Charakterisierung von Verkalkungen Events Verwendung von Live-optische und Elektronenmikroskopie-Techniken in einem Marine-Tubeworm

Introduction

Biomineralisation ist eine komplexe Reihe von Ereignissen, die eine Reihe von zellulären Aktivitäten überbrückt was zur Produktion von exquisit bestellt Mineralien ^1. Die Herausforderung besteht darin, sowohl die dynamischen zellulären Prozess und die anspruchsvollen Mineralstrukturen unter Verwendung einer Kombination von optischen und Elektronenmikroskopie Verfahren zu charakterisieren. Eine Erhöhung der intrazellulären pH - Wert begünstigt die Bildung von CaCO ₃ -Kristalle somit die Lebensstadium zu identifizieren , die einen erhöhten pH - Wert , die Zeit zeigt , wenn Verkalkung wahrscheinlich ² werden ^{vorkommendes, 3.}

Die Röhrenwürmer aus der Familie Kalkröhrenwürmer sind gemeinsame Kalkbildner im Meer ^4. Es ist auch ein beliebtes invertebrate Modell für die Meeresforschung, vor allem in Biofouling ^{5, 6.} In dieser Studie duri der Prozess der Verkalkung Mineralisierungs Abteileng Biomineralisation beobachtet. Der rasche Prozess der Metamorphose schließt die Entstehung von Calciumcarbonat Strukturen ^{7, 8.}

Wir zeigen, wie interne pH-Messungen auf der Röhrenwurm durchgeführt werden und wie Lebensphasen und Gewebe relevant für Verkalkung gescreent werden können. Nachdem der Lebensphase von Interesse identifiziert wird, kann das Gewebe verantwortlich für Verkalkung bei einer höheren Auflösungsmethoden unter Verwendung von Elektronenmikroskopie charakterisiert werden. Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie, bestimmen wir die Zeit für Calciumcarbonat erforderlich nach metamorphen Induktion zu erscheinen. Eine ähnliche Lebensphase wurde anschließend mit SEM-EDS für die Elementarzusammensetzungsverteilung sichtbar gemacht, und das abgelagerte Mineral wurde mit zwei verschiedenen Elektronenmikroskopie Methoden analysiert, und zwar SEM-EBSD und FIB-TEM.

Protocol

1. Screening für Lebensphase und Gewebe von Interesse mit Live-Imaging

1. Kultur der Meereslarven Kompetenz nach zuvor beschriebenen Verfahren ^{6, 7, 9.} Inkubieren Sie die Larven bei Röhrenwurm 5 Larven pro ml Dichte mit gefiltertem Meerwasser mit 10 uM SNARF-01.00 über Nacht. Decken Sie den Behälter mit Aluminiumfolie, die fluoreszierende Sonde von Photobleaching zu schützen.
2. Beachten Sie die Larven eine Dissektion Mikroskop. Kompetente Röhrenwurm-Larven bereit für die Metamorphose wird in Vorwärtsrichtung schwimmen statt einer kreisförmigen Bewegung.
3. Übertragen Sie die zuständigen Larven auf einem 60 & mgr; m-Mesh. Drücken Sie die Gitter gegen eine Petrischale, um eine gute Abdichtung bietet Flüssigkeit zu behalten. Schnell lassen Sie die Dichtung zu lösen und das Meerwasser enthält, Fluoreszenzfarbstoff, Beibehaltung der Larven zu verwerfen.
4. Waschen Sie die Larven mit gefiltertem künstlichem Meerwasser (FASW) zweimal, wobeiachten, dass die Larven in den Prozess zu trocknen.
5. Legen Sie 10 bis 20 Larven in dünnen Glasbodenschalen mit 5 ml FASW mit 10 ^-4 M Isobutylmethylxanthin (IBMX) zur Beobachtung der Metamorphose Prozess.
6. Legen Sie die Filterwürfel SNARF-1-Signal (Kanal 1: Ex 510/25 Em 580/30; Kanal 2: Ex 510/25 Em 640/35) zu erfassen, und DIC Bild der Larven.
7. Positionieren Sie die Metamorphose Larven unter dem 20x-Objektiv, dann optimieren Verschlusszeit (100-300 ms) schnell genug, um sicherzustellen, dass ein klares Bild von den lebenden Tieren eingefangen wird.
8. Set 1 & mgr; m Abstand einen Z-Stapel aller drei Kanäle zu erfassen, bei der Abbildung eines lebenden Tieres, Abbilden jede Schicht für alle drei Kanäle, bevor die nächste Schicht der z-Richtung zu bewegen auf würde eine bessere Korrelation zwischen den Kanälen ermöglichen.
9. Export Graustufenbilder für alle Kanäle und Ebenen als TIF-Dateien aus dem Mikroskop-Software: Datei | Export | Dateityp TIF | Anfang.
10. Mit ImageJ, imPort die Bildfolge für jeden Kanal: Datei | Import | Bildsequenz.
    1. Um Kanal 1 λ ₁ ^em importieren, geben Sie Startbild 3 und Schritt: 4.
    2. Um Kanal 2 λ ₂ ^em importieren, geben Sie Startbild 4 und Schritt: 4.
11. Generieren Sie ein zusammengesetztes Bild von λ ₂ ^em von λ ₁ ^em Teilung für jede Schicht Pixel für Pixel (Process | Bild Rechner ... | Bilddatei 640 nm "divide" Bilddatei 580 nm), dh 640/580 nm - Verhältnis.
12. Bild auswählen | Lookup-Tabellen | 16 Farben.
13. Wählen Sie Analyse | Tools | Kalibrierung bar.
14. Untersuchen Sie die verschiedenen Schichten, die Identifizierung der Schicht, die die meisten Heterogenität enthält. Dies bietet die nützliche Informationen über interne pH-Verteilung.
15. Unter Verwendung der Beziehung zwischen 640/580 nm-Verhältnis und pH-Wert, konstruieren eine Plotprofil die Verteilung des internen pH-Wert zu visualisieren.

1. Nach über Nacht Färbung von etwa 20 Larven mit 10 uM SNARF-1 AM, in Stammlösungen von Nigericin und KCl hinzufügen für die Kalibrierung, um bis zu 50 & mgr; M Nigericin und 150 mM KCl.
2. Der pH-Wert des Kalibrierungs AFSW mit verdünnter NaOH oder HCl, bis ein pH-Wert etwa 5,9 erreicht wird. Notieren Sie sich den genauen pH-Wert. Measure pH mit einem pH - Meter mit einer Glaselektrode , die auf Basis von Meerwasser kalibriert wurde 2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol (Tris) und 2-Aminopyridin ^9.
3. Übertragen einer gefärbten Larven Röhrenwurm zusammen mit einer Flüssigkeit mit einem bekannten pH-Wert auf einem trockenen und sauberen Schale für die Messung von Signalen Intensität bei 640 nm und 580 nm.
4. Wiederholen Sie die Schritte 2.2 und 2.3 für vier weitere pH-Punkte im Bereich von 5,9 bis 9,9. Sie stellen eine Reihe von physiologisch relevanten Werte.
5. Überprüfen Sie die Signale erscheinen homogen im ganzen Tierkörper zu gewährleisten. Dies zeigt, dass der intrazelluläre pH wurde e gewesenmit der Umgebungsmeerwasser quilibrated.
6. Bild der Röhrenwurm - Larven an den fünf verschiedenen Meerwasser pH - Umgebungen, notieren Sie die Intensitäten als "Grauwerte" gezeigt bei 640 nm und bei 580 nm, das heißt λ ₂ ^exc und λ ₁ ^exkl.

3. Analyse von Ratiometrisch Bilddaten

1. Geben Sie die Grauwerte als von fünf zufälligen Orten oder aus einem Gebiet von Interesse auf einer Tabellenkalkulation gemessen.
2. Überprüfen Sie die fünf Punkte Kalibrierung eine lineare Beziehung zeigte intrazellulären pH - Wert anzuzeigen (zB Gleichung wie y = 0.30x - 1,47; y = Grauwert; x = pH; R² = 0,934).
3. Berechnen Sie die intrazellulären pH-Werte aus der Gleichung in Schritt 1.13 die gemessene 640/580 nm Intensitätsverhältnis verwendet wird.

4. Proben Preservation, Dehydration und Montage für die Elektronenmikroskopie

1. Bewahren Sie die Lebensphase des Interesses mit 4% Paraformaldehyd. in dieser Studie, Fixieren Sie die Röhrenwürmer 2-4 Tage nach der Befestigung, die Tiere in Fixiermittel bis zur Analyse halten.
2. Arbeiten in einem Abzug, post-fix die Probe mit 1% Osmiumtetroxid wässrige Lösung für 30 min Gewebe Schrumpfung während der Entwässerungsprozess zu minimieren.
3. Dehydratisieren der Probe mit einer abgestuften Ethanolreihe: 50% Ethanol für 5 min, 70% Ethanol für 5 min, 85% Ethanol für 5 min, 95% Ethanol für 5 min, und schließlich absolutem Ethanol zweimal für 5 min.
4. Arbeiten in einem Abzug, fügen Sie eine 1: 1-Lösung von Ethanol und Hexamethyldisilazan (HMDS) auf die Probe, so dass die Flüssigkeit vollständig zu verdampfen.
5. In der Abzugshaube, 100% HMDS auf die Probe, so dass die Flüssigkeit vollständig zu verdampfen.
6. Mit einem Diamantmesser, führen ein paar Schnitte in die Kulturschale, ein paar Röhrenwürmer umgibt. Mit dem Deckel auf, halten Sie den Schalenboden gegen einen Aluminium-Stub die Schale zu brechen.
7. Unter einem Präpariermikroskop, finden sie eine gebrochene Stück eine intakte Röhrenwurm enthält.
8. Bewerben Silberfarbe auf eine Aluminium Stummel und sichern sorgfältig das Fragment mit dem Stummel. Malen rund um die Ränder des Kunststoff-Fragment zu reduzieren Aufladen.

