Introduction
Biomineralization is een complexe reeks gebeurtenissen die een reeks cellen die leiden tot de productie van prachtig bestelde mineralen 1 overbrugt. De uitdaging is om zowel de dynamische celprocessen en de verfijnde mineraalstructuren een combinatie van optische en elektronenmicroscopie werkwijzen te karakteriseren. Een verhoging van de intracellulaire pH bevordert de vorming van CaCO 3 kristallen, dus het identificeren van de levensfase dat een verhoogde pH heeft onthult tijde verkalking wordt waarschijnlijk optreden 2, 3.
De tubeworms uit de familie Serpulidae komen vaak kalkvormende in de oceaan 4. Het is ook een populaire ongewervelde model voor marien onderzoek, met name in biofouling 5, 6. In deze studie, het proces van calcificatie in mineralisatie compartimenten During biomineralization wordt waargenomen. De snelle proces van metamorfose omvat het ontstaan van calciumcarbonaat structuren 7, 8.
We zien hoe interne pH metingen kunnen worden uitgevoerd op de tubeworm en hoe levensstadia en weefsels relevant voor verkalking kan worden gescreend. Na de levensfase plaats is geïdentificeerd, kan het weefsel belast calcificatie gekarakteriseerd met een hogere resolutie middels elektronenmicroscopie methoden. Middels fluorescentiemicroscopie, we de tijd die calciumcarbonaat verschijnen nadat metamorfe inductie te bepalen. Een vergelijkbare levensfase werd vervolgens zichtbaar gemaakt met SEM-EDS voor elementaire verdeling van de samenstelling en de afgezette minerale werd geanalyseerd met behulp van twee verschillende methoden elektronenmicroscopie, specifiek SEM-EBSD en FIB-TEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Screening for Life Stadium en weefsel van belang met Live Imaging
- Cultuur mariene larven competentie volgens eerder beschreven werkwijzen 6, 7, 9. Incubeer de tubeworm larven op 5 larven per ml dichtheid met gefilterd zeewater met 10 uM SNARF-1:00 's nachts. Bedek de container met aluminiumfolie om de fluorescerende probe van foto-bleken te beschermen.
- Let op de larven met behulp van een dissectie microscoop. Bevoegde tubeworm larven klaar voor metamorfose zal zwemmen in een voorwaartse richting in plaats van een cirkelvormige beweging.
- Breng de bevoegde larven een 60 micrometer mesh. Druk op het gaas tegen een petrischaal, die een goede afdichting om vloeistof vast te houden. Snel de afdichting vrij te geven en gooi het zeewater met fluorescerende kleurstof, met behoud van de larven vrij te geven.
- Was de larven met gefilterd kunstmatig zeewater (FASW) tweemaal, rekeningzorg niet uitdrogen de larven in het proces.
- Plaats 10 tot 20 larven in dunne glazen bodem gerechten met 5 ml FASW bevattende 10 -4 M isobutylmethylxanthine (IBMX) voor observatie van metamorfoseprocédé.
- Plaats het filter blokjes om SNARF-1-signaal te detecteren (kanaal 1: Ex 510/25 Em 580/30; Kanaal 2: Ex 510/25 Em 640/35) DIC beeld van de larven, en.
- Plaats de metamorfoserende larven onder de 20X objectief, dan optimaliseren sluitertijd (100-300 ms) snel genoeg om ervoor te zorgen dat er een duidelijk beeld van de levende dieren wordt vastgelegd.
- Set 1 urn afstand tot een Z-stack van drie kanalen vastleggen, bij beeldvorming van een levend dier, afbeelden elke laag van de drie kanalen voor de doorstroming naar de volgende laag van de z-richting zou een betere correlatie tussen kanalen te schakelen.
- Export grijstinten voor alle kanalen en lagen als TIF-bestanden van de microscoop software: Bestand | export | File Type TIF | Begin.
- Met behulp van ImageJ, impoort van de reeks afbeeldingen voor elk kanaal: Bestand | import | Afbeelding volgorde.
- Channel importeren 1 λ 1 em, voer eerste beeld 3 en Toename: 4.
- Channel importeren 2 λ 2 em, voert het starten afbeelding 4 en Toename: 4.
- Genereer een samengestelde afbeelding door het delen van λ 2 em door λ 1 em voor elke laag pixel per pixel (Process | Image Calculator ... | Beeldbestandsindelingen 640 nm "kloof" image-bestand 580 nm), dat wil zeggen 640/580 nm ratio.
- Selecteer afbeelding | Lookup Tables | 16 Kleuren.
- Selecteer Analyseren | Extra | Calibration bar.
- Inspecteer de verschillende lagen, identificeren van de laag met de heterogeniteit. Dit biedt de meest nuttige informatie over interne pH distributie.
- Met de relatie tussen 640/580 nm-verhouding en pH, de bouw van een plot profiel om de verdeling van interne pH te visualiseren.
- Na een nacht kleuring van ongeveer 20 larven met 10 uM SNARF-01:00, toe te voegen in voorraad oplossingen van nigericine en KCl te maken van 50 pm nigericine en 150 mM KCl voor de kalibratie.
