når Coomassie fremre når enden av gelen.
      4. Flekk gelen med en standard Coomassie blå-protokoll.
    2. denaturering elektroforese
      1. Bland 40 ul av prøven med 10 mL av ladningsbuffer inneholdende SDS (0,05% (w / v) bromfenol blå, 0,2 M Tris-HCl,pH 6,8; 20% (v / v) glycerol; 10% (vekt / volum) SDS; og 10 mM 2-mercaptoethanol) og legger det på en 4-20% Tris glysin gel for å utføre elektroforese.
      2. Fyll katode- og anode tanker med rennende buffer (25 mM Tris-HCl, pH 6,8; 200 mM glycin, og 0,1% (w / v) SDS). Start separasjon ved hjelp av en konstant spenning på 150 V.
      3. Stoppe den elektroforetiske atskillelse når laste fargestoff fremre når enden av gelen.
      4. Flekk gelen med en standard Coomassie blå-protokoll.
  2. Tilberedning av NAPT løsning
    1. Oppløs 1 g fosfotungstatat-natriumsalt i 50 ml vann ved omrøring ved romtemperatur for å gi en 2% (w / v) eddiksyre.
    2. Juster pH til 7,4 med 1 M NaOH. Partiklene fjernes ved anvendelse av en 0,22-um sprøytefilter. Oppbevar løsningen ved romtemperatur eller ved 4 ° C.
  3. Fremstilling av prøven for TEM-analyse
    1. Glow-utslippet karbon-belagt kobbernett (400 mesh) i 20 s ved 30 mA for å gjengi gitrene hydrofile før adsorpsjon av prøven. Plasser 3,5 ul av prøven (0,8 uM med hensyn til nanodiscs) i nettet og inkuber i 30 sek. MERK: Volum anvendt kan variere mellom 2,5 og 5 ul, avhengig av prøvekonsentrasjon. En passende konsentrasjonsområde for nanodiscs er 0,5 - 1 mikrometer.
    2. Blot av overflødig løsning med filter papir.
    3. Umiddelbart flekken rutenettet med et fall på 2% NAPT i 30 s. Blot av overflødig løsning og la rutenettet for å lufttørke.
    4. Vurdere nett av TEM. Et mikroskop med 120-200 keV akselererende spenning er tilstrekkelig til å anslå omfanget av stabling. MERK: For denne protokoll, ble en kalibrert transmisjonselektronmikroskop brukt, utstyrt med en 200-keV feltet utslipp pistol.
    5. Spill TEM-bilder. For bilder som viser lange stakker, ikke behandler videre; Bildene viser kompleks av nanodiscs, med ytre protein som kan inneholde noenkorte stabler, men de fleste partiklene er i komplekset. Ta opp flere bilder og fremgangsmåten disse henhold til standard metoder for å oppnå klasse-gjennomsnittene og en lav-oppløsning, tre-dimensjonal modell av komplekset.
      MERK: For innsamling av negativ-flekk data, ble rutenett gjort på minst tre forskjellige dager. For hver dag, ble friske prøve inkubasjoner (som i trinn 3.1) gjort før den negative flekken ble brukt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Metoden vi foreslår avhenger fremstillingen av nanodiscs for å tilveiebringe den membranoverflaten for monotopic membranproteinbinding. Siden det ikke er trans protein innebygd i nanodisc lipid bilaget blir nanodiscs her betegnes som "tomme nanodiscs" (Figur 2A). Disse har en beregnet molekylvekt på 256 kDa til en sammensetning av to MSP1E3D1 stillas proteiner og rundt 260 molekyler av POPC 8. Ved hjelp av dette proteinet: lipid-forhold for tilberedning, en stor topp (figur 2A) ble eluert under gelfiltrering. Topp-fraksjonene i området rundt 9 ml (figur 2A) ble undersøkt ved hjelp av blå innfødt gelelektroforese 49, som viser ett bånd (figur 2B, kolonne 1). Selv om båndet tilsvarer en størrelse noe større enn den beregnede 256 kDa, den nanodisc diameter målt i TEM-bilder tilsvarerventet 13 nm ± 0,5 nm.

Den monotopic membranprotein 5-lipoksygenase (5LO) ble renset som beskrevet ovenfor (Protocol trinn 2), og i mer detalj tidligere 35. Homogeniteten av det 78-kDa 5LO ble analysert ved SDS-PAGE-elektroforese (figur 2C, kolonne 1), og var fullstendig funksjonell 35 (ikke vist).

I denne protokollen, er forholdene forsettlig opprettet som fremmer stabling av nanodiscs. Det bør imidlertid bemerkes at denne stabling induseres bare i prøvene fremstilt for TEM avbildning (såkalte prøvestykker), spesielt ved tilsetning av den negative flekken natrium fosfotungstatat som siste trinn etter at alle andre behandlinger og tilsetninger hadde blitt gjort. Faktisk, bilder av NAPT-farget nanodiscs viser den forventede stabling (figur 3A) veldig tidlig for HDL 34 5, 50. Den "lange stabler av mynter sett fra siden" (figur 3A) er de nanodiscs aggregert med fosfotungstatat Pilgrim mellom bilagene, som beskrevet skjematisk i figur 1A og foreslått av Zhang et al. 32, 39.

