Caratterizzazione di calcificazione eventi utilizzando dal vivo ottica ed elettronica Microscopia tecniche in un tubeworm Marine

Introduction

Biomineralization è una serie complessa di eventi, quali ponti una serie di attività cellulari conseguente produzione di minerali squisitamente ordinate ^1. La sfida è quella di caratterizzare sia il processo cellulare dinamica e le sofisticate strutture minerali utilizzando una combinazione di metodi di microscopia ottica ed elettronica. Un innalzamento del pH intracellulare favorisce la formazione di CaCO ₃ cristalli, quindi, identificando la fase vita che ha una maggiore pH rivela momento calcificazioni è probabile che si verificano ^{2, 3.}

I tubicoli della famiglia Serpulidae sono calcifiers comuni nell'oceano ^4. È anche un modello invertebrato popolare per la ricerca marina, soprattutto in biofouling ^{5, 6.} In questo studio, il processo di calcificazione nei compartimenti mineralizzanti durisi osserva ng biomineralization. Il rapido processo di metamorfosi prevede l'emergere di strutture di carbonato di calcio ^{7, 8.}

Dimostriamo come interno misurazioni del pH può essere eseguita sul tubeworm, e come le fasi della vita e dei tessuti rilevanti per la calcificazione potrà essere schermato. Dopo la fase di vita di interesse è identificato, il tessuto responsabile calcificazioni può essere caratterizzata con una risoluzione superiore utilizzando metodi di microscopia elettronica. Utilizzando la microscopia a fluorescenza, si determina il tempo necessario per il carbonato di calcio ad apparire dopo l'induzione metamorfica. Una simile fase della vita è stato successivamente visualizzata con SEM-EDS per la distribuzione composizione elementare, e il minerale depositato è stato analizzato utilizzando due diversi metodi di microscopia elettronica, in particolare SEM-EBSD e FIB-TEM.

Protocol

1. Lo screening per la Vita stage e tessuto di interesse con Live Imaging

1. Cultura larve marine per competenza secondo metodi precedentemente riportati ^{6, 7, 9.} Incubare le larve tubeworm a 5 larve per densità mL con acqua di mare filtrata con 10 mM SNARF-01:00 durante la notte. Coprire il contenitore con un foglio di alluminio per proteggere la sonda fluorescente da fotometabolismo.
2. Osservare le larve utilizzando un microscopio dissezione. tubeworm competente larve pronto per la metamorfosi sarà nuotare in una direzione in avanti, invece di un movimento circolare.
3. Trasferire le larve competente di una maglia di 60 micron. Premere la maglia contro un piatto Petri, fornendo una buona tenuta per trattenere liquidi. rilasciare rapidamente il sigillo per liberare ed eliminare l'acqua di mare contenente colorante fluorescente, mantenendo le larve.
4. Lavare le larve con acqua di mare artificiale filtrata (FASW) due volte, prendendoattenzione a non asciugarsi le larve nel processo.
5. Mettere da 10 a 20 larve in piatti con fondo di vetro sottile con 5 ml di FASW contenente 10 ^-4 M isobutylmethylxanthine (IBMX) per l'osservazione del processo di metamorfosi.
6. Inserire i cubi filtro per rilevare SNARF-1 del segnale (Canale 1: Ex 510/25 Em 580/30; Canale 2: Ex 510/25 Em 640/35) immagine DIC delle larve, e.
7. Posizionare le larve metamorfosi nell'ambito dell'obiettivo 20X, quindi, ottimizzare i tempi di scatto (100-300 ms) abbastanza veloce per garantire che una chiara immagine degli animali vivi è catturato.
8. Set 1 micron distanza per catturare un Z-stack di tutti e tre i canali, quando l'imaging un animale vivo, l'imaging ogni strato per tutti e tre i canali prima di passare al livello successivo della direzione z consentirebbe una migliore correlazione tra i canali.
9. Esporta immagini in scala di grigio per tutti i canali e gli strati come file TIF dal software microscopio: File | Export | Tipo di file TIF | Inizio.
10. Utilizzando ImageJ, importa la sequenza di immagini per ogni canale: File | Importa | sequenza di immagini.
    1. Per importare Canale 1 λ ₁ ^em, inserire partendo immagine 3 e minimo: 4.
    2. Per importare Canale 2 λ ₂ ^em, inserire partendo immagine 4 e minimo: 4.
11. Generare un'immagine composita dividendo λ ₂ ^em da λ ₁ ^em per ogni pixel per pixel strato (Process | calcolatore Immagine ... | file immagine 640 nm "dividere" file immagine 580 nm), ossia 640/580 nm rapporto.
12. Seleziona Immagine | Le tabelle di ricerca | 16 colori.
13. Selezionare Analizzare | Strumenti | barra di calibrazione.
14. Controllare i diversi strati, che identifica il livello contenente la più eterogeneità. Questo fornisce le informazioni più utili per quanto riguarda la distribuzione pH interno.
15. Utilizzando la relazione tra il rapporto 640/580 nm e pH, costruire un profilo di stampa per visualizzare la distribuzione del pH interno.

