Introduction
複素環（ すなわち 、1,2- azaborines）を含むホウ素-窒素は、最近、アレーンのアイソスターとして大きな注目を集めています。この等電子性化学空間2、3、4を展開するために、既存の構造モチーフの多様化につながる可能性があります。 Azaborines特に化学が構造のライブラリーと機能的に関連する分子の合成を行った医薬品化学の分野で、生物医学研究5、6、7、8で使用するための潜在的な有用性を有します。重要なことに、しかし、一方、利用可能なアレーン含有分子に多数のよく発達した合成経路があり、azaborinesの合成のための方法の限られた数が報告されている9、10、 11、12、13アップ。これは、ホウ素源と空気と合成配列の初期段階における分子の湿気に敏感な性質のためにオプションの限られた数の主です。
この記事の最初の部分では、（3）標準エアフリー技術を用いて、N -TBS- B -Cl-1,2- azaborineのマルチグラム規模の合成を説明します。この化合物は、さらに、構造的に、より複雑な分子14、15に官能化することができる汎用性の高い中間体として機能します。 3から出発して、タンパク質結合研究に使用するためのN -H- Bエチル-1,2- azaborineの合成および精製（5）について説明します。 5の揮発性のために、その効率的な分離は、反応温度、時間、およびDISTの正確な制御を必要とします推理条件。
第二部では、タンパク質発現およびT4リゾチーム変異体（L99A及びL99A / M102Q）17、18、19の単離のためのプロトコルは、20は、タンパク質結晶化およびタンパク質-リガンドの結晶複合体の調製に続いて、提示されます。 T4リゾチーム変異体L99A及びL99A / M102Qがazaborine分子17を含むNHの水素結合能を調べるために、生物学的モデル系として選択しました。標準的な分子生物学プロトコルを用いて、タンパク質を大腸菌 RR1株で発現させ、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）で誘導されます。タンパク質精製は、イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いて行われます。タンパク質の結晶化は、吊り下げを使用し、高度に濃縮された精製されたタンパク質溶液（ゲル電気泳動によって純度> 95％）を用いて行われます蒸気拡散法をドロップします。そのため、酸素に対する本研究のリガンドの感度が、タンパク質 - リガンド複合体は、空気を含まない条件下で製造されます。
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Protocol
注：全ての酸素および水分に敏感な操作は、標準的な空気を含まない技術またはグローブボックスのいずれかを用いて不活性雰囲気（N 2）下で行いました。 THF（テトラヒドロフラン）をEt 2 O（ジエチルエーテル）、CH 2 Cl 2（ジクロロメタン）、トルエン、ペンタン、アルゴン下、中性アルミナカラムを通して精製しました。アセトニトリルをCaH 2（水素化カルシウム）上で乾燥し、使用前に、窒素雰囲気下で蒸留しました。 Pd / C（炭素上パラジウム）を使用前に12時間、100℃で高真空下で加熱しました。シリカゲル（230-400メッシュ）を高真空下、180℃で12時間乾燥させました。フラッシュクロマトグラフィーは、不活性雰囲気下でこのシリカゲルを用いて行きました。他の全ての化学物質および溶媒は購入し、そのまま使用しました。
注：注意は、使用する前に、関連するすべての物質安全性データシート（MSDS）を参照してください。合成aで使用される化学物質のいくつかの急性毒性及び発がん性再。
1,2- Azaborinesの調製
注：この研究におけるすべての化合物の特性データは、以前に12、13、16に報告されています。
図1：1,2- azaborinesの合成スキーム。各化合物（1-5）の合成のための詳細なプロトコルは、プロトコルセクションに記載されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- Nの調製は、（1）N -TBS- B -アリル塩化物付加物を-allyl-
- グローブボックス中で、6.70グラム（50.0ミリモル）triallylboraを測定しますオーブン乾燥した24/40 1リットルの丸底フラスコに、NE 22は、撹拌棒を備えた250 mLのジクロロメタンを追加します。ゴム隔膜を備えたフラスコを密封します。ボックスの外側を、真空ガスマニホールドに窒素雰囲気下で-78℃にソリューションを冷却します。
- カニューレ転送を介して、-78℃でtriallylborane溶液にヘキサン中の1.00 M三塩化ホウ素溶液（100ミリモル）の100ミリリットルを追加します。 4時間この温度で反応混合物の攪拌をしてみましょう。
注：注意は、三塩化ホウ素は、水との反応性が高いです。 - （ トンのブチルジメチルシリル） - -別の100mLフラスコ中で、25.7グラムのNを測定するN -allylamine（150ミリモル）とは、20.0 mLのジクロロメタンを追加します。 1 Lの反応フラスコに、-78℃の反応温度を維持する、カニューレの移動を介して、この溶液を加えます。
- 反応に21.0 mLのトリエチルアミン（150ミリモル）を追加します。窒素の正の流れの下で撹拌しながら維持し、それが徐々に暖かくROすることを可能にしますオム温度で一晩。
- 攪拌の18時間後、液体窒素トラップを高真空（300〜500トル）を用いて真空ガスマニホールドを通して溶剤の約半分を削除してください。
- グローブボックス内に反応フラスコを取り、攪拌して24/40真空アダプターと24/40 500mLの丸底フラスコを搭載したオーブン乾燥し、中多孔度のフリットを通して反応混合物中に形成された白色塩を濾過して除去バー。残りのすべての材料を転送するために、ジクロロメタンを使用してください。
- 高真空での真空ガスマニホールドを使用して、ボックスの外側ろ液から残りのすべての揮発性物質を除去します。
- グローブボックスにおいて、蒸留の準備をする攪拌棒を備えたオーブンで乾燥した14/20 100mLの丸底フラスコに濃縮した反応混合物を移します。セプタムでフラスコをキャップ。
- 窒素気流下、迅速に隔壁を開き、乾燥剤として200mgの水素化カルシウムを加えます。
- oven-を当てはめることによって蒸留装置を設定します受信14/20 50 mLの無空気貯蔵フラスコ、粗生成物を含む100 mLのフラスコと反対側に温度計を取り付けた14/20蒸留ヘッド、片側を乾燥させました。冷水で蒸留ヘッドを装備。 （蒸留装置のすべての関節のためのグリースを使用してください。）
注：製品は、蒸気温度が300トルで60℃に達したときに蒸留を開始します。 - 蒸留ヘッドの温度計は75°Cを読み取るまでオイルバスの温度を上昇させることによって、製品を集め続けます。
注：製品は無色透明の液体です。 - 熱源を除去することにより、蒸留を停止し、保管前に室温に装置を冷却します。冷却後、窒素で装置をrepressurize、しっかりと空気の無料ストレージフラスコにプラグバルブを閉じてください。グローブボックスの冷凍庫で単離された生成物を保管してください。
注：収率は、65％から84％まで変化することができます。
- Nの調製B -Clの閉環生成物（2）
- グローブボックスにおいて、攪拌棒を備えたオーブン乾燥した24/40 1リットルの丸底フラスコ中のうち56.0グラムN -allyl- N -TBS- B -アリル塩化付加物（1）（217ミリモル）を測定し、500を追加mLのトルエン。
- 1.79グラムグラブス第 1 世代触媒（2.17ミリモル）を測定します。
- 少しずつグローブボックス中、室温で1の撹拌溶液に触媒を追加します。反応から形成されたエチレンガスを除去するために、添加中ボックスをパージします。
注：反応は、通常、ガス発生の停止の30分以内に完了する。完了の別の指標として、反応の色が完全に茶色にその初期紫から変更されています。この時点で、生成物を真空蒸留を用いて単離することができます。詳細については、リファレンス12を参照してください。このプロトコルでは、3の直接合成のためのワンポット、2ステップの手順を説明します。 - N -TBS- B -Cl -1,2- azaborineの調製（3）
- （2）をトルエン（10重量％のPd 13.2ミリモル）炭素14.0グラムのパラジウムを追加閉環生成物の反応溶液に。
- 箱からフラスコを取り外し、窒素でパージし、冷却水が装備されたオーブン乾燥した24/40還流冷却器をそれに合います。
- 攪拌しながら135℃で激しく還流し、油浴を用いて反応を加熱します。
- 16時間還流下で維持した後、油浴からフラスコを除去することにより反応を冷却します。室温まで冷却し、オーブン乾燥したルアーロック注射針を備えた注射器を用いて反応混合物からの0.5mLのアリコートを引き出します。 11 B NMR 12を介して分析するために、スクリュートップNMRチューブに0.5 mLのアリコートを転送します。
注：所望の生成物のピークは約に表示されます35.5 ppmの12、出発母校ながら、IALピークがCAに表示されます。 42.9 ppmの12。通常、この時点で11 B NMRは、マイナーな出発物質のピークが残っていると、反応が不完全であることを示します。 - 反応が不完全な場合、グローブボックス内に反応フラスコを持参し、炭素（10重量％のPd、2.82ミリモル）に、追加の3.00グラムのパラジウムを追加します。
- 1.3.2と1.3.3で説明したように条件を還流する反応を再征服させます。
- 還流下でさらに24時間後、11 B NMRによる反応の別のアリコートを分析します。この時点で、反応が完全でなければなりません。
- グローブボックスに反応フラスコを移し、紙ワイプでパックされた使い捨てのフラッシュクロマトグラフィーカラムを通して反応混合物を渡します。トルエン50.0ミリリットルで洗浄することにより、ろ液を収集します。
- 高真空を搭載した真空ガスマニホールド上のボックスの外側を濾液からすべての揮発性物質を除去します。
注：揮発性物質の除去は、40分のトンを取ることができます真空圧力に応じて90分、O。真空計は、最大圧力を読み取る際には、溶媒の除去が完了したことを示しています。溶剤を除去しながら、フラスコの下に水浴は、放熱のための室温のままでいることを確認してください。 - グローブボックスにおいて、攪拌棒を備えたオーブン乾燥した24/40 250 mL丸底フラスコに濃縮した反応混合物を移します。セプタムでフラスコをキャップ。
- 迅速隔膜を除去し、乾燥剤として200mgの水素化カルシウムを追加します。
- 受信24/40 100mLの空気の無料ストレージフラスコ、粗生成物を含む100 mLのフラスコと反対側に温度計を取り付けたオーブン乾燥した24/40蒸留ヘッド、片側を当てはめることによって蒸留装置を設定します。冷水で蒸留ヘッドを装備。蒸留装置のすべての関節のためのグリースを使用してください。
注：製品は、蒸気温度が油で千ミリトールで65〜70℃に達したときに蒸留を開始します90から100℃の浴温度。製品は、無色透明の液体です。 - 熱源を除去することにより、蒸留を停止し、保管前に室温に装置を冷却します。冷却後、窒素で装置をrepressurize、しっかりと空気の無料ストレージフラスコにプラグバルブを閉じてください。 -30℃で、グローブボックスの冷凍庫で単離された生成物を保管してください。
注：ワンポット二段階手順の収率は52％です。
図2：N -TBS- B -Cl -1,2- azaborineの監視を形成するための11 B NMRスペクトル（3）。 A）N -Allyl- N -TBS-B-アリルクロライドの付加物（1）、閉環メタセシスのための出発材料。 16時間後にB）酸化。 （未反応のN -TBS- B -Clの閉環生成物（さらに24時間後の2）及び（3）が示されているN-TBS-B-CL-1,2- azaborineとともに異性Bのビニルの閉環生成物（2 '））C）酸化。真空蒸留による精製後D）単離された生成物（3）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。- N -H- B -OBu -1,2- azaborineの準備（4）
- グローブボックス中で、4.00グラムN- TBS -B-のCl-1,2- azaborineを測定します （3）攪拌棒を備えたオーブン乾燥した100mLの丸底フラスコ中（17.6ミリモル）及び35 mLのアセトニトリルを追加します。 1.14グラムアセトアミド（19.3ミリモル）を測定し、反応フラスコに移します。ゴム隔膜を備えたフラスコを密封します。
- 箱から反応フラスコを取り外し、Oに適合窒素でパージし、冷却水を備えているVEN乾燥24/40還流冷却器。
- 攪拌しながらオイルバス中で85℃で還流し、反応を加熱します。
- 還流下で3時間後、油浴からフラスコを除去することにより反応を冷却します。室温まで冷却した後、高真空を搭載した真空ガスマニホールドに溶媒を除去します。
- 真空下で揮発性物質を除去した後、15.0 mLのTHF中の反応残渣を再溶解。この溶液に、n個のブタノール（35.1ミリモル）の3.21 mLを追加します。
- 室温で1時間反応を撹拌しました。
- 粗生成物を得、高真空を備えた真空ガスマニホールドに溶媒を除去します。
- （1：5）を溶離液としてグローブボックス内で、ペンタン及びジエチルエーテルの混合物を使用して、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより生成物を単離します。純粋な生成物を得、高真空を備えた真空ガスマニホールドを使用して生成物を含有する画分から揮発性物質を除去白色の固体。
注：収率は、82％から87％まで変化することができます。
- N -H- B -エチル-1,2- azaborineの調製（5）
- グローブボックスにおいて、攪拌棒を備えたオーブン乾燥した100mLの丸底フラスコ中の1.00グラムのN- H -B- OBU -1,2- azaborine（4）（6.62ミリモル）を測定し、25 mLののEt 2を追加します。 O.シール真空ガスマニホールド上のN 2の下でゴム隔壁と場所を備えたフラスコ。
- 独立したオーブン乾燥した100mLの丸底フラスコに、窒素雰囲気下、エチルリチウム溶液（ベンゼン/シクロヘキサン中0.5M、13.2ミリモル）の26.5 mLを加え。希望azaborineの生成物を単離の問題を回避するために、エチルリチウム試薬から溶剤（ベンゼン/シクロヘキサン）の混合物を削除してください。 13.0 mLのを Et 2 O中の固形エチルリチウムを再溶解
注：注意：アルキルリチウムは、自然発火性（空気や水と接触して発火性）です。所望の生成物（5 - 冷却浴で-30℃に4を含む反応フラスコを冷却します。
- -30℃でカニューレ転送を介して反応フラスコにエチルリチウムの溶液を加えます。この温度で1時間攪拌したまま、室温にそれはゆっくり温めます。
- 11 B NMRにより反応を監視します。 （所望の中間のピークは約 39.8 ppmに表示されます。）
- 反応完了後、-30℃まで反応を冷却し、6.62 mLのHCl溶液（のEt 2 O中2.0M、13.2ミリモル）を追加します。室温にそれはゆっくり温めながら1時間反応を撹拌しました。
- 低真空を備えた真空ガスマニホールドに溶媒を除去し（20~25トル）の粗生成物混合物を得ました。
- グローブボックス内で、溶離剤として2-メチルブタンを用いて、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより生成物を単離します。無色の液体として純粋な生成物を得るために、弱毒化された真空を搭載した真空ガスマニホールドに揮発性を削除してください。
注：収率は56％です。
2.タンパク質の調製およびT4リゾチーム変異体の結晶化
- タンパク質の発現および精製
- サブクローニングプラスミド（L99AまたはL99A / M102Q）200 mLのLBで17、20（LB培地）、12時間、37℃で40.0 mgのアンピシリンを補充した培地で形質転換された大腸菌 RR1細胞を成長させます。
注：LB培地の組成は、12グラムのトリプトン、5gの酵母エキス、10gの塩化ナトリウム、1 LH 2 Oあたり1gのグルコースであります - 一晩培養物160 mLで（800 mgのアンピシリンを補足した）4.00 LのLB培地に接種し、filtereで240rpmで37℃でインキュベートDエア供給。
- 光学密度が600nmで0.7に達したとき、培養器から除去することによって、室温に細菌培養物を冷却します。
- 円錐遠心分離管にイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）（0.7ミリモルの最終濃度）の695ミリグラムを測定し、溶解させるために4 mLのLB培地を追加します。
- タンパク質の発現を誘導するために培養液にIPTG液を追加します。 25℃で21時間、110 rpmで培養液をインキュベートします。
- 4℃で30分間、4412×gで文化を遠心。上清を捨て、0.1 Mリン酸ナトリウム（pHは6.6）、0.2 MのNaClの300mLにペレットを再懸濁し、0.5Mエチレンジアミン四酢酸（EDTA）（pH8.0）を30.0 mLを加え。 4℃で17時間サスペンションを撹拌します。
- 懸濁液にデオキシの1.0 MのMgCl 2及び0.500 mLのI（DNアーゼI）の30.0 mLを加え8時間室温で攪拌します。
- 4で30分間30913×gで溶解した細胞懸濁液を遠心 76; C。発現したタンパク質を含む上清を収集し、ペレットを捨てます。
- 4℃で一晩（L99A / M102Q用L99AのためのpH 6.5およびpH 6.3）20mMリン酸ナトリウムに対して溶解液を透析。
- 洗浄およびカラムで平衡化緩衝液（50mMのトリス、1mMのEDTA（pHは7.3））とカルボキシイオン交換ビーズの20.0 mLの平衡化します。ビーズ上に蛋白質を含む溶液をロードし、平衡化緩衝液100mLでカラムを洗浄。平衡緩衝液中の300mMのNaClの600mLの直線勾配でカラムを溶出します。
- カラム精製のために、低圧クロマトグラフィーシステムを使用してください。 1mL /分のポンプ速度を使用し、10 mLのの画分を収集します。純粋なタンパク質を含む画分を収集します。
注：溶出の間、タンパク質の存在を確認するために、280 nmでの光学密度（OD）を監視します。 SDS-PAGEで各画分の純度を測定し、唯一の最も純粋な画分を収集します。
- サブクローニングプラスミド（L99AまたはL99A / M102Q）200 mLのLBで17、20（LB培地）、12時間、37℃で40.0 mgのアンピシリンを補充した培地で形質転換された大腸菌 RR1細胞を成長させます。
図3：T4リゾチーム変異体L99A / M102Qのタンパク質精製のための代表的な結果。 A）クロマトグラムは、MS / cmの（赤線）で測定したUV 280 nmの（ブルーライン）でのAUにおける吸光度と導電率を示します。画分20-23を合わせ、純度はSDS-PAGEによって決定しました。 B）18.6キロダルトンでの画分20-23の精製されたタンパク質の存在を示す15％SDS-PAGEゲル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。- タンパク質結晶化
- 透析膜チューブ（12,000 14,000 MWCO）に精製したタンパク質溶液を移します。 100mMのリン酸ナトリウム、550 mMの塩化ナトリウム、0.02％のNaN 3（L用L99AためのpH 6.5およびpH 6.3の4.00 Lを含有するビーカーに透析チューブを配置99A / M102）。 4℃で一晩、4 Lの溶液を撹拌しました。
- 透析試料に2-メルカプトエタノール（最終濃度5mM）を追加し、遠心濃縮（10,000 MWCO）を使用して、〜に40.0 mg / mlとを集中。 280nmの吸収を測定することによって、タンパク質濃度を決定します。結晶化前に回転させることによって沈殿物を除去します。
- タンパク質結晶化のための蒸気拡散ハンギングドロップ法を使用してください。シリコンコートガラスカバースライド上でリザーバ溶液5.00μLを有する濃縮タンパク質溶液を5.00μL（2.0〜2.2 Mリン酸ナトリウム/カリウム、pHは6.7から7.1、50mMの2-メルカプトエタノール、50mMの2-ヒドロキシエチルジスルフィド）を混合します。
- 含む各ウェルリザーバー溶液の上に逆さまにカバースライドを配置することによって、リザーバー溶液の1.00 mLのに対して、混合降下を平衡化します。しっかりとスライドで各ウェルをシールにグリースを使用してください。 2.2.3で述べたリザーバー溶液を、24ウェルプレートを用いた各種条件を設定します。結晶成長のために4℃でプレートを保管してください。
注：結晶は、通常、カバースライド上の平衡化緩衝液中に1〜2週間以内に成長します。ステップ2.2.3でリザーバー溶液を用いてタンパク質溶液を混合中の即時の沈殿は、結晶化の失敗を示しています。
図4：リガンドとの複合体形成する前にT4リゾチーム変異体L99Aの結晶の代表的な画像。結晶は、母液（2.1 Mリン酸ナトリウム/カリウム、pHは6.9、50mMの2-メルカプトエタノール、50mMの2-ヒドロキシエチルジスルフィド）です。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。- 複雑な準備
- ループ状に成形極低温管を用いて結晶をピック（物質一覧を参照）、0.6 mLのマイクロ遠心チューブに配置します。乾燥を避け、結晶を維持するために、チューブに母液の50.0μLを追加します。
注：単結晶の選択は、顕微鏡を使用することによって促進されます。 - グローブボックス内に結晶を含むチューブを転送します。チューブのスナップキャップの内側にazaborineリガンド（5）と場所の5.00μLしてください。蒸気拡散によって平衡化のため2-7日間グローブボックス内の冷蔵庫（4℃）でチューブを保管キャップと。
注：azaborineリガンドの物理的特性は、（水溶液中の高揮発性および溶解性）（5）蒸気拡散法を介して、予め形成されたタンパク質結晶との複合体形成を可能にします。 - 前フラッシュ凍結液体窒素中にN-paratoneの液滴を含有するガラススライドにループ状に成形極低温管を用いて結晶を転送します。結晶上の急落により、N-paratone、急速にフラッシュ凍結で保護された結晶を選択してください液体窒素を含有するデュワーにループ。極低温トングを使って、ループ上に結晶をマウントします。
- 放射光を用いた単結晶のデータセットを収集します。公開された構造体20、24を用いて、分子置換を実行します。電子密度の非モデル化されたブロブによってタンパク質の結合部位の内側に、リガンドの存在を確認します。
- ループ状に成形極低温管を用いて結晶をピック（物質一覧を参照）、0.6 mLのマイクロ遠心チューブに配置します。乾燥を避け、結晶を維持するために、チューブに母液の50.0μLを追加します。
図5：T4リゾチーム変異体L99Aの原子モデルが電子密度との結合ポケット。結合部位における非モデル化された電子密度ブロブとA）L99A空洞。 B）二つの代替配座でモデル化azaborineリガンド5とL99Aキャビティ。 CLくださいこの図の拡大版を表示するには、こちらICK。
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Representative Results
1,2- azaborinesするための模式的な合成経路は、図1に示されています。このプロトコルは、5つの異なるホウ素 - 窒素含有分子の合成に適用されます。 図2は 、所望の生成物（3）の形成を監視するために、ステップ1.3の過程で測定された11 B NMRスペクトルを表します。タンパク質の精製は、低圧クロマトグラフィーシステムを用いて行った代表的なクロマトグラムを図3に示されています。集めた画分の純度は、SDS-PAGEによって決定しました。 T4リゾチーム変異体L99Aの結晶は、図4に示されています。 図5は、非モデル化された電子密度と結合したリガンド5と洗練後の結合空洞とL99A結合ポケットを示しています。
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Discussion
このプロトコルの最初の部分では、我々は以前に報告された方法12、13に基づいて、1,2- azaborinesの修正された合成を説明しました。 Triallylborane 22を準備するallyltriphenylスズやカリウムallyltrifluoroborateを使用して、ルートの代替として使用されたN -allyl- N -TBS- B -アリル塩化付加物（1）。この方法は、より多くの原子経済的で環境に優しいアプローチを可能にします。 N -TBS- B -Cl -1,2- azaborineの合成のために（3）、ワンポット二段階シーケンス（酸化続く閉環メタセシス）は、以前よりも高い、単離された収率をもたらした、使用されました中間体（2）（2工程にわたって52％対29％）の単離を含む方法。酸化工程の前に閉環生成物（但し、付加物の純度に応じて（1）、隔離真空蒸留を使用して必要になることがあります。この場合には、トルエンの代わりに溶媒としてジクロロメタンを使用して蒸留前に揮発性物質を除去するための時間が短縮される。）、酸化ステップ中11 B NMR（ 図2）の監視も、この中で使用されるのPd / Cの合計量が減少する利点反応（15モル％対7モル％）。
N -H- Bのエチル-1,2- azaborine（5）の合成は、クロム錯体を使用する必要が以前に報告された多段階のシーケンス16の代わりに、エチルリチウムを用いて、4から二段階で達成しました。アイソレーションは、製品の揮発性のために正確な温度制御と減衰真空操作を必要としました。このプロトコルで提示技術はまた、他の揮発性化合物の精製に適用することができます。
第二部では、タンパク質精製および結晶複合体形成を示しましたT4リゾチーム変異体L99AおよびL99A / M102Qの。所望のタンパク質の単離を与え、化学的細胞溶解に続いて、IPTGを用いて大腸菌 RR1株と誘導における標準的なタンパク質の発現、。各ステップの成功を確認するか、または失敗したプロセスを識別するために、タンパク質発現および細胞溶解後にSDS-PAGEを実行することをお勧めします。 L99AのT4リゾチームの場合、発現されたタンパク質は、細菌細胞を溶解するために、その活動に上清およびペレットの両方で見つけることができます。この場合には、上清中のタンパク質を、20mMリン酸ナトリウム緩衝液に対して透析することができ、カラム精製のために細胞溶解からの溶解物と組み合わせます。誘導条件（37℃で2〜3時間に21時間〜25℃）より高い温度およびより短い時間に調整することができます。細胞溶解はまた、過熱を防止するために氷浴で超音波処理を用いて行うことができます。 300mMのNaClの直線勾配でカルボイオン交換カラムは、タンパク質精製のために使用しました。唯一の> 95％の純粋な（Sに基づいて、DS-PAGE）のタンパク質画分を回収し、タンパク質の結晶化に使用しました。
透析したタンパク質を、タンパク質溶液、2-メルカプトエタノールを添加（最終濃度5mM）（ステップ2.2.2）を濃縮する前に、特に高いで容易に沈殿する傾向がL99A / M102Qタンパク質について、その自発的な沈殿を防止する必要がありました濃度。 5を有するタンパク質複合体形成は、空気を含まない雰囲気を必要に応じて、タンパク質-リガンド複合体は、グローブボックス中で調製しました。キャビティbearingT4リゾチーム変異体：本プロトコルで調製された材料は、生体モデル系中の1,2- azaborinesの結合研究に使用しました。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetrahydrofuran (THF), inhibitor-free, for HPLC, ≥99.9% | Sigma Aldrich | 34865 | |
| Diethyl ether (Et2O), for HPLC, ≥99.9%, inhibitor-free | Sigma Aldrich | 309966 | |
| Methylene chloride (CH2Cl2), (Stabilized/Certified ACS) | Fisher | D37-20 | |
| Toluene | Fisher | T290-4 | |
| Pentane, HPLC | Fisher | P399-4 | |
| Acetonitrile | Fisher | A21-4 | |
| Calcium hydride (CaH2), reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 208027 | Pyrophoric |
| Palladium on activated carbon (Pd/C), 10 wt% Pd | Strem | 46-1900 | |
| 1.0 M Boron trichloride solution in hexane | Sigma Aldrich | 211249 | Highly toxic/Pyrophoric |
| Triethylamine, ≥99.5% | Sigma Aldrich | 471283 | |
| Grubbs 1st generation catalyst | materia | C823 | |
| Acetamide | Sigma Aldrich | A0500 | |
| n-Butanol, anhydrous, 99.8% | Sigma Aldrich | 281549 | |
| Ethyllithium solution, 0.5 M in benzene/cyclohexane | Sigma Aldrich | 561452 | Highly toxic/ Pyrophoric |
| HCl solution, 2.0 M in Et2O | Sigma Aldrich | 455180 | |
| 2-Methylbutane, anhydrous, ≥99% | Sigma Aldrich | 277258 | |
| Escherichia coli, (Migula) Castellani and Chalmers (ATCC® 31343™) | ATCC | 31343 | |
| T4 lysozyme WT* (L99A) | Addgene | 18476 | |
| T4 lysozyme mutant (S38D L99A M102Q N144D) | Addgene | 18477 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A0166 | |
| isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Invitrogen | AM9464 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | Fisher | BP329 | |
| Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher | BP332 | |
| Sodium chloride | Fisher | S642212 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher | BP118 | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M4880 | Corrosive |
| Thermo scientific pierce DNaseI | Fisher | PI-90083 | |
| GE Healthcare Sepharose Fast Flow Cation Exchange Media | Fisher | 45-002-931 | |
| Tris-base | Fisher | BP152-500 | |
| Sodium azide | TCI | S0489 | Highly toxic |
| 2-Mercaptoethanol | Fisher | ICN806443 | |
| Sartorius Vivaspin 20 Centrifugal Concentrators | Fisher | 14-558-501 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5379 | |
| 2-Hydroxyethyl disulfide | Sigma Aldrich | 380474 | |
| N-paratone | Hampton Research | HR2-643 | |
| 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO | Fisher | 08-667E | |
| CryoLoop | Hampton Research | cryogenic tubing shaped into a loop | |
| CryoTong | Thermo Fisher | cryogenic tong | |
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References
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