Det er viktig å undersøke hvorvidt forskjellige tilsetninger i bufferne påvirke, forhindre, eller til og med forårsake stabling, og slik det vil fremgå nedenfor, effekten av kalsiumioner som kreves undersøkelse. I figur 3B, er stable fortsatt til stede i en prøve hvor kalsiumioner ble tilsatt til nanodisc løsning før farging med NAPT.

Det vesentlige trinn i protokollen er vist i figur 4, hvor den membran-binding protein er til stede i løsningene. Stable kunne ikke induseres ved NAPT flekken når 5LO var bundet til membranoverflaten på nanodiscs (figur 4A). For denne prøven, det molare forhold mellom 5LO til nanodiscs var 1: 1, som skjematisk vist i figur 1 (figur 1 B, nederst til høyre). Videre, ettersom det ytre lipid bilaget på nanodiscs er tilgjengelig fra begge sider, i motsetning til liposomer, eksemplarer med forholdet mellom to 5LO til en nanodisc ble fremstilt, mens de TEM-bilder viser enda mindre stable (figur 4B).

For binding, kan noen ytre membran proteiner er avhengig av nærværet av en spesifikk lipid i membranen, for eksempel phosphoinositols 10, 11, 12 eller 10 fosfatidylserin. I tilfelle av 5LO, tilstedeværelse av Ca 2+ er nød-vendig 43. I figur 4A og B, kalsiumioner var tilstede i løsninger med nanodiscs og 5LO. Med andre ord, viser mangel på stabling ikke bare at monotopic proteinet er bundet, men også at bindings er avhengig av Ca 2 + -ioner. For å vise dette, ble en oppløsning inneholdende nanodiscs og 5LO, men uten kalsium farget med NAPT og avbildes ved TEM (figur 4C). Som forventet, kan 5LO ikke binde seg til nanodiscs uten Ca2 +, forlater 5LO fritt i løsningen, slik at nanodiscs stabelen istedenfor (figur 4C).

Figur 1
Figur 1. Prinsippet Nanodisc Stacking og Oversikt over Method. A. Prinsippet om nanodisc stabling. Tilsetningen av den negative flekken natrium fosfotungstatat til en oppløsning av nanodiscs (venstre) fører til th e stabling av nanodiscs (til høyre) som følge av elektrostatiske krefter (midten, piler) mellom fosfolipid dobbeltlag og PT molekyler (midten, sorte prikker). B. Skjematisk fremstilling av protokollen. Tomme nanodiscs (venstre) binder seg til et ytre membranprotein (grå) for å danne et kompleks, som er tatt fra fire forskjellige vinkler (lavere midten). Nærværet av monotopic proteinet sterisk hindrer nanodiscs fra stabling når farget med den fosfotungstatat salt (nederst til høyre), i motsetning til den stabling som induseres i fravær av eventuelle store objekter (øverst til høyre). De klima- og oransje-farget ringene representerer de to MSP innpakning rundt fosfolipid kjerne, som er representert i lys brun. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

jpg "/>
Figur 2. Homogenitet Analyse av Nanodiscs og 5LO. A. størrelse utelukkelse kromatografi av rekonstituert tomme nanodiscs. Elueringen av de nanodiscs toppene på 9 ml. B. Ikke-denaturerende gel-elektroforetisk analyse av toppfraksjonen fra SEC vist i (A). Lane M inneholder markøren. Et enkelt bånd er tilstede i felt 1, hvor toppfraksjonen ved 9 ml ble lastet. C. denaturerende gel-elektroforetisk analyse av renset 5LO. Den 78 kDa 5LO viser som en intens band i kjørefelt 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Stack Dannelse av Nanodiscs i fravær av Protein analysert ved TEM. A. Nanodisc stabling ble indusert whøne farget med NAPT. Den "stabler av mynter" er det stabler av nanodiscs sett fra siden. Hver nanodisc vises som et hvitt bånd. B. Stacking ble ikke forstyrret av tilstedeværelsen av kalsiumioner i nanodisc løsning når farget med NAPT. Skalaen barer er 100 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Forebygging Stack Dannelse av Binding Protein i nærvær av en kofaktor analysert ved TEM. A. og B. Kalsiumioner til stede i blandinger av 5LO og nanodiscs ved molare forhold på 1: 1 (A) eller 2: 1 (B). Jo mer 5LO binding til nanodiscs, jo færre nanodiscs er tilgjengelige for stabling, som vist i (B). De single-partikkel komplekser i boksth (A) og (B) er egnet for videre behandling 35. C. I fravær av kalsiumioner, 5LO kan ikke binde. NAPT farging av denne prøven viser typiske stabling av nanodiscs, forlater 5LO ubundet. Skalaen barer er 100 nm. Bildene ble kjøpt opp av en 4K x 4K CCD kamera med en forstørrelse på 69,500x. Pixel størrelsen av CCD-kameraet er 15 mikrometer, noe som gir en tilsvarende verdi på 2,16 Å på prøvenivå for EM-bildene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fremgangsmåten kan deles inn i tre deler: den rekonstituering av tomme nanodiscs, fremstillingen av protein-nanodisc komplekser, og negativ farging for TEM av disse kompleksene. Hver del vil bli behandlet separat om begrensninger av teknikk, kritiske trinn, og nyttige modifikasjoner.

Tilberedning av tomme nanodiscs. Kritiske trinn og begrensninger i produksjon og bruk av nanodiscs.

