We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.
Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals.
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.
Biomineralization is een complexe reeks gebeurtenissen die een reeks cellen die leiden tot de productie van prachtig bestelde mineralen 1 overbrugt. De uitdaging is om zowel de dynamische celprocessen en de verfijnde mineraalstructuren een combinatie van optische en elektronenmicroscopie werkwijzen te karakteriseren. Een verhoging van de intracellulaire pH bevordert de vorming van CaCO 3 kristallen, dus het identificeren van de levensfase dat een verhoogde pH heeft onthult tijde verkalking wordt waarschijnlijk optreden 2, 3.
De tubeworms uit de familie Serpulidae komen vaak kalkvormende in de oceaan 4. Het is ook een populaire ongewervelde model voor marien onderzoek, met name in biofouling 5, 6. In deze studie, het proces van calcificatie in mineralisatie compartimenten During biomineralization wordt waargenomen. De snelle proces van metamorfose omvat het ontstaan van calciumcarbonaat structuren 7, 8.
We zien hoe interne pH metingen kunnen worden uitgevoerd op de tubeworm en hoe levensstadia en weefsels relevant voor verkalking kan worden gescreend. Na de levensfase plaats is geïdentificeerd, kan het weefsel belast calcificatie gekarakteriseerd met een hogere resolutie middels elektronenmicroscopie methoden. Middels fluorescentiemicroscopie, we de tijd die calciumcarbonaat verschijnen nadat metamorfe inductie te bepalen. Een vergelijkbare levensfase werd vervolgens zichtbaar gemaakt met SEM-EDS voor elementaire verdeling van de samenstelling en de afgezette minerale werd geanalyseerd met behulp van twee verschillende methoden elektronenmicroscopie, specifiek SEM-EBSD en FIB-TEM.
Live optische beeldvorming is een bruikbare methode voor het observeren van cellulaire gebeurtenissen in een meercellig organisme. Hier werden de interne pH en calciumionen indicatoren gebruikt om de flux van ionen te meten aan de mineralisatie sites. In deze gebieden wordt actieve ionen pompen nodig om pH en Ca2 + -concentratie te verheffen tot calcificatie 2, 3 mogelijk maken. Bij toepassing fluorescerende moleculen aan een organisme te bestuderen, …
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to send a big thank you to Clemson Broadcast Productions, audio recording by J. Bright, Narration by A. D. McQuiston, Audio sweetening, K. Murphy, videography by G. Spake, Graphic arts by T. Messervy, Video editing by T. Messervy and E. Rodgers. Technical assistance and scientific advice was inspired by the advice of S. Kawada, S. Kubo, J. Hudson, T. Darroudi, D. Mulwee, H. Qian, Y. W. Lam, M. B. Johnstone, C. Campanati, A. C. Lane, and R. Dineshram. This study was funded by three GRF grants from the HKSAR-RGC (Grant Numbers: 705511P, 705112P, and 17304914).
Hexamethyldisilazane | Electron Microscopy Sciences | 16700(EM) | |
Osmium Tetroxide 2% Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 19192 | |
IBMX 3-Isobutyl-1-methylxanthine | ThermoFisher Scientific | PHZ1124 | |
Nigericin, Free Acid | ThermoFisher Scientific | N7143-5MG | |
35-mm-diam dish, hole size 27 mm, Glass No.0, Non-coat | ThermoFisher Scientific | D110400 | |
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate | ThermoFisher Scientific | C-1271 | |
BDH Potassium Chloride, ACS Grade | VWR | BDH0258-500G | |
Paraformaldehyde reagent grade, crystalline |
Sigma | P6148 | |
1 M Hydrochloric Acid for Volumetric Analysis | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 083-01095 | |
0.05 M Sodium Hydroxide Solution for Volumetric Analysis | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 199-02185 | |
Calcein | Sigma | C0875 | |
FASW | Iwaki Co. Ltd. | Rei-sea Marine | |
Mixed Cellulose Ester Membranes; 47 mm dia, 0.45 µm | ADVANTEC | A045A047A | |
ethanol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 051-00476 | |
Artificial seawater for buffers | by SOP06 of DOE (1994), cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf | ||
Sodium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 191-01665 | |
Potassium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 163-03545 | |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 135-00165 | |
Calcium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 039-00475 | |
Sodium Sulfate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 197-03345 | |
Hydrochloric Acid | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 089-08415 | |
2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (tris) | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 207-06275 | |
2-aminopyridine | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 011-02775 | |
Orion 5-star Plus pH meter | Thermo Scientific | ||
PrpHecT ROSS Micro Combination pH Electrode 8220BNWP | Thermo Scientific | ||
Axiovision, Version 4.6, Axio Observer Z1 | Zeiss | ||
ImageJ | NIH, Bethesda, MD, USA | ||
HRTEM H500 | Hitachi | ||
SU6600 VPSEM | Hitachi | ||
NB5000 Focused Ion and Electron Beam (FIB-SEM) system | Hitachi |