Introduction
Na pesquisa médica, muita atenção está focada em proteínas de membrana, quer intrínsecos ou extrínsecos, envolvidos em uma variedade de interações lipídicas. Trabalhando com proteínas interactuantes de lípidos inclui quer seleccionando um substituto para os lípidos, tais como detergentes, amphipols 1, ou 2 pequenas proteínas, ou encontrar um substituto membrana que mantém a proteína solúvel e activa. Substitutos de membrana lipóico incluem lipossomas e nanodiscs (ND) 3, 4.
Nanodiscs são plataformas de membrana de quase-nativos desenvolvidos por engenharia a parte de proteína, ApoA-1, da lipoproteína de alta densidade (HDL) no sangue que ocorrem naturalmente. ApoA-1 é um resíduo 243 ao longo da cadeia de curtas hélices a anfipáticas e tem uma conformação solúvel livre de lípidos. In vitro, quando na presença de lípidos, duas cópias da proteína de ApoA-1 espontaneamente rearranjar para rodear o hidrporção da cadeia acil ophobic de um lipídico remendo bicamada 5. versões modificadas de ApoA-1 são geralmente chamadas proteínas de membrana de andaime (MSP), e um número crescente estão comercialmente disponíveis como plasmídeos ou como proteínas purificadas. Repetições ou deleções das hélices em ApoA-1 resultam em proteínas de membrana de andaimes 7 6 mais longos ou mais curtos. Isto por sua vez faz com que seja possível formar discos de cerca de 6 nm 7 a 17 nm de diâmetro 8. Existem diferentes tipos de aplicações para o nanodiscs 3, 9. A aplicação mais vulgarmente utilizado é o de proporcionar um ambiente de membrana quase nativo para a estabilização de uma proteína de membrana integral 8, avaliação previamente 3, 9. Uma utilização menos explorado é proporcionar uma superfície de membrana para o estudo nanoescala demembrana periférica proteínas 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Seção 1 do protocolo abaixo visualiza o procedimento para fazer nanodiscs compostos de fosfolipídios e proteínas andaimes membrana.
A preparação da amostra é um gargalo na maioria dos métodos. amostras específicos do método pode adicionar informações particular, mas também fazer comparações de resultados difícil. Portanto, é mais simples quando as amostras são multimodais e pode ser utilizado directamente em vários métodos diferentes. Uma vantagem com a utilização de nanodiscs é o tamanho pequeno do nanodisc em comparação com lipossomas (por exemplo, as amostras podem ser utilizados directamente para ambos TEM e electroforese em gel não desnaturante, tal como no presente protocolo).
18. No entanto, nenhuma estrutura 3D de alta resolução de uma proteína de membrana monotópico incorporado em uma membrana de lipossoma ainda não foi publicada, tanto quanto sabemos. As nanopartículas de ouro ou anticorpos pode ser utilizada para visualizar as proteínas de ligação a lipossomas ou vesículas usar o sistema 19. Mesmo que estas sondas são muito específicos, eles podem interferir com as proteínas de ligação membrana velando o local de ligação da membrana ou mascarando áreas de interesse com as partes flexíveis. Ouro-marcado ou proteínas complexado com anticorpo poderia provavelmente ser analisados num gel, mas isto iria aumentar o custo do experimento.
Embora lipossomas são uma excelente plataforma, não se pode ter certeza de que o popmento tem uma razão particular de proteína por lipossoma, uma característica que pode ser explorado pela utilização de nanodiscs 20. Em um lipossoma, cofactores e substratos pode ser preso no interior solúvel. Substâncias que são membrana solúvel irá compartilhar o mesmo destino para os dois tipos de miméticos de membranas. No entanto, como a área de bicamada é menor em nanodiscs, uma quantidade menor de substância é necessária para saturar as membranas nanodisc.
a função da proteína compreensão através da determinação da estrutura atômica tem sido essencial para muitos campos de pesquisa. Os métodos para determinação de estruturas de proteínas incluem raios X 21; ressonância magnética nuclear (RMN) de 22, 23; e microscopia eletrônica de transmissão (TEM) 24 em temperaturas criogênicas, cryoEM. A resolução por cryoEM ultimamente tem sido muito melhorada, principalmente devido ao uso de elétrons de diretaTectors 25, 26. As macromoléculas são gravadas em fina, gelo vítreo 27 em um estado quase nativo. No entanto, devido ao baixo contraste de moléculas biológicas, tornam-se difíceis de detectar na gama de tamanhos de 100-200 kDa. Para as amostras de tamanho adequado, recolha de dados pode ser feita, e o método de reconstrução única partícula pode ser aplicado para se obter uma estrutura 28.
No entanto, a determinação da estrutura da proteína por MET é um processo de múltiplos passos. Geralmente começa com a avaliação de monodispersity amostra por-coloração negativa TEM 29 usando sais de metais pesados como phosphotungsten (PT) 30 ou urânio 31. Reconstrução de um modelo de baixa resolução da macromolécula negativamente corada é geralmente feito e pode fornecer informações importantes sobre a estrutura molecular 29. Em paralelo,recolha de dados usando cryoEM pode começar. Cuidados devem ser tomados quando se avaliam dados TEM-mancha negativa para evitar a má interpretação da formação de artefato. Um artefacto particular é o efeito da mancha PT em fosfolípidos e lipos somas de 32, resultando na formação de longas hastes que se assemelham a pilhas de moedas visto de lado 33. Tal "rouleau" ou "pilhas" (doravante denominada como "pilhas") foram observados no início de HDL 34, e mais tarde também para nanodiscs 35.
O empilhamento e reformulação das membranas pode ocorrer por várias razões. Por exemplo, pode ser induzida por co-factores, como o cobre, mostrado por imagem TEM de uma mancha de molibdato de amónio 36. Uma fracção dos lípidos de membrana em liposomas continha um grupo de cabeça de ácido iminodiacético imitando complexação de metais por EDTA, empilhamento, portanto, os lipossomas após a adição de iões de cobre
Aqui, propõe-se um método para aproveitar a nanodisc induzida napt empilhamento para o estudo de proteínas de ligação de membrana por TEM. Em suma, obrigatória para as nanodiscs proteína impediria os nanodiscs de empilhamento. Embora as razões para o empilhamento não são claros, foi proposto que 39 existe uma interacção electrostática entre os fosfolípidos e o grupo fosforilo da PT, fazendo com que os discos adiram uns aos outros (Figura 1A). A hipótese atrás nosso protocolo é que quando uma proteína se liga a um nanodisc, a maior parte da superfície de fosfolípido não é disponí ble para a interacção com o PT devido a impedimento estérico da proteína. Isto iria evitar a formação da pilha (Figura 1B). Duas conclusões podem ser tiradas. Em primeiro lugar, a prevenção de empilhamento significa que a proteína de interesse está ligado à membrana. Em segundo lugar, o complexo proteína-ND pode ser tratado com os métodos de processamento de uma única partícula padrão 24, 40 para obter uma morfologia grosseira do complexo. Além disso, as análises por métodos tais como a electroforese em gel não desnaturante ou dispersão dinâmica da luz pode ser realizado.
Para demonstrar esta hipótese, utilizou-se a proteína de ligação à membrana de 5-lipoxigenase (5LO), que está envolvida em muitas doenças inflamatórias, 41 42. Esta proteína de 78 kDa requer iões de cálcio para se ligar à sua membrana 43. Embora esta associação membrana tem sido estudada extensivamente utilizando lipossomass = "refex"> 44, 45, 46 e 47 fracções de membrana, estes não podem ser utilizados para a análise TEM e determinação da estrutura.
A preparação de nanodiscs começa por mistura com lípidos MSP ressuspensas no detergente colato de sódio. Após incubação em gelo durante 1 h, o detergente é lentamente removido da mistura reconstituição utilizando uma resina adsorvente. Este tipo de material é frequentemente feito de poliestireno moldado em pequenos grânulos. Eles são relativamente hidrofóbico e têm uma forte preferência para o detergente de ligação em comparação com lipídeos 48. Depois de remover as pérolas hidrofóbicas e realizando clarificação com centrifugação, os nanodiscs são purificados por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). Os nanodiscs purificadas são misturados com uma proteína de membrana monotópico (e possíveis cofactores) em uma proporção equimolar (ou várias proporções para uma titulação) e são deixados a react (15 min). A análise por TEM é levada a cabo aplicando-ul quantidades de amostra em, grelhas revestidas de carbono têm um brilho descarregada e, em seguida, através da realização de coloração negativa com napt. A mesma amostra de quando as alíquotas foram aplicadas às grades de MET pode ser utilizado para análise por não desnaturante ou SDS-PAGE electroforese em gel, bem como por vários tipos de medições da actividade, sem grandes alterações.
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Protocol
1. Preparação de Nanodiscs
- Expressão e purificação da proteína de membrana de andaimes 8, 35
- Expressar a MSP1E3D1 marcada com His no coli BL21 E. (DE3) estirpe T1R pRARE2 em frascos. Prepara-se uma cultura de arranque durante a noite de 50 ml com meio LB suplementado com 50 ug / ml de canamicina a 37 ° C. Dilui-se a cultura de arranque durante a noite em 2 L de meio de caldo óptimo suplementado com 50 ug / ml de canamicina.
- Crescer as células a 37 ° C até a densidade óptica a 600 nm (DO 600) atingir aproximadamente 3. induzem a expressão de proteínas com 0,5 mM de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) durante 3 h a 18 ° C.
- Preparar o tampão de lise (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; NaCl 100 mM; e 10% de glicerol). Adicionar TCEP 1 mM imediatamente antes da utilização.
- Após 3 h de indução a 18 ° C, a colheita das células por centrifugação durante 10 min a 4500 xge 4 ° C. Descartar o sobrenadante, pesar as células colhidas e re-suspender-los em tampão de lise a uma razão de 2 ml de tampão de lise por g de células.
- Lisar as células por ultra-sons pulsada (taxa de repetição: 4 está ligado, 4 s OFF) durante 3 min a 80% de amplitude.
- Centrifugar os lisados durante 20 minutos a 49000 xg e 4 ° C. Desprezar o pelete desta centrifugação.
- Injectar o sobrenadante para a 5 ml de Ni + coluna quelante ligado a um sistema de cromatografia líquida automatizado de preferência mantida a 4 ° C.
- Antes do passo de eluição (passo 1.1.9), lava-se a coluna com tampões 1 - 3 abaixo para remover todas as proteínas, excepto a marcada com His MSP. Controlar o teor de proteína a 280 nm a seguir o processo de purificação; a gravação de UV a 280 nm deve voltar à linha de base após cada lavagem.
- Lava-se com um tampão de lavagem: 40 mM Tris-HCl, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM, e 1% de Triton, pH 8,0.
- Lava-se com tampão de lavagem 2: 40 mM de Tris-HCl, 300 mMDe NaCl, imidazole 20 mM, e colato de sódio 50 mM, pH 8,0.
- Lava-se com tampão de lavagem 3: 40 mM de Tris-HCl, NaCl 300 mM e imidazole 50 mM, pH 8,0.
- Elui-se o MSP com Tris-HCl 40 mM, NaCl 300 mM e imidazole 500 mM, pH 8,0.
- Mudar o tampão para MSP tampão convencional (20 mM de Tris-HCl, pH 7,5; NaCl 100 mM; e EDTA 0,5 mM) por filtração em gel 8, 35; o rendimento por lote deve ser em torno de 7 mg L -1.
- Preparação da solução de fosfolipídios
- Adicionar 305 uL de 1-palmitoil-2-oleoyl--sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) dissolvido em clorofórmio a uma concentração de 25 mg / mL para um copo de vidro e evapora-se o clorofórmio, purgando-o com uma corrente suave de azoto . Seca-se a noite lipídico em um excicador de vácuo. NOTA: Este passo é realizado para remover o solvente a partir do lípido, o que deixa uma fina película de lípido na parte inferior do copo de vidro.
- Ressuspender o bolo de lípido em 200 uL de tampão de padrão MSP contendo colato de sódio 100 mM em vortex do tubo até que a solução se torna transparente; isto irá proporcionar uma solução com uma concentração de 50 mM de POPC.
NOTA: De um modo geral, a razão molar de lípido para detergente neste ponto deverá ser de 1: 2 (lípido: detergente) 8. Esta mistura de lípido-detergente pode ser armazenado a -80 ° C durante cerca de 2 meses.
- Preparação dos grânulos hidrófobos para a remoção do detergente
- Colocar 5 g de pérolas (-peso seco) num tubo de 50 mL.
- Lavam-se as esferas com 30 ml de metanol a 100% e depois com 40 ml de água ultrapura.
- Lavam-se as esferas com 10 ml de tampão padrão MSP. Finalmente, armazenar as pérolas com 15 mL de solução tampão padrão de MSP a 4 ° C.
- Nanodisc reconstituição
- Dispensar 190 ul de MSP1E3D1 (0,124 mM) num tubo de microcentrífuga e adicionar 61,5 mL de solução de estoque de fosfolípido (50 mM de POPC) para o mesmo tubo. Incubar a mistura reconstituição em gelo húmido durante 1 h. NOTA: Este é igual a uma proporção molar de 1: 130 (MSP1E3D1: POPC).
- Adicionar pérolas hidrofóbicas a uma concentração de 0,5 g de pérolas por ml de mistura de reconstituição para iniciar o processo de auto-montagem. Incubar numa incubadora rotativa durante 16 horas a 4 ° C.
- Depois da incubação, centrifuga-se durante 10 min a 13000 xg e 4 ° C para remover os precipitados e agregados. Descartar o pellet e guardar o sobrenadante.
- Equilibrar a coluna de cromatografia de exclusão de tamanho (montado em um sistema de cromatografia líquida automatizado) com tampão padrão MSP até a absorvância a 280 nm é estável. Injecta-se o sobrenadante na coluna e recolher as fracções de pico.
- Medem-se as concentrações de nanodiscs nas fracções de pico a 280 nm. Utilizar o coeficiente de extinção molar de MSP1E3D1 (£ = 29,910 centímetros -1 M-1) para o cálculo da concentração nanodisc. Note onúmero de lípidos por nanodisc pode ser medido por uma combinação de lípidos radiomarcados e análise de fosfato de 4 ou por análise de fosfato sozinha.
2. Preparação da Proteína monotópico 5-lipoxigenase 35
- Prepara-se uma cultura de arranque durante a noite. Suplemento 50 ml de meio LB com 100 ug / ml de ampicilina. Inocular o meio com E. coli BL21 (DE3) contendo o plasmídeo do gene da 5-lipoxigenase (ALOX5). Dilui-se a cultura de arranque durante a noite em meio de expressão contendo 42 mM de Na 2 HPO 4, mM de KH 2 PO 4, NaCl 9 mM, 19 mM de NH4CI, MgSO4 1 mM, CaCl 0,1 2, 0,2% de D-glucose 24, 0,1 %, 5 uM de FeSO4, e 100 ug / ml de ampicilina. Crescer as células até que a OD 600 é ~ 0,5 a 25 ° C. Induzem a expressão de proteínas com IPTG 0,2 mM durante 16 h a 20 ° C 35.
- Colheita por centrifugação durante 10 min a 7000 xg e 4 ° C e desprezar o sobrenadante. Pesa-se o sedimento encontra no fundo do tubo contendo as células colhidas e ressuspender as células colhidas em tampão de lise (Tris-HCl a 100, pH 8,0; NaCl 100 mM; glicerol a 10%; e TCEP 1 mM) contendo inibidores de protease e 0,5 mg / mL de lisozima de 35 a uma razão de 2 ml de tampão de lise por g de células.
- Lisar as células por sonicação durante 5 x 15 segundos a 80% de amplitude. Remover os detritos celulares por centrifugação durante 10 min a 7000 xg e 4 ° C. Realizar de amónio sulfato de precipitação de 30 - 60% de saturação para precipitar as proteínas na solução 35. Centrifugar durante 15 minutos a 16000 xg e 4 ° C. NOTA: O sedimento 5LO pode ser rapidamente congeladas e armazenadas a -80 ° C durante até 6 meses.
- Ressuspender o sedimento com 20 ml de tampão de lise e centrifugação durante 15 min a 40000 xg e 4 ° C.
- Incubar o sobrenadante sobre uma coluna de agarose com ATP a 4 ° C durante 30 min. Lava-se a coluna uma vez com um volume de coluna de tampão de lise contendo NaCl 0,5 M. Eluir a 5LO com ATP 20 mM em tampão de lise contendo 10 mM de FeSO4 e 20 ug / ml de catalase. Realizar cromatografia de filtração em gel para remover o ATP de 35.
NOTA: O 5LO é instável e deve ser utilizado imediatamente após a purificação. Caso contrário, recomenda-se a suspender no passo de precipitação com sulfato de amónio (ver a nota depois do passo 2.1.3).
3. Preparação do Complexo de proteína-Nanodisc
- Preparar um volume total de 100 ul de complexo. Misture 0,8 uM e 0,8 uM ND 5LO com Ca 2+ 1 mM presentes no tampão padrão MSP (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; NaCl 100 mM; EDTA 0,5 mM; e 1,5 mM de CaCl2) e incubar durante 10 min no gelo. NOTA: A amostra pode ser armazenada durante até um mês a 4 ° C 35.
- A electroforese em gel
- Não eletroforese desnaturante
- Misturar 15 mL da amostra com 5 uL de tampão de carga (BisTris 50 mM, HCl 6, 50 mM de NaCl, 10% (w / v) de glicerol, e 0,001% de Ponceau S, pH 7,2) 49 e carregá-lo sobre um 4 - 16% de gel de Bis-Tris de realizar electroforese.
- Encher o reservatório de cátodo com tampão de luz cátodo (Bis Tris 50 mM; Tricina 50 mM, pH 6,8, e 0,002% de Coomassie G-250) e o reservatório de ânodo com tampão (50 mM de Bis Tris e Tricina 50 mM, pH 6,8) em execução. Comece a separação usando uma voltagem constante de 150 V.
- Pare a separação electroforética quando a frente de Coomassie atinge a extremidade do gel.
- Corar o gel com azul de Coomassie de um protocolo padrão.
- eletroforese desnaturante
- Misturar 40 ul de amostra com 10 ul de tampão de carga contendo SDS (0,05% (w / v) de azul de bromofenol; M de Tris-HCl 0,2,pH 6,8; 20% (v / v) de glicerol; 10% (w / v) de SDS; e 10 mM de 2-mercaptoetanol) e carregá-lo sobre um 4 - glicina gel de Tris a 20% para realizar a electroforese.
- Encher os tanques de cátodo e ânodo com tampão de corrida (25 mM Tris-HCl, pH 6,8; 200 mM de glicina, e 0,1% (w / v) de SDS). Comece a separação usando uma voltagem constante de 150 V.
- Pare a separação electroforética quando a frente de corante de carga atinge a extremidade do gel.
- Corar o gel com azul de Coomassie de um protocolo padrão.
- Não eletroforese desnaturante
- Preparação da solução napt
- Dissolve-se 1 g de sal de fosfotungstato de sódio em 50 ml de água por agitação à temperatura ambiente para dar origem a 2% (w / v) de solução ácida.
- Ajustar o pH para 7,4 com NaOH 1 M. Remover as partículas utilizando um filtro de seringa de 0,22? M. Guardar a solução à temperatura ambiente ou a 4 ° C.
- Preparação da amostra para análise TEM
- Glow-descarga grades de cobre revestido de carbono (400 mesh) por 20 s a 30 mA para processar as grelhas hidrofílicos antes da adsorção da amostra. Colocar 3,5 mL da amostra (0,8 uM no que diz respeito aos nanodiscs) da grelha e incubar durante 30 s. NOTA: O volume aplicada pode variar entre 2,5 e 5 ul, dependendo da concentração da amostra. Um intervalo de concentração é adequado para nanodiscs 0,5 - 1 jiM.
- Blot off solução excedente usando papel de filtro.
- Imediatamente manchar a grelha com uma gota de 2% napt durante 30 s. Seque o excesso de solução e deixar a grade para secar ao ar.
- Avaliar as grades por TEM. Um microscópio com 120-200 keV tensão de aceleração suficiente para estimar o grau de empilhamento. NOTA: Para o presente protocolo, foi utilizado um microscópio eletrônico de transmissão calibrado, equipado com um canhão de emissão de campo de 200 keV.
- Grave as imagens de TEM. Para as imagens que mostram pilhas de comprimento, não processam mais longe; imagens mostram o complexo de nanodiscs, com proteína extrínseca que pode conter algunsshort stacks, mas a maioria das partículas são no complexo. Registe várias imagens e processo desses acordo com métodos convencionais para a obtenção de classe-média e de baixa resolução, 3 modelo dimensional do complexo.
NOTA: Para a coleta de dados de mancha negativa, as redes foram feitas em pelo menos três dias diferentes. Para cada dia, as incubações amostra fresca (como na etapa 3.1) foram feitas antes da coloração negativa foi aplicado.
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Representative Results
O método é proposto depende da preparação de nanodiscs para proporcionar a superfície da membrana para a ligação monotópico membrana-proteína. Como não há nenhuma proteína transmembranar incorporado na bicamada lipídica nanodisc, os nanodiscs são aqui indicadas como "nanodiscs vazias" (Figura 2A). Estes têm um peso molecular calculado de 256 kDa para uma composição de duas proteínas MSP1E3D1 andaimes e cerca de 260 moléculas de POPC 8. Usando esta relação proteína: lípido para reconstituição, um pico principal (Figura 2A) foi eluído durante a filtração em gel. As fracções de pico de cerca de 9 ml (Figura 2A) foram examinados por electroforese em gel nativo azul 49, que mostra uma banda (figura 2B, pista 1). Embora a banda corresponde a um tamanho ligeiramente maior do que o valor calculado de 256 kDa, o diâmetro medido em nanodisc as imagens de TEM corresponde aoesperado 13 nm ± 0,5 nm.
A proteína de membrana monotópico 5-lipoxigenase (5LO) foi purificada como descrito acima (passo Protocolo 2) e em mais pormenor no início 35. A homogeneidade da 78-kDa 5LO foi analisada por electroforese SDS PAGE (Figura 2C, faixa 1) e era totalmente funcional 35 (não mostrado).
Neste protocolo, as condições são criadas intencionalmente que promovam o empilhamento dos nanodiscs. No entanto, deve notar-se que este empilhamento é induzido apenas nas amostras feitas para imagiologia MET (chamados espécimes), especificamente através da adição do fosfotungstato mancha de sódio negativo como o último passo depois de todos os outros tratamentos e adições foram feitas. Na verdade, as imagens de nanodiscs NAPT coradas mostram o empilhamento esperado (Figura 3A) muito cedo para HDL 34 5, 50. Os "longas pilhas de moedas visto de lado" (Figura 3A) são os nanodiscs agregados com fosfotungstato intercalada entre as bicamadas, como descrito esquematicamente na Figura 1A e proposto por Zhang et ai. 32, 39.
É importante verificar se várias adições nos buffers afectar, prevenir, ou mesmo induzir empilhamento, e tal como se tornará evidente abaixo, os efeitos dos iões de cálcio necessária investigação. Na Figura 3B, o empilhamento ainda está presente numa amostra em que os iões de cálcio foram adicionadas à solução antes da coloração com nanodisc napt.
O passo essencial no protocolo é demonstrado na Figura 4, em que a membrana de escaninhoDing proteína está presente nas soluções. O empilhamento não pôde ser induzida pela mancha napt quando 5LO foi ligado à superfície da membrana das nanodiscs (Figura 4A). Para esta amostra, a razão molar de 5LO para nanodiscs foi de 1: 1, como mostrado esquematicamente na Figura 1 (Figura 1B, inferior direito). Além disso, como a bicamada lipídica dos nanodiscs é acessível a partir de ambos os lados, em contraste com os lipossomas, as amostras com a relação de dois para um 5LO nanodisc foram preparados, enquanto as imagens TEM mostram ainda menos de empilhamento (Figura 4B).
Para a ligação, algumas proteínas de membrana extrínsecos pode depender da presença de um lípido específico na membrana, tal como phosphoinositols 10, 11, 12 ou 10 fosfatidilserina. No caso de 5LO, a presença de Ca2 + é necesSary 43. Na Figura 4A e B, os iões cálcio estão presentes nas soluções com nanodiscs e 5LO. Em outras palavras, a ausência de empilhamento não só mostra que a proteína se ligou monotópico mas também que a ligação depende de iões Ca2 +. De modo a mostrar isto, uma solução contendo nanodiscs e 5LO mas sem cálcio foi corado com napt e fotografada através de TEM (Figura 4C). Como esperado, não 5LO pode ligar-se aos nanodiscs sem Ca 2+, deixando o 5LO livre na solução, de modo que os nanodiscs pilha em vez (Figura 4C).
Figura 1. Princípio do Nanodisc Stacking e Visão Geral do Método. A. Princípio do empilhamento nanodisc. A adição de fosfotungstato de sódio mancha negativa a uma solução de nanodiscs (esquerda) leva ao th e empilhamento das nanodiscs (direita), devido a forças eletrostáticas (meio, setas) entre a bicamada de fosfolipídios e as moléculas PT (meio, pontos pretos). B. Representação esquemática do protocolo. nanodiscs vazio (esquerda) se ligam a uma proteína de membrana extrínseca (cinzento) para formar um complexo, representadas a partir de quatro ângulos diferentes (média baixa). A presença da proteína monotópico estericamente impede os nanodiscs de empilhamento quando corado com o sal de fosfotungstato (inferior direito), em contraste com o empilhamento induzida na ausência de quaisquer grandes objectos (superior direito). Os anéis com efeito de estufa e de cor laranja representam os dois MSP de envolvimento em torno do núcleo de fosfolípido, que é representado em cor castanha clara. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 2. Análise de Homogeneidade de Nanodiscs e 5LO. A. cromatograf ia de exclusão de tamanho de nanodiscs vazios reconstituídos. A eluição dos picos nanodiscs a 9 ml. B. não desnaturante em gel de análise electroforética da fracção do pico da SEC mostrado em (A). Pista M contém o marcador. Uma única banda está presente na pista 1, em que a fracção do pico a 9 ml foi carregado. C. gel desnaturante de análise electroforética de 5LO purificado. A 78 kDa 5LO mostra como uma banda intensa na pista 1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Formação Pilha de Nanodiscs na ausência de proteína Analisado por TEM. A. Nanodisc empilhamento foi induzida When coradas com NAPT. As pilhas de moedas "" são as pilhas de nanodiscs quando visto de lado. Cada nanodisc aparece como uma faixa branca. B. Stacking não foi perturbado pela presença de iões de cálcio na solução nanodisc quando corados com NAPT. As barras de escala são 100 nm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. prevenção da formação da pilha pela ligação da proteína na presença de um cofactor Analisado por TEM. A. e B. Os iões de cálcio se presentes em misturas de 5LO nanodiscs e em proporções molares de 1: 1 (A) ou 2: 1 (B). O mais 5LO ligação aos nanodiscs, menos nanodiscs estão disponíveis para o empilhamento, como mostrado em (B). Os complexos de partícula única em both (A) e (B) são adequados para processamento adicional 35. C. Na ausência de iões de cálcio, 5LO não se pode ligar. NAPT coloração deste exemplo mostra empilhamento típico de nanodiscs, deixando o 5LO não ligado. As barras de escala são 100 nm. As imagens foram obtidas por uma câmera 4K x 4K CCD com uma ampliação de 69,500x. O tamanho do pixel da câmara CCD é de 15 mm, o que dá um valor correspondente de 2,16 Å no nível de amostra para as imagens de EM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O método pode ser dividido em três partes: a reconstituição de nanodiscs vazio, a preparação de complexos de proteína-nanodisc, e a coloração negativa para a ETM destes complexos. Cada parte será tratado separadamente sobre limitações da técnica, passos críticos, e as modificações úteis.
Reconstituição de nanodiscs vazios. passos e limitações críticas na produção e utilização de nanodiscs.
Para a preparação dos nanodiscs vazias, que é essencial para optimizar a relação de MSP-para-lípido. Para o MSP mais comum e lípidos (utilizando colato como um detergente), sugestões para as razões óptimas podem ser encontrados na literatura (por exemplo, 125-130 POPC por MSP1E3D1 8, 51 utilizado no presente protocolo). Diferenças obtidas em comparação com as proporções publicados pode depender do método para determinação da concentração de proteína, a eficiência de Lsolvatação IPID no detergente, e o método de remoção de detergente a partir da solução.
Propomo-nos a realizar a remoção de detergente usando esferas hidrofóbicas 48 (passo 1.3), enquanto as alternativas possíveis são a diálise ou a adição de ciclodextrina 52, 53. Inicialmente, a diálise foi usada para a reconstituição da HDL 5, 34 e 54 ainda é preferida. Independentemente do método para a remoção de detergente, a velocidade é essencial. Se a remoção é muito rápido (o volume de grânulos hidrófobos é muito grande), o rearranjo espontâneo de MSP com os lipidos pode não ter tempo para ocorrer. Em vez disso, grandes quantidades de lipossomas e agregados de proteína podem formar. Os resultados de cromatografia de exclusão de tamanho iria mostrar grandes quantidades de lipossomas no volume de vazio, um pico sub-óptima de nanodiscs reconstituídas, e um pico maior de não utilizadaMSP 4, 6, 51. Por muito pequenas um volume de pérolas hidrofóbicas, a remoção de detergente pode ser incompleta, e os nanodiscs que formam podem ter uma variação em tamanhos, onde a maioria são menores do que o esperado. Pode-se testar duas adições de volumes mais pequenos de esferas hidrofóbicas em vez de uma grande adição de abrandar a velocidade de reconstituição.
A escolha de lipídios devem ser cuidadosamente considerados 8, 9, 45, 46, 55, dependendo da finalidade para a preparação nanodisc. Em geral, para todos os métodos que visam a formação de membranas (reconstituição de nanodiscs ou lipossomas, bem como para experiências de cristalização 2D), os lípidos devem estar num estado "fluido" 56. Abaixo de uma certa temperatura, The lipídico é rígida. Acima desta assim chamada temperatura de transição (Tm), o lípido é fluido. Note-se que alguns lípidos saturados comummente utilizados têm uma Tm bem acima da temperatura ambiente. Além disso, no caso de misturas de lípidos, a miscibilidade de lipídios musa ser considerado 57. A temperatura óptima para a formação é de cerca de Nanodisc a transição de fase (Tm) do lípido.
O detergente no presente protocolo é colato de sódio 8. Se outro detergente deve ser usado, nas mesmas concentrações que as utilizadas para a colato não pode ser utilizado directamente. Alguns detergentes suaves dissolver lípidos de forma menos eficiente, e pode ser necessária uma concentração mais elevada. O bolo de lípido obtido depois da evaporação do clorofórmio (passo 1.2.2 do protocolo) deve ser dissolvido em uma solução límpida por o detergente. Vórtex, ciclos de congelação-descongelação, banhos de ultra-som, ou sonicação pode ser utilizada para acelerar a solubilização.
para combinatíons de lipídios (-misturas), MSP, e outros do que aqueles usados aqui, titulações para minimizar grandes agregados e lipossomas ou MSP excesso de detergentes são necessários 4, 6, 51, 58. Para algumas combinações de MSP e fosfolipídios, a otimização pode ser mais difícil do que para os outros 4, 6, 51, e torna-se essencial para determinar o conteúdo das fracções do pico. O método mais preciso para a análise da composição e tamanho nanodisc é para determinar o número de fosfolípidos por MSP por análise de fosfato de 4 e calcular o peso molecular nanodisc. Nanodisc tamanho pode ser estimada pela bem resolvido electroforese em gel, não desnaturante; espalhamento dinâmico de luz (DLS) 59; ou a coloração negativa TEM, para citar apenas alguns métodos. Como para o NegaProtocolo de empilhamento induzida por tiva-mancha aqui apresentados, a medição da largura das pilhas presentes nas imagens de TEM produz o diâmetro dos nanodiscs.
Como para a expressão e purificação da proteína de membrana de andaimes, todas as precauções habituais e preocupações para uma proteína solúvel deve ser tomado. Os plasmídeos disponíveis podem conter marcas diferentes e locais de clivagem de protease no caso de a etiqueta tem de ser removida antes de utilizar o MSP.
5LO, a proteína monotópico utilizada no protocolo, inactiva-se rapidamente a menos que sejam tomadas precauções, descrito noutro local 35 e nas referências aí. Em suma, o ferro catalítico é facilmente perdido, e as condições oxidantes podem causar dimerização do 5LO. Como indicado na nota (passo protocolo 2.1.3), a purificação pode ser parado após a etapa de precipitação e alíquotas armazenadas até à sua utilização posterior. Após a purificação de uma aliquota, a proteína deve ser utilizada no prazo de algumas horas d ue à rápida inativação 35.
passos críticos na preparação dos complexos de proteína-nanodisc.
O tamanho da proteína monotópico contra a área de nanodisc é de importância. O comprimento da cadeia de proteína MSP1E3D1 corresponde a um nanodisc com um diâmetro interno de 10,5 nm e cerca de uma área de bicamada 8900-A 2 8. Isto corresponde bem com a área relatado para a parte incorporada na membrana de 5LO 45. Assim, a razão de ligação esperado era de 1: 1, ou, no máximo 2: 1 5LO por nanodisc. Isto provou ser correta, conforme relatado em um experimento de titulação de 35. No entanto, não foi obtido a ligação de duas 5LO por nanodisc máxima, tal como discutido noutro local 35. Um nanodisc um pouco maior poderia permitir a um total de 2: 1 de ligação para as experiências onde tal é desejável, mas neste caso, a relação de 1: 1 é o objectivo principal.
ove_content "> A escolha de lipídios óptimas para a formação do complexo de proteína-nanodisc pode ser auxiliada pelo conhecimento anterior. Este foi o caso no presente protocolo, onde a escolha de lipídios foi POPC sintética 35. Ambas as alterações no grupo de cabeça lipídica 46 e variações na saturação das cadeias de acilo 45 foram testados em estudos de ligação de liposomas-5LO. actividade 5LO foi aumentada através da ligação em lipossomas contendo fosfolípidos de colina insaturados na posição sn-2 posição cadeia acilo 45, 46. Se os requisitos de lípidos específicos não são conhecidos, mas a identidade da membrana original for conhecida, os extractos de lípidos naturais pode ser testado pela primeira vez 55.A dependência do cofactor foi conhecido por 5LO, que depende de iões de Ca 2+ para a ligação à membrana 43. É um desafio para remover completamente o cálcio de soluções. Aqui, o agente complexante EDTA está presente nos buffers em quantidades ajustadas para deixar uma quantidade controlada de iões Ca2 + livre. Cálculos de moléculas livres e ligadas nos buffers foram feitas pelo 60 software BAD para buffers que contenham mais de um tipo de agente de complexação 35. O efeito sobre a concentração de um co-fator parcialmente solúvel na membrana não é contabilizada por este software.
As etapas críticas na coloração negativa de nanodiscs para promover a formação de pilha.
Para o protocolo de mão, onde é desejado empilhamento máxima, a mancha deve ser o sal de sódio de phosphotungsten. Diferentes sais de tungsténio estão disponíveis, e observou-se que o ácido fosfotúngstico foi menos eficiente no empilhamento (não mostrado). Por razões pouco claras, parece que altas quantidades de sódio durante a coloração PT promove empilhamento. Além disso, para o tampão de amostra, mostrou-se que quanto menor o sódio content, quanto menor for a quantidade de empilhamento 32 induzida. Pela mesma razão, depois da amostra ter sido aplicada à grade EM, lavagem com água antes da coloração não deve ser efectuada, tal como isto também reduz o empilhamento. Por outro lado, alguns empilhamento sempre foi induzida, embora não na medida necessária para o melhor desempenho do protocolo.
Claro, co-fatores como as Ca 2+ aqui deve ser verificado se há interferência com a mancha negativa ou com as nanodiscs. Para o presente protocolo, os íons de cálcio teria precipitado um tampão fosfato, por isso foi utilizado um tampão Tris. Os nanodiscs não estavam empilhados por Ca 2+ per se, tal como verificado usando outra coloração negativa, uranyl formato de 35, nem de cálcio evitar empilhamento induzida NAPT (Figura 3B).
Para uma pequena proteína monotópico, o tamanho extra adicionado por ligação a um nanodisc pode tornar detectável em cryoEM. UMAnanodisc muito grande em comparação com a proteína pode não ser o ideal, como uma pequena proteína em larga nanodisc pode não impedir o empilhamento. No entanto, a forma da proteína extrínseca poderia ter uma influência. Embora nenhuma relação rigorosa pode ser fornecida a partir de agora, uma superfície bicamada nanodisc apenas ligeiramente maior do que a superfície de ligação estimativa da proteína é recomendado. Com esta restrição, a ligação máxima de proteína seria uma proteína em cada lado do nanodisc.
limitações gerais e vantagens do método.
O protocolo depende da disponibilidade de um MET e o equipamento relacionado, que não estão disponíveis em todos os laboratórios. No entanto, um microscópio de electrões de 120 a 200 kV, equipado com uma câmara CCD tradicional seria completamente suficiente para a detecção de empilhamento. A coloração negativa napt é realizada à temperatura ambiente, e as grades podem ser armazenados a esta temperatura para visualização posterior.
imag TEMing rapidamente mostrar se o empilhamento tenha sido impedida ou não. Para as imagens que mostram os complexos proteína-nanodisc (por exemplo, a Figura 4A e B), processamento adicional para se obter informação estrutural poderia ser realizada. Detalhes estruturais de uma amostra negativamente manchado pode chegar a 1 nm e pode fornecer informações estruturais útil 29. Nos laboratórios dedicados para estruturar a determinação por cryoEM, a coloração negativa de amostras é um procedimento padrão. O uso de nosso protocolo seria uma adição simples e rápida de procedimentos regulares.
Algumas proteínas monotópico estão ancoradas à membrana por miristoilação, palmitoilação, ou manchas hidrofóbicas na superfície da proteína, tornando-se necessário, para formar o complexo nanodisc-proteína com o mesmo procedimento utilizado para a incorporação de uma proteína transmembranar em nanodiscs 13. Aqui, uma das subunidades do complexo de proteínas contém amyristoylation em uma cauda de terminal N flexível para a ligação à membrana. Para as imagens de TEM manchado de acetato de uranilo, afirmou-se que o complexo de proteínas foi ligada perpendicularmente à membrana, e não do lado da nanodisc. Este e outros resultados confirmaram uma estrutura rígida para a fixação da membrana 13. Para esta ligação, NAPT coloração de acordo com a nossa proposta de protocolo iria mostrar as mesmas partículas individuais distribuídas regularmente. No entanto, se o anexo tinha sido através de uma cadeia flexível, a coloração acetato de uranilo pode não ter dado um resultado claro. Especula-se que, para os complexos de proteína ligada à membrana cadeia flexível, a coloração napt pode induzir as nanodiscs para empilhar, demonstrando o típico "pilha de moedas," mas agora decorado por a proteína ligada nos lados.
Por que usar nanodiscs se lipossomas pode ser usado? A optimização de lípidos, cofactores ou outros parâmetros poderia muito bem ser testado em lipossomas para a ligação de perproteínas ipheral (cf. 5LO). Empilhamento induzida napt de lipossomas tem sido demonstrada 32, de modo que uma proteína monotópico poderia impedir lipossoma empilhamento. No entanto, os tamanhos dos lipossomas, em comparação com monotópico proteínas e nanodiscs também entra em jogo. Uma grande proteína extrínseca pode ser capaz de impedir o empilhamento dos lipossomas, ao passo que uma pequena proteína, como o 78-kDa 5LO, pode não ser detectada em grandes números por lipossoma. Pequenos lipossomas podem ser preparados, mas quanto menor for a vesícula, mais forte é a curvatura da sua membrana. A bicamada nanodisc é plana. Testando vários parâmetros usando nanodiscs poderia ser menos rentável, devido ao MSP. Por outro lado, para os lipossomas, co-factores determinados substratos caros ou parcialmente partição em que a membrana e ainda, para o interior dos lipossomas, podem ser necessários em quantidades maiores. Em conclusão, a plataforma nanodisc fornece a possibilidade de escolha de uma área definida por uma ligação n precisa úmero de proteínas. A área de bicamada é acessível a partir de dois lados e é plana.
Importância do método.
A determinação da estrutura 3D de proteínas ou macromoléculas complexas visualiza o funcionamento interno de células. Neste ambiente cheia, proteínas específicas são activos nas superfícies de membrana, sozinhos ou em complexo com outras proteínas, mas geralmente de modo que a interacção física com componentes na bicamada lipídica é parte da sua função mecânica. Para algumas proteínas, a conformação em solução é alterada mediante a incorporação de membrana, ao passo que outros são amarrados à membrana mas, no entanto, alterar a conformação ou orientação na membrana devido a algum tipo de gatilho. Um caminho de entrada substrato hidrofóbico pode, em seguida, abrir, ou uma conformação que permite a ligação a uma proteína transmembranar pode ocorrer. Para obter a estrutura, ou pelo menos a informação estrutural, de tais proteínas periféricos ligados à membrana é difícil.
jove_content "> Nanodiscs foram utilizados em alguns estudos sobre a orientação e função em membranas 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. citocromo P450, central na desintoxicação, está ancorada à membrana por uma α-hélice e contém um grupo heme na sua parte globular, permitindo medições de dicroísmo lineares 15. os resultados indicaram uma orientação do heme com respeito à membrana, em estreita concordância com simulações realizadas, reforçando assim outras conclusões retiradas a partir de simulações do citocromo P450 incorporado na membrana. para uma GTPase ancorado à membrana numa pequena nanodisc, estudos de RMN poderia identificar duas áreas diferentes na proteína com uma interface de cada membrana e ainda, como Nucleo maré de ligação induzido um interruptor de uma interface para o outro 17. Mutações e ligação de efector, assim como a ligação ao GTP, foram estudados em outro GTPase nas Ras-superfamília de encontrar um número de efeitos sobre a actividade que dependiam da orientação sobre a membrana, o que iria afectar a sinalização oncogénica 16. 5LO tem uma conformação solúvel 61 e requer cálcio para a ligação em membranas nucleares 43. Utilizando lipossomas unilamelares gigantes, polarizada, atenuado, Total de reflexão de infravermelhos experimentos foram realizados 46. O resultado implicava que o N-terminal de β-barril se liga a membranas, com o eixo de simetria do β-tambor inclinado cerca de 45 graus a partir da membrana normal. O domínio C-terminal 5LO é um feixe quase cilíndrica α-helicoidal, e esta foi proposto para se ligar com o eixo longo paralelo à membrana 45,= "xref"> 46. No nosso trabalho anterior sobre 5LO incorporado em nanodiscs, a área da bicamada foi escolhido para permitir uma 5LO de cada lado com a orientação acima sugeriu-35. As imagens de TEM confirmou esta orientação, ainda que em baixa resolução 35. Se, por exemplo, apenas o N-terminal de β-tambor foi ligado, mas não o domínio C-terminal, teria sido obtido um maior número de 5LO por nanodisc. Além disso, uma outra proteína poderia alterar a ligação de membrana e a orientação de 5LO, tais como um activador, a proteína transmembranar 5-lipoxigenase proteína de activação, FLAP. FLAP foi reconstituído em nanodiscs, e usamos TEM e outros métodos para estudar a interação entre 5LO e FLAP. Os resultados de interacção em ácido araquidónico endógeno a ser convertido em leucotrieno A4, que é o primeiro passo na síntese de agentes quimioatractivos potentes envolvido em muitas doenças inflamatórias 41, 42 sup>, 62.O complexo de 5LO-nanodisc é calculado para ter um peso molecular de 334 kDa, perto do limite de cerca de 200 kDa para investigação estrutural por cryoEM. No entanto, como a estrutura atómica de 5LO está disponível 61, o seu acoplamento a um meio de resolução, mapa de densidade de electrões a 3 dimensões iria proporcionar informações sobre a interacção com a membrana nanodisc.