For fremstilling av de tomme nanodiscs, er det viktig å optimalisere MSP-til-lipid-forhold. For den vanligste MSP og lipider (med cholate som et vaskemiddel), kan forslag til de optimale forholdene som finnes i litteraturen (f.eks 125-130 POPC per MSP1E3D1 8, 51 brukes i den foreliggende protokoll). Forskjeller ble oppnådd sammenlignet med de publiserte forhold kan avhenge av fremgangsmåten for bestemmelse av proteinkonsentrasjonen, effektiviteten av lipid oppløsnings i vaskemiddel, og fremgangsmåten for vaskemiddel fjernelse fra oppløsningen.

Vi foreslår å utføre fjerning vaskemiddel ved hjelp av hydrofobe perler 48 (trinn 1.3), mens mulige alternativer er dialyse eller tillegg av syklodekstrin 52, 53. Til å begynne med, dialyse ble anvendt for rekonstituering av HDL 5, 34 og er fremdeles foretrukket 54. Uavhengig av fremgangsmåten for fjerning av detergent, er hastigheten vesentlig. Dersom fjerning er for rask (det volum av hydrofobe kuler er for stor), vil spontan omleiring av MSP med lipidene ikke har tid til å finne sted. I stedet kan store mengder av liposomer og dannelse av proteinaggregater. Resultatene fra størrelseseksklusjonskromatografi ville vise store mengder liposomer i hulromsvolumet, en suboptimal topp på rekonstituert nanodiscs, og en større topp av ubruktMSP 4, 6, 51. For altfor lite volum av hydrofobe perler, kan fjerning vaskemiddel være ufullstendig, og nanodiscs som danner kan vise en variasjon i størrelser, hvor de fleste er mindre enn forventet. Man kan teste to tilsetninger av mindre mengder hydrofobe perler i stedet for en stor tillegg til å bremse ned hastigheten på tilberedning.

Valget av lipider bør vurderes nøye 8, 9, 45, 46, 55, avhengig av formålet for nanodisc forberedelse. Generelt for alle metoder som tar sikte på dannelsen av membraner (rekonstituering av nanodiscs eller liposomer, så vel som for 2D krystallisering eksperimenter), må lipidene være i en "flytende" tilstand 56. Under en viss temperatur, the lipid er stiv. Ovenfor denne såkalte overgangs-temperatur (Tm), er det lipid fluid. Merk at noen vanlig brukte mettet fett har en Tm godt over romtemperatur. Videre, for lipid-blandinger, blandbarhet av lipider muse veies 57. Den optimale temperatur for Nanodisc dannelse er rundt faseovergangen (Tm) av lipid.

Vaskemiddelet i denne protokoll er natrium cholate 8. Hvis et annet vaskemiddel må brukes, de samme konsentrasjoner som de som brukes for cholat kan ikke direkte brukes. Visse milde vaskemidler oppløse lipidene mindre effektivt, og en høyere konsentrasjon kan være nødvendig. Lipidkaken erholdt etter fordampning av kloroform (trinn 1.2.2 i protokollen) må oppløses til en klar oppløsning av vaskemidlet. Virvling, fryse-tine-sykluser, ultralyd bad, eller ultralydbehandling kan anvendes for å akselerere solubilisering.

for combinationer av lipid (-mixtures), MSP, og andre enn de som brukes her, titreringer for å minimere store aggregater og liposomer eller overskudd av MSP vaskemidler er nødvendig med 4, 6, 51, 58. For noen kombinasjoner av MSP og fosfolipider, kan optimaliseringen være vanskeligere enn for andre, 4, 6, 51, og det blir viktig for å bestemme innholdet av toppfraksjonene. Den mest nøyaktige metode for analyse av nanodisc sammensetning og størrelse er for å bestemme antall av fosfolipider pr MSP ved fosfatanalyse 4 og beregne nanodisc molekylvekt. Nanodisc størrelse kan estimeres ved godt løst, ikke-denaturerende gelelektroforese; dynamisk lysspredning (DLS) 59; eller negativ-flekken TEM, for å nevne bare noen få metoder. Som for Negative-flekk-indusert stabling protokoll er presentert her, er målingen av bredden av stablene som er tilstede i TEM-bilder gir diameteren av nanodiscs.

Som for ekspresjon og rensing av membranen stillas protein, bør alle vanlige forholdsregler og bekymringer for et løselig protein bli tatt. Plasmidene tilgjengelige kan inneholde ulike koder og protease kutteseter i tilfelle tag må fjernes før du bruker MSP.

5LO, den monotopic proteinet anvendt i protokollen, inaktiverer hurtig med mindre forholdsregler tas, beskrevet andre steder 35 og i referansene deri. Kort sagt, er den katalytiske jern lett tapt, og oksiderende forhold kan føre dimerization av 5LO. Som nevnt i notatet (protokoll trinn 2.1.3), kan rensingen bli stanset etter presipitasjonstrinnet og porsjoner lagret til senere bruk. Etter rensing av en alikvot, må proteinet brukes innen få timer d ue til rask inaktivering 35.

Kritiske trinn i utarbeidelsen av protein-nanodisc komplekser.

