Introduction
バイオミネラリゼーションが絶妙に注文したミネラル1の産生をもたらす細胞活性のスイートを橋渡しする複雑な一連の事象、です。課題は、光学および電子顕微鏡法の組み合わせを使用して動的な細胞プロセスで洗練された鉱物の構造の両方を特徴付けることです。細胞内pHの上昇は、したがって、増加したpHを有し、ライフステージを特定する石灰化は2、3に発生する可能性がある時間を明らかにする、CaCO 3を結晶の形成に有利に働きます。
家族カンザシゴカイ科からtubewormsは海4で共通calcifiersです。これは、特に生物付着5、6に、また、海洋研究のための人気の無脊椎動物のモデルです。本研究では、鉱化区画における石灰化のプロセスドゥリNGのバイオミネラリゼーションが観察されます。変態の急速なプロセスは、炭酸カルシウム構造体7,8の出現を含みます。
我々はtubeworm上で実行することができますどのように内部のpH測定を実証し、ライフステージや石灰化に関連する組織がどのようにスクリーニングすることができます。関心のライフステージが識別された後、石灰化を担当する組織は、電子顕微鏡法を用いて、高い解像度で特徴づけることができます。蛍光顕微鏡を使用して、我々は、変成誘導後に表示されるように、炭酸カルシウムのために必要な時間を決定します。人生の類似の段階が続いて元素の組成分布のためのSEM-EDSで可視化し、析出した鉱物は、二つの異なる電子顕微鏡法、特にSEM-EBSDとFIB-TEMを用いて分析しました。
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Protocol
1.ライフステージのためのスクリーニングとライブイメージングと関心のある組織
- 以前に報告された方法6、7、9に記載のコンピテンシーに文化海洋幼虫。一晩10μMSNARF-1 AMでろ過海水でmLの密度あたり5幼虫でtubeworm幼虫をインキュベートします。光退色からの蛍光プローブを保護するためにアルミホイルで容器を覆います。
- 解剖顕微鏡を使用して幼虫を観察します。変態の準備ができて有能なtubewormの幼虫は、順方向の代わりに円を描くように泳ぐます。
- 60μmのメッシュに有能な幼虫を転送します。液体を保持するために良好なシールを提供し、ペトリ皿に対してメッシュを押してください。迅速に幼虫を保持し、蛍光色素を含む海水を解放し、破棄するシールを解放します。
- 取って、二回フィルタリング人工海水（FASW）との幼虫を洗いますプロセス内の幼虫を乾燥しないように注意。
- FASWの5 mLの変態過程の観察のために10 -4 Mイソブチルメチルキサンチン（IBMX）を含む薄いガラスボトムディッシュに10〜20の幼虫を置きます。
- SNARF-1信号（：例25分の510エム30分の580;チャネル2：チャンネル1例25分の510エム35分の640）を検出するためのフィルターキューブを挿入し、幼虫のDIC画像。
- 生きた動物の鮮明な画像が取り込まれることを確実にするために、シャッター時間（100から300ミリ秒）を十分に速く最適化、その後、20X対物レンズの下に変態幼虫を置きます。
- すべての3つのチャンネルのZスタックをキャプチャするために1ミクロンの距離を設定し、チャネル間のより良い相関を可能にする、z方向の次の層に移動する前に、すべての3つのチャネルのための各レイヤーを画像化する、生きている動物を撮影する場合。
- 顕微鏡ソフトウェアからTIFファイルとしてすべてのチャンネルとレイヤーの輸出グレースケール画像：ファイル|エクスポート|ファイルタイプTIF |開始。
- ImageJのを使用して、イムポート各チャネルのイメージシーケンス：ファイル|インポート|画像シーケンス。
- チャンネル1λ1 のemをインポートするには、画像3及び増分を開始する入力します。4。
- チャンネル2λ2 のemをインポートするには、画像4及び増分を開始する入力します。4。
- ピクセルによってそれぞれの層の画素に対してλ1 全角によりλ2 のemを分割することにより合成画像を生成する（プロセス|イメージ電卓... |イメージファイル640 nmの「分割」の画像ファイル580 nm）を、すなわち580分の640 nmの比率。
- 選択画像|ルックアップテーブル| 16色。
- 選択して分析|ツール|キャリブレーションバー。
- 最も異質性を含む層を識別し、異なる層を点検。これは、内部のpH分布に関する最も有用な情報を提供しています。
- 580分の640 nmの比とpHとの関係を使用して、内部のpHの分布を可視化するためにプロットのプロファイルを構築します。
- 10μMのSNARF-1 AMで約20幼虫の一晩染色した後、50μMのナイジェリシンおよびキャリブレーションのための150のKClを補うためにニゲリシンとKClの原液に追加します。
- 5.9付近のpHが達成されるまで、希NaOHまたはHClを用いてキャリブレーションAFSWのpHを調整します。正確なpH値に注意してください。ベース海水によって較正されたガラス電極でpHメーターで測定値のpHを、2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-1,3-プロパンジオール（トリス）及び2-アミノピリジン9。
- 640 nmおよび580 nmでの信号強度の測定のために乾燥したきれいな皿に知られているpHの液体と一緒に1ステンドtubewormの幼虫を転送します。
- 繰り返しは、5.9から9.9までの4以上のpHポイントを2.2と2.3を繰り返します。彼らは、生理学的に関連する値の範囲を表します。
- 信号は、動物の体全体に均質に見えるかどうかを確認してください。これは、細胞内pHは、電子されていることを示しています環境海水でquilibrated。
- 画像5異なる海水pH環境でのtubewormの幼虫は、すなわち、λ2 EXCとλ1 EXC、640 nmでの「グレー値」とし、580 nmで示す強度を記録します。
レシオメトリックイメージングデータの3解析
- 5ランダムな場所から、またはスプレッドシート上の関心領域から測定した灰色の値を入力します。
- 5点のキャリブレーションは、細胞内のpHを示すために直線関係が認められたか確認してください（ 例えば y = 0.30x様式- 1.47であり、y =グレー値であり、x =のpH;R²= 0.934）。
- ステップ1.13で測定した580分の640 nmの強度比を用いて、式から細胞内pH値を計算します。
4.サンプル保存、脱水および電子顕微鏡用の取付
- 4％パラホルムアルデヒドで興味のライフステージを保持します。本研究では、分析まで固定剤で動物を維持し、2-4日アタッチメント後tubewormsを修正。
- ヒュームフード内で作業し、脱水プロセス中に組織の収縮を最小限にするために30分間、1％四酸化オスミウム水溶液で試料を後固定します。
- 段階的エタノールシリーズで試料を脱水：回5分間、5分間、50％エタノール、5分間、70％エタノール、5分間、85％エタノール、5分間、95％エタノール、そして最後に無水エタノール。
- 液体が完全に蒸発させること、試料にエタノールおよびヘキサメチルジシラザン（HMDS）の1液：ドラフト内で作業し、1を追加します。
- ヒュームフードでは、液体が完全に蒸発させること、試料に100％のHMDSを追加します。
- ダイヤモンドナイフを使用して、培養皿に、いくつかのカットを導入する、いくつかのtubewormsを取り囲みます。上の蓋で、皿を破るためにアルミスタブに対して皿底を保持します。
- 解剖顕微鏡下で、無傷のtubewormを含む骨折した作品を見つけます。
- アルミスタブに銀塗料を塗布し、慎重にスタブにフラグメントを固定します。充電を減らすためにプラスチック製のフラグメントのエッジの周りペイント。
5. SEM-EDSを使用したカルシウムに富む領域の検索
- サンプルホルダーに試料スタブを固定します。
- 、顕微鏡で提供さゲージに対するアセンブリ全体の高さを測定した試料は、標準的な高さになるまで、ロックワッシャを緩め、ポストを回転させることで高さを調節する、または記録されている高さを入力します。
- 顕微鏡交換室に空気を認め、オープン室のドアを開けます。交換ロッドの端部に試料ホルダーをスライドさせます。その後、チャンバーを閉じて避難。
- ゲートバルブを開き、顕微鏡室に向かうに交換ロッドをスライドさせます。完全に顕微鏡ステージに試料ホルダーを装着することで交換棒のすべての方法をスライドさせます。交換ロッドを外し、ゲートバルブを閉じます。
- 入力トン彼は寸法をサンプリングし、電子カラムの下にサンプルを配置するために、ホームポジションにステージを送信します。
- VP-SEMモードで20-30 Paまでチャンバーの真空レベルを設定します。 20キロボルトの電子加速電圧を設定し、上の高電圧の電源を入れます。
- 10ミリメートルのサンプルワーキングディスタンスにステージを上げます。ライブフィードを取得し、試料を見つけます。非点収差を調整してイメージを最適化し、必要に応じて焦点を合わせます。
- SEM-EDSプログラムを開き、EDS-SEMモードオプションを選択します。 EDSマップを実行するには、メニューオプションを選択します。
- SEM-EDSプログラムで速度計を介してモニターされる変更集光レンズおよび絞りの設定は、3の処理時間で30％〜のデッドタイムを達成します。ビームの設定に変更を加えた後、ビームと開口位置合わせ手順を実行します。
- 単一の生物が視野全体を満たすように倍率を選択します。ドリフト補正オプションを有効にして、SEM-EDSプログラムで画像をキャプチャします。
- ミリアンペアを買収生物は50から100ミリ秒の滞留時間を使用して、視野全体を埋めるのpデータ。データは、生物（約15分）内のCaの明確な局在を示すまで、マップを実行します。
- 点定量化データを得るために、6の処理時間を変更して、30％〜のデッドタイムを取得する電子プローブを調整します。アライメントの手順を実行し、必要に応じて画像を最適化します。
- SEM-EDSプログラムにおけるポイントとIDオプションを選択して、別の画像を取得します。一点ツールを使用して、比較のためにEDSマップだけでなく、カルシウム欠損領域中のCaが豊富登場エリアをクリックしてください。 30秒のライブ時のために各ポイントをスキャンします。
6. SEM-EBSDを用いたカルシウムに富む領域の結晶学的情報の識別
- フラット標本スタブから興味のあるプラスチック製の断片を含む試料を取り出して、銀の導電性接着剤を用いて45°のプレチルトスタブの傾斜面に貼り付けます。
- サンプルH上にスタブをねじ込み古いと試料ホルダーの正面に向かって位置（試料との）スタブの傾斜面。交換室を用いて顕微鏡のチャンバ内に試料ホルダーを挿入します。
- 20 kVのに加速電圧を30Paと電子にチャンバ真空を設定します。電子カラムの下にサンプルを送信し、電子ビームを試料表面に法線から約70°を配置するステージ25°傾けます。高電圧の電源を入れます。
- 〜18ミリメートルの作動距離にステージを上げます。ステージを移動し、検体を特定するためにトラックボールを使用してください。興味のある特定の機能をフレームに倍率を上げます。ビームの位置を合わせ、必要に応じて画像を最適化します。
- EBSDモードでSEM-EDSプログラムを開きます。関心の相として方解石とアラゴナイトを選択します。 154ミリメートルの距離でEBSDカメラを挿入します。 1×1ビニングと100ミリ秒のフレーム時間にカメラの条件を設定します。高速ビームラスタを使用して、背景を獲得。
注：別のフレームレート電子プローブに応じて必要とされ得ます。約90％のシグナルを達成するためのプローブまたはカメラのフレームレートを調整します。 - SEM-EDSプログラムで画像をキャプチャします。スポット分析ツールを使用して、その点にビームを走査する画像のどこかをクリックします。任意の菊池パターンが検出されたかどうかを確認するためにカメラウィンドウを確認します。
- 菊池バンドが存在しているかどうかを確認するために、各時点でカメラウィンドウを観察し、潜在的な石灰化部位をスキャンするために、画像の異なる領域をクリックします。パターンが存在し、データベース内の選択された相のいずれかと一致する場合は、自動的にインデックス付けされます。
7. TEM試料作製FIB-SEMを使用しました
- 導電層を作成するためにコートに白金または類似の材料を用いて調製したSEM試料をスパッタ。
- 以前、固定脱水を配置し、スパッタコーターのハウジング内に試験片を取り付けられ、チャンバをポンプダウンを開始するために電源をオンにします。
- チャンバの真空が40ミリトル以下を読み取ると、上のガススイッチをオンにし、200ミリトールのチャンバ圧力に達するようにアルゴンガス流量を増加させます。 80ミリトールの最終のチャンバ圧力を達成するために、ガスの流れを調整します。
- 上の電圧スイッチをオンにし、15ミリアンペアの電流を達するために、電圧を増加させます。長時間タイマーやコートを設定します（〜10分）イオン照射損傷から試料表面を保護する厚い層（〜60 nm）を作成します。安定の15mAの電流を維持するために電圧を調整します。
- いったんパワーダウン真空を解放し、サンプルを除去するためのコーターを、終えました。
- 準備のベースをねじ、器具サンプルホルダーのM4ねじポスト上にコーティングされたサンプルをスパッタ。手きつくなるまで締め、ロックナットを緩め、その後、アセンブリの高さを変更するには、サンプルホルダーポストを回転させます。レーザーの高さゲージを使用し、標準的なsupplieの1ミリメートル（ビデオに表示されているように= 0.04インチ）の範囲内であると高さを調整楽器とD。
- FIB-SEM内のすべての銃のバルブを閉じて、ユーセントリックステージエアロックに空気を認めます。圧力は、環境と等しくしたら、空気が開いてロックし、交換ロッドの突起上に試料ホルダーを固定スライドさせます。 「ロック」の位置に交換ロッドの先端にノブを回します。エアロックを閉じ、エアロック室を排気します。
- ユーセントリックステージエアロックが避難されており、圧力がFIB-SEM室のそれに一致した後、ゲートバルブを開き、交換棒を押し込むことによって、試料を挿入します。楽器ユーセントリックステージにおけるサンプルホルダーを装着することで交換棒のすべての方法をスライドさせ、その後、「アンロック」の位置に交換棒を回転させます。バックアウト交換ロッドをスライドさせ、ゲートバルブを閉じます。
- イオンビームカラムの下にサンプルを配置するためにステージを移動します。ゲートバルブを開き、FIBのライブイオンによって誘発される二次電子像を取得します。低倍率であり、aを使用して高速ラスタ走査は、イオン損傷を最小限にします。通常観察ビームの焦点をリセットし、サンプルにフォーカスがあるまで、ステージのZ高さを上げます。この時点で、試料は、イオンと電子の両方のビームが同じ場所に集束されたクロスポイントの位置にあります。
- SEMの二次電子像を用いて、試料中の関心領域を見つけ、周囲に試料を移動させるためにトラックボールを使用。以前EDSマッピングにより決定されるような関心のある分野は、Ca豊富な領域です。窓の枠に沿って、関心のある特徴を取得するために、必要に応じてステージを回転させます。
- FIBウィンドウインターフェイスでは、追加のデジタル2倍ズームで1,000倍の倍率で試料の迅速なスナップショットをキャプチャし、関心のある領域にわたって〜8ミクロン×2ミクロン蒸着テンプレートを描画します。堆積ボックスの拡大サイズは、異なるサイズの特徴に対応するように調整されてもよいです。 40キロボルトを用いて炭素を堆積させるスパッタ条件を設定します5分間、0.5マイクロ秒の滞留時間を使用して、0.09 nAのビーム、。
- 炭素の堆積後、〜2-3μmのタングステンキャップを生成するために、5分間40 kVで、0.7 nAのビーム、および預金を使用してタングステンを堆積するために堆積条件を変更します。
- 観察ビームを使用して、FIBのスナップショットをキャプチャし、タングステンキャップの周りの4つのボックスのパターンを描画するためにマイクロサンプリングスパッタツールを使用します。約15μm×8μmであることが、上下のボックスを設定します。右のボックス10ミクロン×5ミクロン、および左のボックス6×5ミクロンミクロン、または関心のある領域を囲むのに十分な大きさ。
- 40 kVの、19 nAのビーム、および50マイクロ秒、および各ボックスの3-4スキャンフレームの滞留時間を使用して切断するために製造条件を変更してください。次に、パターンを製作。保護CとW層との製造、関心領域、後、上、下、右両側に取り外したすべての隣接する材料で、島のようになります。
- SAMPを入れて58℃のステージを傾けてルは、電子カラムに、イオンカラムに急角度で表面法線。 FIBを用いて試料「島」の裏側を見つけて、1,000倍の倍率と2〜4倍デジタルズームでスナップショットをキャプチャします。
- それが表示されているところの一番最後に「島」サンプルの裏側の下部にわたって〜15ミクロン×2ミクロンのスパッタパターンを描画します。 3分間の4 nAのビームを使用してボックスを製作、またはビームを試料の下を通って切断するまで "島"。
- ユーセントリックステージを（ゼロに戻る）現在位置から-58°に傾けます。 FIBインタフェースで「プローブで」をクリックすることにより、タングステンマイクロサンプリングプローブを挿入します。ステージ制御パネル上の「MS」を選択し、試験片の上にプローブを移動するためにトラックボールを使用しています。
- 1 KXの倍率でFIBからのライブフィードを取得し、先端が直接マイクロサンプルのタングステンキャップの右側の上にあるように、プローブを配置します。ライブを見ながらSEMからのSE像は、それに接触タングステンキャップまで、プローブを下げるために、ステージパネルのZコントロールノブを使用します。接触が行われた後にブザーが鳴ります。
- 1,000倍と2倍デジタルズームの倍率で40 kVの、0.01 nAのビームを使用してFIBを使用してスナップショットを、キャプチャします。それはマイクロサンプルのタングステンキャップに接触したプローブの先端の上には2μm×2μmのボックスを描画するために堆積ツールを使用してください。
- 2分であり、0.5マイクロ秒の滞留時間のために、40 kVの、0.09 nAのビームを用いてタングステンを堆積させるために条件を設定します。次に、パターンを製作。
- （それはまだサンプルのバルクに接続されている）「アーム」マイクロサンプルの左端の上〜2ミクロン×5ミクロンのスパッタパターンを描画します。 40 kVのを使用してパターンを作製、2分間、またはビープ音まで0.7 nAのビームは、マイクロサンプルは、バルクサンプルから取り外されたことを示しています。
- まで取り付けられたマイクロサンプルとプローブを上昇させるために、Zコントロール・ノブを使用しますそれは、プローブを後退させる、バルクサンプルをクリアします。ホームまたはExchange位置のいずれかにユーセントリックステージを送信します。
- サイドエントリーホルダーに銅半グリッドを置き、サイドエントリーステージパージ室にホルダーをロードします。室を排気し、サイドエントリーホルダーを挿入します。 FIBの位置にホルダーを設定します。
- プレスステージコントロールパネルの側面とFIBモニタ上のビューにハーフグリッドをもたらすために、トラックボールを使用しています。半分グリッドのきれいな部分に移動し、焦点に表面をもたらすために、Zノブを使用します。
- プレスプローブでは、ステージ制御パネルにプローブを押しMSを挿入し、半分グリッド上にマイクロサンプルを配置するためにトラックボールとZノブを使用しています。マイクロサンプルに接触グリッドまでプローブを下げます。
- 1,000倍の倍率（2倍ズーム）でFIB上の画像をキャプチャします。堆積ツールを使用して、マイクロサンプルの下側にわたって〜10ミクロン×3ミクロンのパターンを描画します。ドウェルトンを使用して、40 kVで、0.7 nAのビームで預金タングステン、3分間0.5マイクロ秒のIME。
- スパッタツールを使用して、プローブの先端の上に小さな1ミクロン×3ミクロンのパターンを描画します。離れマイクロサンプルからプローブを切断するために3ミリ秒の滞留時間で40 kVの、0.7 nAのビームを用いたパターンを製作。一度無料のプローブを撤回。
- 5,000X倍率でFIB画像をキャプチャし、マイクロサンプルの上部と下部に2スパッタパターン7ミクロン×4ミクロンを描き、ボックス間〜1μmのギャップを残します。マイクロサンプルの左右をカットしないようにパターンの中心。マイクロサンプルの中心に向かってラスタ方向を設定し、2分間、40 kVのを使用してパターン、4 nAのビーム、および3マイクロ秒の滞留時間の両方を製造します。
- 5,000XでFIBの観察ビームを使用して別の画像をキャプチャします。 〜6.5ミクロン×1ミクロンに前のスパッタボックスのサイズを変更し、〜0.5μmのギャップを残して、40 kVで、0.7 nAのビームを使用して製造するために互いに近づきます。
- サイドエントリーステージに0.5°とキャップを傾け別のFIB画像をTURE。ワイド6μmのスパッタボックスのサイズを変更します。マイクロサンプルの上面の上に上部パターンを置き、40 kVで、0.7 nAのビームを使用して製作してください。 -0.5°に傾け、より低いスパッタパターンとマイクロサンプルの下側に繰り返します。
- さらに〜0.5μmのことでパターン幅を減少させます。 0.5°を傾け、40 kVで、0.09 nAのビームを用いたマイクロサンプルの上面をスパッタ。 -0.5°の傾斜で下側に繰り返します。
- ステージ2.2°を傾け、10,000倍でFIB画像を取得します。幅5μmにスパッタパターンのサイズを変更し、5キロボルト、0.03 NAにビーム条件を変更してください。右上端まで、マイクロサンプルの上側の上に上部パターンを置き、製造。 -2.2°に傾け、下側と底パターンを繰り返します。
- マイクロサンプルが（〜100 nmの厚さ）、電子透明になるまで5 kVのミリング手順を繰り返します。一度、近いgunvalvesを終え、サイドエントリーホルダーを削除します。
8. OTEMに選択されたエリア回折パターンをbtaining
- 分析のための機器を準備するには、デュワーは液体窒素でフラスコと300キロボルトに加速電圧を設定し、両方の満たします。
- FIBを使用して、サンプル調製後、FIB-SEMからサイドエントリーホルダーを取り外し、ホルダーの長さは300 kVのTEMのものと一致するように、ピンの位置を調整します。もう一度、正しいサンプルの向きを確実にするために、標準的なTEMホルダーにそれを比較し、正しい観察位置にホルダーの先端を回転させます。
- 代わりに、標準的なTEMホルダーでFIB-SEMホルダーと場所から添付ラメラとハーフグリッドを削除します。
- TEMの交換室に試料ホルダーをロードし、チャンバを排気します。空気が交換室に導入されるたびに、機器銃バルブが閉じていることを確認してください。交換室は、ポンプダウンしたら、アラーム音が鳴ります。試料ホルダーを時計回りに回転させ、バキュを許可umの第1停止位置までにサンプルホルダを引き出します。
- 機器の真空が回復することを許可し、その後、銃のバルブを開きます。フォーカスをリセットし、約10,000倍の倍率に拡大します。
- 蛍光体スクリーンの中央にビームをシフトするために、アライメント・ノブを使用してください。契約とは、ビームを拡大し、すべてのビーム移動が同心であることを確認してください。必要に応じてコンデンサー非点収差のために調整します。
- 反時計回りに試料ホルダーを回転させ、真空が完全にカラムにホルダーを引くことができます。サンプルをナビゲートし、見つけるためにステージ移動ノブを使用してください。
- サンプルの倍率を大きくして、サンプルが焦点になるまでZ高さを調整します。必要に応じて、光学接眼レンズを使用してください。
- カメラを挿入し、蛍光体スクリーンを削除します。カメラを過飽和を避けるために、必要に応じてビームを展開します。焦点とカメラパラメータを調整し、その後、画像をキャプチャするために取得を開始します。
- 回折パターンを、第1の中心を取得します興味のある機能です。対物絞りを削除し、回折アパーチャを挿入します。
- コントロールパネルのDIFFボタンを押して、回折レンズモードに変更し、ビームを縮小するDIFFコントロールノブを使用します。
- カメラや蛍光体スクリーンの燃焼から回折パターンの中心を防止するために、必要に応じてブランカを挿入します。パターンの画像をキャプチャするために、カメラの取得を開始します。
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Representative Results
tubewormの変態時の石灰化プロセスのいくつかの観察結果は以下のとおりです。 図1は、カラー領域の近くのpH値は、変態後の他の組織よりも高いことを示しています。 図2iが重大な石灰化イベントが始まっていない示唆し、カルシウムが均一に分散しているtubewormを示しています。 図2IIは、関心のある時点を超えてしまった石灰化を示唆し、より長い期間のために石灰化したtubewormを示しています。 図2iiiは石灰化を担当する組織を理解するためのさらなる分析のために選択した関心の石灰化の段階、とtubewormを示しています。 図3は、より高いpH値は、カルセイン染色及びSEM-EDXマッピングの両方から高いCaイオン信号と相関される示します。これらの観察から、関心のライフステージからの組織は、ハイテクで調べましたより局所的な技術、SEM-EBSDを用いてgher解像度。鉱物相の発見に、 図4は、TEMのために関心の材料を持ち上げるために、集束イオンビームの適用と選択された領域の回折分析は、鉱物の結晶性を確認するために示しています。
図1：tubeworm の細胞内pHをマッピング（チャンらから2015年。）。 IBMX処理後71時間の時点で、変態の遅い速度を表しtubeworm、Hydroidesエレガンスは 、細胞内pH分布に大きな不均一性を示しています。 DIC画像（左上）および580 nmでのグレー値で割った640 nmのグレー値から生成された合成画像をpseudocolorizedは、（右上）に示されています。 580分の640 nmの比から計算されたグレー値は、細胞内pHに比例しています。 PROFI合成画像からグレー値のレは、tubeworm（下のパネル）の長手方向の体軸に沿った距離で細胞内pH値に変換しました。細胞内pHと580分の640との間の関係は、発光のnmの比は、in vitroでのキャリブレーション（ - ; R 2 = 0.934; Y、グレー値であり、x、細胞内pH 1.47のy = 0.30x）によって設立されました。 （赤色）pHが8.5以上の細胞内pHを有する領域は、石灰化構造が発見された領域に対応しています。スケールバー= 100ミクロン。 C、襟。 B、鰓ローブ。アリ、anteior。ポスト、後部。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：SEM-EDS を用いて目的のライフステージを特定します。
異なるでTubeworms変態の時点は、（i）1日目後変成tubewormは、Ca信号の均一な分布（ii）の急成長後2日目変成tubewormは、Ca信号のショートリングを示しを示し、さらなる分析のために新たに石灰化の段階をキャプチャするためにスクリーニングしました（iii）の遅い成長後2日目の変成tubewormは、Ca信号のスポットを示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 3：（Chanら 2015）からのライブ顕微鏡を使用してCA信号の特性評価。 （I-IV）、SEM-EDS（V-VII）およびSEM-EBSD（VIII-X）。カルシウムイオンの分布はHydroidesエレガンスの変態後31時間および53時間の時点でカルセイン信号に相関として。 DIC画像（左パネル、3I及びiii）とt彼は信号カルセイン（左パネル、2IIをおよびiv）が示されています。低電圧（5キロボルト）SEM像（中央のパネル、3V）に示すように、後2日目変成Hydroidesエレガンス上の相関電子顕微鏡は、石灰化した構造のスポットを検出しました。 20 kVので行わSEM-EDS分析マッピングは、カルシウムの不均質な分布（;黄色で中央のパネル、3vi、CA）を示しています。カルシウムの内容はtubewormの画像を低電圧（5キロボルト）の大きい表面の詳細を重ねる数として提示され、カルシウム含有量（モル重量％は、小数点は、スポットの位置を示すために整列されている分析）（スポット定量化から得られました20 kVのではSEM-EDS付き）（中央パネル; 3vii）。 15モル重量％よりも高いカルシウム含有量を有する領域は、構造体を石灰化される可能性があります。カルシウムが豊富な地域のSEM-EBSD分析は2viii-xの右パネルにilluastratedされます。 SEM-EDSの結果に見られるようなカルシウムが豊富な領域（白箱）をさらにEBSDを用いて分析した（右パネル; 3viii）（ii）の丸（右のパネル;3ix）EBSD分析部位を示します。菊池パターン（右のパネル; 2倍）がサイトはEDS / EBSD微量分析ソフトウェアのインターフェイスからアラゴナイトであることを示唆しています。 C、襟。 B、鰓ローブ。アリ、前方;ポスト、後部。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：FIB-TEMを用いて、結晶構造のキャラクタリゼーション（Chan らから2015年。）。 EBSDから菊池パターンを示す領域は、TEM試料を作製するために切除した（I）、（II）、集束イオンビーム（FIB）技術（上面図）で切り出し除去周囲の材料、（iii）の材料を用いて解除されましたタングステンプローブ（側面図）、低電圧で得られた〜200nmで、最終的な厚さの（iv）のサンプル。 （v）があった中で丸で囲んだエリアアラゴナイトの単結晶パターンを示す、TEM（VI）において選択された領域の回折パターンの存在について分析しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ライブ光学イメージングは、多細胞生物において、細胞事象を観察するための有用な方法です。ここでは、内部pHおよびカルシウムイオン指示薬は、石灰化部位におけるイオンのフラックスを測定しました。これらの地域では、活性イオンポンプは石灰化2、3を有効にするために、pHおよびCa 2+濃度を上昇させるために必要とされます。生物を研究するために蛍光分子を適用する場合、その使用濃度は無視できる毒性を有し、生理学的に適切な方法で実行するように生物を可能にすることを確実にするために重要です。より低い染色濃度が低毒性になり、通常より長い染色時間10に連結されています。染色期間中の酸素欠乏と廃棄物の蓄積を最小限に抑える、インキュベーション時間の間に幼虫の低密度を維持することが重要です。
ローカライズされたことを含むFIB / TEM法を追求する前に関心領域は、ライフステージとSEM-EDS及びSEM-EBSDのような低解像度の方法を用いて、関心のある組織を通ってスクリーニングすることが重要です。後方散乱モードで試料を観察すると、軽いコントラストが重い原子量11と相関する相対的な元素組成の可視化を可能にします。したがって、SEM-BSE画像もカルシウムイオンおよびオスミウム染色脂質小球のような重い元素が配置されている場所の推定を提供します。 SEM-EDS分析は、サンプルのカルシウムイオンのより具体的なマッピングを可能にします。しかし、結晶のCaCO 3の存在を確認しません。従来のEBSD法は、研磨面12を必要とするが、SEM-EBSDは、結晶構造の検出を可能にします。この研究は、SEM-EBSDは玄米サンプルに有用な情報を提供する方法を示しています。 20 kVのビーム電流は、試料表面での分析の大きな深さを可能にします。したがって、EBSDを検出するための望ましい方法であります特に海洋幼虫のような小さい、無傷の生物学的サンプルにバイオミネラルの存在、。鉱物は菊池パターンが関心13の領域において鉱物相の明白な証拠であると考えられている見て、約70℃で検出器に直面していないときに研磨されていないサンプルは、偽陰性を与えるだろうが。
透過型電子顕微鏡（TEM）材料14のより広い範囲の構造の特徴付けを可能にします。集束イオンビーム（FIB）は、部位特異的抽出及びTEM分析15のための典型的な寸法を有する試料の調製を可能にします。したがって、FIB / TEM技術は、局所的な領域で新たに堆積した生体材料を分析するための適切な方法です。合わせたFIB-SEM機器はまた、統合された電子ビームカラムの使用による試料の損傷を含まない観察を可能にします。試料のタングステンスパッタコーティングは、導電性を増加させ、限界はIをイオンサンプル16のmplantation照射損傷。低滞留時間で細かく集束イオンビームの使用は、有機材料のフライス加工を可能にします。 FIB-SEMの内部に、関心対象の特定の特徴は、バルク試料から抽出し、TEM分析17のための透明性の電子ために薄くすることができます。イオンビームの高エネルギーに、結晶材料がアモルファスにすることができます。これにより、TEM分析用の薄いラメラを調製し、非晶質層を除去するために、低加速電圧、イオンビームを用いて軽減することができる場合に発生することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hexamethyldisilazane | Electron Microscopy Sciences | 16700(EM) | |
| Osmium Tetroxide 2% Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 19192 | |
| IBMX 3-Isobutyl-1-methylxanthine | ThermoFisher Scientific | PHZ1124 | |
| Nigericin, Free Acid | ThermoFisher Scientific | N7143-5MG | |
| 35 mm diameter dish, hole size 27 mm, Glass No.0, Non-coat | ThermoFisher Scientific | D110400 | |
| 5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate | ThermoFisher Scientific | C-1271 | |
| BDH Potassium Chloride, ACS Grade | VWR | BDH0258-500G | |
| Paraformaldehyde reagent grade, crystalline |
Sigma | P6148 | |
| 1 M Hydrochloric Acid for Volumetric Analysis | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 083-01095 | |
| 0.05 M Sodium Hydroxide Solution for Volumetric Analysis | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 199-02185 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | |
| FASW | Iwaki Co. Ltd. | Rei-sea Marine | |
| Mixed Cellulose Ester Membranes; 47 mm dia, 0.45 µm | ADVANTEC | A045A047A | |
| ethanol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 051-00476 | |
| Artificial seawater for buffers | by SOP06 of DOE (1994), cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf | ||
| Sodium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 191-01665 | |
| Potassium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 163-03545 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 135-00165 | |
| Calcium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 039-00475 | |
| Sodium Sulfate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 197-03345 | |
| Hydrochloric Acid | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 089-08415 | |
| 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (tris) | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 207-06275 | |
| 2-aminopyridine | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 011-02775 | |
| Orion 5-star Plus pH meter | Thermo Scientific | ||
| PrpHecT ROSS Micro Combination pH Electrode 8220BNWP | Thermo Scientific | ||
| Axiovision, Version 4.6, Axio Observer Z1 | Zeiss | ||
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD, USA | ||
| HRTEM H500 | Hitachi | ||
| SU6600 VPSEM | Hitachi | ||
| NB5000 Focused Ion and Electron Beam (FIB-SEM) system | Hitachi |
References
- Aizenberg, J., et al. Skeleton of Euplectella sp.: structural hierarchy from the nanoscale to the macroscale. Science. 309 (5732), 275-278 (2005).
- de Nooijer, L. J., Toyofuku, T., Oguri, K., Nomaki, H., Kitazato, H. Intracellular pH distribution in foraminifera determined by the fluorescent probe HPTS. Limnol Oceanogr Methods. 6 (11), 610-618 (2008).
- de Nooijer, L. J., Langer, G., Nehrke, G., Bijma, J. Physiological controls on seawater uptake and calcification in the benthic foraminifer Ammonia tepida. Biogeosciences. 6 (11), 2669-2675 (2009).
- Smith, A. M., Riedi, M. A., Winter, D. J. Temperate reefs in a changing ocean: skeletal carbonate mineralogy of serpulids. Mar Biol. 160 (9), 1-14 (2013).
- Carpizo-Ituarte, E., Hadfield, M. Stimulation of metamorphosis in the polychaete Hydroides elegans Haswell (Serpulidae). Biol. Bull. 194 (1), 14 (1998).
- Bryan, P. J., Kreider, J. L., Qian, P. Y. Settlement of the serpulid polychaete Hydroides elegans (Haswell) on the arborescent bryozoan Bugula neritina (L.): evidence of a chemically mediated relationship. J Exp Mar Biol Ecol. 220, 171-190 (1998).
- Chan, V. B. S., et al. Evidence of compositional and ultrastructural shifts during the development of calcareous tubes in the biofouling tubeworm, Hydroides elegans. J. Struct. Biol. 189 (3), 230-237 (2015).
- DOE. Handbook of methods for the analysis of the various parameters of the carbon dioxide system in sea water. Version 2. Dickson, A. G., Goyet, C. , ORNL/CDIAC-74 (1994).
- Chan, V. B. S., et al. Direct deposition of crystalline aragonite in the controlled biomineralization of the calcareous tubeworm. Front Mar Sci. 2, 97 (2015).
- Bond, J., Varley, J. Use of flow cytometry and SNARF to calibrate and measure intracellular pH in NS0 cells. Cytometry A. 64, 43-50 (2005).
- Lloyd, G. E. Atomic number and crystallographic contrast images with the SEM: a review of backscattered electron techniques. Mineral Mag. 51, 3-19 (1987).
- Perez-Huerta, A., Dauphin, Y., Cuif, J. P., Cusack, M. High resolution electron backscatter diffraction (EBSD) data from calcite biominerals in recent gastropod shells. Micron. 42 (3), 246-251 (2011).
- Bandli, B. R., Gunter, M. E. Electron backscatter diffraction from unpolished particulate specimens: examples of particle identification and application to inhalable mineral particulate identification. Am. Mineral. 97, 1269-1273 (2012).
- Hayat, M. A. Principles and techniques of electron microscopy: biological applications. , Cambridge University Press. (2000).
- Wirth, R. Focused Ion Beam (FIB) combined with SEM and TEM: Advanced analytical tools for studies of chemical composition, microstructure and crystal structure in geomaterials on a nanometre scale. Chem Geo. 261, 217-229 (2009).
- Volkert, C. A., Minor, A. M. Focused ion beam microscopy and micromachining. MRS Bull. 32, 389-399 (2007).
- Kudo, M., et al. Microtexture of larval shell of oyster, Crassostrea nippona: A FIB-TEM study. J. Struct. Biol. 169 (1), 1-5 (2009).
