Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Syntese av 1,2-Azaborines og utarbeidelse av deres protein komplekser med T4 Lysozyme Mutants

Published: March 25, 2017 doi: 10.3791/55154
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry, Boston College

Introduction

Boron-nitrogenholdig heterosykler (dvs. 1,2-azaborines) har nylig trukket betydelig oppmerksomhet som isosterer av Arenes. Dette isosterism kan føre til spredning av de eksisterende strukturelle motiver for å utvide den kjemiske rommet 2, 3, 4. Azaborines har potensiell anvendelse for anvendelse i biomedisinsk forskning 5, 6, 7, 8, spesielt i området medisinsk kjemi som kjemikere gjennomføre syntese av biblioteker av strukturelt og funksjonelt relevante molekyler. Signifikant, men mens det finnes mange godt utviklede synteseveier til tilgjengelige Arene-inneholdende molekyler, har bare et begrenset antall fremgangsmåter for syntese av azaborines blitt rapportert 9, 10, 11, 12, 13. Dette er hovedsakelig på grunn av et begrenset antall alternativer for bor kilden og luft- og fukt sensitiv karakter av molekylet i den tidlige fasen av syntetisk sekvens.

I den første delen av denne artikkelen vil vi beskrive en fler gram skala syntese av N -TBS- B-Cl-1,2-azaborine (3) ved anvendelse av standard luftfrie teknikker. Denne forbindelsen virker som et allsidig mellomprodukt som kan bli ytterligere funksjonalisert for å strukturelt mer komplekse molekyler, 14 15. Å starte fra 3, vil syntese og rensing av N -H- B-etyl-1,2-azaborine (5) for bruk i proteinbindingsstudier beskrives. På grunn av volatiliteten av 5, krever sin effektiv isolering nøyaktig kontroll av reaksjonstemperatur, tid og distillation forhold.

I den andre delen, protokoller for protein ekspresjon og isolering av T4 lysozym mutanter (L99A og L99A / M102Q) 17, 18, 19, 20 vil bli presentert, etterfulgt av krystallisering protein og fremstilling av protein-ligand-krystall-komplekser. T4 lysozym mutanter L99A og L99A / M102Q ble valgt som biologiske modellsystemer for å undersøke hydrogenbinding evnen til NH inneholder azaborine molekyler 17. Ved hjelp av en standard molekylærbiologi-protokollen, er proteinet uttrykt i Escherichia coli RR1-stamme og indusert med isopropyl-β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG). Proteinrensing utføres ved anvendelse av ionebytte-kolonnekromatografi. Protein krystallisering utføres med sterkt konsentrert renset proteinløsning (> 95% renhet ved gelelektroforese) ved hjelp av opphengsslippe damp diffusjon metode. På grunn av følsomheten av denne studien er ligander til oksygen, blir protein-ligand-kompleksene fremstilt i henhold til luftfrie betingelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Alle oksygen- og fuktfølsomme manipulasjoner ble utført under en inert atmosfære (N 2) med enten standard luftfritt teknikker eller en hanskerommet. THF (tetrahydrofuran), Et 2 O (dietyleter), CH 2Cl 2 (diklormetan), toluen og pentan ble renset ved føring gjennom en nøytral aluminiumoksyd-kolonne under argon. Acetonitril ble tørket over CaH 2 (kalsiumhydrid) og destilleres under nitrogenatmosfære før bruk. Pd / C (palladium på karbon) ble oppvarmet under høyvakuum ved 100 ° C i 12 timer før bruk. Silikagel (230-400 mesh) ble tørket i 12 timer ved 180 ° C under høyt vakuum. Flashkromatografi ble utført med dette kiselgel under en inert atmosfære. Alle andre kjemikalier og oppløsningsmidler ble kjøpt og anvendt som mottatt.

MERK: Forsiktig, ta kontakt med alle relevante sikkerhetsdatablad (MSDS) før bruk. Flere av kjemikaliene som brukes i syntesen enre akutt giftig og kreftfremkallende.

1. Utarbeidelse av 1,2-Azaborines

MERK: Karakterisering data av alle forbindelser i denne studien har tidligere blitt rapportert 12, 13, 16.

Figur 1
Figur 1: Syntetisk ordningen med 1,2-azaborines. Detaljerte protokoller for syntese av hver forbindelse (1-5) er beskrevet i protokollen delen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Fremstilling av N -allyl- N -TBS- B allyl kloridadduktet (1)
    1. I et hanskerom, måle ut 6,70 g (50,0 mmol) triallylborane 22 inn i en ovn-tørket 24/40 1 L rundkolbe utstyrt med en rørestav og tilsett 250 ml diklormetan. Forsegl kolben med et gummiseptum. Utenfor boksen, avkjøl løsningen til -78 ° C under en nitrogenatmosfære på et vakuumgassmanifold.
    2. Tilsett 100 ml av 1,00 M bortriklorid oppløsning (100 mmol) i heksan, og det triallylborane oppløsningen ved -78 ° C via en kanyle overføring. La reaksjonsblandingen røre ved denne temperaturen i 4 timer.
      MERK: Forsiktig, er svært reaktive med vann bortriklorid.
    3. I en separat 100 ml kolbe, måle ut 25,7 g N - (t-butyldimetylsilyl) - N -allylamin (150 mmol) og tilsett 20,0 ml diklormetan. Til en l reaksjonskolben, legge til denne løsning via kanyle overføring holdt reaksjonstemperaturen ved -78 ° C.
    4. Legg 21,0 ml trietylamin (150 mmol) til reaksjonsblandingen. Oppretthold omrøring under en positiv strøm av nitrogen og la det gradvis varme til room temperaturen over natten.
    5. Etter 18 timers omrøring, fjerner omtrent halvparten av oppløsningsmidlet gjennom en vakuumgassmanifold ved bruk av høyt vakuum (300-500 mTorr) med en flytende nitrogenfelle.
    6. Ta reaksjonskolben inn i en hanskeboks, og filtrere fra det hvite saltet som dannes i reaksjonsblandingen gjennom en ovnstørket middels porøs fritte er utstyrt med en 24/40 vakuum-adapter og en 24/40 500 ml rundbunnet kolbe med en røre bar. Bruke diklormetan til å overføre alle de gjenværende materialer.
    7. Fjern alle de gjenværende flyktige stoffer fra filtratet utenfor boksen med et vakuum gassmanifold med høyt vakuum.
    8. I en hanskeboks, overfører den konsentrerte reaksjonsblandingen inn i en ovn-tørket 14/20 100 mL rundbunnet kolbe med en rørestav for å forberede for destillasjon. Cap kolben med et septum.
    9. Under en strøm av nitrogen, åpnes septum og tilsett 200 mg kalsium-hydrid som et tørkemiddel.
    10. Sett opp destillasjonsapparatet ved å montere en ovntørket 14/20 destillasjon hode festet med et termometer, en side med en mottaker 14/20 50 ml luftfritt lagring kolbe, og den andre siden med den 100 ml kolbe inneholdende råproduktet. Utstyre destillasjon hodet med kaldt vann. (Bruk fett for alle leddene i destillasjonsapparatet.)
      MERK: Produktet begynner å destillere når dampen temperaturen når 60 ° C ved 300 mTorr.
    11. Fortsette å samle produktet ved å heve temperaturen av oljebadet inntil destillasjonshode termometeret leser 75 ° C.
      MERK: Produktet er en klar, fargeløs væske.
    12. Stopp destillasjon ved å fjerne varmekilden og kjøle apparatet til romtemperatur før lagring. Ved avkjøling, settes under apparaturen med nitrogen og tett lukke pluggventilen på den luftfrie lagring kolbe. Oppbevar isolerte produkt i en hanskeboks fryser.
      MERK: Avkastningen kan variere fra 65% til 84%.
  2. Fremstilling av N B-Cl ring lukket produkt (2)
    1. I et hanskerom, måle ut 56,0 g N -allyl- N -TBS- B allyl kloridadduktet (1) (217 mmol) i en ovn-tørket 24/40 1 L rundkolbe med en rørepinne og legge til 500 ml toluen.
    2. Mål opp 1,79 g Grubbs 1. generasjon katalysator (2,17 mmol).
    3. Tilsett katalysatorporsjonsvis til den omrørte oppløsning av en ved værelsestemperatur i en hanskeboks. Rens boksen under tilsetningen for å fjerne etylengass som dannes fra reaksjonen.
      MERK: Reaksjonen er vanligvis fullstendig i løpet av 30 min av opphør av gassutviklingen. Som en annen indikator på fullføring, vil reaksjonen farge har helt forandret fra sin opprinnelige lilla til brun. På dette punktet, kan produktet bli isolert ved anvendelse av vakuum-destillasjon; se referanse 12 for detaljer. I denne protokollen, er en én-pot, to-trinns fremgangsmåten for den direkte syntese av 3 rives.
    4. Fremstilling av N -TBS- B-Cl-1,2-azaborine (3)
      1. Til reaksjonsløsningen av ringlukkede produkt (2) i toluen, tilsett 14,0 g palladium på karbon (10 vekt% Pd, 13,2 mmol).
      2. Fjern kolben fra boksen og passer det med en ovnstørket 24/40 tilbakeløpskjøler som har blitt spylt med nitrogen og utstyrt med avkjølt vann.
      3. Oppvarm reaksjonsblandingen ved hjelp av et oljebad til en kraftig tilbakeløp ved 135 ° C under omrøring.
      4. Etter å ha holdt ved tilbakeløp i 16 timer, avkjøles reaksjonsblandingen ved å fjerne flasken fra oljebadet. Etter avkjøling til romtemperatur, ta ut en 0,5 ml alikvot fra reaksjonsblandingen ved hjelp av en sprøyte utstyrt med en ovnstørket Luer-lock nål. Overfør 0,5 ml delmengde til en skrue-top NMR rør for å analysere via 11 B NMR 12.
        MERK: Det ønskede produkt peak vises på ca. 35,5 ppm 12, mens utgangs material peak vises ca. 42.9 ppm 12. Vanligvis på dette punktet 11 B NMR indikerer at reaksjonen er ufullstendig, med gjenværende en mindre startmateriale topp.
      5. Hvis reaksjonen er ufullstendig, bringe reaksjonskolben inn i en hanskeboks og tilsett ytterligere 3,00 g palladium på karbon (10 vekt% Pd, 2,82 mmol).
      6. Resubject reaksjonsblandingen til tilbakeløp betingelser som beskrevet i 1.3.2 og 1.3.3.
      7. Etter ytterligere 24 timer ved tilbakeløp, analysere en annen alikvot av reaksjonen ved 11 B NMR. På dette punktet, bør reaksjonen være fullstendig.
      8. Overfør reaksjonskolben til hanskerommet og passerer reaksjonsblandingen gjennom en engangs flash-kromatografikolonne pakket med papirhåndklær. Samle filtratet ved vasking med 50,0 ml toluen.
      9. Fjern alle de flyktige fra filtratet utenfor boksen på et vakuum gassmanifold utstyrt med høyt vakuum.
        MERK: Fjerning av de flyktige kan ta 40 min to 90 min avhengig av vakuumtrykk. Når vakuummåleren viser maksimalt trykk, betyr det at fjerningen av oppløsningsmidlet er fullført. Mens fjerning løsemiddel, sørg for at vannbadet under kolben forblir i romtemperatur for varmespredning.
      10. I en hanskeboks, overfører den konsentrerte reaksjonsblandingen inn i en ovn-tørket 24/40 250 mL rundbunnet kolbe med en rørestav. Cap kolben med et septum.
      11. Raskt fjerne septum og legge til 200 mg kalsium hydrid som et tørkemiddel.
      12. Sett opp destillasjonsapparatet ved å montere en ovnstørket 24/40 destillasjon hode festet med et termometer, en side med en mottaker 24/40 100 ml luftfritt lagring kolbe, og den andre siden med den 100 ml kolbe inneholdende råproduktet. Utstyre destillasjon hodet med kaldt vann. Bruk fett for alle leddene i destillasjonsapparatet.
        Merk Produktet begynner å destillere når damptemperaturen når 65 til 70 ° C ved 1000 mTorr med en oljebadetemperatur mellom 90-100 ° C. Produktet er en klar, fargeløs væske.
      13. Stopp destillasjon ved å fjerne varmekilden og kjøle apparatet til romtemperatur før lagring. Ved avkjøling, settes under apparaturen med nitrogen og tett lukke pluggventilen på den luftfrie lagring kolbe. Oppbevar isolerte produkt i en hanskeboks fryser ved -30 ° C.
        MERK: Avkastningen for one-pot, to-trinns prosedyre er 52%.

    Figur 2
    Figur 2: 11 B NMR-spektra for å overvåke dannelsen av N -TBS- B-Cl-1,2-azaborine (3). A) N -Allyl- N -TBS-B-allylklorid addukt (1), Utgangsmaterialet for ring lukking metatese. B) Oksidasjon etter 16 timer. (Ureagert N -TBS- B-Cl ring lukket produkt (2) og isomerisert B -vinyl ring-lukkede produkt (2 ') sammen med N-TBS-B-Cl-1,2-azaborine (3) er vist.) C) Oksidasjon etter ytterligere 24 timer. D) Isolert produkt (3) etter rensing ved vakuum-destillasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    1. Fremstilling av N -H- B -OBu-1,2-azaborine (4)
      1. I et hanskerom, måle ut 4,00 g N- TBS -B- Cl-1,2-azaborine (3) (17,6 mmol) i en ovn-tørket 100 ml rundbunnet kolbe med en rørestav og tilsett 35 ml acetonitril. Måle ut 1,14 g acetamid (19,3 mmol) og overføre til reaksjonskolben. Forsegl kolben med et gummiseptum.
      2. Fjern reaksjonskolben fra boksen og passe med en oven tørket 24/40 tilbakeløpskjøler som har blitt spylt med nitrogen og utstyrt med avkjølt vann.
      3. Oppvarm reaksjonsblandingen til tilbakeløp ved 85 ° C i et oljebad under omrøring.
      4. Etter 3 timer ved tilbakeløp, avkjøles reaksjonsblandingen ved å fjerne flasken fra oljebadet. Etter avkjøling til romtemperatur, fjernes løsningsmidlet på en vakuumgassmanifold utstyrt med høyt vakuum.
      5. Etter fjerning av de flyktige stoffene under vakuum, gjenoppløse reaksjonen residuet i 15,0 ml THF. Tilsett til denne oppløsning 3,21 ml n-butanol (35,1 mmol).
      6. Omrør reaksjonsblandingen ved romtemperatur i 1 time.
      7. Fjern løsningsmidlet på en vakuumgassmanifold utstyrt med høyt vakuum for å oppnå råproduktet.
      8. I en hanskeboks, isolere produktet ved hjelp av silikagel-kolonnekromatografi ved anvendelse av en blanding av pentan og dietyleter (5: 1) som elueringsmiddel. Fjerne flyktige bestanddeler fra de produktholdige fraksjoner ved hjelp av en vakuumgassmanifold utstyrt med høyt vakuum for å oppnå det rene produkt somet hvitt, fast stoff.
        MERK: Avkastningen kan variere fra 82% til 87%.
    2. Fremstilling av N -H- B-etyl-1,2-azaborine (5)
      1. I en hanskeboks, måle ut 1,00 g N-H -B- OBu-1,2-azaborine (4) (6,62 mmol) i en ovn-tørket 100 ml rundbunnet kolbe med en rørestav og tilsett 25 ml Et2 O. Seal kolben med et gummiseptum og plasser under N2 på et vakuumgassmanifold.
      2. I en separat ovn-tørket 100 ml rundbunnet flaske, tilsett 26,5 ml etyl-litium-løsning (0,5 M i benzen / cykloheksan, 13,2 mmol) under nitrogenatmosfære. Fjern blandingen av løsningsmiddel (benzen / cykloheksan) fra etyl-litium-reagens for å unngå problemer med å isolere det ønskede produkt azaborine. Gjenoppløse solid etyllitium i 13,0 ml Et 2 O.
        MERK: Forsiktig: organolitiumreagenser er pyrofort (antennelig ved kontakt med luft eller vann). Det ønskede produkt (5
      3. Avkjøl reaksjonskolben inneholdende 4 til -30 ° C med et kjølebad.
      4. Tilsett etyl-litium-løsning til reaksjonskolben via en kanyle overføring ved -30 ° C. Hold omrøring ved denne temperatur i 1 time og lar det langsomt oppvarmes til romtemperatur.
      5. Overvåk reaksjonen ved 11 B NMR. (Det ønskede mellomproduktet topp vises ved ca. 39,8 ppm).
      6. Etter ferdig reaksjon avkjøles reaksjonsblandingen til -30 ° C og tilsett 6,62 ml HCl-oppløsning (2,0 M i Et2 O, 13,2 mmol). Omrør reaksjonsblandingen i 1 time mens den får langsomt oppvarmes til romtemperatur.
      7. Fjern løsningsmidlet på en vakuumgassmanifold utstyrt med lavt vakuum (20-25 Torr) for å oppnå den urene produktblanding.
      8. I et hanskerom,isolere produktet ved hjelp av silikagel kolonnekromatografi under anvendelse av 2-metylbutan som elueringsmiddel. Fjern flyktig på en vakuummanifold gass utstyrt med et svekket vakuum under dannelse av det rene produkt som en fargeløs væske.
        MERK: Utbyttet er 56%.

    2. Protein Utarbeidelse og Krystallisering av T4 Lysozyme Mutants

    1. Protein uttrykk og rensing
      1. Dyrke E. coli RR1 celler transformert med plasmidene subklonet (L99A eller L99A / M102Q) 17, 20 i 200 ml LB (lysogeni buljong) medier supplert med 40,0 mg ampicillin ved 37 ° C i 12 timer.
        MERK: Sammensetningen av LB-medium er 12 g trypton, 5 g gjærekstrakt, 10 g natriumklorid, og 1 g glukose per en LH 2 O.
      2. Inokuler 4,00 L LB-medium (supplert med 800 mg ampicillin) med 160 ml av over natten-kulturen og inkuber ved 37 ° C ved 240 rpm med en filtered lufttilførsel.
      3. Når optisk tetthet når 0,7 ved 600 nm, kjøle bakteriekultur til romtemperatur ved å fjerne den fra inkubatoren.
      4. Mål ut 695 mg isopropyl-β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) (sluttkonsentrasjon på 0,7 mM) i et konisk rør sentrifugering og tilsett 4 ml LB-medier for å oppløse.
      5. Tilsett IPTG løsning til kulturen for å indusere proteinekspresjon. Inkuber kulturene ved 110 rpm i 21 timer ved 25 ° C.
      6. Sentrifuger kulturen ved 4412 xg i 30 min ved 4 ° C. Kast supernatanten og resuspender pelleten i 300 ml 0,1 M natriumfosfat (pH 6,6), 0,2 M NaCl og tilsett 30,0 ml 0,5 M etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) (pH 8,0). Rør suspensjon i 17 timer ved 4 ° C.
      7. Legge til 30,0 ml 1,0 M MgCl2 og 0,500 ml deoksyribonuklease I (DNase I) til suspensjonen og omrørt ved romtemperatur i 8 timer.
      8. Sentrifuger den lyserte cellesuspensjonen ved 30 913 xg i 30 min ved 4 76; C. Samle supernatanten inneholdende uttrykte protein og kast pellet.
      9. Dialyser lysatet mot 20 mM natriumfosfat (pH 6,5 for L99A og pH 6,3 for L99A / M102Q) ved 4 ° C over natten.
      10. Vask og likevekt 20,0 ml av karboksymetylgrupper ionebytterperler med ekvilibreringsbuffer (50 mM Tris, 1 mM EDTA (pH 7,3)) i en kolonne. Installering av oppløsningen inneholdende proteinet på perlene og vasker kolonnen med 100 ml ekvilibreringsbuffer. Eluer kolonnen med en 600 ml lineær gradient av 300 mM NaCl i ekvilibreringsbuffer.
      11. Bruke en lav-trykk kromatografi-system for kolonnerensing av. Bruke en pumperate på 1 ml / min, og samle fraksjoner på 10 ml. Samle fraksjonene inneholdende rent protein.
        MERK: Under eluering, overvåke den optiske densitet (OD) ved 280 nm for å bekrefte tilstedeværelsen av proteinet. Bestemme renheten av hver fraksjon ved hjelp av SDS-PAGE og samle bare de reneste fraksjonene.
    "Fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 1
    Figur 3: Representative resultater for protein rensing av T4 lysozym mutant L99A / M102Q. A) kromatogram som viser den målte UV absorbans i AU ved 280 nm (blå linje) og ledningsevne i mS / cm (rød linje). Fraksjoner 20-23 ble kombinert, og renhet ble bestemt ved hjelp av SDS-PAGE. B) 15% SDS-PAGE-gel som viser nærvær av renset protein fra fraksjonene 20-23 ved 18,6 kDa. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    1. protein krystallisering
      1. Overfør den rensede proteinoppløsning til en dialysemembran røret (12 000 til 14 000 MWCO). Plasser dialyserøret inn i et beger inneholdende 4,00 liter 100 mM natriumfosfat, 550 mM NaCl, 0,02% NaN3 (pH 6,5 for L99A og pH 6,3 for L99A / M102). Rør i 4 l løsning over natten ved 4 ° C.
      2. Tilsett 2-merkaptoetanol (endelig konsentrasjon på 5 mM) til den dialyserte prøven og konsentrer til ~ 40,0 mg / ml ved anvendelse av en sentrifuge-konsentrator (10 000 MWCO). Bestem proteinkonsentrasjonen ved å måle absorpsjonen ved 280 nm. Fjerne eventuelt bunnfall ved å spinne før krystallisering.
      3. Bruk av damp-diffusjon hengende dråpemetode for protein krystallisering. Bland 5,00 mL av den konsentrerte proteinoppløsning med 5,00 mL av forrådsløsningen (2,0 til 2,2 M natrium / kaliumfosfat, pH 6,7 til 7,1, 50 mM 2-merkaptoetanol, 50 mM 2-hydroksyetyldisulfid) på et silikonbehandlet glassdeksel lysbilde.
      4. Ekvilibrer blandingen fallet mot 1,00 mL av forrådsløsningen ved å plassere dekselet sleiden opp-ned på toppen av hver brønn inneholdende reservoar løsning. Bruk fett for tett å forsegle hver brønn med sleiden. Sette opp forskjellige betingelser under anvendelse av en 24-brønners plate med reservoarløsningen ble nevnt i 2.2.3.Oppbevar platen ved 4 ° C for krystallvekst.
        MERK: Krystaller normalt vokse innen 1-2 uker i likevekt buffer på omslaget lysbildet. Umiddelbar utfelling under blanding proteinløsning med reservoaret oppløsningen i trinn 2.2.3 indikerer svikt av krystallisering.

    Figur 4
    Figur 4: Representant bilde av krystaller av T4 lysozym mutant L99A før kompleks med ligander. Krystaller er i moderluten (2,1 M natrium / kaliumfosfat, pH 6,9, 50 mM 2-merkaptoetanol, 50 mM 2-hydroksyetyl ​​disulfid). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    1. Complex forberedelse
      1. Plukk krystaller ved hjelp av en kryogenisk slange formet i en løkke (se Materialer List) ogplassere dem i et 0,6 ml mikrosentrifugerør. Legg 50,0 mL av moderluten til røret for å unngå tørrhet og bevare krystaller.
        MERK: Single krystall utvalg er hjulpet ved hjelp av et mikroskop.
      2. Overfør røret som inneholder krystaller i en hanskerommet. Ta 5,00 mL av azaborine ligand (5) og sted inne i snap-cap av røret. Cap og lagre røret i kjøleskap (4 ° C) inne i hanskerommet for 2-7 dager for likevekt av damp diffusjon.
        MERK: Den fysiske egenskaper (høy volatilitet og løselighet i vandig oppløsning) av azaborine ligand (5) gjør det mulig for kompleks med prefabrikkerte proteinkrystaller via damp diffusjon metode.
      3. Overfør krystaller ved hjelp av en kryogenisk slange formet i en løkke til en glassplate som inneholder en dråpe med N-paratone før flash-frysing i flytende nitrogen. Plukk det krystall beskyttet med N-paratone og raskt flash-fryse ved stuper krystall påsløyfe inn i en Dewar-inneholdende flytende nitrogen. Montere krystallen på sløyfen ved hjelp av en kryogen tang.
      4. Samle datasett for en enkelt krystall ved hjelp av synkrotron stråling. Utføre molekylær utskiftning ved bruk av publiserte strukturene 20, 24; bekrefte eksistensen av liganden inne proteinbindingssetet ved hjelp av en u-formet kvikksølvdråpe elektrontetthet.

    Figur 5
    Figur 5: Atomic modeller av T4 lysozyme mutant L99A bindende lomme med elektrontettheten. A) L99A hulrom med en u-formet elektrontetthet klumpen i bindingssetet. B) L99A hulrom med den modellerte azaborine ligand 5 i to alternative konformere. Vennligst click her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den skjematiske synteserute for 1,2-azaborines er vist i figur 1. Denne protokollen gjelder syntesen av fem forskjellige bor-nitrogen-inneholdende molekyler. Figur 2 representerer 11 B NMR-spektra målt i løpet av trinnet 1,3 for å overvåke dannelsen av det ønskede produkt (3). Proteinrensing ble utført ved hjelp av lav-trykk kromatografi-system og et representativt kromatogram er vist i figur 3. Renheten av de oppsamlede fraksjonene ble bestemt ved hjelp av SDS-PAGE. Krystaller av T4 lysozyme mutant L99A er avbildet i figur 4. Figur 5 viser den L99A bindende lomme med un-modellerte elektrontettheten og bindingen hulrommet etter avgrensning med liganden 5 bundet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I den første delen av denne protokollen, beskrev vi en modifisert syntese av 1,2-azaborines basert på tidligere rapporterte fremgangsmåter 12, 13. Triallylborane 22 ble brukt som en erstatning for de ruter ved hjelp av allyltriphenyl tinn eller kalium allyltrifluoroborate for å fremstille N -allyl- N -TBS- B -allyl kloridadduktet (1). Denne metoden gir en mer atom-økonomisk og miljøvennlig måte. For syntese av N -TBS- B-Cl-1,2-azaborine (3), ble en ett-pot, to-trinns-sekvens (ring avsluttes metatese, etterfulgt av oksydasjon) anvendt, noe som resulterte i høyere isolert utbytte enn tidligere Fremgangsmåten måten~~POS=HEADCOMP omfatter isolering av mellomproduktet (2) (52% vs. 29% over to trinn). (Imidlertid, avhengig av renheten av adduktet (1), isolering av det ringlukkede produkt før oksidasjonstrinnetkan være nødvendig ved hjelp av vakuumdestillasjon. I dette tilfellet, under anvendelse av diklormetan som løsningsmiddel i stedet for toluen reduserer tiden for fjerning av flyktige forbindelser forut for destillasjon.) Kontroll 11 B NMR (figur 2) under oksidasjonstrinnet også fordeler i reduksjon i de totale mengder av Pd / C som brukes i denne reaksjonen (7 mol% vs 15 mol%).

Syntese av N -H- B-etyl-1,2-azaborine (5) ble oppnådd i to trinn fra 4 under anvendelse av etyl-litium i stedet for den tidligere rapportert flertrinns-sekvens 16 som kreves for bruk av en kromkompleks. Isolasjon kreves nøyaktig temperaturkontroll og svekket vakuum manipulasjon grunn av volatiliteten i produktet. Teknikkene som presenteres i denne protokollen kan også brukes til rensing av andre flyktige forbindelser.

I den andre delen, viste vi protein rensing og krystallkompleksT4 lysozym mutanter L99A og L99A / M102Q. En standard protein ekspresjon i E. coli RR1-stamme og induksjon ved hjelp av IPTG, etterfulgt av kjemisk cellelyse ga isolering av det ønskede protein. Det anbefales å kjøre SDS-PAGE etter protein uttrykk og cellelyse for å bekrefte suksess for hvert trinn eller identifisere den mislykkede prosessen. For L99A T4 lysozyme, kan det uttrykte protein som finnes i både supernatant og pellet på grunn av sin aktivitet å lysere bakterieceller. I dette tilfellet kan proteinet i supernatanten dialyseres mot 20 mM natriumfosfat-buffer og kombinert med lysat fra cellelyse for kolonnerensing. Induksjonsforhold kan justeres til høyere temperatur og kortere tid (fra 21 timer ved 25 ° C i 2-3 timer ved 37 ° C). Cellelyse kan også utføres ved hjelp av ultralydbehandling med et isbad for å hindre overoppheting. Carboxymethyl ionebytterkolonne med en 300 mM NaCl lineær gradient ble anvendt for proteinrensing. Kun> 95% rent (basert på SDS-PAGE) proteinfraksjoner ble samlet og anvendt i protein krystallisering.

Forut for konsentrering av protein-løsning, tilsetning av 2-merkaptoetanol (endelig konsentrasjon på 5 mM) (trinn 2.2.2) til den dialyserte proteinet var nødvendig for å hindre at den spontane utfelling, spesielt for L99A / M102Q-protein som har en tendens til å utfelles lett ved høy konsentrasjon. Som protein kompleksering med 5 kreves en luft-fri atmosfære, ble protein-ligand-kompleks fremstilt i en hanskeboks. Materialene fremstilt på denne protokollen ble anvendt i bindingsstudier av 1,2-azaborines i et biologisk system modell: hulrom-bearingT4 lysozym mutanter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tetrahydrofuran (THF), inhibitor-free, for HPLC, ≥99.9% Sigma Aldrich 34865
Diethyl ether (Et2O), for HPLC, ≥99.9%, inhibitor-free Sigma Aldrich 309966
Methylene chloride  (CH2Cl2), (Stabilized/Certified ACS) Fisher D37-20
Toluene Fisher T290-4
Pentane, HPLC Fisher P399-4
Acetonitrile Fisher A21-4
Calcium hydride (CaH2), reagent grade, 95% Sigma Aldrich 208027 Pyrophoric
Palladium on activated carbon (Pd/C), 10 wt% Pd Strem 46-1900
1.0 M Boron trichloride solution in hexane Sigma Aldrich 211249 Highly toxic/Pyrophoric
Triethylamine, ≥99.5% Sigma Aldrich 471283
Grubbs 1st generation catalyst  materia C823
Acetamide Sigma Aldrich A0500
n-Butanol, anhydrous, 99.8% Sigma Aldrich 281549
Ethyllithium solution, 0.5 M in benzene/cyclohexane Sigma Aldrich 561452 Highly toxic/ Pyrophoric
HCl solution, 2.0 M in Et2O Sigma Aldrich 455180
2-Methylbutane, anhydrous, ≥99% Sigma Aldrich 277258
Escherichia coli, (Migula) Castellani and Chalmers (ATCC® 31343™) ATCC 31343
T4 lysozyme WT* (L99A) Addgene 18476
T4 lysozyme mutant (S38D L99A M102Q N144D) Addgene 18477
Ampicillin sodium salt Sigma Aldrich A0166
isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  Invitrogen AM9464
Sodium phosphate monobasic anhydrous Fisher BP329
Sodium Phosphate dibasic anhydrous Fisher BP332
Sodium chloride Fisher S642212 
Ethylenediaminetetraacetic acid Fisher BP118
Magnesium chloride Sigma Aldrich M4880 Corrosive
Thermo scientific pierce DNaseI Fisher PI-90083
GE Healthcare Sepharose Fast Flow Cation Exchange Media Fisher 45-002-931
Tris-base Fisher BP152-500 
Sodium azide TCI S0489 Highly toxic
2-Mercaptoethanol Fisher ICN806443 
Sartorius Vivaspin 20 Centrifugal Concentrators Fisher 14-558-501
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P5379
2-Hydroxyethyl disulfide Sigma Aldrich 380474
N-paratone  Hampton Research HR2-643
4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO  Fisher 08-667E
 CryoLoop Hampton Research cryogenic tubing shaped into a loop
CryoTong Thermo Fisher cryogenic tong
Coot Electron density images are generated from the software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ducruix, A., Giége, R. Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach. , IRL Press. Oxford, UK, New York. (1992).
  2. Bosdet, M. J. D., Piers, W. E. B-N as a C-C substitute in aromatic systems. Can. J. Chem. 87 (1), 8-29 (2009).
  3. Campbell, P. G., Marwitz, A. J., Liu, S. -Y. Recent Advances in Azaborine Chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 51 (25), 6074-6092 (2012).
  4. Wang, X. -Y., Wang, J. -Y., Pei, J. B. N. Heterosuperbenzenes: Synthesis and Properties. Chem. Eur. J. 21 (9), 3528-3539 (2015).
  5. Zhou, H. -B., et al. Elemental isomerism: a boron-nitrogen surrogate for a carbon-carbon double bond increases the chemical diversity of estrogen receptor ligands. Chem. Biol. 14 (6), 659-669 (2007).
  6. Ito, H., Yumura, K., Saigo, K. Synthesis, characterization, and binding property of isoelectronic analogues of nucleobases, B(6)-substituted 5-aza-6-borauracils and -thymines. Org. Lett. 12 (15), 3386-3389 (2010).
  7. Vlasceanu, A., Jessing, M., Kilburn, J. P. BN/CC isosterism in borazaronaphthalenes towards phosphodiesterase 10A (PDE10A) inhibitors. Bioorg. Med. Chem. 23 (15), 4453-4461 (2015).
  8. Rombouts, F. J., Tovar, F., Austin, N., Tresadern, G., Trabanco, A. A. Benzazaborinines as Novel Bioisosteric Replacements of Naphthalene: Propranolol as an Example. J. Med. Chem. 58 (23), 9287-9295 (2015).
  9. Culling, G. C., Dewar, M. J. S., Marr, P. A. New Heteroaromatic Compounds. XXIII. Two Analogs of Triphenylene and a Possible Route to Borazarene. J. Am. Chem. Soc. 86 (6), 1125-1127 (1964).
  10. White, D. G. 2-Phenyl-2,1-borazarene and Derivatives of 1,2-Azaboracycloalkanes. J. Am. Chem. Soc. 85 (22), 3634-3636 (1963).
  11. Ashe III, A. J., Fang, X. A Synthesis of Aromatic Five- and Six-Membered B−N Heterocycles via Ring Closing Metathesis. Org. Lett. 2 (14), 2089-2091 (2000).
  12. Marwitz, A. J. V., Matus, M. H., Zakharov, L. N., Dixon, D. A., Liu, S. -Y. A Hybrid Organic/Inorganic Benzene. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (5), 973-977 (2009).
  13. Abbey, E. R., Lamm, A. N., Baggett, A. W., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. Protecting Group-Free Synthesis of 1,2-Azaborines: A Simple Approach to the Construction of BN-Benzenoids. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12908-12913 (2013).
  14. Rudebusch, G. E., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. Rhodium-catalyzed boron arylation of 1,2-azaborines. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (35), 9316-9319 (2013).
  15. Brown, A. N., Li, B., Liu, S. -Y. Negishi Cross-Coupling Is Compatible with a Reactive B-Cl Bond: Development of a Versatile Late-Stage Functionalization of 1,2-Azaborines and Its Application to the Synthesis of New BN Isosteres of Naphthalene and Indenyl. J. Am. Chem. Soc. 137 (28), 8932-8935 (2015).
  16. Knack, D. H. BN/CC Isosteric Compounds as Enzyme Inhibitors: N- and B-Ethyl-1,2-azaborine Inhibit Ethylbenzene Hydroxylation as Non-Convertible Substrate Analogs. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (9), 2599-2601 (2013).
  17. Eriksson, A. E. Response of a Protein Structure to Cavity-Creating Mutations and Its Relation to the Hydrophobic Effect. Science. 255 (5041), 178-183 (1992).
  18. Eriksson, A. E., Baase, W. A., Wozniak, J. A., Matthews, B. W. A cavity-containing mutant of T4 lysozyme is stabilized by buried benzene. Nature. 355 (6358), 371-373 (1992).
  19. Morton, A., Baase, W. A., Matthews, B. W. Energetic Origins of Specificity of Ligand Binding in an Interior Nonpolar Cavity of T4 Lysozyme. Biochemistry. 34 (27), 8564-8575 (1995).
  20. Wei, B. Q., Baase, W. A., Weaver, L. H., Matthews, B. W., Shoichet, B. K. A Model Binding Site for Testing Scoring Functions in Molecular Docking. J. Mol. Biol. 322 (2), 339-355 (2002).
  21. Lee, H., Fischer, M., Shoichet, B. K., Liu, S. -Y. Hydrogen Bonding of 1,2-Azaborines in the Binding Cavity of T4 Lysozyme Mutants: Structures and Thermodynamics. J. Am. Chem. Soc. 138 (37), 12021-12024 (2016).
  22. Brown, H. C., Racherla, U. S. Organoboranes. 43. A Convenient, Highly Efficient Synthesis of Triorganylboranes via a Modified Organometallic Route. J. Org. Chem. 51 (4), 427-432 (1986).
  23. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  24. Liu, L., Baase, W. A., Matthews, B. W. Halogenated Benzenes Bound within a Non-polar Cavity in T4 Lysozyme Provide Examples of I.S and I.Se Halogen-bonding. J. Mol. Biol. 385 (2), 595-605 (2009).

Tags

Biokjemi azaborine heterosykliske grupper syntese protein krystallisering T4 lysozym damp diffusjon hengende dråpe protein-ligand-komplekset røntgendiffraksjon og forpliktende samhandling
Syntese av 1,2-Azaborines og utarbeidelse av deres protein komplekser med T4 Lysozyme Mutants
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, H., Liu, S. Y. Synthesis of… More

Lee, H., Liu, S. Y. Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants. J. Vis. Exp. (121), e55154, doi:10.3791/55154 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter