Introduction
Le bore-azote contenant des hétérocycles (ie 1,2-azaborines) ont récemment attiré l' attention significative en tant isostères de arenes. Cette isosterism peut conduire à la diversification des motifs structurels existants pour élargir l'espace chimique 2, 3, 4. Azaborines ont une utilité potentielle pour les applications en recherche biomédicale , 5, 6, 7, 8, en particulier dans le domaine de la chimie médicinale dans laquelle les chimistes effectuent la synthèse de banques de molécules structuralement et fonctionnellement pertinents. De manière significative, cependant, alors qu'il existe de nombreuses voies de synthèse bien développés à des molécules disponibles contenant arene, seul un nombre limité de méthodes pour la synthèse de azaborines ont été rapportés 9, 10, 11, 12, 13. Ceci est principalement dû à un nombre limité d'options pour la source de bore et de l'air et de la nature sensible à l'humidité de la molécule dans le stade précoce de la séquence synthétique.
Dans la première partie de cet article, nous allons décrire une synthèse à l'échelle multi-gramme de N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3) en utilisant des techniques de libre-air standard. Ce composé sert comme intermédiaire polyvalent qui peut encore être fonctionnalisé pour structurellement plus complexes molécules 14, 15. A partir de 3, dont la synthèse et la purification du N -H- B -éthyl-1,2-azaborine (5) destiné à être utilisé dans des études de liaison de protéine seront décrits. En raison de la volatilité de 5, son isolement efficace nécessite un contrôle précis de la température de réaction, le temps, et distillation conditions.
Dans la deuxième partie, les protocoles pour l' expression de la protéine et l' isolement des mutants T4 lysozyme (L99A et L99A / M102Q) 17, 18, 19, 20 seront présentés, suivie d' une cristallisation de la protéine et la préparation de complexes cristallins protéine-ligand. Les mutants T4 lysozyme L99A et L99A / M102Q ont été choisis en tant que systèmes modèles biologiques pour examiner la capacité de liaison hydrogène de NH contenant des molécules azaborine 17. En utilisant un protocole de biologie moléculaire standard, la protéine est exprimée dans la souche Escherichia coli RR1 et induite par l' isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside 1 (IPTG). La purification des protéines est réalisée en utilisant une Chromatographie sur colonne échangeuse d'ions. La cristallisation des protéines est effectuée avec une solution fortement concentrée et purifiée de protéine (> 95% de pureté par électrophorèse sur gel) en utilisant la tenturedéposer méthode de diffusion de la vapeur. En raison de la sensibilité des ligands de la présente étude à l'oxygène, les complexes protéine-ligand sont préparés dans des conditions exemptes d'air.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTE: Toutes les manipulations oxygène et sensibles à l' humidité ont été effectuées sous atmosphère inerte (N 2) en utilisant soit des techniques libres d'air standard ou une boîte à gants. THF (tétrahydrofuranne), Et2O (éther diéthylique), un groupe CH 2 Cl 2 (dichlorométhane), le toluène et le pentane ont été purifiés par passage à travers une colonne d'alumine neutre sous argon. L' acétonitrile a été séché sur CaH2 (hydrure de calcium) et distillé sous atmosphère d'azote avant l'emploi. Pd / C (palladium sur charbon) a été chauffé sous vide poussé à 100 ° C pendant 12 h avant utilisation. Du gel de silice (230-400 mesh) a été séché pendant 12 h à 180 ° C sous vide poussé. La Chromatographie éclair a été réalisée avec ce gel de silice sous une atmosphère inerte. Tous les autres produits chimiques et solvants ont été achetés et utilisés tels que reçus.
NOTE: Attention, s'il vous plaît consulter toutes les fiches de données de sécurité des produits concernés (MSDS) avant utilisation. Plusieurs des produits chimiques utilisés dans la synthèse d'unre aiguë toxique et cancérigène.
1. Préparation du 1,2-Azaborines
REMARQUE: Les données de caractérisation de tous les composés de cette étude ont été signalés précédemment , 12, 13, 16.
Figure 1: Schéma de synthèse de 1,2-azaborines. Des protocoles détaillés pour la synthèse de chaque composé (1-5) sont décrits dans la partie protocole. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Préparation de la N -allyl- N -TBS- B chlorure de allyl produit d' addition (1)
- Dans une boîte à gants, mesurer 6,70 g (50,0 mmol) triallylborane 22 dans un 24/40 1 L ballon à fond rond séché au four équipé d'un barreau d'agitation et ajouter 250 ml de dichlorométhane. Sceller le flacon avec un septum en caoutchouc. À l'extérieur de la boîte, refroidir la solution à -78 ° C sous une atmosphère d'azote sur un collecteur de gaz d'aspiration.
- Ajouter 100 ml d'une solution 1,00 M de trichlorure de bore (100 mmol) dans de l'hexane à la solution de triallylborane à -78 ° C par transfert de canule. Laissez le bruit du mélange réactionnel à cette température pendant 4 h.
NOTE: Attention, le trichlorure de bore est très réactif avec de l'eau. - Dans un ballon séparé de 100 ml, mesurez 25,7 g N - (t - butyldiméthylsilyle) - N -allylamine (150 mmol) et ajouter 20,0 ml de dichlorométhane. L 1 au flacon de réaction, ajouter cette solution par transfert de la canule en maintenant la température réactionnelle à -78 ° C.
- Ajouter 21,0 ml de triéthylamine (150 mmoles) à la réaction. Maintenir sous agitation sous un flux positif d'azote et de lui permettre de se réchauffer progressivement à room nuit de température.
- Après 18 heures d'agitation, d'éliminer environ la moitié du solvant à travers un distributeur de gaz sous vide en utilisant un vide élevé (300 à 500 mTorr), avec un piège à azote liquide.
- Prendre le ballon réactionnel dans une boîte à gants et filtrer le sel blanc formé dans le mélange réactionnel à travers une porosité moyenne fritte séché au four équipé d'un adaptateur 24/40 à vide et une ml ballon à fond rond 24/40 500 avec une agitation bar. Utilisez le dichlorométhane pour transférer tous les matériaux restants.
- Éliminer tous les produits volatils restants du filtrat à l'extérieur de la boîte à l'aide d'un distributeur de gaz sous vide avec un vide poussé.
- Dans une boîte à gants, transférer le mélange réactionnel concentré dans un four séché 14/20 100 ml flacon à fond rond avec une barre d'agitation pour se préparer à la distillation. Boucher le flacon avec un septum.
- Sous un flux d'azote, ouvrir rapidement le septum et on ajoute 200 mg d'hydrure de calcium comme agent de séchage.
- Mettre en place un appareil de distillation par le montage d'un four-on sèche 14/20 tête de distillation attenante avec un thermomètre, d'un côté avec une fiole jaugée de stockage recevant 14/20 50 exempt d'air et de l'autre côté avec le flacon de 100 ml contenant le produit brut. Équipez la tête de distillation avec de l'eau glacée. (Utiliser de la graisse pour toutes les articulations de l'appareil de distillation).
NOTE: Le produit commence à distiller lorsque la température de la vapeur atteigne 60 ° C à 300 mTorr. - Continuer à collecter le produit en augmentant la température du bain d'huile jusqu'à ce que le thermomètre indique une tête de distillation 75 ° C.
NOTE: Le produit est un liquide clair, incolore. - Arrêter la distillation en enlevant la source de chaleur et de refroidir le dispositif à la température ambiante avant le stockage. Après refroidissement, repressuriser l'appareil avec de l'azote et fermer hermétiquement la soupape de bouchon sur le flacon de stockage sans air. Stocker le produit isolé dans une boîte à gants congélateur.
NOTE: Le rendement peut varier de 65% à 84%.
- Préparation du N B -Cl (2)
- Dans une boîte à gants, mesurez 56,0 g N -allyl- N -TBS- B chlorure de produit d' addition (1) (217 mmol) dans un 24/40 1 L ballon à fond rond séché au four avec une barre d'agitation et ajouter 500 toluène mL.
- Mesurer g Grubbs 1 catalyseur de génération st 1,79 (2,17 mmol).
- Ajouter la partie-goutte à la solution d'agitation de 1 à température ambiante dans une boîte à gants catalyseur. Purger la boîte pendant l'addition pour éliminer l'éthylène gazeux formé à partir de la réaction.
NOTE: La réaction est généralement complète dans les 30 minutes de la cessation du dégagement de gaz. Comme un autre indicateur d'achèvement, la couleur de réaction aura complètement changé depuis sa première pourpre au brun. A ce stade, le produit peut être isolé par distillation sous vide; voir la référence 12 pour plus de détails. Dans ce protocole, un one-pot, procédure en deux étapes pour la synthèse directe de 3 est décrite. - Préparation de la N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3)
- A la solution de réaction du produit à cycle fermé (2) dans le toluène, ajouter 14,0 g de palladium sur charbon (10% en poids de Pd, 13,2 mmol).
- Retirer le ballon de la boîte et le monter avec un 24/40 condenseur à reflux séché au four qui a été purgé à l'azote et équipé d'eau glacée.
- Chauffer le mélange réactionnel en utilisant un bain d'huile à un reflux vigoureux à 135 ° C tout en agitant.
- Après maintien au reflux pendant 16 heures, refroidir la réaction en éliminant le ballon du bain d'huile. Lors du refroidissement à température ambiante, on retire une aliquote ml du mélange réactionnel à l'aide d'une seringue munie d'une aiguille Luer lock séché au four 0,5. Transférer la mL aliquote de 0,5 à un tube de RMN vis-top pour analyser via 11 B RMN 12.
NOTE: Le pic du produit désiré apparaît à ca. 35,5 ppm 12, tandis que la mère de départpic ial apparaît à ca. 42,9 ppm 12. Habituellement , à ce point 11 B RMN indique la réaction est incomplète, avec un mineur pic de matériau de départ restant. - Si la réaction est incomplète, amener le ballon réactionnel dans une boîte à gants et ajoute 3,00 g supplémentaires de palladium sur du carbone (10% en poids de Pd, 2,82 mmol).
- Resubject la réaction au reflux conditions telles que décrites dans 1.3.2 et 1.3.3.
- Au bout d' une 24 h supplémentaires à reflux, on analyse une autre aliquote de la réaction de 11 B - RMN. À ce stade, la réaction doit être complète.
- Transférer le ballon de réaction à la boîte à gants et passer le mélange réactionnel à travers une colonne de Chromatographie éclair jetable emballé avec des lingettes en papier. Recueillir le filtrat par lavage avec 50,0 ml de toluène.
- Retirez toutes les substances volatiles du filtrat en dehors de la boîte sur un collecteur de gaz d'aspirateur équipé d'un vide poussé.
NOTE: L'élimination des matières volatiles peut prendre 40 min to 90 min en fonction de la pression du vide. Lorsque le manomètre indique une pression maximale, il indique que l'élimination du solvant est terminée. Bien que l'élimination du solvant, assurez-vous que le bain d'eau sous le ballon reste à la température ambiante pour la dissipation thermique. - Dans une boîte à gants, transférer le mélange réactionnel concentré dans un four séché 24/40 250 ml flacon à fond rond avec une barre d'agitation. Boucher le flacon avec un septum.
- Retirez rapidement le septum et ajouter 200 mg d'hydrure de calcium comme agent de séchage.
- Mettre en place un appareil de distillation en installant une tête de distillation 24/40 séché au four attaché d'un thermomètre, d'un côté avec une fiole jaugée de stockage recevant 24/40 100 exempt d'air et l'autre côté de la fiole de 100 ml contenant le produit brut. Équipez la tête de distillation avec de l'eau glacée. Utiliser de la graisse pour toutes les articulations de l'appareil de distillation.
NOTE: Le produit commence à distiller lorsque la température de la vapeur atteint 65 à 70 ° C à 1 000 mTorr avec une huiletempérature du bain entre 90-100 ° C. Le produit est un liquide clair, incolore. - Arrêter la distillation en enlevant la source de chaleur et de refroidir le dispositif à la température ambiante avant le stockage. Après refroidissement, repressuriser l'appareil avec de l'azote et fermer hermétiquement la soupape de bouchon sur le flacon de stockage sans air. Stocker le produit isolé dans une boîte à gants congélateur à -30 ° C.
NOTE: Le rendement de celui-pot, procédure en deux étapes est de 52%.
Les spectres de RMN 11 B pour la formation d' un suivi de N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3): Figure 2. A) N -Allyl- N -TBS-B-chlorure d' allyle produit d' addition (1), un matériau pour l' anneau métathèse de fermeture de départ. B) Oxydation après 16 h. (Produit à cycle fermé inaltéré N -TBS- B -Cl (2) et le produit B est isomérisé -vinyl annulaire fermé (2 ') le long de la N-TBS-B-Cl-1,2-azaborine (3) sont représentés). C) après l' oxydation supplémentaire de 24 h. D) Produit isolé (3) après une purification par distillation sous vide. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.- Préparation de la N -H- B -OBu-1,2-azaborine (4)
- Dans une boîte à gants, mesurer 4,00 g N- TBS -B- Cl-1,2-azaborine (3) (17,6 mmol) dans un ballon de 100 ml à fond rond séché au four avec un barreau d'agitation et ajouter 35 ml d' acétonitrile. Mesurer acétamide 1,14 g (19,3 mmol) et de transférer dans le ballon de réaction. Sceller le flacon avec un septum en caoutchouc.
- Retirer le flacon de réaction de la boîte et monter avec un oême séché 24/40 condenseur à reflux qui a été purgé à l'azote et équipé d'eau glacée.
- Chauffer le mélange réactionnel au reflux à 85 ° C dans un bain d'huile sous agitation.
- Après 3 heures au reflux, refroidir la réaction en éliminant le ballon du bain d'huile. Lors du refroidissement à température ambiante, éliminer le solvant sur un collecteur de gaz d'aspirateur équipé d'un vide poussé.
- Après avoir enlevé les matières volatiles sous vide, on redissout le résidu réactionnel dans 15,0 ml de THF. A cette solution , ajouter 3,21 ml de n - butanol (35,1 mmol).
- Agiter le mélange réactionnel à la température ambiante pendant 1 h.
- On élimine le solvant sur un collecteur de gaz d'aspirateur équipé d'un vide poussé pour obtenir le produit brut.
- Dans une boîte à gants, isoler le produit par Chromatographie sur colonne de gel de silice en utilisant un mélange de pentane et d'éther éthylique (5: 1) comme éluant. Éliminer les matières volatiles à partir des fractions contenant le produit au moyen d'un collecteur de gaz d'aspirateur équipé d'un vide poussé pour obtenir le produit pur sous forme d'un solide blanc.
NOTE: Le rendement peut varier de 82% à 87%.
- Préparation de la N -H- B -éthyl-1,2-azaborine (5)
- Dans une boîte à gants, mesurer 1,00 g N- H -B- OBu-1,2-azaborine (4) (6,62 mmol) dans un ballon de 100 ml à fond rond séché au four avec un barreau d'agitation et ajouter 25 ml Et 2 O. Seal le ballon avec un septum en caoutchouc et placer sous N 2 sur un collecteur de gaz sous vide.
- Dans un ballon de 100 ml à fond rond séché au four séparé, ajouter 26,5 ml d'une solution d'éthyl lithium (0,5 M dans le benzène / cyclohexane, 13,2 mmol) sous atmosphère d'azote. Enlever le mélange du solvant (benzène / cyclohexane) à partir du réactif éthyllithium pour éviter les problèmes d'isolement du produit souhaité azaborine. Reprendre le éthyllithium solide dans 13,0 ml Et 2 O.
NOTE: Attention: Organolithien sont pyrophoriques (ignitable au contact de l'air ou de l'eau). Le produit désiré (5 - On refroidit le ballon de réaction contenant 4 à -30 ° C avec un bain de refroidissement.
- Ajouter la solution d'éthyl-lithium dans le ballon de réaction par transfert de canule à -30 ° C. Maintenir l'agitation à cette température pendant 1 h, et lui permettre de se réchauffer lentement à température ambiante.
- Surveiller la réaction de 11 B RMN. (Le pic intermédiaire désiré apparaît à environ 39,8 ppm.)
- Après achèvement de la réaction, refroidir la réaction à -30 ° C et ajouter 6,62 ml d'une solution de HCl (2,0 M dans Et2Û, 13,2 mmol). Agiter le mélange réactionnel pendant 1 h tout en la laissant se réchauffer lentement à température ambiante.
- On élimine le solvant sur un collecteur de gaz d'aspirateur équipé d'un faible vide (20-25 torr) pour obtenir le mélange de produit brut.
- Dans une boîte à gants,isoler le produit par Chromatographie sur colonne de gel de silice, en utilisant du 2-méthylbutane comme éluant. Retirer la volatile sur un collecteur de gaz d'aspirateur équipé d'un vide atténué pour obtenir le produit pur sous forme d'un liquide incolore.
NOTE: Le rendement est de 56%.
2. Protein Préparation et Cristallisation de lysozyme T4 Mutants
- L'expression des protéines et la purification
- Cultiver des cellules de E. coli RR1 transformé par les plasmides sous - clonés (à L99A ou L99A / M102Q) 17, 20 dans 200 ml de LB (bouillon de lysogénie) milieu supplémenté avec 40,0 mg d' ampicilline à 37 ° C pendant 12 h.
REMARQUE: La composition du milieu LB est de 12 g de tryptone, 5 g d' extrait de levure, 10 g de chlorure de sodium et 1 g de glucose par 1 G 2 O. - Inoculer 4,00 L de milieu LB (supplémenté avec 800 mg d'ampicilline) avec 160 ml de la culture d'une nuit et on incube à 37 ° C, à 240 tours par minute avec un filtered 'alimentation en air.
- Lorsque la densité optique atteint 0,7 à 600 nm, de refroidir la culture bactérienne à la température ambiante en le retirant de l'incubateur.
- Mesurer 695 mg d'isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside 1 (IPTG) (concentration finale de 0,7 mM) dans un tube de centrifugation conique et ajouter 4 ml du milieu LB à se dissoudre.
- Ajouter la solution d'IPTG à la culture pour induire l'expression de la protéine. Incuber les cultures à 110 rpm pendant 21 h à 25 ° C.
- Centrifuger la culture à 4412 xg pendant 30 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 300 ml de 0,1 M de phosphate de sodium (pH 6,6), 0,2 M de NaCl et ajoute 30,0 ml d'acide 0,5 M éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (pH 8,0). Agiter la suspension pendant 17 h à 4 ° C.
- Ajouter 30,0 ml de 1,0 M de MgCl2 et 0,500 ml de désoxyribonucléase I (DNase I) à la suspension et on agite à température ambiante pendant 8 h.
- Centrifuger la suspension de cellules lysées à 30.913 xg pendant 30 min à 4 76; C. Recueillir le surnageant contenant la protéine exprimée et jeter le culot.
- Dialyser contre le lysat de phosphate 20 mM de sodium (pH 6,5 à pH 6,3 L99A et pour L99A / M102Q) à 4 ° C pendant une nuit.
- Laver et équilibrer 20,0 ml de carboxyméthyle billes échangeuses d'ions avec un tampon d'équilibrage (Tris 50 mM, EDTA 1 mM (pH 7,3)) dans une colonne. Charger la solution contenant la protéine sur les billes et laver la colonne avec 100 ml du tampon d'équilibration. Éluer la colonne avec un gradient de 600 ml linéaire de NaCl 300 mM dans la zone tampon d'équilibration.
- Utiliser un système de Chromatographie à basse pression pour la purification de la colonne. En utilisant un débit de 1 ml / min de la pompe et recueillir des fractions de 10 ml. Recueillir les fractions contenant la protéine pure.
Remarque: Au cours de l'élution, surveiller la densité optique (DO) à 280 nm pour vérifier la présence de la protéine. Déterminer la pureté de chaque fraction par SDS-PAGE et ne recueillir que les fractions les plus pures.
- Cultiver des cellules de E. coli RR1 transformé par les plasmides sous - clonés (à L99A ou L99A / M102Q) 17, 20 dans 200 ml de LB (bouillon de lysogénie) milieu supplémenté avec 40,0 mg d' ampicilline à 37 ° C pendant 12 h.
Figure 3: Les résultats représentatifs pour la purification des protéines de T4 lysozyme L99A mutant / M102Q. A) Chromatogramme montrant l'absorbance UV mesurée en AU à 280 nm (ligne bleue) et la conductivité en mS / cm (ligne rouge). Les fractions 20-23 ont été rassemblées et la pureté a été déterminée par SDS-PAGE. B) 15% gel SDS-PAGE montrant la présence de la protéine purifiée des fractions 20-23 à 18,6 kDa. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.- La cristallisation des protéines
- Transférer la solution de protéine purifiée dans un tube à membrane de dialyse (12 000 à 14 000 MWCO). Placer le tube de dialyse dans un bêcher contenant 4,00 L de phosphate de sodium 100 mM, NaCl 550 mM, NaN3 à 0,02% (pH 6,5 pour L99A et à un pH de 6,3 L99A / M102). Agiter la solution 4 L nuit à 4 ° C.
- Ajouter 2-mercaptoéthanol (concentration finale de 5 mM) à l'échantillon dialysé et concentré à ~ 40,0 mg / ml en utilisant un concentrateur centrifuge (10 000 MWCO). Déterminer la concentration de la protéine en mesurant l'absorption à 280 nm. Retirez tout précipité par centrifugation avant la cristallisation.
- Utilisez la méthode goutte pendante diffusion de vapeur pour la cristallisation des protéines. Mélanger 5,00 ul de la solution concentrée de protéine avec 5,00 ul de la solution de réservoir (2,0 à 2,2 M de sodium / phosphate de potassium, pH 6,7 à 7,1, 50 mM de 2-mercaptoéthanol, 50 mM de 2-hydroxyéthyl disulfure) sur une lamelle de verre siliconé.
- Équilibrer la chute de mélange contre 1,00 ml de la solution réservoir en plaçant la lamelle couvre la tête en bas au-dessus de la solution de réservoir contenant chacun des puits. Utiliser de la graisse pour sceller hermétiquement chaque puits avec la diapositive. Mettre en place diverses conditions en utilisant une plaque de 24 puits avec une solution de réservoir mentionné au point 2.2.3.Stocker la plaque à 4 ° C pendant la croissance cristalline.
NOTE: Les cristaux se développent normalement dans les 1-2 semaines dans le tampon équilibré sur la lamelle. précipitation immédiate lors du mélange, la solution protéique avec la solution du réservoir à l'étape 2.2.3 indique l'échec de la cristallisation.
Figure 4: image représentant des cristaux de lysozyme T4 L99A mutant avant complexation avec des ligands. Les cristaux sont dans la liqueur mère (2,1 M de sodium / phosphate de potassium, pH 6,9, 50 mM de 2-mercaptoéthanol, 50 mM de disulfure de 2-hydroxyéthyle). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.- préparation complexe
- Choisissez les cristaux à l'aide d'un tube cryogénique en forme dans une boucle (voir la liste des matériaux) etles placer dans un tube de 0,6 ml de microcentrifugation. Ajouter 50,0 ul de liqueur mère dans le tube pour éviter la sécheresse et de préserver les cristaux.
REMARQUE: La sélection du monocristal est facilitée à l'aide d'un microscope. - Transférer le tube contenant des cristaux dans une boîte à gants. Prendre 5,00 pi du ligand azaborine (5) et place à l' intérieur du composant logiciel enfichable bouchon du tube. Cap et stocker le tube dans un réfrigérateur (4 ° C) à l'intérieur de la boîte à gants pour 2-7 jours pour équilibration par diffusion de vapeur.
REMARQUE: Les propriétés physiques (forte volatilité et la solubilité en solution aqueuse) du ligand azaborine (5) permet la complexation avec les cristaux de protéine préformées par la méthode de diffusion de vapeur. - Transférer les cristaux à l'aide d'un tube cryogénique en forme dans une boucle sur une lame de verre contenant une goutte de N-Paratone avant éclair congélation dans l'azote liquide. Choisissez le cristal protégé par N-Paratone rapidement et le flash-gel en plongeant le cristal surboucle dans un dewar contenant de l'azote liquide. Monter le cristal sur la boucle en utilisant une pince cryogénique.
- Collecter des jeux de données d'un monocristal en utilisant le rayonnement synchrotron. Effectuer le remplacement moléculaire en utilisant des structures publiées 20, 24; vérifier l'existence de ligand à l'intérieur du site de liaison de la protéine par un blob non modélisé de la densité électronique.
- Choisissez les cristaux à l'aide d'un tube cryogénique en forme dans une boucle (voir la liste des matériaux) etles placer dans un tube de 0,6 ml de microcentrifugation. Ajouter 50,0 ul de liqueur mère dans le tube pour éviter la sécheresse et de préserver les cristaux.
Figure 5: modèles atomiques de T4 lysozyme mutant L99A poche de liaison avec la densité d'électrons. A) cavité L99A avec une densité d'électrons blob non modélisé dans le site de liaison. B) de la cavité L99A avec le ligand azaborine modélisé 5 dans deux conformations alternatives. S'il vous plaît clbeurk ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La voie de synthèse schématique pour le 1,2-azaborines est représenté sur la figure 1. Ce protocole applicable à la synthèse de cinq molécules du bore contenant de l'azote différentes. La figure 2 représente les spectres 11 RMN B mesuré au cours de l' étape 1.3 pour suivre la formation du produit désiré (3). La purification des protéines a été réalisée en utilisant un système de Chromatographie à basse pression et un chromatogramme représentatif est montré sur la figure 3. La pureté des fractions collectées a été déterminée par SDS-PAGE. Cristaux de lysozyme T4 L99A mutante sont représentées sur la figure 4. La figure 5 montre la poche de liaison L99A avec la densité d'électrons non modélisé et la cavité de liaison après raffinement avec le ligand 5 lié.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dans la première partie de ce protocole, nous avons décrit une synthèse modifiée de 1,2-azaborines basés sur des méthodes précédemment rapportées 12, 13. Triallylborane 22 a été utilisé comme un substitut pour les routes à l' aide de allyltriphenyl étain ou potassium allyltrifluoroborate pour préparer N -allyl- N -TBS- B chlorure de produit d' addition (1). Cette méthode permet une approche plus atome-économique et écologique. Pour la synthèse de N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3), un seul pot, séquence en deux étapes (fermeture de cycle métathèse suivie d' une oxydation) a été employé, ce qui a entraîné un rendement plus élevé que le précédent isolé procédé impliquant l' isolement de l'intermédiaire (2) (52% vs 29% en deux étapes). (Toutefois, en fonction de la pureté du produit d' addition (1), l' isolement du produit à cycle fermé , avant l' étape d'oxydationPeut être nécessaire en utilisant une distillation sous vide. Dans ce cas, en utilisant du dichlorométhane comme solvant à la place du toluène réduit le temps d'élimination des substances volatiles avant la distillation.) Surveillance 11 B RMN (Figure 2) lors de l'étape d'oxydation bénéficie également de la réduction des quantités totales de Pd / C utilisés dans ce la réaction (7 mol% par rapport à 15% en mole).
Synthèse de la N -H- B -éthyl-1,2-azaborine (5) a été réalisée en deux étapes à partir de 4 à l' aide éthyllithium à la place de la séquence à étapes multiples précédemment rapporté 16 qui nécessitait l' utilisation d'un complexe de chrome. L'isolement nécessaire contrôle précis de la température et de manipulation sous vide atténuée en raison de la volatilité du produit. Les techniques présentées dans ce protocole peuvent également être appliqués à la purification d'autres composés volatils.
Dans la deuxième partie, nous avons démontré la purification des protéines et du cristal complexationdes mutants de lysozyme T4 L99A et L99A / M102Q. Une expression de protéine standard dans la souche E. coli RR1 et induction par IPTG, suivie d' une lyse cellulaire chimique a donné l' isolement de la protéine désirée. Il est conseillé d'exécuter SDS-PAGE après l'expression de la protéine et la lyse des cellules pour confirmer le succès de chaque étape ou identifier le processus a échoué. Pour le lysozyme T4 L99A, la protéine exprimée peut être trouvée à la fois dans le surnageant et le culot en raison de son activité pour lyser les cellules bactériennes. Dans ce cas, la protéine dans le surnageant peut être dialysée contre 20 mM de tampon de phosphate de sodium et combiné avec un lysat de lyse cellulaire pour la purification de la colonne. les conditions d'induction peuvent être réglées à une température plus élevée et le temps le plus court (de 21 h à 25 ° C 2-3 h à 37 ° C). La lyse des cellules peut également être réalisée à l'aide d'une sonication dans un bain de glace pour éviter la surchauffe. Carboxyméthyl colonne échangeuse d'ions avec un gradient linéaire de NaCl 300 mM a été utilisée pour la purification des protéines. Seulement pureté> 95% (basé sur SDS-PAGE) des fractions protéiques ont été recueillies et utilisées dans la cristallisation des protéines.
Avant la concentration de la solution de protéines, l'addition de 2-mercaptoéthanol (concentration finale de 5 mM) (étape 2.2.2) à la protéine dialysée était nécessaire pour empêcher la précipitation spontanée, en particulier pour L99A / protéine M102Q qui tend à précipiter facilement à haute concentration. En tant que protéine 5 nécessaire complexation avec une atmosphère sans air, le complexe protéine-ligand a été préparé dans une boîte à gants. Les matériaux préparés dans ce protocole ont été utilisés dans des études de 1,2-azaborines liaison dans un système de modèle biologique: mutants lysozyme cavité bearingT4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetrahydrofuran (THF), inhibitor-free, for HPLC, ≥99.9% | Sigma Aldrich | 34865 | |
| Diethyl ether (Et2O), for HPLC, ≥99.9%, inhibitor-free | Sigma Aldrich | 309966 | |
| Methylene chloride (CH2Cl2), (Stabilized/Certified ACS) | Fisher | D37-20 | |
| Toluene | Fisher | T290-4 | |
| Pentane, HPLC | Fisher | P399-4 | |
| Acetonitrile | Fisher | A21-4 | |
| Calcium hydride (CaH2), reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 208027 | Pyrophoric |
| Palladium on activated carbon (Pd/C), 10 wt% Pd | Strem | 46-1900 | |
| 1.0 M Boron trichloride solution in hexane | Sigma Aldrich | 211249 | Highly toxic/Pyrophoric |
| Triethylamine, ≥99.5% | Sigma Aldrich | 471283 | |
| Grubbs 1st generation catalyst | materia | C823 | |
| Acetamide | Sigma Aldrich | A0500 | |
| n-Butanol, anhydrous, 99.8% | Sigma Aldrich | 281549 | |
| Ethyllithium solution, 0.5 M in benzene/cyclohexane | Sigma Aldrich | 561452 | Highly toxic/ Pyrophoric |
| HCl solution, 2.0 M in Et2O | Sigma Aldrich | 455180 | |
| 2-Methylbutane, anhydrous, ≥99% | Sigma Aldrich | 277258 | |
| Escherichia coli, (Migula) Castellani and Chalmers (ATCC® 31343™) | ATCC | 31343 | |
| T4 lysozyme WT* (L99A) | Addgene | 18476 | |
| T4 lysozyme mutant (S38D L99A M102Q N144D) | Addgene | 18477 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A0166 | |
| isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Invitrogen | AM9464 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | Fisher | BP329 | |
| Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher | BP332 | |
| Sodium chloride | Fisher | S642212 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher | BP118 | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M4880 | Corrosive |
| Thermo scientific pierce DNaseI | Fisher | PI-90083 | |
| GE Healthcare Sepharose Fast Flow Cation Exchange Media | Fisher | 45-002-931 | |
| Tris-base | Fisher | BP152-500 | |
| Sodium azide | TCI | S0489 | Highly toxic |
| 2-Mercaptoethanol | Fisher | ICN806443 | |
| Sartorius Vivaspin 20 Centrifugal Concentrators | Fisher | 14-558-501 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5379 | |
| 2-Hydroxyethyl disulfide | Sigma Aldrich | 380474 | |
| N-paratone | Hampton Research | HR2-643 | |
| 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO | Fisher | 08-667E | |
| CryoLoop | Hampton Research | cryogenic tubing shaped into a loop | |
| CryoTong | Thermo Fisher | cryogenic tong | |
| Coot | Electron density images are generated from the software |
References
- Ducruix, A., Giége, R. Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach. , IRL Press. Oxford, UK, New York. (1992).
- Bosdet, M. J. D., Piers, W. E. B-N as a C-C substitute in aromatic systems. Can. J. Chem. 87 (1), 8-29 (2009).
- Campbell, P. G., Marwitz, A. J., Liu, S. -Y. Recent Advances in Azaborine Chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 51 (25), 6074-6092 (2012).
- Wang, X. -Y., Wang, J. -Y., Pei, J. B. N. Heterosuperbenzenes: Synthesis and Properties. Chem. Eur. J. 21 (9), 3528-3539 (2015).
- Zhou, H. -B., et al. Elemental isomerism: a boron-nitrogen surrogate for a carbon-carbon double bond increases the chemical diversity of estrogen receptor ligands. Chem. Biol. 14 (6), 659-669 (2007).
- Ito, H., Yumura, K., Saigo, K. Synthesis, characterization, and binding property of isoelectronic analogues of nucleobases, B(6)-substituted 5-aza-6-borauracils and -thymines. Org. Lett. 12 (15), 3386-3389 (2010).
- Vlasceanu, A., Jessing, M., Kilburn, J. P. BN/CC isosterism in borazaronaphthalenes towards phosphodiesterase 10A (PDE10A) inhibitors. Bioorg. Med. Chem. 23 (15), 4453-4461 (2015).
- Rombouts, F. J., Tovar, F., Austin, N., Tresadern, G., Trabanco, A. A. Benzazaborinines as Novel Bioisosteric Replacements of Naphthalene: Propranolol as an Example. J. Med. Chem. 58 (23), 9287-9295 (2015).
- Culling, G. C., Dewar, M. J. S., Marr, P. A. New Heteroaromatic Compounds. XXIII. Two Analogs of Triphenylene and a Possible Route to Borazarene. J. Am. Chem. Soc. 86 (6), 1125-1127 (1964).
- White, D. G. 2-Phenyl-2,1-borazarene and Derivatives of 1,2-Azaboracycloalkanes. J. Am. Chem. Soc. 85 (22), 3634-3636 (1963).
- Ashe III, A. J., Fang, X. A Synthesis of Aromatic Five- and Six-Membered B−N Heterocycles via Ring Closing Metathesis. Org. Lett. 2 (14), 2089-2091 (2000).
- Marwitz, A. J. V., Matus, M. H., Zakharov, L. N., Dixon, D. A., Liu, S. -Y. A Hybrid Organic/Inorganic Benzene. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (5), 973-977 (2009).
- Abbey, E. R., Lamm, A. N., Baggett, A. W., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. Protecting Group-Free Synthesis of 1,2-Azaborines: A Simple Approach to the Construction of BN-Benzenoids. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12908-12913 (2013).
- Rudebusch, G. E., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. Rhodium-catalyzed boron arylation of 1,2-azaborines. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (35), 9316-9319 (2013).
- Brown, A. N., Li, B., Liu, S. -Y. Negishi Cross-Coupling Is Compatible with a Reactive B-Cl Bond: Development of a Versatile Late-Stage Functionalization of 1,2-Azaborines and Its Application to the Synthesis of New BN Isosteres of Naphthalene and Indenyl. J. Am. Chem. Soc. 137 (28), 8932-8935 (2015).
- Knack, D. H. BN/CC Isosteric Compounds as Enzyme Inhibitors: N- and B-Ethyl-1,2-azaborine Inhibit Ethylbenzene Hydroxylation as Non-Convertible Substrate Analogs. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (9), 2599-2601 (2013).
- Eriksson, A. E. Response of a Protein Structure to Cavity-Creating Mutations and Its Relation to the Hydrophobic Effect. Science. 255 (5041), 178-183 (1992).
- Eriksson, A. E., Baase, W. A., Wozniak, J. A., Matthews, B. W. A cavity-containing mutant of T4 lysozyme is stabilized by buried benzene. Nature. 355 (6358), 371-373 (1992).
- Morton, A., Baase, W. A., Matthews, B. W. Energetic Origins of Specificity of Ligand Binding in an Interior Nonpolar Cavity of T4 Lysozyme. Biochemistry. 34 (27), 8564-8575 (1995).
- Wei, B. Q., Baase, W. A., Weaver, L. H., Matthews, B. W., Shoichet, B. K. A Model Binding Site for Testing Scoring Functions in Molecular Docking. J. Mol. Biol. 322 (2), 339-355 (2002).
- Lee, H., Fischer, M., Shoichet, B. K., Liu, S. -Y. Hydrogen Bonding of 1,2-Azaborines in the Binding Cavity of T4 Lysozyme Mutants: Structures and Thermodynamics. J. Am. Chem. Soc. 138 (37), 12021-12024 (2016).
- Brown, H. C., Racherla, U. S. Organoboranes. 43. A Convenient, Highly Efficient Synthesis of Triorganylboranes via a Modified Organometallic Route. J. Org. Chem. 51 (4), 427-432 (1986).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Liu, L., Baase, W. A., Matthews, B. W. Halogenated Benzenes Bound within a Non-polar Cavity in T4 Lysozyme Provide Examples of I.S and I.Se Halogen-bonding. J. Mol. Biol. 385 (2), 595-605 (2009).