- Breng de pH van kalibratie AFSW met verdund NaOH of HCl tot pH ongeveer 5,9 is bereikt. Let op de juiste pH-waarde. Meet de pH met een pH-meter met een glaselektrode die door zeewater is geijkt 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3- propaandiol (Tris) en 2-aminopyridine 9.
- Transfer een gebrandschilderd tubeworm larven samen met een vloeistof met een bekende pH op een droge en schone schaal voor het meten van signalen intensiteit bij 640 nm en 580 nm.
- Herhaal stap 2.2 en 2.3 voor vier pH punten variërend 5,9-9,9. Ze vertegenwoordigen een scala van fysiologisch relevante waarden.
- Controleer de signalen verschijnen egaal over het dierlijk lichaam. Dit geeft aan dat de intracellulaire pH e isquilibrated met het milieu zeewater.
- Het imago van de tubeworm larven op de vijf verschillende zeewater pH omgevingen, noteer de intensiteiten getoond als "grijswaarden" op 640 nm en 580 nm, dat wil zeggen, λ 2 exc en λ 1 exc.
3. Analyse van Ratiometrische beeldgegevens
- Voer de grijswaarden, gemeten vanaf vijf willekeurige locaties of uit een gebied van de rente op een spread sheet.
- Controleer de vijf punten kalibratie toonde een lineair verband aan intracellulaire pH aan te geven (bijvoorbeeld vergelijking zoals y = 0.30x - 1,47; y = grijswaarde; x = pH; R² = 0,934).
- Bereken de intracellulaire pH-waarden uit de vergelijking met behulp van de gemeten 640/580 nm intensiteit verhouding in stap 1.13.
4. Sample Preservation, Uitdroging en montage voor elektronenmicroscopie
- Behoud de levensfase van de rente met 4% paraformaldehyde. in dit onderzoek, Bevestig de tubeworms 2-4 dagen na de beslaglegging, in fixatief houden van de dieren tot de analyse.
- Werken in een zuurkast, post-fix het monster met 1% osmiumtetroxide waterige oplossing gedurende 30 minuten aan weefsel krimp te minimaliseren tijdens het droogproces.
- Dehydrateren het monster met een ethanolreeks: 50% ethanol gedurende 5 minuten, 70% ethanol gedurende 5 minuten, 85% ethanol gedurende 5 minuten, 95% ethanol gedurende 5 minuten, en tenslotte absolute ethanol gedurende 5 minuten tweemaal.
- Werken in een zuurkast, voeg een 1: 1 oplossing van ethanol en hexamethyldisilazaan (HMDS) met het model, waardoor de vloeistof volledig verdampt.
- In de zuurkast, voeg 100% HMDS met het model, waardoor de vloeistof volledig verdampen.
- Met behulp van een diamant mes, de invoering van een paar bezuinigingen op de cultuur schotel, rond een paar tubeworms. Met het deksel op, houdt de schotel bodem tegen een aluminium stub aan het gerecht te breken.
- Onder een dissectie microscoop, het vinden van een gebroken stuk met een intacte tubeworm.
- Solliciteer zilveren verf op een aluminium stomp en zet het fragment naar de stomp zorgvuldig. Verf rond de randen van de kunststof fragment om het laden te verminderen.
5. Plaatsing van een calciumrijke Regio Met behulp van SEM-EDS
- Beveilig het monster stomp op het monster houder.
- Meet de hoogte van het gehele samenstel tegen de meter voorzien van de microscoop, om de hoogte door het losdraaien van de borgring en draaien van de post tot het monster op standaardhoogte of voer de hoogte als opgenomen.
- Toegeven lucht in de microscoop uitwisseling kamer en draai de kamerdeur open is. Schuif de monsterhouder op het uiteinde van de centrale stang. Dan sluiten en evacueren de kamer.
- Open de poort klep en schuif de uitwisseling staaf in de richting van de microscoop kamer. Schuif de uitwisseling staaf helemaal in om volledig op zijn plaats het monster houder in de microscoop podium. Verwijder de uitwisseling stang en sluit de afsluiter.
- Input thij afmetingen proeven en stuur het podium naar de Home positie om het monster onder het elektron kolom te plaatsen.
- Stel de kamer vacuüm niveau 20-30 Pa in de VP-SEM-modus. Stel het elektron versnellende spanning tot 20 kV en draai de hoge spanning op.
- Hef het podium om een steekproef werkafstand van 10 mm. Het verwerven van een live feed en zoek het monster. Optimaliseer het beeld aanpassen van het astigmatisme en de focus als dat nodig is.
- Open de SEM-EDS-programma en selecteer de EDS-SEM-modus optie. Selecteer de menu-optie om een EDS kaart uit te voeren.
- Change condensor lens en diafragma-instellingen om een dode tijd van ~ 30% te realiseren in een proces van 3 als gecontroleerd via het tarief meter in de SEM-EDS-programma. Run beam en diafragma uitlijning procedures na het maken van eventuele wijzigingen in beam-instellingen.
- Selecteer een vergroting zodanig dat een enkel organisme het gehele gezichtsveld vult. Schakel de correctie optie drift en vastleggen van een beeld in het SEM-EDS-programma.
- verwerven map gegevens met het organisme opvullen van het gehele beeldveld, met een verblijftijd van 50-100 ms. Run de kaart tot de gegevens blijkt onderscheiden lokalisatie van Ca in het organisme (ongeveer 15 min).
- Om point-kwantificering gegevens te verkrijgen, wijzigt het proces tijd om 6 en pas de elektronen probe een dode tijd van ~ 30% te verwerven. Run alignment stappen en het optimaliseren van het beeld als dat nodig is.
- Selecteer de Point en ID-optie in de SEM-EDS-programma en het verwerven van een ander beeld. Met het gereedschap enkel punt, op gebieden die rijk aan Ca kaart EDS, evenals Ca deficiënte gebieden verschenen ter vergelijking. Scan elk punt voor een live-tijd van 30 s.
6. Het identificeren Kristallografische Informatie van Calcium Rich Regio's met behulp van SEM-EBSD
- Verwijder de plastic fragment dat exemplaar van de belangstelling van platte specimen stomp en aan te brengen op het hellende vlak van een 45 ° pre-gekanteld stomp met behulp van zilver geleidende lijm.
- Schroef de stomp op het monster houder en de positie van de schuine vlak van de stomp (specimens) naar de voorkant van de monsterhouder. Schuif de monsterhouder in de kamer van de microscoop met de uitwisseling kamer.
- Stel de kamer vacuüm 30 Pa en elektron versnellingsspanning 20 kV. Stuur het monster onder de elektronen kolom en kantel het podium 25 ° ten opzichte van het monster oppervlak doen ongeveer 70 ° van normaal tot de elektronenbundel. Draai de hoge spanning op.
- Hef het podium om een werkafstand van ~ 18 mm. Gebruik de trackball om het podium te bewegen en zoek een exemplaar. Verhoog de vergroting om specifieke kenmerken van belang omlijsten. Lijn de balk en het optimaliseren van het beeld als dat nodig is.
- Open de SEM-EDS programma in de EBSD mode. Selecteer calciet en aragoniet als fasen van belang. Plaats de EBSD camera op een afstand van 154 mm. Zet camera voorwaarden tot 1 x 1 binning en een 100 ms frame van de tijd. Met behulp van een snelle balk raster, het verwerven van een achtergrond.
LET OP: Een andere frame rateafhankelijk van de elektronen probe kan nodig; Pas de probe of camera framesnelheid een signaal van ongeveer 90% te bereiken. - Een afbeelding vastleggen in de SEM-EDS-programma. Gebruik de plek analyse-instrument en klik ergens op de afbeelding om de straal op dat punt te scannen. Let op het raam camera om te zien of Kikuchi patronen worden gedetecteerd.
- Klik op de verschillende delen van het beeld om potentiële verkalking locaties te scannen, het observeren van het venster camera op elk punt om te zien of Kikuchi bands aanwezig zijn. Als patronen aanwezig zijn en overeen met de geselecteerde fasen in de database, worden deze automatisch geïndexeerd.
7. TEM Monstervoorbereiding Met behulp van FIB-SEM
- Sputteren de vacht van de voorbereide SEM specimen met platina of een soortgelijk materiaal om een geleidende laag te maken.
- Plaats de eerder vastgestelde, uitgedroogd, en gemonteerde exemplaren in de behuizing van de sputter coater en zet de stroom om te beginnen met het pompen van de kamer naar beneden.
- Zodra de kamer vacuüm leest 40 mTorr of minder, draai het gas schakelaar aan en verhoging van de argon gasstroom naar een kamer druk van 200 mTorr te bereiken. Stel de gasstroom tot een uiteindelijke kamerdruk van 80 mTorr te bereiken.
- Zet de spanning schakelaar op en verhoging van de spanning op een stroom van 15 mA te bereiken. Stel de timer en jas voor langere tijd (~ 10 min) om een dikke laag (~ 60 nm) dat het specimen oppervlak beschermd tegen ion stralingsschade maken. Regel de spanning om een stabiele 15 mA stroom te handhaven.
- Zodra u klaar bent, schakelt u de bekleder van het vacuüm op te heffen en verwijder het monster.
- Schroef de basis van de voorbereide, sputteren gecoat monster op de M4 schroef post van het instrument monsterhouder. Draai tot de hand vast, draai de borgmoer en draai de monsterhouder post naar de hoogte van de vergadering te wijzigen. Gebruik de laser hoogtemeter en de hoogte te zijn binnen 1 mm (= 0,04 inch zoals weergegeven in de video) van de standaard leverantiesd met het instrument.
- Sluit alle pistool kleppen in de FIB-SEM, en vervolgens toe te laten lucht in de eucentrische fase luchtsluis. Zodra de druk is vereffend met de omgeving, schuift u de luchtsluis open en bevestig de monsterhouder op de tanden van de uitwisseling staaf. Draai de knop op het uiteinde van de centrale stang naar de "lock" positie. Sluit de luchtsluis en evacueren de lucht sluiskolk.
- Zodra de eucentrische fase luchtsluis is geëvacueerd en de druk overeenkomt met die van de FIB-SEM kamer, open de poort klep en plaats het monster door te drukken in de centrale staaf. Schuif de uitwisseling staaf helemaal in om het monster houder van het instrument eucentrische podium plaats en draai de uitwisseling staaf naar de "unlock" positie. Schuif de uitwisseling roede terug en sluit de afsluiter.
- Verplaats het podium om het monster onder de ionenbundel kolom te positioneren. Open de afsluiters en een live-ion geïnduceerde secundaire elektronen beeld van de FIB te verwerven. Gebruik een lage vergroting en eenfast raster scan om ion schade te minimaliseren. Reset de focus van de normale observatie balk en verhogen de Z-hoogte van het podium, totdat het monster in focus. Op dit punt het monster op het kruispunt positie waarbij zowel het ion en elektronenbundels worden gefocusseerd op dezelfde locatie.
- imago van de secundaire elektronen met behulp van de SEM, zoek het gebied van interesse in het monster, met behulp van de trackball met het model verplaatsen. Aandachtsgebieden zijn Ca rijke gebieden, zoals eerder bepaald door EDS mapping. Draai de fase bestaan dat de belangrijke kenmerken in overeenstemming met het frame van het raam te krijgen.
- Op de FIB window-interface, het veroveren van een kort overzicht van het monster bij een vergroting van 1000x met een extra 2x digitale zoom en een ~ 8 urn x 2 micrometer depositie template te trekken over het gebied van belang. De vergrotingsfactor van de depositie box kan worden aangepast om eigenschappen van verschillende afmetingen op. Stel de sputter voorwaarden aan koolstof met behulp van een 40 kV deponeren, 0,09 nA bundel, met een verblijftijd van 0,5 microseconden gedurende 5 min.
- Na afzetting van koolstof, wijzigen van de depositie voorwaarden wolfraam deponeren met behulp van een 40 kV, 0,7 nA balk, en borg voor 5 min naar een ~ 2-3 um wolfraam cap te genereren.
- Het veroveren van een FIB snapshot met behulp van de observatie balk en gebruik de microsampling sputter instrument om een patroon van vier vakken rond de wolfraam dop te trekken. Stel de bovenste en onderste vakken tot ongeveer 15 urn x 8 urn; de juiste doos 10 micrometer x 5 micrometer, en de linker doos 6 micrometer x 5 micrometer, of groot genoeg is om het gebied van belang omringen.
- Wijzig de fabricage voorwaarden te snijden met behulp van een 40 kV, 19 nA balk, en een verblijftijd van 50 microseconden, en 3-4 scan frames voor elk vak. fabriceren dan het patroon. Na fabricage, het interessegebied, met beschermende C en W lagen, wordt een eiland lijken, met alle aangrenzende materiaal verwijderd boven, onder en rechts.
- Kantel het podium 58 ° naar samp zettenle oppervlak loodrecht op de elektronen kolom en onder een steile hoek met de ion kolom. Zoek de achterzijde van het monster "eiland" met de FIB en vastleggen van een momentopname op 1000x en 2-4x digitale zoom.
- Teken een ~ 15 pm x 2 pm sputter patroon over de onderkant van de achterzijde van het monster "eiland" aan het einde waar het toegankelijk. Fabriceren de doos met een 4 nA balk 3 minuten, of totdat de bundel door de bodem van het monster stuurde "island."
- Kantel de eucentrische podium -58 ° ten opzichte van de huidige positie (terug naar nul). Steek de wolfraam microsampling sonde door te klikken op "Sonde In" in het FIB-interface. Selecteer "MS" op het podium bedieningspaneel en gebruik de trackball om de sonde over de top van het monster te verplaatsen.
- Het verwerven van een levende voeder van de FIB bij een vergroting van 1 kx en plaats de probe zodanig dat de punt direct boven de rechterzijde van het wolfraam dop van de microproefcel. Met inachtneming van een levendSE afbeelding van de SEM, gebruik maken van de Z bedieningsknop van het podium paneel om de sonde te verlagen tot hij contact maakt met de wolfraam dop. Een zoemer eenmaal contact is gelegd.
- Het veroveren van een snapshot met behulp van de FIB met behulp van een 40 kV, 0,01 nA balk, bij een vergroting van 1000x en 2x digitale zoom. Gebruik de depositie gereedschap om een 2 pm x 2 pm te tekenen op de punt van de sonde waar deze contact wolfraam dop van de microproefcel.
- Stel de voorwaarden voor wolfraam deponeren met behulp van een 40 kV, 0,09 nA balk, gedurende 2 minuten en een verblijftijd van 0,5 microseconden. fabriceren dan het patroon.
- Teken een ~ 2 micrometer x 5 micrometer sputter patroon over het linkereinde van de microproefcel "arm" (indien deze nog het grootste deel van het monster). Fabriceren het patroon met behulp van een 40 kV, 0,7 nA balk, gedurende 2 minuten, of totdat de pieptoon geeft aan dat de microproefcel is losgemaakt van het bulkmonster.
- Gebruik de Z-draaiknop om de sonde met aangehechte microproefcel totdat verhogenklaart het bulkmonster, dan trekken de sonde. Stuur het eucentrische podium om ofwel the Home of Exchange positie.
- Plaats een koperen half-grid in een zijingang houder en plaats de houder in de zijingang podium purge kamer. Evacueren de kamer en plaats de zijingang houder. Stel de houder de FIB positie.
- Druk Side op het podium bedieningspaneel en gebruik de trackball om de half-grid in zicht op de FIB-monitor te brengen. Ga naar gebied van de halve rooster schoon te maken en gebruik maken van de Z-knop om de oppervlakte in beeld te brengen.
- Druk Probe In de sonde, drukt u op MS te voegen op het podium bedieningspaneel, en het gebruik van de trackball en Z-knop om de microproefcel positie over de helft net. Laat de sonde tot de microproefcel contact maakt met de rooster.
- Leg een beeld op het FIB bij 1000x (2x zoom). Gebruik de afzetting gereedschap en trek een ~ 10 micrometer x 3 micrometer patroon over de onderkant van de microproefcel. Depot wolfraam met een 40 kV, 0,7 nA bundel, met een verblijftijd time van 0,5 ps voor 3 minuten.
- Gebruik de sputter gereedschap en trek een kleine 1 urn x 3 urn patroon over de punt van de sonde. Fabriceren het patroon met behulp van een 40 kV, 0,7 nA bundel bij een verblijftijd van 3 ms tot de sonde uit de buurt van de microproefcel snijden. Trek de sonde een keer gratis.
- Leg een FIB beeld bij 5,000X vergroting en teken twee sputter patronen 7 pm x 4 pm boven en onderkant van de microproefcel, waardoor een ~ 1 micrometer tussenruimte tussen de vakken. Centreer de patronen om zo niet knippen de linker en rechterkant van het microproefcel. Fabriceren beide patronen met een 40 kV, 4 nA balk en een verblijftijd van 3 microseconden voor 2 minuten, waarin het raster richting naar het midden van de microproefcel.
- Leg een ander beeld met behulp van de FIB observatie balk op 5,000X. Het formaat van de vorige sputter dozen om ~ 6,5 micrometer x 1 micrometer, dichter bij elkaar om een gat van ~ vertrekken 0,5 urn en fabriceren met behulp van een 40 kV, 0,7 nA balk.
- Kantel de zijingang podium 0,5 ° en captuur een ander beeld FIB. Het formaat van de sputter dozen tot 6 micrometer breed. Plaats de bovenste patroon over de bovenzijde van de microproefcel en fabriceren met een 40 kV, 0,7 nA beam. Tilt -0,5 ° en herhaal de onderste sputter patroon en onderzijde van de microproefcel.
- Verdere daling van het patroon breedte door ~ 0,5 micrometer. Tilt 0,5 ° en sputteren de bovenzijde van de microproefcel met een 40 kV, 0,09 nA beam. Herhaal dit met de onderkant op -0,5 ° tilt.
- Kantel het podium 2.2 ° beeld en een FIB te verwerven op 10.000X. Resize sputter patronen tot 5 pm breed en veranderen bundel voorwaarden tot 5 kV, 0,03 nA. Plaats de bovenste patroon over de bovenzijde van de microproefcel, tot de bovenrand en fabriceren. Kantel -2,2 ° en herhaal met de onderkant en de bodem patroon.
- Herhaal 5 kV frezen stappen totdat de microproefcel wordt elektron transparant (~ 100 nm dikte). Eenmaal klaar, in de buurt gunvalves en verwijder opschuifmast houder.
8. Obtaining geselecteerd gebied diffractiepatroon op een TEM
- Om het instrument voor de analyse te maken, vullen beide Dewar flesjes met vloeibare stikstof en stel de versnellende spanning tot 300 kV.
- Na de bereiding van de monsters met behulp van de FIB, verwijder de zijingang houder van de FIB-SEM en stel de pin zodanig dat de houder lengte overeenkomt met die van de 300 kV TEM. Draai het uiteinde van de houder op de juiste observatiepositie opnieuw vergelijken met de standaard TEM houder juiste monster oriëntatie wordt gewaarborgd.
- Als alternatief, verwijder de half-grid met aangehechte lamellen van de FIB-SEM houder en plaats in de standaard TEM houder.
- Laad de monsterhouder in de uitwisseling kamer van de TEM en evacueren de kamer. Zorg ervoor dat het instrument pistool gesloten is wanneer lucht in de uitwisseling kamer wordt toegelaten. Zodra de uitwisseling kamer heeft gepompt, zal een akoestisch alarm klinken. Draai de monsterhouder met de klok mee en laat de vacuum aan het monster houder trekken naar de eerste stop positie.
- Laat het instrument vacuüm om te herstellen, en open vervolgens het pistool ventiel. Reset de focus en zoom om een vergroting van ongeveer 10.000X.
- Met de uitlijning knoppen om de balk verschuiven naar het midden van het fosforscherm. Contract en uitbreiden van de balk en ervoor zorgen dat alle balk beweging concentrische. Pas voor condensor stigmatism als dat nodig is.
- Draai de monsterhouder linksom en laat het vacuüm op de houder trekken volledig in de kolom. Gebruik het podium beweging knoppen om te navigeren en zoek het monster.
- De vergroting van het monster en stel de Z-hoogte totdat het monster is scherpgesteld. Met de optische oculairs nodig.
- Plaats de camera en verwijder het fosforscherm. Vouw de bundel als nodig is om te voorkomen dat oversaturating de camera. Pas de scherpstelling en de camera parameters, dan beginnen de verwerving om een beeld vast te leggen.
- Om een diffractiepatroon, eerste centrum het verwervenkenmerk van belang. Verwijder de objectieve diafragma en steek de diffractie diafragma.
- Ga naar de diffractie lens modus door op de DIFF-knop op het bedieningspaneel en gebruik de DIFF bedieningsknop op de balk krimpen.
- Plaats de blanker nodig om te voorkomen dat het midden van het diffractiepatroon verbranden het scherm camera of fosfor. Start overname van de camera om een beeld van het patroon vast te leggen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De volgende zijn enkele opmerkingen van de verkalking proces tijdens de metamorfose van het tubeworm. Figuur 1 toont dat de pH bij de kraag gebied is hoger dan de andere weefsels na metamorfose. Figuur 2i toont een tubeworm met homogene verdeling van Ca, wat suggereert geen grote kalkafzetting gebeurtenissen zijn begonnen; Figuur 2ii toont een tubeworm dat is verkalkt voor een langere periode, wat erop wijst verkalking is verder gegaan dan het tijdstip van belang; Figuur 2iii toont een tubeworm de verkalking fase plaats, die werd geselecteerd voor verdere analyse aan het weefsel belast mineralisatie begrijpen. Figuur 3 toont de hogere pH waarden gecorreleerd met de hogere Ca ionen signalen van beide calceïne kleuring en SEM-EDX mapping. Uit deze observaties, het weefsel van de levensfase van belang werd onderzocht bij een higher resolutie met behulp van een meer gelokaliseerde techniek, SEM-EBSD. Na de ontdekking van de minerale fase, Figuur 4 toont de toepassing van gefocusseerde ionenbundel te tillen uit het materiaal van belang voor TEM en geselecteerde gebied diffractie analyse om de kristalliniteit van de minerale bevestigen.
Figuur 1: intracellulaire pH in kaart brengen van de tubeworm (van Chan et al 2015.). Op 71 uur na IBMX behandeling, een tubeworm, Hydroides elegans, die een trager tempo van de metamorfose geeft blijk van een grote heterogeniteit in de intracellulaire pH distributie. beeld DIC (linksboven) en pseudocolorized samengestelde beelden gegenereerd uit de grijswaarden 640 nm gedeeld door de grijswaarden 580 nm (rechtsboven) getoond. De berekende grijswaarden van de 640/580 nm-verhouding is evenredig met de intracellulaire pH. de profiles van de grijswaarden van de samengestelde beelden, omgezet in intracellulaire pH-waarden over de afstand langs de longitudinale as van het lichaam tubeworm (onderste paneel). De relatie tussen intracellulaire pH en 640/580 nm verhouding in emissie werd vastgesteld in vitro kalibratie (y = 0.30x - 1,47; R 2 = 0,934 y, grijswaarde, x, intracellulair pH). Regio's met intracellulaire pH boven pH 8,5 (in het rood) worden die overeenkomen met de regio's waar de verkalkte structuren werden gevonden. Schaal bar = 100 urn; c, kraag; b, branchial lobben; mier, anteior; post, posterior. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Het identificeren van de levensfase van belang met behulp van SEM-EDS.
Tubeworms op verschillendetijdstip van de metamorfose werden gescreend op de nieuw calcificerende podium voor verdere analyse (i) Een dag 1 na de metamorfose tubeworm toont homogene verdeling van Ca signaal vast te leggen (ii) Een snellere groeiende dag 2 na de metamorfose tubeworm toont een korte ring van Ca signaal (iii) Een langzamer groeiend dag 2 na de metamorfose tubeworm toont plekken van Ca signaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Karakterisering van Ca signalen met levende microscopie (van Chan et al 2015.). (I-iv), SEM-EDS (v-vii) en SEM-EBSD (viii-x). De verdeling van calciumionen als gecorreleerd met calceïne signaal op 31 uur en 53 uur na de metamorfose van Hydroides elegans. De DIC beelden (linker paneel, 3i en iii) en tHij calceïne signaal (linker panel, 2ii en iv) getoond. Correlatieve elektronenmicroscopie op de dag 2 na de metamorfose Hydroides elegans ontdekt plekjes van verkalkte structuren, zoals het een lager voltage (5 kV) in SEM (middelste paneel, 3V). SEM-EDS-analyse in kaart brengen, uitgevoerd bij 20 kV, toont een heterogene verdeling van calcium (middelste paneel, 3vi, Ca, in het geel). De Ca inhoud worden als getallen overlappen een groter oppervlak detail van lagere spanning (5 kV) beeld van de tubeworm, de Ca inhoud (mol gew%, komma zijn afgestemd op de locatie van de vlek in analyses) verkregen spot kwantificering ( met SEM-EDS bij 20 kV) (middelste paneel; 3vii). Gebieden met een Ca-gehalte hoger dan 15 mol% gew waarschijnlijk verkalkte structuren. SEM-EBSD analyse van de calcium rijke gebieden is illuastrated in het rechter paneel van 2viii-x. De calcium rijke regio's (witte doos) zoals gevonden in SEM-EDS resultaten werden verder geanalyseerd met EBSD (rechter paneel; 3viii) (ii) de cirkel (rechter paneel;3ix) geeft de EBSD analyse site; Kikuchi een patroon (rechter paneel; 2x) suggereert dat de site is aragonitic van het raakvlak van EDS / EBSD micro-analyse software. c, kraag; b, branchial lobben; mier, anterior; post, posterior. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Karakterisering van kristallijne structuur met behulp van FIB-TEM (van Chan et al 2015.). (I) Het gebied vertoont een Kikuchi patroon van EBSD werd uitgesneden om een TEM monster te bereiden, (ii) het verwijderen omringende materiaal uitgesneden door een gefocusseerde ionenbundel (FIB) (bovenaanzicht), (iii) het materiaal werd opgetild met behulp van een wolfraam probe (zijaanzicht), (iv) het monster met een einddikte van ~ 200 nm, die werd verkregen bij een lagere spanning. Omcirkeld gebied (v) warengeanalyseerd op de aanwezigheid van geselecteerde gebied diffractiepatroon in een TEM (vi), dat een eenkristal patroon aragoniet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Live optische beeldvorming is een bruikbare methode voor het observeren van cellulaire gebeurtenissen in een meercellig organisme. Hier werden de interne pH en calciumionen indicatoren gebruikt om de flux van ionen te meten aan de mineralisatie sites. In deze gebieden wordt actieve ionen pompen nodig om pH en Ca2 + -concentratie te verheffen tot calcificatie 2, 3 mogelijk maken. Bij toepassing fluorescerende moleculen aan een organisme te bestuderen, is het essentieel dat de gebruikte concentratie verwaarloosbare toxiciteit en maakt het organisme te presteren in een fysiologisch relevante manier. Een lagere concentratie kleuring zou minder toxisch zijn en wordt gewoonlijk gekoppeld aan een langere tijd 10 kleuren. Het is belangrijk om een lage dichtheid van larven gedurende de incubatietijd houden, minimaliseren zuurstoftekort en afval accumulatie in de kleuring periode.
Voorafgaand aan het nastreven van de FIB / TEM methoden, die een gelokaliseerde impliceertregio van belang, is het cruciaal om te screenen door de levensfase en weefsel van belang het gebruik van lagere resolutie methoden, zoals SEM-EDS en SEM-EBSD. Het observeren van het monster onder terugverstrooide modus maakt visualisatie van relatieve elementaire samenstelling, waar lichter contrast correleert met zwaardere atoomgewicht 11. Daarom SEM-beelden BSE bieden ook een schatting waar de zwaardere elementen zoals calciumionen en osmium gekleurd lipide bolletjes liggen. SEM-EDS-analyse laat specifiekere mapping van calciumionen op de monsters. Dit betekent echter niet de aanwezigheid van kristallijne CaCO 3 te bevestigen. SEM-EBSD maakt de ontdekking van kristallijne structuren, hoewel conventionele methoden EBSD een gepolijst oppervlak 12 vereisen. Deze studie toont aan hoe SEM-EBSD op een ongepolijste steekproef nuttige informatie kan verschaffen. Een 20 kV straalstroom zorgt voor een grotere diepte van analyse op het monster oppervlak. Daarom EBSD een gewenste methode voor het opsporende aanwezigheid van biomineraal, vooral op kleine, intacte biologische monsters zoals mariene larven. Hoewel de ongepolijste monsters zou geven valse negatieven wanneer mineralen niet tegenover de detector bij ongeveer 70 °, Kikuchi zien van een patroon wordt geacht ondubbelzinnig bewijs van een minerale fase aan het gebied van belang 13 zijn.
Transmissie elektronen microscopie (TEM) laat structurele karakterisering van een grotere verscheidenheid van materialen 14. De gefocusseerde ionenbundel (FIB) zorgt voor plaatsspecifiek extractie en bereiding van een monster met typische afmetingen voor TEM analyse 15. Daarom is de FIB / TEM techniek is een geschikte methode om opnieuw gedeponeerde biologische materialen op een gelokaliseerd gebied te analyseren. Gecombineerde FIB-SEM instrumenten ook mogelijk schadevrij waarneming van een monster door het gebruik van een geïntegreerde elektronenbundelkolom. Tungsten sputter coating van het monster verhoogt geleidbaarheid en grenzen ion implantation en stralingsschade van het monster 16. Het gebruik van een fijn gefocusseerde ionenbundel met een lage verblijftijd maakt malen van organische materialen. Binnen in de FIB-SEM, kan een bijzonder kenmerk van belang worden gewonnen uit een bulk specimen en uitgedund om de transparantie elektron voor TEM analyse 17. Door de hoge energie van de ionenstraal kan kristallijne materialen amorf worden gemaakt. Dit kan gebeuren bij het bereiden van een dunne lamel voor TEM analyse en kunnen worden verzacht met een lage versnellingsspanning ionenbundel de amorfe laag te verwijderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hexamethyldisilazane | Electron Microscopy Sciences | 16700(EM) | |
| Osmium Tetroxide 2% Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 19192 | |
| IBMX 3-Isobutyl-1-methylxanthine | ThermoFisher Scientific | PHZ1124 | |
| Nigericin, Free Acid | ThermoFisher Scientific | N7143-5MG | |
| 35 mm diameter dish, hole size 27 mm, Glass No.0, Non-coat | ThermoFisher Scientific | D110400 | |
| 5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate | ThermoFisher Scientific | C-1271 | |
| BDH Potassium Chloride, ACS Grade | VWR | BDH0258-500G | |
| Paraformaldehyde reagent grade, crystalline |
Sigma | P6148 | |
| 1 M Hydrochloric Acid for Volumetric Analysis | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 083-01095 | |
| 0.05 M Sodium Hydroxide Solution for Volumetric Analysis | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 199-02185 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | |
| FASW | Iwaki Co. Ltd. | Rei-sea Marine | |
| Mixed Cellulose Ester Membranes; 47 mm dia, 0.45 µm | ADVANTEC | A045A047A | |
| ethanol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 051-00476 | |
| Artificial seawater for buffers | by SOP06 of DOE (1994), cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf | ||
| Sodium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 191-01665 | |
| Potassium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 163-03545 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 135-00165 | |
| Calcium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 039-00475 | |
| Sodium Sulfate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 197-03345 | |
| Hydrochloric Acid | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 089-08415 | |
| 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (tris) | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 207-06275 | |
| 2-aminopyridine | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 011-02775 | |
| Orion 5-star Plus pH meter | Thermo Scientific | ||
| PrpHecT ROSS Micro Combination pH Electrode 8220BNWP | Thermo Scientific | ||
| Axiovision, Version 4.6, Axio Observer Z1 | Zeiss | ||
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD, USA | ||
| HRTEM H500 | Hitachi | ||
| SU6600 VPSEM | Hitachi | ||
| NB5000 Focused Ion and Electron Beam (FIB-SEM) system | Hitachi |
References
- Aizenberg, J., et al. Skeleton of Euplectella sp.: structural hierarchy from the nanoscale to the macroscale. Science. 309 (5732), 275-278 (2005).
- de Nooijer, L. J., Toyofuku, T., Oguri, K., Nomaki, H., Kitazato, H. Intracellular pH distribution in foraminifera determined by the fluorescent probe HPTS. Limnol Oceanogr Methods. 6 (11), 610-618 (2008).
- de Nooijer, L. J., Langer, G., Nehrke, G., Bijma, J. Physiological controls on seawater uptake and calcification in the benthic foraminifer Ammonia tepida. Biogeosciences. 6 (11), 2669-2675 (2009).
- Smith, A. M., Riedi, M. A., Winter, D. J. Temperate reefs in a changing ocean: skeletal carbonate mineralogy of serpulids. Mar Biol. 160 (9), 1-14 (2013).
- Carpizo-Ituarte, E., Hadfield, M. Stimulation of metamorphosis in the polychaete Hydroides elegans Haswell (Serpulidae). Biol. Bull. 194 (1), 14 (1998).
- Bryan, P. J., Kreider, J. L., Qian, P. Y. Settlement of the serpulid polychaete Hydroides elegans (Haswell) on the arborescent bryozoan Bugula neritina (L.): evidence of a chemically mediated relationship. J Exp Mar Biol Ecol. 220, 171-190 (1998).
- Chan, V. B. S., et al. Evidence of compositional and ultrastructural shifts during the development of calcareous tubes in the biofouling tubeworm, Hydroides elegans. J. Struct. Biol. 189 (3), 230-237 (2015).
- DOE. Handbook of methods for the analysis of the various parameters of the carbon dioxide system in sea water. Version 2. Dickson, A. G., Goyet, C. , ORNL/CDIAC-74 (1994).
- Chan, V. B. S., et al. Direct deposition of crystalline aragonite in the controlled biomineralization of the calcareous tubeworm. Front Mar Sci. 2, 97 (2015).
- Bond, J., Varley, J. Use of flow cytometry and SNARF to calibrate and measure intracellular pH in NS0 cells. Cytometry A. 64, 43-50 (2005).
- Lloyd, G. E. Atomic number and crystallographic contrast images with the SEM: a review of backscattered electron techniques. Mineral Mag. 51, 3-19 (1987).
- Perez-Huerta, A., Dauphin, Y., Cuif, J. P., Cusack, M. High resolution electron backscatter diffraction (EBSD) data from calcite biominerals in recent gastropod shells. Micron. 42 (3), 246-251 (2011).
- Bandli, B. R., Gunter, M. E. Electron backscatter diffraction from unpolished particulate specimens: examples of particle identification and application to inhalable mineral particulate identification. Am. Mineral. 97, 1269-1273 (2012).
- Hayat, M. A. Principles and techniques of electron microscopy: biological applications. , Cambridge University Press. (2000).
- Wirth, R. Focused Ion Beam (FIB) combined with SEM and TEM: Advanced analytical tools for studies of chemical composition, microstructure and crystal structure in geomaterials on a nanometre scale. Chem Geo. 261, 217-229 (2009).
- Volkert, C. A., Minor, A. M. Focused ion beam microscopy and micromachining. MRS Bull. 32, 389-399 (2007).
- Kudo, M., et al. Microtexture of larval shell of oyster, Crassostrea nippona: A FIB-TEM study. J. Struct. Biol. 169 (1), 1-5 (2009).