Størrelsen på monotopic proteinet versus nanodisc område er av betydning. Lengden av MSP1E3D1 proteinkjeden tilsvarer en nanodisc med en 10,5 nm indre diameter og ca. 8900 Å-2-dobbeltlaget område 8. Dette samsvarer godt til området rapportert for membran-embedded delen av 5LO 45. Dermed vår forventet bindende forholdet var 1: 1, eller høyst 2: 1 5LO per nanodisc. Dette viste seg å være riktig, som rapportert i en titrering eksperiment 35. Men den maksimale bindingen av to 5LO per nanodisc ble ikke erholdt, som diskutert andre steder 35. En noe større nanodisc kunne tillate en fullstendig 2: 1-binding til eksperimenter der dette er ønskelig, men i dette tilfelle er 1: er forholdet 1 hovedformål.

ove_content "> Valget av optimale lipider for protein-nanodisc kompleks formasjon kan bli hjulpet av forkunnskaper. Dette var tilfelle i denne protokoll, hvor valg av lipid var syntetisk POPC 35. Begge variasjoner i lipid hodet gruppen 46 og variasjoner i metning av acylkjedene 45 ble testet i liposom-5LO bindingsstudier. 5LO aktivitet ble økt ved å binde seg på liposomer inneholdende kolin fosfolipider umettede i sn-2 acylkjede posisjon 45, 46. Når spesielle lipid kravene ikke er kjent, men identiteten av den opprinnelige membranen er kjent, naturlige lipidekstrakter kunne testes først 55.

En kofaktor avhengighet var kjent for 5LO, som er avhengig av Ca2 + ioner for membranbinding 43. Det er utfordrende å fjerne kalsium fra løsninger. Her er det kompleksdannende middel EDTA til stede i bufferne i mengder tilpasset for å la en kontrollert mengde av frie Ca 2 + -ioner. Beregninger av frie og bundne molekyler i bufferne som ble gjort ved den BAD 60 programvare for buffere inneholdende mer enn en type av kompleksdannende middel 35. Den effekt på konsentrasjonen av en kofaktor delvis oppløselig i membranen er ikke avsatt ved denne programvaren.

Kritiske trinn i negativ farging av nanodiscs å fremme stack formasjon.

For protokollen for hånden, hvor maksimal stabling er ønsket, bør flekken være natriumsaltet av phosphotungsten. Forskjellige salter av wolfram er tilgjengelige, og vi har observert at fosfowolframsyre var mindre effektiv ved stabling (ikke vist). For uklare grunner, ser det ut til at store mengder natrium under PT farging fremmer stabling. Også for prøvebufferen, ble det vist at den nedre natrium fortsent, desto lavere er mengden av indusert stabling 32. Av samme grunn, etter at prøven er påført på EM nettet, bør vasking med vann før fargingen ikke utføres, da dette reduserer også stabling. På den annen side ble noen stabling alltid induserte, men ikke i den grad som er nødvendig for den beste ytelse av protokollen.

Selvfølgelig må kofaktorer som de Ca 2+ her sjekkes for interferens med negative beis eller med nanodiscs. For den foreliggende protokoll, ville kalsiumioner er utfelt en fosfatbuffer, slik at en Tris-buffer ble anvendt. De nanodiscs ble ikke stablet av Ca 2+ ioner per se, som kontrolleres ved hjelp av en annen negativ flekken, uranyl formiat 35, og heller ikke kalsium hindre NAPT-indusert stabling (figur 3B).

For en liten monotopic protein, den ekstra størrelsen lagt ved binding til en nanodisc kan gjøre det påvises i cryoEM. ENmeget stor nanodisc i forhold til proteinet, kan ikke være optimal, da et lite protein på en stor nanodisc kan ikke hindre stabling. Imidlertid kan formen på den ytre proteinet har en innflytelse. Selv om ingen nøyaktige forholdet kan være anordnet som nå er en nanodisc to-lags overflate bare litt større enn den estimerte bindeflaten av proteinet anbefalt. Med denne begrensning, vil den maksimale proteinbindings være en protein på hver side av nanodisc.

Generelle begrensninger og fordeler ved fremgangsmåten.

Protokollen er avhengig av tilgjengeligheten av en TEM og tilhørende utstyr, som ikke er tilgjengelig i alle laboratorier. Imidlertid ville en 120- til 200-kV elektronmikroskop utstyrt med en tradisjonell CCD-kamera være helt tilstrekkelig for påvisning av stabling. NAPT negativ farging blir utført ved romtemperatur, og gitrene kan oppbevares ved denne temperatur for senere visning.

TEM imaging vil raskt vise om stabling er blitt forhindret eller ikke. For de bilder som viser protein nanodisc komplekser (f.eks, figur 4A og B), videre prosessering for å oppnå strukturell informasjon kunne bli utført. Strukturelle detaljer om en negativt farget prøven kan nå en nm og kan gi nyttig strukturell informasjon 29. I laboratorier som er dedikert til strukturbestemmelse av cryoEM, er negativ farging av prøver er standard prosedyre. Bruken av vår protokoll ville være en rask og enkel tillegg til vanlige prosedyrer.