5. Suchen eines Calcium-reichen Region Mit SEM-EDS

1. Sichern Sie die Probe Stummel auf den Probenhalter.
2. Messen Sie die Höhe der gesamten Baugruppe gegen das Messgerät mit dem Mikroskop vorgesehen ist, um die Höhe einzustellen, indem die Sicherungsscheibe Auflockern und Drehen der Pfosten, bis die Probe auf Standardhöhe ist, oder die Höhe ein, wie aufgezeichnet.
3. Zugeben, Luft in das Mikroskop Austauschkammer und klappen Sie die Kammertür offen. Schieben Sie den Probenhalter auf das Ende des Austauschstabes. Dann schließen und Kammer evakuieren.
4. Öffnen Sie die Absperrschieber und schieben Sie den Wechselstange in Richtung der Mikroskopkammer. Die Wechselstange den ganzen Weg in den vollen Genuss der Probenhalter in den Mikroskoptisch sitzt. Ziehen Sie die Wechselstange und schließen Sie das Absperrventil.
5. Eingang ter Dimensionen probieren und die Bühne in die Home-Position senden, um die Probe unter der Elektronensäule zu platzieren.
6. Stellen Sie die Kammer Vakuumniveau auf 20-30 Pa in der VP-SEM-Modus. Stellen Sie die Elektronenbeschleunigungsspannung bis 20 kV und schalten Sie die Hochspannung an.
7. Heben Sie die Bühne auf eine Probe Arbeitsabstand von 10 mm. Erwerben Sie einen Live-Feed und die Probe zu lokalisieren. Optimieren Sie das Bild, um den Astigmatismus Anpassung und Fokussierung wie nötig.
8. Öffnen Sie die SEM-EDS-Programm und wählen Sie die EDS-SEM-Modus-Option. Wählen Sie die Menüoption eine EDS-Karte laufen zu lassen.
9. Änderungs Kondensorlinse und Einstellungen Öffnung eine Totzeit von ~ 30% bei einer Prozesszeit von 3 zu erreichen, wie durch den Frequenzmesser in dem SEM-EDS-Programm überwacht. Führen Sie Strahl und Blende Ausrichtung Verfahren nach Änderungen an Strahl Einstellungen vornehmen.
10. Wählen Sie eine Vergrößerung, so dass ein einziger Organismus das gesamte Sichtfeld ausfüllt. Aktivieren Sie die Option Korrektur Drift und erfassen ein Bild in der SEM-EDS-Programm.
11. erwerben Sie map Daten mit der Organismus das gesamte Sichtfeld zu füllen, eine Verweilzeit von 50 bis 100 ms verwendet. Führen Sie die Karte, bis die Daten unterschiedliche Lokalisierung von Ca innerhalb des Organismus zeigt (ca. 15 min).
12. Punkt-Quantifizierung Daten zu erhalten, ändern Sie die Prozesszeit bis 6 und stellen Sie den Elektronensonde mit einer Totzeit von ~ 30% zu erwerben. Führen Sie Ausrichtungsschritte und das Bild bei Bedarf zu optimieren.
13. Wählen Sie den Punkt und ID-Option in der SEM-EDS-Programm und ein anderes Bild zu erwerben. Mit dem Single-Point-Tool, klicken Sie auf Bereiche, die Ca reichen in der EDS-Karte erschien, sowie Ca fehlenden Bereiche zum Vergleich. Scannen Sie jeden Punkt für eine Live-Zeit von 30 s.

6. Identifizierung von kristallographischen Informationen von Calcium-reichen Regionen Mit SEM-EBSD

1. Entfernen Sie die Plastik Fragment Probe von Interesse von Flachprobe Stummel enthält und bringt an der geneigten Fläche eines 45 ° vorge gekippt Stummel mit Silber leitfähigen Kleber.
2. Schrauben Sie den Stummel auf die Probe hältere und Position der Winkelfläche des Stutzens (mit Probe) in Richtung der Vorderseite des Probenhalters. Setzen Sie den Probenhalter in die Kammer des Mikroskops die Austauschkammer verwendet wird.
3. Stellen Sie die Vakuumkammer auf 30 Pa und Elektronenbeschleunigungsspannung bis 20 kV. Senden Sie die Probe unter der Elektronensäule und kippen Sie die Stufe 25 ° der Probenoberfläche mit dem Elektronenstrahl von normalen ca. 70 ° zu platzieren. Schalten Sie die Hochspannung an.
4. Heben Sie die Bühne zu einem Arbeitsabstand von ca. 18 mm. Verwenden Sie den Trackball, um die Bühne zu bewegen und ein Exemplar finden. Erhöhen Sie die Vergrößerung spezifischen Merkmale von Interesse zu gestalten. Richten Sie den Strahl und optimieren Sie das Bild wie nötig.
5. Öffnen Sie die SEM-EDS-Programm in der EBSD-Modus. Wählen Sie Calcit und Aragonit als Phasen von Interesse. Legen Sie die EBSD Kamera in einem Abstand von 154 mm. Stellen Sie die Kamera Bedingungen auf 1 x 1 Binning und 100 ms Bildzeit. Mit einem schnellen Strahl Raster, erwerben einen Hintergrund.
   HINWEIS: Eine andere Frameratekann in Abhängigkeit von der Elektronensonde erforderlich sein; stellen Sie die Sonde oder Kamerabildrate ein Signal von etwa 90% zu erreichen.
6. Aufnehmen eines Bildes in der SEM-EDS-Programm. Verwenden Sie den Spot-Analyse-Tool, und klicken Sie irgendwo auf dem Bild an diesem Punkt den Strahl zu scannen. Beachten Sie die Kamera Fenster, um zu sehen, ob irgendwelche Kikuchi-Muster erkannt werden.
7. Klicken Sie auf verschiedene Bereiche der Bildpotential Verkalkung Websites zu scannen, an jedem Punkt das Kamerafenster beobachten, um zu sehen, ob Kikuchi Bänder vorhanden sind. Wenn Muster vorhanden sind und in der Datenbank eine der ausgewählten Phasen übereinstimmen, werden sie automatisch indiziert werden.

7. TEM-Probenvorbereitung FIB-SEM

1. Sputter - Beschichtung der vorbereiteten SEM Probe mit Platin oder einem ähnlichen Material mit einer leitfähigen Schicht zu schaffen.
   1. Legen Sie die zuvor festgelegten, dehydriert und montiert Proben in das Gehäuse des Sputter-Coater und schalten Sie das Gerät zu beginnen, um die Pumpkammer nach unten.
   2. Sobald die Kammer Vakuum 40 mTorr oder weniger liest, drehen Sie den Gaswechsel auf und die Argongasstrom erhöhen, um einen Kammerdruck von 200 mTorr zu erreichen. Stellen Sie den Gasstrom eine endgültige Kammerdruck von 80 mTorr zu erreichen.
   3. Schalten Sie den Spannungsschalter auf und erhöhen die Spannung einen Strom von 15 mA zu erreichen. Stellen Sie den Timer und Mantel für längere Zeit (~ 10 min) eine dicke Schicht (~ 60 nm) zu erstellen, die die Probenoberfläche von Ionenbestrahlung Beschädigung schützt. Regulieren Sie die Spannung ein stabiles 15 mA Strom aufrechtzuerhalten.
   4. Sobald Sie fertig sind, schalten Sie den Beschichter das Vakuum zu lösen und die Probe zu entfernen.
2. Schrauben Sie die Basis des vorbereiteten, Sputter beschichtete Probe auf die M4 Schraube Pfosten des Instruments Probenhalter. Ziehen Sie handfest, lösen Sie die Sicherungsmutter, und drehen Sie dann den Probenhalter Post die Höhe der Baugruppe zu ändern. Verwenden Sie die Laser-Höhenmesser und passen Sie die Höhe innerhalb von 1 mm (= 0,04 Zoll, wie in Video angezeigt) der Standard supplied mit dem Instrument.
3. Schließen Sie alle Pistole Ventile in der FIB-SEM, und dann Luft in die euzentrischen Bühne airlock zugeben. Sobald der Druck mit der Umgebung angeglichen hat, schieben die Luft geöffnet sperren und den Probenhalter auf den Zinken des Wechselstange befestigen. Drehen Sie den Knopf am Ende des Austauschstange mit dem "Lock" -Position. Schließen Sie die Luftschleuse und evakuieren die Schleusenkammer.
4. Sobald die euzentrischen Stufe Luftschleuse evakuiert worden und der Druck entspricht der des FIB-SEM Kammer, öffnen Sie das Absperrventil und die Probe ein, indem Sie in den Wechselstange drückt. Die Wechselstange den ganzen Weg in den Probenhalter in der Instrumenten euzentrischen Bühne zu setzen, drehen Sie dann den Wechselstab mit dem "Betriebsposition". Die Wechselstange wieder aus und schließen Sie das Absperrventil.
5. Bewegen Sie die Stufe der Probe unter der Ionenstrahlsäule zu positionieren. Öffnen Sie die Absperrschieber und erwerben einen Live-Ionen-induzierte Sekundärelektronenbild des FIB. Verwenden geringer Vergrößerung und einschnelle Rasterscan-Ionen-Schaden zu minimieren. Setzen Sie den Fokus des normalen Beobachtungsstrahlen und erhöhen die Z Höhe der Bühne, bis die Probe im Fokus ist. Zu diesem Zeitpunkt ist die Probe am Kreuzungspunkt-Position, in der sowohl die Ionen- und Elektronenstrahlen werden an der gleichen Stelle ausgerichtet.
6. Mit dem Sekundärelektronenbild aus dem SEM, suchen Sie den Bereich von Interesse in der Probe mit dem Trackball um die Probe zu bewegen. Bereiche von Interesse sind reichen Gebiete Ca, wie zuvor von EDS-Mapping bestimmt. Drehen Sie die Bühne als notwendig, um die Merkmale von Interesse im Einklang mit dem Rahmen des Fensters zu erhalten.
7. Auf der FIB Fenster-Interface, erfassen einen schnellen Überblick der Probe bei einer Vergrößerung von 1,000x mit einem zusätzlichen digitalen 2fach-Zoom und eine ~ 8 um x 2 um Ablagerung Schablone über den Bereich von Interesse zu ziehen. Der Vergrößerungsgröße der Ablagerungsfeld eingestellt werden können Merkmale unterschiedlicher Größen aufzunehmen. Stellen Sie die Sputterbedingungen Kohlenstoff unter Verwendung eines 40 kV zu deponieren0,09 nA beam, eine Verweilzeit von 0,5 & mgr; s für 5 min unter Verwendung.
8. Nach der Abscheidung von Kohlenstoff, ändern Sie die Ablagerungsbedingungen Wolfram unter Verwendung eines 40 kV, 0,7 nA Strahl und Kaution für 5 min zur Abscheidung einer ~ 2-3 um Wolfram Kappe zu erzeugen.
9. Nehmen Sie ein FIB Schnappschuss mit dem Beobachtungsstrahl und verwenden Sie das microsampling Sputter-Tool, um ein Muster von vier Boxen rund um die Wolfram-Kappe ziehen. Den oberen und unteren Kästen etwa 15 um sein x 8 & mgr; m; das rechte Feld 10 & mgr; m × 5 & mgr; m, und die linke Box 6 um x 5 um, oder groß genug, um den Bereich von Interesse zu umgeben.
   1. Ändern Sie die Herstellungsbedingungen zu schneiden Sie ein 40 kV unter Verwendung von 19 nA Strahl, und eine Verweilzeit von 50 & mgr; s und 3-4 Scanrahmen für jede Box. Dann das Muster herzustellen. den Bereich von Interesse, mit Schutz C und W-Schichten wird eine Insel, mit allen angrenzenden Material auf der Oberseite entfernt, unten, und der rechten Seite nach der Herstellung ähneln.
10. Kippen Sie die Stufe 58 ° die Samp zu setzenle Oberfläche zu der Elektronensäule und in einem steilen Winkel auf die Ionensäule normal. Suchen Sie die Rückseite der Probe "Insel" mit dem FIB und erfassen einen Schnappschuss bei 1,000x Vergrößerung und 2-4x Digitalzoom.
11. Zeichnen Sie ein ~ 15 & mgr; m × 2 & mgr; m-Sputter-Muster über den Boden der Rückseite der Probe "Insel", ganz am Ende, wo es sichtbar ist. Fabrizieren die Box ein 4 nA Strahl für 3 min, oder bis der Strahl durch den Boden der Probe geschnitten "Insel".
12. Kippen Sie die euzentrischen Stufe -58 ° von der aktuellen Position (auf Null). Legen Sie die Wolfram microsampling Sonde durch "Sonde" in der FIB-Schnittstelle klicken. Wählen Sie "MS" auf der Bühne Bedienfeld und verwenden Sie den Trackball, um die Sonde über die Oberseite der Probe zu bewegen.
13. Erwerben Sie einen Live-Feed aus dem FIB bei einer Vergrößerung von 1 kx und die Position der Sonde, so dass die Spitze direkt über der rechten Seite der Wolframkappe des Mikroprobe ist. Unter Beobachtung einer LiveSE-Bild aus dem SEM, verwenden Sie die Z-Steuerknopf der Bühne Tafel die Sonde, bis er an der Wolfram Kappe zu senken. Ein akustisches Signal ertönt, sobald der Kontakt hergestellt wurde.
14. Nehmen Sie einen Schnappschuss mit dem FIB mit einem 40 kV, 0,01 nA Strahl, bei einer Vergrößerung von 1,000x und 2X Digitalzoom. Verwenden Sie die Abscheideanlage eine 2 um x 2 um Box über die Spitze der Sonde zu ziehen, wo er die Wolframkappe der Mikroprobe in Berührung gekommen ist.
    1. Setzen die Bedingungen Wolfram unter Verwendung eines 40 kV, 0,09 nA beam, für 2 min und einer Verweilzeit von 0,5 & mgr; s abzuscheiden. Dann das Muster herzustellen.
15. Zeichne eine ~ 2 & mgr; m × 5 & mgr; m-Sputter-Muster über dem linken Ende der Mikroprobe "Arm" (wo es noch an der Masse der Probe verbunden ist). Fabrizieren das Muster unter Verwendung eines 40 kV, 0,7 nA Strahl, für 2 Minuten oder bis der Signalton zeigt an, dass die Mikroprobe aus der Gesamtprobe abgelöst wurde.
16. Verwenden Sie die Z-Steuerknopf die Sonde mit angeschlossenem Mikroprobe zu erhöhen, bises löscht den Massenprobe, dann die Sonde zurückziehen. Senden Sie die euzentrischen Bühne entweder zu Hause oder Exchange-Position.
17. Legen Sie ein Kupferhalb Gitter in einen Seiteneingang Halter und laden den Halter in die Seiteneingang der Bühne Spülkammer. Evakuieren der Kammer und legen Sie den Seiteneingang Halter. Stellen Sie die Halterung an der FIB Position.
18. Drücken Sie Side auf der Bühne Bedienfeld und den Trackball verwenden, um die Halbraster in Blick auf die FIB-Monitor zu bringen. Bewegen Bereich des Halb Gitter zu reinigen und zu verwenden, um die Z-Knopf, um die Oberfläche in den Fokus zu bringen.
19. Drücken Sie Probe in der Sonde, drücken Sie MS auf der Bühne Bedienfeld, und verwenden Sie den Trackball und Z-Knopf einzulegen, um die Mikroprobe über die Hälfte Raster zu positionieren. Senken Sie die Sonde bis in die Mikroprobe in Kontakt mit dem Netz.
20. Aufnehmen eines Bildes auf dem FIB bei 1,000x Vergrößerung (2-fach Zoom). Verwenden Sie die Abscheideanlage und zeichnen Sie ein ~ 10 um x 3 um Muster über die Unterseite der Mikroprobe. Kaution Wolfram mit einem 40 kV, 0,7 nA Strahl, unter Verwendung einer Verweilzeit time von 0,5 & mgr; s für 3 min.
21. Verwenden Sie das Sputter-Werkzeug und ziehen Sie eine kleine 1 um x 3 um Muster über die Spitze der Sonde. Fabrizieren das Muster ein 40 kV, 0,7 nA Strahl bei einer Verweilzeit von 3 ms unter Verwendung der Sonde weg von der Mikroprobe zu schneiden. Ziehen Sie die Sonde einmal frei.
22. Nehmen Sie ein FIB Bild bei 5.000-facher Vergrößerung und zeichnen zwei Sputter-Muster 7 um x 4 um am oberen und unteren Rand des Mikroprobe, eine ~ 1 & mgr; m Abstand zwischen den Boxen zu verlassen. Center, um die Muster, um nicht die linke und rechte Seite des Mikroprobe zu schneiden. Fabrizieren beide Muster eine 40 kV, 4 nA Strahl verwendet, und eine Verweilzeit von 3 & mgr; s für 2 min, Einstellen der Rasterrichtung in Richtung der Mitte der Mikroprobe.
23. Nehmen Sie ein anderes Bild unter Verwendung des FIB Beobachtungsstrahlen bei 5.000-facher. Ändern Sie die Größe der vorherigen Sputter-Boxen auf ~ 6,5 um x 1 um, rücken näher zusammen eine Lücke von ~ 0,5 & mgr; m zu verlassen und Herstellung unter Verwendung eines 40 kV, 0,7 nA Strahl.
24. Kippen Sie den Seiteneingang Stufe 0,5 ° und Kappeture andere FIB Bild. Ändern Sie die Größe der Sputter-Boxen bis 6 & mgr; m breit. Positionieren Sie die Top-Muster über die Oberseite der Mikroprobe und Herstellung unter Verwendung eines 40 kV, 0,7 nA Strahl. Tilt -0,5 ° und wiederholen Sie mit dem unteren Sputter-Muster und Unterseite der Mikroprobe.
25. weiter verringern die Musterbreite von ~ 0,5 & mgr; m. Neigen 0,5 ° und Sputter die Oberseite der Mikroprobe unter Verwendung eines 40 kV, 0,09 nA Strahl. Wiederholen Sie mit der Unterseite bei -0,5 ° Neigung.
26. Kippen Sie die Stufe 2,2 ° und erwerben ein FIB Bild bei 10.000fach. Resize-Sputter-Muster bis 5 & mgr; m breit und ändern Strahlbedingungen zu 5 kV, 0,03 nA. Positionieren Sie das obere Muster über die Oberseite der Mikroprobe, bis die obere Kante und herzustellen. Kippen -2,2 ° und wiederholen Sie mit der unteren Seite und Boden-Muster.
27. Wiederholen Sie 5 kV Frässchritte, bis die Mikroprobe Elektronen transparent wird (~ 100 nm Dicke). Sobald Sie fertig sind, schließen gunvalves und seitlichem Halter entfernen.

8. Obtaining auf einem TEM Selected Area Diffraction Pattern

1. Um das Instrument für die Analyse vorzubereiten, füllen Sie beide Dewargefäße mit flüssigem Stickstoff und stellen Sie die Beschleunigungsspannung auf 300 kV.
2. Nach der Probenvorbereitung der FIB, den Seiteneingang Halter aus dem FIB-SEM entfernen und die Stiftposition einstellen, so dass der Halter Länge, dass der 300-kV-TEM entspricht. Drehen Sie die Spitze des Halters an der Position richtige Beobachtung, noch einmal an die Standard-TEM-Halter Vergleich korrekte Probenorientierung zu gewährleisten.
   1. Alternativ nehmen Sie die Halbraster mit angebautem Lamellen aus dem FIB-SEM Halter und in den Standard-TEM-Halter.
3. Legen Sie den Probenhalter in die Austauschkammer des TEM und die Kammer zu evakuieren. Stellen Sie sicher, dass das Instrument Pistole Ventil geschlossen ist, wenn Luft in die Austauschkammer zugelassen wird. Sobald die Austauschkammer hat abgepumpt, wird ein akustischer Alarm ertönt. Drehen Sie den Probenhalter im Uhrzeigersinn und ermöglichen die vacuum den Probenhalter in die erste Anschlagposition zu ziehen.
4. Lassen Sie das Instrument Vakuum zu erholen, und öffnen Sie dann die Pistole Ventil. Setzen Sie den Fokus und Zoom auf eine Vergrößerung von etwa 10.000fach.
5. Verwenden Sie die Ausrichtung Regler, um den Strahl in die Mitte des Leuchtschirms zu verschieben. Vertrag und erweitern Sie den Strahl und sicherzustellen, dass alle Strahlbewegung konzentrisch ist. Stellen Sie für Kondensator stigmatism wie nötig.
6. Drehen Sie den Probenhalter gegen den Uhrzeigersinn und damit das Vakuum den Halter vollständig in die Säule zu ziehen. Verwenden Sie die Tischbewegung Knöpfe zu navigieren und um die Probe zu lokalisieren.
7. Erhöhen Sie Vergrößerung auf die Probe und stellen Sie die Z-Höhe, bis die Probe im Fokus ist. Verwenden Sie die optische Okulare wie nötig.
8. Legen Sie die Kamera aus und entfernen den Leuchtstoffschirm. Erweitern Sie den Strahl nach Bedarf Übersättigung der Kamera zu vermeiden. Stellen Sie den Fokus und Kameraparameter, dann Erfassung starten ein Bild zu erfassen.
9. Um ein Beugungsmuster, das erste Zentrum erwerbenMerkmal von Interesse. Entfernen Sie die Objektivöffnung und setzen Sie die Beugungsöffnung.
10. Wechseln Sie in das Beugungslinse Modus mit der DIFF-Taste auf dem Bedienfeld drücken und den DIFF Steuerknopf verwenden, um den Strahl zu schrumpfen.
11. Legen Sie die Blanker als notwendig, um die Mitte des Beugungsmusters zu verhindern, dass die Kamera oder Phosphorschirm brennt. Starten Sie Erwerb der Kamera ein Bild des Musters zu erfassen.

Representative Results

Im Folgenden werden einige Beobachtungen des Verkalkungsprozess während der Metamorphose des Röhrenwurm. 1 zeigt , dass die pH - Werte in der Nähe des Kragenbereich ist höher als die anderen Gewebe nach der Metamorphose. Abbildung 2i zeigt eine Röhrenwurm mit homogener Verteilung von Ca, was darauf hindeutet , keine größeren Verkalkung Ereignisse begonnen haben; Abbildung 2II zeigt einen Röhrenwurm , die für einen längeren Zeitraum verkalkt ist, was darauf hindeutet , Verkalkung ist über den Zeitpunkt des Interesses gegangen; Abbildung 2iii zeigt einen Röhrenwurm mit der Verkalkung der Bühne von Interesse, die für die weitere Analyse ausgewählt wurde , das Gewebe verantwortlich für die Mineralisierung zu verstehen. Abbildung 3 zeigt die höheren pH - Werte werden mit den höheren Ca - Ionen - Signale korreliert sowohl von Calcein - Färbung und REM-EDX - Mapping. Aus diesen Beobachtungen wurde das Gewebe aus der Lebensphase des Interesses an einem hallo geprüftgher Auflösung eine lokalisierte Technik, SEM-EBSD. Nach der Entdeckung der Mineralphase, Figur 4 zeigt die Anwendung von fokussierten Ionenstrahl das Material von Interesse für TEM herauszuheben und ausgewählten Bereich Beugungsanalyse die Kristallinität des Minerals zu bestätigen.

Abbildung 1: Intrazelluläre pH - Mapping des Röhrenwurm (von Chan et al 2015) . . Mit 71 h nach IBMX Behandlung, ein Röhrenwurm, Hydroides elegans, die eine langsamere Geschwindigkeit der Metamorphose darstellt zeigt eine große Heterogenität in den intrazellulären pH - Verteilung. DIC Bild (oben links) und pseudocolorized zusammengesetzte Bilder aus den Grauwerten bei 640 nm von Grauwerten bei 580 nm (oben rechts) unterteilt erzeugt werden gezeigt. Die berechneten Grauwerte aus dem 640/580 nm-Verhältnis ist proportional zu der intrazellulären pH. Der profiles der Grauwerte aus den zusammengesetzten Bilder wurden entlang der Körperlängsachse des Röhrenwurm (unteres Feld) in intrazelluläre pH-Werte über den Abstand umgewandelt. Die Beziehung zwischen intrazellulären pH - Wert und 640/580 nm Verhältnis in Emission etabliert wurde durch in - vitro - Kalibrierung (y = 0.30x - 1.47; R ² = 0,934; y, Grauwert; x, intrazellulären pH). Regionen mit intrazellulären pH-Wert über pH 8,5 (in rot) entsprechen den Bereichen, in denen verkalkte Strukturen gefunden. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m; c, Kragen; b, Kiemen Lappen; Ameise, anteior; Post, posterior. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2: Ermittlung der Lebensphase des Interesses SEM-EDS verwenden.
Tubeworms bei verschiedenenZeitpunkt der Metamorphose wurden gescreent, um die neu verkalkende Bühne für eine weitere Analyse (i) Einen Tag 1 post-metamorphen Röhrenwurm zeigt eine homogene Verteilung von Ca-Signal (ii) Ein schneller wachsenden Tag 2 post-metamorphen Röhrenwurm zeigt einen kurzen Ring von Ca-Signal zu erfassen (iii) Ein langsamer wachsenden Tag 2 nach metamorphen Röhrenwurm zeigt Flecken von Signal Ca. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: Charakterisierung von Ca Signale Live - Mikroskopie (von Chan et al 2015) . . (I-iv), SEM-EDS (v-vii) und SEM-EBSD (viii-x). Die Verteilung von Calcium - Ionen , wie bei 31 h zu Calcein Signal korreliert und 53 h nach der Metamorphose der Hydroides elegans. Die DIC Bilder (linkes Bild, 3i und iii) und ter Calcein Signal (linkes Bild, 2II und iv) gezeigt. Korrelative Elektronenmikroskopie an den Tag 2 post-metamorphen Hydroides elegans entdeckt Flecken von verkalkten Strukturen, wie sie in einer niedrigeren Spannung (5 kV) REM - Aufnahme (Mitteltafel, 3 V) gezeigt. SEM-EDS-Analyse-Mapping, bei 20 kV durchgeführt wird, zeigt eine heterogene Verteilung von Calcium (Mitteltafel, 3vi, Ca, in gelb). Die Ca Inhalt als Zahlen dargestellt werden eine größere Oberfläche Detail niedrigerer Spannung (5 kV) Bild der Röhrenwurm überlagert, die Ca-Gehalte (Mol Gew%, werden Dezimalstellen ausgerichtet die Lage vor Ort zu zeigen Analysen) von Punkt Quantifizierung erhalten ( mit SEM-EDS bei 20 kV) (Mitteltafel; 3vii). Regionen mit einem Ca-Gehalt von mehr als 15 mol% wt wahrscheinlich verkalkte Strukturen. SEM-EBSD Analyse der Calcium-reichen Regionen ist auf der rechten Seite von 2viii-x illuastrated. Die Calcium-reichen Regionen (weißer Kasten), wie in SEM-EDS Ergebnisse wurden weiter mit EBSD analysiert (rechtes Bild; 3viii) (ii) Der Kreis (rechts;3iX) zeigt die EBSD Analyse Stelle; ein Kikuchi-Muster (rechtes Bild; 2x) schlägt vor, die Website von der Schnittstelle von EDS / EBSD Mikro-Analyse-Software aragonitischen ist. c, Kragen; b, Kiemen Lappen; Ameise, vordere; Post, posterior. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4: Charakterisierung der Kristallstruktur unter Verwendung von FIB-TEM (von Chan et al 2015) . . (I) Die Region ein Kikuchi Muster aus EBSD ausstellenden herausgeschnitten wurde eine TEM-Probe herzustellen, (ii) das entfernte umgebende Material durch einen fokussierten Ionenstrahl ausgeschnitten (FIB) Technik (Draufsicht), (iii) das Material angehoben wurde mit einem Wolframsonde (Seitenansicht), (iv) die Probe mit einer Enddicke von ~ 200 nm, die bei einer niedrigeren Spannung erhalten wurde. Eingekreisten Bereich in (v) warenauf die Anwesenheit von ausgewählten Flächenbeugungsmuster in einem TEM (vi) analysiert, wobei eine einkristalline Muster von Aragonit zeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Live optische Abbildung ist ein nützliches Verfahren für in einem mehrzelligen Organismus zellulärer Ereignisse zu beobachten. Hier internen pH-Wert und Calciumionen-Indikatoren wurden verwendet, um den Fluss von Ionen an den Mineralisierungs Standorten zu messen. In diesen Bereichen wird die aktive Ionenpump erforderlichen pH zu erhöhen , und Ca ²⁺ -Konzentration Verkalkungs ^{2, 3} zu ermöglichen. Wenn fluoreszierende Moleküle Anlegen eines Organismus zu untersuchen, ist es wichtig, sicherzustellen, dass die verwendete Konzentration vernachlässigbare Toxizität aufweist und ermöglicht, den Organismus in einer physiologisch relevanten Weise durchzuführen. Eine geringere Anfärbung Konzentration wäre weniger toxisch und wird in der Regel mit einer längeren Färbezeit ¹⁰ gekoppelt. Es ist wichtig, eine geringe Dichte der Larven während der Inkubationszeit zu halten, Sauerstoffmangel und Abfallaufkommen in der Färbungsperiode zu minimieren.

Bevor die FIB / TEM Methoden verfolgt, was eine lokalisierte beinhaltetRegion von Interesse, ist es wichtig, durch die Lebensphase und Gewebe von Interesse mit geringerer Auflösung Methoden wie SEM-EDS und SEM-EBSD zu screenen. Die Beobachtung der Probe unter rückgestreute Modus ermöglicht die Visualisierung der relativen elementaren Zusammensetzung , wo leichter Kontrast ¹¹ bis schwerer Atomgewicht korreliert. Daher SEM-BSE-Bilder liefern auch eine Schätzung von wo die schwereren Elemente wie Kalzium-Ionen und Osmium gefärbten Lipidkügelchen befinden. SEM-EDS-Analyse ermöglicht eine spezifische Zuordnung von Calciumionen auf den Proben. Allerdings ist es nicht das Vorliegen von kristallinem _CaCO3 bestätigen. SEM-EBSD ermöglicht den Nachweis von kristallinen Strukturen, obwohl herkömmliche EBSD Methoden ¹² eine polierte Oberfläche erfordern. Diese Studie zeigt, wie SEM-EBSD auf einer unpolierten Probe nützliche Informationen zur Verfügung stellen kann. A 20 kV Strahlstrom ermöglicht eine größere Tiefe der Analyse an der Probenoberfläche. Daher ist EBSD ein wünschenswertes Verfahren zum Nachweisdas Vorhandensein von Biomineral, insbesondere für kleine, intakte biologische Proben wie Meereslarven. Obwohl die unpolierten Proben würden falsch - negative Ergebnisse geben, wenn Mineralien sind nicht auf den Detektor bei etwa 70 ° gegenüber , sehen ein Kikuchi Muster ¹³ eindeutige Beweise für eine Mineralphase in der Region von Interesse angesehen wird.

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ermöglicht strukturelle Charakterisierung eines breiteren Bereichs von Materialien ^14. Der fokussierte Ionenstrahl (FIB) ermöglicht die ortsspezifische Extraktion und Herstellung einer Probe mit typischen Abmessungen für die TEM - Analyse ^15. Daher ist die FIB / TEM-Technik ein geeignetes Verfahren neu abgelagerten Biomaterialien in einem lokalisierten Bereich zu analysieren. Kombinierte FIB-SEM Instrumente auch beschädigungsfreie Beobachtung einer Probe durch Verwendung eines integrierten Elektronenstrahlsäule ermöglichen. Wolfram Sputterbeschichtung der Probe erhöht die Leitfähigkeit und Grenzen Ions implantation und Strahlungsschäden der Probe ^16. Die Verwendung eines fein fokussierten Ionenstrahl mit einer geringen Verweilzeit ermöglicht Fräsen von organischen Materialien. Im Inneren des FIB-SEM, kann ein besonderes Merkmal von Interesse aus einer Massenprobe und Transparenz ¹⁷ für die TEM - Analyse zur Elektronendünnt extrahiert werden. Aufgrund der hohen Energie des Ionenstrahls kann kristallinen Materialien amorph gemacht werden. Dies kann auftreten, wenn eine dünne Lamelle für die TEM-Analyse vorbereitet und kann mit einer niedrigen Beschleunigungsspannung Ionenstrahls abgeschwächt werden, um die amorphe Schicht zu entfernen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hexamethyldisilazane	Electron Microscopy Sciences	16700(EM)
Osmium Tetroxide 2% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	19192
IBMX 3-Isobutyl-1-methylxanthine	ThermoFisher Scientific	PHZ1124
Nigericin, Free Acid	ThermoFisher Scientific	N7143-5MG
35 mm diameter dish, hole size 27 mm, Glass No.0, Non-coat	ThermoFisher Scientific	D110400
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate	ThermoFisher Scientific	C-1271
BDH Potassium Chloride, ACS Grade	VWR	BDH0258-500G
Paraformaldehyde reagent grade, crystalline	Sigma	P6148
1 M Hydrochloric Acid for Volumetric Analysis	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	083-01095
0.05 M Sodium Hydroxide Solution for Volumetric Analysis	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	199-02185
Calcein	Sigma	C0875
FASW	Iwaki Co. Ltd.	Rei-sea Marine
Mixed Cellulose Ester Membranes; 47 mm dia, 0.45 µm	ADVANTEC	A045A047A
ethanol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	051-00476
Artificial seawater for buffers			by SOP06 of DOE (1994), cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf
Sodium Chloride	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	191-01665
Potassium Chloride	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	163-03545
Magnesium Chloride Hexahydrate	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	135-00165
Calcium Chloride	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	039-00475
Sodium Sulfate	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	197-03345
Hydrochloric Acid	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	089-08415
2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (tris)	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	207-06275
2-aminopyridine	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	011-02775
Orion 5-star Plus pH meter	Thermo Scientific
PrpHecT ROSS Micro Combination pH Electrode 8220BNWP	Thermo Scientific
Axiovision, Version 4.6, Axio Observer Z1	Zeiss
ImageJ	NIH, Bethesda, MD, USA
HRTEM H500	Hitachi
SU6600 VPSEM	Hitachi
NB5000 Focused Ion and Electron Beam (FIB-SEM) system	Hitachi