1. Dopo la colorazione durante la notte di circa 20 larve con 10 mM SNARF-01:00, aggiungere soluzioni madre di Nigericina e KCl per compensare 50 micron Nigericina e 150 mm KCl per la calibrazione.
2. Regolare il pH della AFSW calibrazione con NaOH o HCl diluito, fino ad ottenere un pH circa 5,9. Si noti il ​​valore esatto del pH. Misurare il pH con un misuratore di pH con un elettrodo di vetro che è stato calibrato con acqua marina base 2-amino-2-idrossimetil-1,3-propandiolo (Tris) e 2-amminopiridina ^9.
3. Trasferire uno macchiato larve tubeworm insieme ad un liquido con un pH noto ad un piatto asciutto e pulito per misurazione dell'intensità segnali a 640 nm e 580 nm.
4. Ripetere i punti 2.2 e 2.3 per ulteriori quattro punti di pH che vanno 5,9-9,9. Essi rappresentano un intervallo di valori fisiologicamente rilevanti.
5. Verificare i segnali appaiono omogenea in tutto il corpo animale. Questo indica che il pH intracellulare è stata postaquilibrated con l'acqua di mare ambientale.
6. Immagine le larve tubeworm in cinque diversi ambienti di acqua di mare di pH, registrare le intensità mostrati come "valori di grigio" a 640 nm ea 580 nm, vale a dire, λ ₂ ^Ecc e λ ₁ ^Ecc.

3. Analisi delle Raziometrico Imaging dati

1. Inserire i valori di grigio come misurato da cinque posizioni casuali o da una zona di interesse su un foglio di calcolo.
2. Verificare la taratura cinque punti ha mostrato una relazione lineare per indicare pH intracellulare (ad esempio, l'equazione come y = 0.30x - 1.47; y = valore di grigio; x = pH; R² = 0,934).
3. Calcolare i valori di pH intracellulare dall'equazione utilizzando il rapporto di intensità misurata 640/580 nm a passo 1.13.

4. Conservazione del campione, disidratazione e di montaggio per la microscopia elettronica

1. Preservare la fase di vita di interesse con paraformaldeide al 4%. in questo studio, Fissare i tubeworms 2-4 giorni dopo il collegamento, tenere gli animali in fissativo fino al momento dell'analisi.
2. Lavorare in una cappa aspirante, post-fissare il campione con l'1% di osmio tetrossido soluzione acquosa per 30 minuti per ridurre al minimo il restringimento del tessuto durante il processo di disidratazione.
3. Disidratare il campione con una serie graduata di etanolo: 50% di etanolo per 5 min, 70% di etanolo per 5 min, 85% di etanolo per 5 min, 95% di etanolo per 5 minuti, ed etanolo assoluto infine per 5 min due volte.
4. Lavorando in una cappa aspirante, aggiungere una soluzione 1: 1 di etanolo e esametildisilazano (HMDS) per il campione, permettendo al liquido di evaporare completamente.
5. Nella cappa, aggiungere 100% HMDS al campione, permettendo al liquido di evaporare completamente.
6. Con un coltello di diamante, introdurre alcuni tagli al piatto cultura, che circonda alcuni spirografi. Con il coperchio, tenere il fondo piatto contro uno stub di alluminio per rompere il piatto.
7. Sotto un microscopio dissezione, trovare un pezzo fratturato contenente un tubeworm intatto.
8. Applicare la vernice argento per uno stub in alluminio e fissare il frammento allo stub con attenzione. Vernice intorno ai bordi del frammento di plastica per ridurre la carica.