Noen monotopic proteiner er forankret til membranen ved myristoylation, palmitoylation, eller hydrofobe flekker på protein overflaten, noe som gjør det nødvendig å danne nanodisc-proteinkomplekset ved den samme fremgangsmåte som for inkorporering av et transmembranprotein inn i nanodiscs 13. Her, inneholder en av underenhetene i proteinkomplekset amyristoylation på en fleksibel N-terminal hale for membran bindende. For uranylacetat-farget TEM bilder, ble det uttalt at proteinet komplekset ble bundet vinkelrett på membranen, og ikke på siden av nanodisc. Dette og andre resultater bekreftet en stiv struktur for membranen vedlegg 13. For denne bindingen, NAPT flekker i henhold til våre foreslåtte protokoll vil vise de samme jevnt spredt enkeltpartikler. Men dersom feste hadde vært gjennom en fleksibel kjede, uranylacetat farging kanskje ikke har gitt et klart resultat. Vi spekulerer i at, for fleksible kjedemembran festet protein komplekser, kan NAPT flekker indusere nanodiscs å stable, viser den typiske "stabel med mynter," men nå dekorert av den vedlagte protein på sidene.

Hvorfor bruke nanodiscs hvis liposomer kan brukes? Optimalisering av lipider, kofaktorer, eller andre parametere, kan det meget vel bli testet i liposomer for binding av peripheral proteiner (jf. 5LO). NAPT-indusert stabling av liposomer er påvist 32, så en monotopic protein kan forhindre liposom stabling. Men til de størrelser av liposomer i sammenligning monotopic proteiner og nanodiscs kommer også inn i bildet. En stor ytre proteinet kan være i stand til å hindre stabling av liposomer, mens et lite protein, som det 78-kDa 5LO, kanskje ikke med mindre stede i høye tall pr liposom. Små liposomer kan fremstilles, men jo mindre vesikkel, jo sterkere krumningen av dets membran. Den nanodisc bilags er flat. Teste ulike parametere ved hjelp nanodiscs kan være mindre kostnadseffektivt på grunn av MSP. På den annen side, for liposomer, visse kostbare kofaktorer eller substrater som delvis fordeles i membranen og videre inn i det indre av liposomene, kan det være nødvendig i større mengder. Som konklusjon, gir muligheten til å velge et definert område for binding av en nøyaktig n nanodisc plattformen umbra av proteiner. Bilaget Området er tilgjengelig fra to sider og er flat.

Betydningen av fremgangsmåten.

Bestemme 3D-struktur av proteiner eller komplekse makromolekyler visualiserer den interne driften av celler. I denne overfylt miljø, spesifikke proteiner er aktive på membranflater, alene eller i kompleks med andre proteiner, men vanligvis slik at fysisk interaksjon med komponenter i det ytre lipid bilaget er en del av deres mekanistiske funksjon. For noen proteiner er konformasjon i løsning endret på membran embedding, mens andre er bundet til membranen, men likevel endre konformasjon eller orientering på membranen på grunn av noen slags trigger. Et hydrofobt substrat inngangsbanen kan deretter åpnes, eller en konformasjon som tillater binding til et transmembranprotein kan forekomme. For å oppnå strukturen, eller i det minste strukturell informasjon, av slike perifere proteiner bundet til membranen er utfordrende.

jove_content "> Nanodiscs ble anvendt i noen studier angående orientering og funksjon på membraner 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Cytokrom P450, sentralt i avgiftning, er forankret til membranen ved en α-heliks og inneholder en heme gruppe i sitt kuleformede del, slik at for lineære dikroisme målinger 15. resultatene indikerte en orientering av heme i forhold til membranen i nær overensstemmelse med simuleringer laget, og dermed styrke andre konklusjoner trukket fra simuleringer av membran-innebygde cytokrom P450. for en GTPase forankret til membranen i en liten nanodisc, kan NMR-studier identifisere to forskjellige områder på proteinet med en membran grensesnitt hver og videre, hvor nucleo tidevannet binding indusert et bytte fra ett grensesnitt til den andre 17. Mutasjoner og effektor bindende, samt GTP bindende, ble undersøkt i en annen GTPase i Ras-super å finne en rekke effekter på aktivitet som var avhengig av retningen på membranen, noe som vil påvirke onkogen signale 16. 5LO har en løselig konformasjon 61 og krever kalsium for innbinding på atom membraner 43. Ved hjelp av gigantiske unilamellære liposomer, ble polarisert, svekket, total-refleksjon infrarøde eksperimenter utført 46. Resultatet underforstått at den N-terminale β-fat bindes til membraner, med symmetriaksen til β-fat skråstilt omtrent 45 grader fra normal membranen. Den 5LO C-terminale domene er et nesten sylindrisk α-heliks bunt, og dette ble foreslått å binde med den lange akse parallell med membranen 45,= "xref"> 46. I vårt tidligere arbeid på 5LO innleiret på nanodiscs, ble det område av bilaget valgt til å tillate en 5LO per side med den ovenfor foreslåtte orientering 35. De TEM bilder bekreftet denne orienteringen, om enn på lav oppløsning 35. Hvis, for eksempel, ble bare den N-terminale β-fat bundet, men ikke den C-terminale domene, ville ha blitt oppnådd et høyere antall 5LO pr nanodisc. Videre kan et annet protein endre membranbinding og orientering av 5LO, såsom en aktivator, transmembranprotein 5-lipoksygenase aktiverende protein, FLAP. FLAP har blitt rekonstruert i nanodiscs, og vi bruker TEM og andre metoder for å studere samspillet mellom 5LO og klaff. Deres interaksjon resulterer i endogen arakidonsyre blir omdannet til leukotrien A4, som er det første trinnet i syntesen av potente kjemoattraktanter involvert i en rekke inflammatoriske sykdommer 41, 42 sup>, 62.