Inovações em tecnologia cryoEM não são apenas empurrando resolução ao nível atómico 63, mas também empurrando o limite de tamanho para as proteínas menores. Para a determinação estrutural por RMN 22, a situação é a oposta, como o objectivo é aumentar a gama de tamanhos, que agora se aproxima de 200 kDa. Recentemente, a ligação de proteínas de membrana de GTPase pequenas foram investigados por RMN 16, 17. Estas proteínas, de apenas cerca de 20 kDa, nósre amarrados a pequenas nanodiscs de um diâmetro interior de 7,6 nm, formando complexos de cerca de 130 kDa. No futuro, os complexos de tamanho similar poderia ser investigado pelos dois RMN e cryoEM para elucidar diferentes aspectos da proteína de ligação a membrana.
Uma extensão do protocolo poderia ser para investigar nanodiscs contendo uma proteína transmembranar (TMP) na bicamada nanodisc. empilhamento induzida NAPT dos TMP-nanodiscs poderia ser comparado a nanodiscs vazias contendo a mesma composição lipídica. Grandes laços extramembranous impediria de empilhamento, enquanto alças curtas não pode impedir o empilhamento 64. Este pode ser transformado em uma vantagem, tal como o protocolo pode ser utilizado para investigar as proteínas que se ligam especificamente à proteína transmembranar.
A vantagem deste método é que a interacção de membrana podem ser visualizados de imediato. A relativa simplicidade de fazer grandes quantidades de nanodiscs vazios implica que se pode estendereste método para o rastreio de condições diferentes, como pH, temperatura, buffers, e dependência de cofactor monotópico ligação às proteínas. De facto, enquanto que a plataforma nanodisc 9 foi desenvolvido para a estabilização de proteínas transmembranares e é cada vez mais utilizada para este propósito, o seu potencial para a estudos de grandes números de mais-ou-menos transitoriamente de ligação a proteínas extrínsecas no interior das células presentes devem ser claramente mantida em mente.
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Acknowledgments
Os autores agradecem o Conselho Sueco de Pesquisa, Conselho do Condado de Estocolmo, e os fundos de Ki para o seu apoio. A expressão e purificação de MSP foi realizado no Karolinska Institutet / SciLifeLab Protein Ciência Núcleo Facility (http://PSF.ki.se). Os autores também gostariam de agradecer ao Dr. Pasi Purhonen e Dr. Mathilda Sjöberg para compartilhar seus conhecimentos técnicos e para a sua assistência oportuna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transmission electron microscope: JEOL2100F | JEOL | ||
| CCD camera | Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany | ||
| Glow discharger | Baltec | ||
| TEM grid: 400 mesh | TAAB | GM016/C | |
| Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5 | Agilent Technologies | 5190-2526 | |
| Superdex 200 HR 10/300 | GE Healthcare Life Sciences | 17-5172-01 | |
| Plasmid: MSP1E3D1 | Addgene | 20066 | |
| Bacteria: BL21DE3 | NEB | C2527H | |
| Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2 | Protein Science Facility, KI, Solna | ||
| Purification Matrix: ATP agarose | Sigma Aldrich | A2767 | |
| Purification Matrix: HisTrap HP-5 mL | GE Healthcare Life Sciences | 17-5247-01 | |
| Lipid: POPC | Avanti polar lipids | 850457C | 25 mg/mL in chloroform |
| Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin | Bio-Rad | 1523920 | |
| 13 mm syringe filter: 0.2 μm | Pall life sciences | PN 4554T | |
| Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate | Sigma Aldrich | 31648 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148-250ML | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad | 161-0301 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | 4693132001 | |
| TCEP | Sigma Aldrich | 646547 | |
| Detergent: Sodium cholate hydrate | Sigma Aldrich | C6445-10G | |
| Sodium Cholate | 500 mM Sodium cholate. Resuspend in miliQ water and store at -20 °C. | ||
| Lipid Stock | 50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl. Store -80 °C for a month, after purging the solution with nitrogen. |
||
| MSP standard buffer | 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA. Store at 4 °C. |
||
| Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer | Thermo Fisher Scientific | BN2001 | 50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8 |
| Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer | Thermo Fisher Scientific | BN2002 | 50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8, 0.002% Coomassie G-250 |
| Non-Denaturaing Electrophoresis 4x Sample loading Buffer | Thermo Fisher Scientific | BN2003 | 50 mM Bis-Tris, pH 7.2, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S |
| Denaturaing Electrophoresis Running Buffer | In-house recipe: 25 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1% (w/v) SDS | ||
| Denaturaing Electrophoresis 5x Sample loading Buffer | In-house recipe: 0.05% (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl, pH 6.8, 20% (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS, 10 mM 2-mercaptoethanol | ||
| Terrific broth | Tryptone - 12.0 g, Yeast Extract - 24.0 g, 100 mL 0.17 M KH2PO4 and 0.72 M K2HPO4, Glycerol - 4 mL. Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 mL and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium. |
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