5. Individuazione di un calcio regione ricca Utilizzando SEM-EDS

1. Fissare lo stub provino sul supporto del campione.
2. Misurare l'altezza dell'intero gruppo contro il calibro fornito con il microscopio, regolando l'altezza allentando la rondella di bloccaggio e ruotando il palo finché il campione è all'altezza standard o inserire l'altezza come registrato.
3. Immettere aria nella camera di scambio microscopio e ruotare la porta della camera aperta. Far scorrere il supporto del campione sull'estremità dell'asta scambio. Quindi chiudere ed evacuare la camera.
4. Aprire la saracinesca e far scorrere l'asta di cambio verso la camera di microscopio. Far scorrere l'asta di scambio fino in fondo per il completo supporto del campione nella fase di microscopio. Rimuovere l'asta di cambio e chiudere la saracinesca.
5. ingresso tegli campioni Dimensioni e inviare il palco per la posizione di Home per mettere il campione sotto la colonna di elettroni.
6. Impostare il livello di vuoto della camera di 20-30 Pa in modalità VP-SEM. Impostare l'elettrone tensione di accelerazione di 20 kV e accendere l'alta tensione.
7. Portare il tavolino una distanza campione funzionamento di 10 mm. Acquisire un feed dal vivo e individuare il campione. Ottimizzare l'immagine regolando la astigmatismo e mettere a fuoco, se necessario.
8. Aprire il programma SEM-EDS e selezionare l'opzione modalità EDS-SEM. Selezionare l'opzione di menu per eseguire una mappa EDS.
9. Change condensatore ottico e del diaframma per ottenere un tempo morto di ~ 30% in un periodo di 3 come processo monitorato attraverso il misuratore della frequenza nel programma SEM-EDS. Eseguire le procedure di allineamento del fascio e di apertura dopo aver apportato modifiche alle impostazioni del fascio.
10. Selezionare un ingrandimento tale che un singolo organismo riempie l'intero campo visivo. Attivare l'opzione correzione della deriva e catturare un'immagine del programma SEM-EDS.
11. acquisire madati p con l'organismo riempire l'intero campo visivo, con un tempo di sosta di 50-100 ms. Eseguire la mappa fino a quando i dati mostrano la localizzazione distinta di Ca all'interno dell'organismo (circa 15 min).
12. Per ottenere dati point-quantificazione, modificare il tempo di processo a 6 e regolare la sonda di elettroni per acquisire un tempo morto di ~ 30%. Eseguire passaggi di allineamento e ottimizzare l'immagine come necessario.
13. Selezionare il punto e l'opzione ID nel programma SEM-EDS e di acquisire un'altra immagine. Utilizzando lo strumento unico punto, clicca su aree che apparivano Ca ricco di mappa EDS, così come Ca zone carenti per il confronto. Scansione ogni punto per un tempo vivo di 30 s.

6. Individuazione Crystallographic Informazioni di calcio regioni ricche Utilizzando SEM-EBSD

1. Rimuovere frammento contenente esemplare di plastica di interesse da parte piatta stub campione e apporre la faccia inclinata di uno stub pre-inclinato a 45 ° con argento adesivo conduttivo.
2. Avvitare il stub sul campione hanziani e la posizione faccia angolata dello stub (con il campione) verso la parte anteriore del supporto del campione. Inserire il supporto del campione nella camera del microscopio utilizzando la camera di scambio.
3. Impostare il vuoto della camera di 30 Pa e elettrone tensione di accelerazione a 20 kV. Invia il campione sotto la colonna elettrone e inclinare la fase 25 ° per posizionare la superficie del campione di circa 70 ° rispetto alla normale al fascio di elettroni. Girare l'alta tensione su.
4. Sollevare il palco per una distanza di lavoro di ~ 18 mm. Utilizzare la trackball per spostare il palco e individuare un esemplare. Aumentare l'ingrandimento per inquadrare le caratteristiche specifiche di interesse. Allineare il fascio e ottimizzare l'immagine come necessario.
5. Aprire il programma SEM-EDS in modalità EBSD. Selezionare calcite e aragonite come fasi di interesse. Inserire la fotocamera EBSD ad una distanza di 154 mm. Impostare le condizioni della fotocamera per 1 x 1 binning e di un lasso di tempo di 100 ms. Utilizzando un raster fascio veloce, acquisire uno sfondo.
   NOTA: un frame rate diversopuò essere richiesta in funzione della sonda di elettroni; regolare il frame rate sonda o fotocamera per ottenere un segnale di circa 90%.
6. Acquisizione di immagini in programma SEM-EDS. Utilizzare lo strumento di analisi posto e cliccare da qualche parte sopra l'immagine per la scansione del fascio su questo punto. Osservare la finestra di macchina fotografica per vedere se vengono rilevati eventuali modelli Kikuchi.
7. Clicca su diverse aree dell'immagine per la scansione di potenziali siti di calcificazione, osservando la finestra della fotocamera in ogni punto, per vedere se le bande Kikuchi sono presenti. Se i modelli sono presenti e corrisponde a nessuna delle fasi selezionate nel database, verranno automaticamente indicizzati.

7. TEM del campione Preparazione Utilizzo FIB-SEM

1. Polverizzazione catodica cappotto il campione preparato SEM con il platino o materiale simile per creare uno strato conduttivo.
   1. Posizionare i campioni preventivamente fissati, disidratati, e montati nella custodia del dispositivo a induzione polverizzazione e attivare l'alimentazione per cominciare a pompare la camera verso il basso.
   2. Una volta che la camera in vuoto legge 40 mTorr o meno, accendere l'interruttore gas e aumentare il flusso di gas argon per raggiungere una pressione della camera di 200 mTorr. Regolare il flusso del gas per ottenere una pressione della camera finale di 80 mTorr.
   3. Portare il commutatore di tensione e aumentare la tensione di raggiungere una corrente di 15 mA. Impostare il timer e cappotto per un tempo prolungato (~ 10 min) per creare uno strato spesso (~ 60 nm) che protegge la superficie del campione da danni ioni irradiazione. Regolare la tensione per mantenere una stabile 15 mA.
   4. Una volta terminato, spegnere il spalmatrice per rilasciare il vuoto e rimuovere il campione.
2. Avvitare la base del preparato, sputter campione rivestito sul montante vite M4 del supporto del campione strumento. Serrare fino mano stretta, allentare il dado di bloccaggio, e quindi ruotare il posto titolare di esempio per modificare l'altezza del gruppo. Utilizzare il calibro altezza del laser e regolare l'altezza per essere meno di 1 mm (= 0,04 pollici, come mostrato in video) del supplie normad con lo strumento.
3. Chiudere tutte le valvole di pistola nella FIB-SEM, e poi ammettere aria nella camera di decompressione eucentrica. Una volta che la pressione è pareggiato con l'ambiente, far scorrere lucchetto aperto l'aria e fissare il supporto del campione sui rebbi della canna scambio. Ruotare la manopola sull'estremità dell'asta scambio nella posizione "lock". Chiudere il blocco d'aria ed evacuare la camera stagna.
4. Una volta che il eucentrica serranda stadio è stato evacuato e la pressione corrisponde a quello della camera di FIB-SEM, aprire la saracinesca e inserire il campione spingendo l'asta scambio. Far scorrere l'asta di scambio fino in fondo al sedile supporto del campione nella fase dello strumento eucentrica, quindi ruotare l'asta di cambio in posizione "sblocco". Far scorrere l'asta di scambio di nuovo fuori e chiudere la saracinesca.
5. Spostare lo stadio per posizionare il campione nella colonna fascio di ioni. Aprire le saracinesche e di acquisire una immagine dal vivo di elettroni secondari di ioni indotta della FIB. Utilizzare basso ingrandimento e unscansione raster veloce per ridurre al minimo i danni di ioni. Ripristinare il fuoco del raggio di osservazione normale e aumentare l'altezza Z dello stadio fino a quando il campione è a fuoco. A questo punto il campione è in posizione trasversale punto in cui fasci sia il ioni e elettroni sono concentrati nella stessa posizione.
6. Utilizzando l'immagine di elettroni secondari dal SEM, individuare l'area di interesse nel campione, utilizzando la trackball per spostare il campione intorno. Le aree di interesse sono Ca zone ricche come precedentemente determinati dalla mappatura EDS. Ruotare il palco come necessario per ottenere le caratteristiche di interesse in linea con il telaio della finestra.
7. Nell'interfaccia finestra FIB, catturare una rapida istantanea di tutti i pozzetti a un ingrandimento di 1,000X con un ulteriore zoom digitale 2X e disegnare un modello di deposizione ~ 8 micron x 2 micron sopra l'area di interesse. La dimensione ingrandimento della casella di deposizione può essere regolata per soddisfare le caratteristiche di diverse dimensioni. Impostare le condizioni di sputtering a depositare carbonio utilizzando un 40 kV, 0,09 nA fascio, utilizzando un tempo di permanenza di 0,5 ms per 5 min.
8. Dopo la deposizione di carbonio, modificare le condizioni di deposizione per depositare tungsteno con un 40 kV, 0,7 fascio nA, e deposito per 5 minuti per generare un tappo micron tungsteno ~ 2-3.
9. Cattura un'istantanea FIB utilizzando il raggio di osservazione e utilizzare lo strumento microcampionamento polverizzazione per disegnare un modello di quattro scatole di tutto il tappo di tungsteno. Impostare le caselle superiore e inferiore a circa 15 micron x 8 micron; il diritto scatola 10 micron x 5 micron, e la sinistra casella 6 micron x 5 micron, o grande abbastanza per circondare l'area di interesse.
   1. Modificare le condizioni di fabbricazione per tagliare con un 40 kV, 19 nA fascio, e un tempo di permanenza di 50 ms, e 3-4 telai scansione per ogni casella. Poi realizzare il modello. Dopo la fabbricazione, l'area di interesse, con la C e W strati protettivi, sarà simile un'isola, con tutto il materiale adiacente rimosso in alto, in basso, e destra.
10. Inclinare la fase di 58 ° per mettere il SAMPle superficie normale alla colonna di elettroni e ad un angolo ripido alla colonna ione. Individuare la parte posteriore del campione "isola" con il FIB e catturare un'istantanea a 1,000X ingrandimenti e zoom digitale 2-4x.
11. Disegnare un modello polverizzazione ~ 15 um x 2 micron sopra la parte inferiore del retro del campione "isola", alla fine del quale è visibile. Realizzare il box utilizzando un fascio 4 nA per 3 min, o fino a quando il fascio ha tagliare il fondo del campione "isola".
12. Inclinare il eucentrica -58 ° rispetto alla posizione corrente (a zero). Inserire la sonda microcampionamento tungsteno cliccando su "Probe In" nell'interfaccia FIB. Selezionare "MS" sul pannello di comando dello stadio e utilizzare la trackball per spostare la sonda sopra la parte superiore del provino.
13. Acquisire una alimentazione diretta dalla FIB con un ingrandimento di 1 kx e posizionare la sonda in modo tale che la punta è direttamente sopra la parte destra del tappo di tungsteno del microcampione. Osservando un liveimmagine SE dal SEM, utilizzare la manopola di controllo Z del pannello palco per abbassare la sonda finché non tocca la capitalizzazione di tungsteno. Un cicalino suonerà una volta il contatto è stato fatto.
14. Cattura un'istantanea utilizzando il FIB utilizzando un 40 kV, 0,01 nA fascio, con un ingrandimento di zoom digitale 2X e 1,000X. Utilizzare lo strumento di deposizione per disegnare una scatola di x 2 micron 2 micron sopra la punta della sonda dove ha contattato il tappo di tungsteno del microcampione.
    1. Impostare le condizioni di depositare tungsteno con un 40 kV, 0,09 nA fascio, per 2 minuti e un tempo di permanenza di 0,5 ms. Poi realizzare il modello.
15. Disegnare un modello polverizzazione ~ 2 micron x 5 micron sopra l'estremità sinistra del microcampione "braccio" (dove è ancora collegato alla massa del campione). Realizzare il modello con un 40 kV, 0,7 nA fascio, per 2 minuti, o fino a quando il segnale acustico indica che il microcampione è stato staccato dal campione globale.
16. Utilizzare la manopola di controllo Z per aumentare la sonda con microcampione attaccato finoazzera il campione globale, quindi ritrarre la sonda. Inviare il eucentrica sia alla casa o la posizione di Exchange.
17. Posizionare un mezzo di rame-grid in un supporto ingresso laterale e caricare il supporto nel ingresso laterale camera di fase di spurgo. Evacuare la camera e inserire il supporto laterale. Impostare il supporto sulla posizione FIB.
18. Premete laterale sul pannello di controllo fase e utilizzare la trackball per portare la metà della griglia in vista sul monitor FIB. Spostare a pulire superficie della metà della griglia e utilizzare la manopola Z per portare la superficie a fuoco.
19. Premere Sonda per inserire la sonda, premere MS sul pannello di comando dello stadio, ed utilizzare la manopola trackball e Z per posizionare il microcampione sulla metà griglia. Abbassare la sonda fino a quando i contatti microcampione griglia.
20. Scattare una foto sul FIB a 1,000X ingrandimento (zoom 2X). Utilizzare lo strumento deposizione e disegnare un motivo ~ 10 micron x 3 micron sul lato inferiore del microcampione. tungsteno deposito con un 40 kV, 0,7 nA fascio, utilizzando una sosta time di 0,5 ms per 3 min.
21. Utilizzare lo strumento polverizzazione e disegnare un piccolo 1 micron modello x 3 micron sopra la punta della sonda. Realizzare il pattern usando un 40 kV, 0,7 nA fascio in un tempo di permanenza di 3 ms per tagliare la sonda dalla microcampione. Ritrarre la sonda, una volta libero.
22. Acquisire un'immagine FIB a 5,000X ingrandimento e disegnare due modelli di sputtering 7 micron x 4 micron nella parte superiore e inferiore della microcampione, lasciando un vuoto micron ~ 1 tra le scatole. Centrare i modelli in modo da non tagliare i lati sinistro e destro del microcampione. Realizzare entrambi pattern usando un 40 kV, 4 fascio nA, e un tempo di permanenza di 3 ms, per 2 minuti, impostando la direzione raster verso il centro della microcampione.
23. Cattura un'altra immagine utilizzando il raggio di osservazione FIB a 5,000X. Ridimensionare le caselle di sputtering precedenti per ~ 6.5 micron x 1 micron, avvicinarsi insieme per lasciare uno spazio di ~ 0,5 micron, e fabbricare con un 40 kV, 0,7 nA fascio.
24. Inclinare la fase di ingresso laterale 0,5 ° e cappuccioture un'altra immagine FIB. Ridimensionare le caselle di sputtering a 6 micron di larghezza. Posizionare il modello superiore sopra la parte superiore del microcampione e fabbricare utilizzando un 40 kV, 0,7 nA fascio. Tilt -0.5 ° e ripetere con il modello sputter inferiore e lato inferiore della microcampione.
25. Ulteriori diminuire la larghezza del modello di ~ 0,5 micron. Tilt 0,5 ° e sputter il lato superiore del microcampione utilizzando un 40 kV, 0,09 nA fascio. Ripetere con il lato inferiore a -0.5 ° di inclinazione.
26. Inclinare la fase 2.2 ° e acquisire un'immagine FIB a 10.000X. Ridimensionare modelli sputtering a 5 micron di larghezza e cambiare le condizioni del fascio di 5 kV, 0,03 nA. Posizionare il modello superiore sul lato superiore del microcampione, fino al bordo superiore, e fabbricare. Inclinare -2.2 ° e ripetere con il lato inferiore e modello di fondo.
27. Ripetere 5 passi kV di fresatura fino a quando il microcampione diventa elettrone trasparente (~ 100 spessore nm). Una volta terminato, chiudere gunvalves e rimuovere il supporto laterale.

8. Obtaining selezionato modello Area di diffrazione su un TEM

1. Per preparare lo strumento per l'analisi, riempire sia Dewar palloni con azoto liquido e impostare la tensione di accelerazione a 300 kV.
2. Dopo la preparazione del campione usando l'FIB, rimuovere il supporto entrata laterale dalla FIB-SEM e regolare la posizione del perno in modo tale che la lunghezza titolare corrisponde a quello del 300 kV TEM. Ruotare la punta del supporto alla posizione di osservazione corretta, una volta confrontandolo al titolare TEM standard per assicurare il corretto orientamento del campione.
   1. In alternativa, rimuovere il mezzo griglia con lamelle allegato da parte del titolare FIB-SEM e il luogo nel supporto TEM standard.
3. Caricare il supporto del campione nella camera di scambio del TEM e evacuare la camera. Assicurarsi che la valvola della pistola strumento viene chiuso quando l'aria viene ammessa nella camera di scambio. Una volta che la camera di scambio ha pompato verso il basso, un allarme acustico. Ruotare il supporto del campione in senso orario e consentire il vacuum per tirare il supporto del campione per la prima posizione di arresto.
4. Lasciare che il vuoto dello strumento per recuperare, e quindi aprire la valvola della pistola. Ripristinare la messa a fuoco e lo zoom ad un ingrandimento di circa 10.000X.
5. Utilizzare le manopole di allineamento per spostare il fascio al centro dello schermo fosforo. Contrarsi ed espandersi la trave e garantire che tutti i movimenti del fascio è concentrica. Regolare per condensatore stigmatism se necessario.
6. Ruotare il portacampioni antiorario e lasciare il vuoto per estrarre il supporto completamente nella colonna. Utilizzare il movimento manopole palco per navigare e individuare il campione.
7. Aumentare l'ingrandimento sul campione e regolare l'altezza Z fino a quando il campione è a fuoco. Utilizzare gli oculari ottici, se necessario.
8. Inserire la fotocamera e rimuovere lo schermo di fosforo. Espandere la trave come necessario per evitare la sovra- saturazione della telecamera. Regolare i parametri di messa a fuoco e della telecamera, quindi avviare l'acquisizione per catturare un'immagine.
9. Per acquisire un modello di diffrazione, primo centro dellacaratteristica di interesse. Rimuovere l'apertura obiettiva e inserire l'apertura di diffrazione.
10. Passare alla modalità lente di diffrazione premendo il pulsante DIFF sul pannello di controllo e utilizzare la manopola di controllo DIFF per ridurre la trave.
11. Inserire il blanker se necessario per evitare che il centro del modello di diffrazione di bruciare lo schermo della fotocamera o il fosforo. Avviare l'acquisizione della fotocamera per catturare un'immagine del modello.

Representative Results

Di seguito sono riportate alcune osservazioni del processo di calcificazione durante la metamorfosi del tubeworm. La figura 1 mostra che i valori di pH vicino regione collare è superiore rispetto agli altri tessuti dopo metamorfosi. La figura mostra una 2i tubeworm con distribuzione omogenea di Ca, suggerendo senza grandi eventi calcificazione hanno cominciato; La figura mostra un 2II tubeworm che ha calcificate per un periodo più lungo, suggerendo calcificazione ha superato il punto di tempo di interesse; La figura mostra una 2iii tubeworm con la fase di calcificazione di interesse, che è stato selezionato per ulteriori analisi per comprendere il tessuto responsabile della mineralizzazione. La figura 3 mostra i valori di pH superiori sono correlati con le più alte Ca segnali ioni sia da colorazione calceina e mappatura SEM-EDX. Da queste osservazioni, il tessuto dalla fase di vita di interesse è stata esaminata in un hirisoluzione gher utilizzando una tecnica più localizzato, SEM-EBSD. Con la scoperta della fase minerale, la figura 4 mostra l'applicazione del fascio ionico focalizzato per sollevare il materiale di interesse per TEM e l'analisi di diffrazione zona selezionata per confermare la cristallinità del minerale.

Figura 1: mappatura pH intracellulare del tubeworm (da Chan et al 2015).. A 71 ore dopo il trattamento IBMX, un tubeworm, elegans Hydroides, che rappresenta un tasso più lento di metamorfosi dimostra una grande eterogeneità nella distribuzione pH intracellulare. immagine DIC (in alto a sinistra) e pseudocolorized immagini composite generate dai valori di grigio a 640 nm divisa per valori di grigio a 580 nm (in alto a destra) sono mostrati. I valori di grigio calcolata dal rapporto 640/580 nm è proporzionale al pH intracellulare. il profiles dei valori di grigio dalle immagini composite, sono stati convertiti in valori di pH intracellulare sulla distanza lungo l'asse longitudinale del corpo del tubeworm (pannello inferiore). Il rapporto tra pH intracellulare e il rapporto di 640/580 nm di emissione è stato istituito con la calibrazione in vitro (y = 0.30x - 1.47; ^R2 = 0,934; y, valore di grigio, x, pH intracellulare). Le regioni con pH intracellulare sopra pH 8,5 (in rosso) sono corrispondenti alle regioni in cui sono state trovate strutture calcificate. Barre di scala = 100 micron; c, collare; b, lobi branchiali; formica, anteior; posta, posteriore. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Identificare la fase di vita di interesse utilizzando SEM-EDS.
Tubeworms a diversipunto di tempo di metamorfosi sono stati proiettati per catturare la fase di nuova calcificazione per ulteriori analisi (i) Un giorno 1 post-metamorfica tubeworm mostra la distribuzione omogenea del segnale Ca (ii) Una giornata più veloce crescita tubeworm 2 post-metamorfica mostra un breve anello di segnale Ca (iii) una lenta giornata in crescita a 2 colonne metamorfica tubeworm mostra macchie di segnale Ca. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Caratterizzazione dei segnali Ca utilizzando la microscopia diretta (da Chan et al 2015).. (I-IV), SEM-EDS (v-vii) e SEM-EBSD (VIII-x). La distribuzione di ioni calcio come correlato al segnale calceina a 31 ore e 53 ore dopo la metamorfosi dei elegans Hydroides. Le immagini DIC (pannello di sinistra, 3i e iii) e tegli calceina segnale (pannello di sinistra, 2II e iv) sono mostrati. Microscopia elettronica correlativa il giorno 2 post-metamorfiche elegans Hydroides rilevato macchie di strutture calcificate, come mostrato un'immagine SEM bassa tensione (5 kV) in (pannello centrale, 3v). SEM-EDS mappatura analisi, effettuata a 20 kV, mostra una distribuzione eterogenea di calcio (pannello centrale, 3vi, Ca; in giallo). Il contenuto di Ca sono presentati come i numeri sovrapponendo una maggiore dettaglio superficie inferiore di tensione (5 kV) immagine della tubeworm, il Ca contenuti (mol% in peso, punti decimali sono allineati per mostrare la posizione del punto di analisi) ottenuto dalla quantificazione spot ( con SEM-EDS a 20 kV) (pannello centrale; 3vii). Regioni con un contenuto di Ca superiore a 15 mol% in peso sono suscettibili di essere strutture calcificate. analisi SEM-EBSD delle regioni ricche di calcio è illuastrated nel pannello di destra di 2viii-x. Le regioni ricche di calcio (scatola bianca) come si trova nei risultati di SEM-EDS sono stati ulteriormente analizzati con EBSD (pannello di destra; 3viii) (ii) Il cerchio (pannello di destra;3iX) indica il sito di analisi EBSD; un modello Kikuchi (pannello di destra; 2x) suggerisce il sito è aragonitica dall'interfaccia del software / EBSD microanalisi EDS. c, collare; b, lobi branchiali; formica, anteriore; posta, posteriore. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Caratterizzazione della struttura cristallina mediante FIB-TEM (da Chan et al 2015).. (I) La regione esibendo un modello Kikuchi da EBSD è stato asportato per preparare un campione TEM, (ii) il materiale circostante rimosso asportato da un fascio ionico focalizzato tecnica (FIB) (vista dall'alto), (iii) il materiale è stato sollevata mediante un sonda tungsteno (vista laterale), (iv) il campione con uno spessore finale di ~ 200 nm, che è stato ottenuto ad una tensione inferiore. zona cerchiata in (v) sono statianalizzati per la presenza di area selezionata diffrazione in un TEM (vi), mostrando un modello singolo cristallo di aragonite. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

imaging ottico diretta è un metodo utile per osservare eventi cellulari in un organismo multicellulare. Qui, sono stati usati indicatori di pH e ioni calcio interni per misurare il flusso di ioni nei siti di mineralizzazione. In queste regioni, pompaggio ione attivo è necessario per elevare il pH e Ca ²⁺ concentrazione consentire calcificazioni ^{2, 3.} Quando si applica molecole fluorescenti a studiare un organismo, è fondamentale garantire che la concentrazione utilizzata ha una tossicità trascurabile e consente l'organismo a funzionare in modo fisiologicamente rilevanti. Una concentrazione più bassa colorazione sarebbe meno tossici e di solito è accoppiato con un tempo di colorazione più lungo ^10. È importante mantenere una bassa densità di larve durante il tempo di incubazione, minimizzando deprivazione di ossigeno e l'accumulo dei rifiuti nel periodo di colorazione.

Prima di perseguire i metodi FIB / TEM, che comporta una localizzataregione di interesse, è fondamentale per lo screening attraverso la fase di vita e il tessuto di interesse utilizzando metodi di risoluzione inferiore, come SEM-EDS e SEM-EBSD. Osservando il campione in modalità retrodiffusa consente la visualizzazione di composizione elementare relativo in cui il contrasto più leggero è correlato al pesante peso atomico ^11. Pertanto, le immagini SEM-BSE forniscono anche una stima di dove si trovano gli elementi più pesanti, come gli ioni di calcio e osmio globuli lipidici macchiati. analisi SEM-EDS permette mappatura più specifico di ioni calcio sui campioni. Tuttavia, essa non conferma la presenza di CaCO ₃ cristallina. SEM-EBSD consente il rilevamento di strutture cristalline, anche se i metodi convenzionali EBSD richiedono una superficie lucidata ^12. Questo studio dimostra come SEM-EBSD su un campione non lucidata può fornire informazioni utili. Una corrente di fascio 20 kV consente una maggiore profondità di analisi alla superficie del campione. Pertanto, EBSD è desiderabile un metodo per rilevarela presenza di biominerale, soprattutto su piccoli campioni biologici, intatte come larve marine. Anche se i campioni non lucidati sarebbero dare falsi negativi quando minerali non sono rivolti verso il rivelatore a circa 70 °, vedendo un modello Kikuchi è considerato univoci elementi di una fase minerale alla regione di interesse ^13.

Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) permette caratterizzazione strutturale di una più ampia gamma di materiali ^14. Il fascio ionico focalizzato (FIB) permette specifico estrazione e preparazione di un campione con dimensioni tipiche per analisi TEM ¹⁵ sito. Pertanto, la tecnica FIB / TEM è un metodo adatto per analizzare biomateriali appena depositati in una zona localizzata. Combinati strumenti FIB-SEM permettono anche senza danni osservazione di un campione attraverso l'uso di una colonna fascio elettronico integrato. rivestimento Tungsteno sputter del campione aumenta la conduttività e limiti ion implantation e irradiazione danni del campione ^16. L'uso di un fascio di ioni finemente focalizzato con un basso tempo di permanenza consente macinazione di materiali organici. All'interno del FIB-SEM, una caratteristica particolare di interesse può essere estratto da un campione di massa e diluito per elettroni di trasparenza per l'analisi TEM ^17. Grazie all'elevata energia del fascio ionico, materiali cristallini possono essere resi amorfo. Questo si può verificare quando si prepara una lamella sottile per analisi TEM e può essere attenuato utilizzando un fascio di ioni a bassa tensione di accelerazione per rimuovere lo strato amorfo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hexamethyldisilazane	Electron Microscopy Sciences	16700(EM)
Osmium Tetroxide 2% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	19192
IBMX 3-Isobutyl-1-methylxanthine	ThermoFisher Scientific	PHZ1124
Nigericin, Free Acid	ThermoFisher Scientific	N7143-5MG
35 mm diameter dish, hole size 27 mm, Glass No.0, Non-coat	ThermoFisher Scientific	D110400
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate	ThermoFisher Scientific	C-1271
BDH Potassium Chloride, ACS Grade	VWR	BDH0258-500G
Paraformaldehyde reagent grade, crystalline	Sigma	P6148
1 M Hydrochloric Acid for Volumetric Analysis	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	083-01095
0.05 M Sodium Hydroxide Solution for Volumetric Analysis	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	199-02185
Calcein	Sigma	C0875
FASW	Iwaki Co. Ltd.	Rei-sea Marine
Mixed Cellulose Ester Membranes; 47 mm dia, 0.45 µm	ADVANTEC	A045A047A
ethanol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	051-00476
Artificial seawater for buffers			by SOP06 of DOE (1994), cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf
Sodium Chloride	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	191-01665
Potassium Chloride	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	163-03545
Magnesium Chloride Hexahydrate	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	135-00165
Calcium Chloride	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	039-00475
Sodium Sulfate	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	197-03345
Hydrochloric Acid	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	089-08415
2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (tris)	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	207-06275
2-aminopyridine	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	011-02775
Orion 5-star Plus pH meter	Thermo Scientific
PrpHecT ROSS Micro Combination pH Electrode 8220BNWP	Thermo Scientific
Axiovision, Version 4.6, Axio Observer Z1	Zeiss
ImageJ	NIH, Bethesda, MD, USA
HRTEM H500	Hitachi
SU6600 VPSEM	Hitachi
NB5000 Focused Ion and Electron Beam (FIB-SEM) system	Hitachi