Den 5LO-nanodisc komplekset er beregnet til å ha en molekylvekt på 334 kDa, nær grensen på omkring 200 kDa for struktur- undersøkelse av cryoEM. Likevel, som atomstrukturen 5LO er tilgjengelig 61, sin docking i en medium-oppløsning, 3-dimensjonale elektrontettheten kartet vil gi informasjon om samspillet med nanodisc membran.

Innovasjoner i cryoEM teknologi er ikke bare presser oppløsningen til atomnivå 63, men også skyve størrelsesgrensen til mindre proteiner. For strukturelle bestemmelse av NMR 22, er situasjonen den motsatte, da målet er å øke det størrelsesområde som nærmer seg nå 200 kDa. Nylig, ble membranen binding av små GTPase proteiner undersøkt ved hjelp av NMR 16, 17. Disse proteinene, med bare rundt 20 kDa, vire bundet til små nanodiscs av ​​en 7,6-nm indre diameter, danner komplekser av ca 130 kDa. I fremtiden, kan like store komplekser granskes med både NMR og cryoEM å belyse ulike aspekter av proteinmembranbinding.

En forlengelse av protokollen kan være å undersøke nanodiscs inneholdende et transmembranprotein (TMP) i nanodisc bilaget. NAPT-indusert stabling av TMP-nanodiscs kan sammenlignes med tomme nanodiscs inneholdende det samme lipid sammensetning. Store extramembranous loops ville hindre stabling, mens korte løkker ikke kan hindre stabling 64. Dette kan gjøres om til en fordel, som protokollen kan bli brukt til å undersøke proteiner som spesifikt binder til det transmembranprotein.

Fordelen med denne metoden er at membranen interaksjon kan bli visualisert umiddelbart. Den relative enkelhet for fremstilling av store mengder av tomme nanodiscs innebærer at man kan forlengedenne metoden for å screene for forskjellige forhold som pH, temperatur, buffere, og kofaktor avhengighet av monotopic proteinbinding. Faktisk, mens nanodisc plattformen 9 ble utviklet for stabilisering av transmembranproteiner og er i økende grad anvendt for dette formål, er det potensial for studier av et stort antall mer eller mindre kortvarig bindende ytre proteiner tilstede inne i cellene bør åpenbart holdes i tankene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Forfatterne takker Vetenskapsrådet, Stockholm fylkeskommune, og KI midler for deres støtte. Uttrykket og rensing av MSP ble utført ved Karolinska Institutet / SciLifeLab Protein Science Kjerne Facility (http://PSF.ki.se). Forfatterne ønsker også å takke Dr. Pasi Purhonen og Dr. Mathilda Sjöberg for å dele sin tekniske ekspertise og for deres rettidig hjelp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transmission electron microscope: JEOL2100F JEOL
CCD camera Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany
Glow discharger Baltec
TEM grid: 400 mesh TAAB GM016/C
Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5 Agilent Technologies 5190-2526
Superdex 200 HR 10/300 GE Healthcare Life Sciences 17-5172-01
Plasmid: MSP1E3D1 Addgene 20066
Bacteria: BL21DE3 NEB C2527H
Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2 Protein Science Facility, KI, Solna
Purification Matrix: ATP agarose Sigma Aldrich A2767
Purification Matrix: HisTrap HP-5 mL GE Healthcare Life Sciences 17-5247-01
Lipid: POPC Avanti polar lipids 850457C 25 mg/mL in chloroform
Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin Bio-Rad 1523920
13 mm syringe filter: 0.2 μm Pall life sciences PN 4554T
Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate Sigma Aldrich 31648
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Bio-Rad 161-0301
Protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001
TCEP Sigma Aldrich 646547
Detergent: Sodium cholate hydrate Sigma Aldrich C6445-10G
Sodium Cholate 500 mM Sodium cholate. Resuspend in miliQ water and store at -20 °C.
Lipid Stock 50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl. Store at 4 °C for a week; or
Store -80 °C for a month, after purging the solution with nitrogen.
MSP standard buffer 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA.
Store at 4 °C.
Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer Thermo Fisher Scientific BN2001 50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8
Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer Thermo Fisher Scientific BN2002 50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8, 0.002% Coomassie G-250
Non-Denaturaing Electrophoresis 4x Sample loading Buffer Thermo Fisher Scientific BN2003 50 mM Bis-Tris, pH 7.2, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S
Denaturaing Electrophoresis Running Buffer In-house recipe: 25 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1% (w/v) SDS
Denaturaing Electrophoresis 5x Sample loading Buffer In-house recipe: 0.05% (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl, pH 6.8, 20% (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS, 10 mM 2-mercaptoethanol
Terrific broth Tryptone - 12.0 g, Yeast Extract - 24.0 g, 100 mL 0.17 M KH2PO4 and 0.72 M K2HPO4, Glycerol - 4 mL.
Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 mL and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kleinschmidt, J. H., Popot, J. L. Folding and stability of integral membrane proteins in amphipols. Arch Biochem Biophys. 564, 327-343 (2014).
  2. Frauenfeld, J., et al. A saposin-lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nat Methods. 13 (4), 345-351 (2016).
  3. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nat Struct Mol Biol. 23 (6), 481-486 (2016).
  4. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-Assembly of Discoidal Phospholipid Bilayer Nanoparticles with Membrane Scaffold Proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  5. Jonas, A., Steinmetz, A., Churgay, L. The number of amphipathic alpha-helical segments of apolipoproteins A-I, E, and A-IV determines the size and functional properties of their reconstituted lipoprotein particles. J Biol Chem. 268 (3), 1596-1602 (1993).
  6. Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers. Protein Eng Des Sel. 23 (11), 843-848 (2010).
  7. Hagn, F., Etzkorn, M., Raschle, T., Wagner, G. Optimized phospholipid bilayer nanodiscs facilitate high-resolution structure determination of membrane proteins. J Am Chem Soc. 135 (5), 1919-1925 (2013).
  8. Ritchie, T. K., et al. Methods in Enzymology. Duzgunes, N. ejat 464, Academic Press. 211-231 (2009).
  9. Schuler, M. A., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs as a new tool to examine lipid-protein interactions. Methods Mol Biol. 974, 415-433 (2013).
  10. Nasr, M. L., et al. Membrane phospholipid bilayer as a determinant of monoacylglycerol lipase kinetic profile and conformational repertoire. Protein Sci. 22 (6), 774-787 (2013).
  11. Yokogawa, M., et al. NMR analyses of the interaction between the FYVE domain of early endosome antigen 1 (EEA1) and phosphoinositide embedded in a lipid bilayer. J Biol Chem. 287 (42), 34936-34945 (2012).
  12. Wan, C., et al. Insights into the molecular recognition of the granuphilin C2A domain with PI(4,5)P2. Chem Phys Lipids. 186, 61-67 (2015).
  13. Zhang, P., et al. An Isoform-Specific Myristylation Switch Targets Type II PKA Holoenzymes to Membranes. Structure. 23 (9), 1563-1572 (2015).
  14. Grushin, K., Miller, J., Dalm, D., Stoilova-McPhie, S. Factor VIII organisation on nanodiscs with different lipid composition. Thromb Haemost. 113 (4), 741-749 (2015).
  15. Baylon, J. L., Lenov, I. L., Sligar, S. G., Tajkhorshid, E. Characterizing the membrane-bound state of cytochrome P450 3A4: structure, depth of insertion, and orientation. J Am Chem Soc. 135 (23), 8542-8551 (2013).
  16. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Oncogenic and RASopathy-associated K-RAS mutations relieve membrane-dependent occlusion of the effector-binding site. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), 6625-6630 (2015).
  17. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Membrane-dependent modulation of the mTOR activator Rheb: NMR observations of a GTPase tethered to a lipid-bilayer nanodisc. J Am Chem Soc. 135 (9), 3367-3370 (2013).
  18. Wang, L., Sigworth, F. J. Structure of the BK potassium channel in a lipid membrane from electron cryomicroscopy. Nature. 461 (7261), 292-295 (2009).
  19. Ackerson, C. J., Powell, R. D., Hainfeld, J. F. Site-specific biomolecule labeling with gold clusters. Methods Enzymol. 481, 195-230 (2010).
  20. Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (31), 11509-11514 (2006).
  21. Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. Membrane protein structure determination - the next generation. Biochim Biophys Acta. 1838 (1 Pt A), 78-87 (2014).
  22. Dias, D. M., Ciulli, A. NMR approaches in structure-based lead discovery: recent developments and new frontiers for targeting multi-protein complexes. Prog Biophys Mol Biol. 116 (2-3), 101-112 (2014).
  23. Viegas, A., Viennet, T., Etzkorn, M. The power, pitfalls and potential of the nanodisc system for NMR-based studies. Biol Chem. , (2016).
  24. Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A primer to single-particle cryo-electron microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
  25. Wu, S., Armache, J. P., Cheng, Y. Single-particle cryo-EM data acquisition by using direct electron detection camera. Microscopy (Oxf). 65 (1), 35-41 (2016).
  26. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  27. De Carlo, S., Adrian, M., Kalin, P., Mayer, J. M., Dubochet, J. Unexpected property of trehalose as observed by cryo-electron microscopy. J Microsc. 196 (1), 40-45 (1999).
  28. Nogales, E. The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nat Methods. 13 (1), 24-27 (2016).
  29. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).
  30. Forte, T. M., Nordhausen, R. W. Electron microscopy of negatively stained lipoproteins. Methods Enzymol. 128, 442-457 (1986).
  31. Zhao, F. Q., Craig, R. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. J Struct Biol. 141 (1), 43-52 (2003).
  32. Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. J Lipid Res. 52 (1), 175-184 (2011).
  33. Zhang, L., et al. An optimized negative-staining protocol of electron microscopy for apoE4 POPC lipoprotein. J Lipid Res. 51 (5), 1228-1236 (2010).
  34. Matz, C. E., Jonas, A. Micellar complexes of human apolipoprotein A-I with phosphatidylcholines and cholesterol prepared from cholate-lipid dispersions. J Biol Chem. 257 (8), 4535-4540 (1982).
  35. Kumar, R. B., et al. Structural and Functional Analysis of Calcium Ion Mediated Binding of 5-Lipoxygenase to Nanodiscs. PLoS One. 11 (3), e0152116 (2016).
  36. Waggoner, T. A., Last, J. A., Kotula, P. G., Sasaki, D. Y. Self-assembled columns of stacked lipid bilayers mediated by metal ion recognition. J Am Chem Soc. 123 (3), 496-497 (2001).
  37. Kovacs, E., et al. Analysis of the Role of the C-Terminal Tail in the Regulation of the Epidermal Growth Factor Receptor. Mol Cell Biol. 35 (17), 3083-3102 (2015).
  38. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy. J Vis Exp. (90), e51087 (2014).
  39. Zhang, L., Tong, H., Garewal, M., Ren, G. Optimized negative-staining electron microscopy for lipoprotein studies. Biochim Biophys Acta. 1830 (1), 2150-2159 (2013).
  40. Cong, Y., Ludtke, S. J. Single particle analysis at high resolution. Methods Enzymol. 482, 211-235 (2010).
  41. Radmark, O., Werz, O., Steinhilber, D., Samuelsson, B. 5-Lipoxygenase, a key enzyme for leukotriene biosynthesis in health and disease. Biochim Biophys Acta. 1851 (4), 331-339 (2015).
  42. Anwar, Y., Sabir, J. S., Qureshi, M. I., Saini, K. S. 5-lipoxygenase: a promising drug target against inflammatory diseases-biochemical and pharmacological regulation. Curr Drug Targets. 15 (4), 410-422 (2014).
  43. Radmark, O., Samuelsson, B. Regulation of the activity of 5-lipoxygenase, a key enzyme in leukotriene biosynthesis. Biochem Biophys Res Commun. 396 (1), 105-110 (2010).
  44. Noguchi, M., Miyano, M., Matsumoto, T., Noma, M. Human 5-lipoxygenase associates with phosphatidylcholine liposomes and modulates LTA4 synthetase activity. Biochim Biophys Acta. 1215 (3), 300-306 (1994).
  45. Pande, A. H., Qin, S., Tatulian, S. A. Membrane fluidity is a key modulator of membrane binding, insertion, and activity of 5-lipoxygenase. Biophys J. 88 (6), 4084-4094 (2005).
  46. Pande, A. H., et al. Modulation of human 5-lipoxygenase activity by membrane lipids. Biochemistry. 43 (46), 14653-14666 (2004).
  47. Wong, A., Hwang, S. M., Cook, M. N., Hogaboom, G. K., Crooke, S. T. Interactions of 5-lipoxygenase with membranes: studies on the association of soluble enzyme with membranes and alterations in enzyme activity. Biochemistry. 27 (18), 6763-6769 (1988).
  48. Rigaud, J. L., Levy, D., Mosser, G., Lambert, O. Detergent removal by non-polar polystyrene beads. European Biophysics Journal. 27 (4), 305-319 (1998).
  49. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  50. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. J Vis Exp. (90), e51087 (2014).
  51. Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size. J Am Chem Soc. 126 (11), 3477-3487 (2004).
  52. Hornschemeyer, P., Liss, V., Heermann, R., Jung, K., Hunke, S. Interaction Analysis of a Two-Component System Using Nanodiscs. PLoS One. 11 (2), 0149187 (2016).
  53. Degrip, W. J., Vanoostrum, J., Bovee-Geurts, P. H. Selective detergent-extraction from mixed detergent/lipid/protein micelles, using cyclodextrin inclusion compounds: a novel generic approach for the preparation of proteoliposomes. Biochem J. 330 (Pt 2), 667-674 (1998).
  54. Martin, D. D., Budamagunta, M. S., Ryan, R. O., Voss, J. C., Oda, M. N. Apolipoprotein A-I assumes a "looped belt" conformation on reconstituted high density lipoprotein. J Biol Chem. 281 (29), 20418-20426 (2006).
  55. Cerione, R. A., Ross, E. M. Reconstitution of receptors and G proteins in phospholipid vesicles. Methods Enzymol. 195, 329-342 (1991).
  56. Shaw, A. W., McLean, M. A., Sligar, S. G. Phospholipid phase transitions in homogeneous nanometer scale bilayer discs. FEBS Lett. 556 (1-3), 260-264 (2004).
  57. Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).
  58. Civjan, N. R., Bayburt, T. H., Schuler, M. A., Sligar, S. G. Direct solubilization of heterologously expressed membrane proteins by incorporation into nanoscale lipid bilayers. Biotechniques. 35 (3), 553-562 (2003).
  59. Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A step-by-step method for the reconstitution of an ABC transporter into nanodisc lipid particles. J Vis Exp. (66), e3910 (2012).
  60. Brooks, S. P., Storey, K. B. Bound and determined: a computer program for making buffers of defined ion concentrations. Anal Biochem. 201 (1), 119-126 (1992).
  61. Gilbert, N. C., et al. The structure of human 5-lipoxygenase. Science. 331 (6014), 217-219 (2011).
  62. Radmark, O. 5-lipoxygenase-derived leukotrienes: mediators also of atherosclerotic inflammation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (7), 1140-1142 (2003).
  63. Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature. 534 (7607), 347-351 (2016).
  64. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Self-assembly of single integral membrane proteins into soluble nanoscale phospholipid bilayers. Protein Sci. 12 (11), 2476-2481 (2003).

Tags

Biochemistry negativ farging proteinkompleks TEM lipoksygenaser visualisering ikke-denaturerende gelelektroforese
Metode for å visualisere og analysere Membran samspill proteiner av transmisjonselektronmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

B. Kumar, R., Zhu, L., Hebert, H.,… More

B. Kumar, R., Zhu, L., Hebert, H., Jegerschöld, C. Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (121), e55148, doi:10.3791/55148 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter