Introduction
Biomineralization היא סדרה מורכבת של אירועים, אשר מגשרת חבילה של פעילות הסלולר וכתוצאה מכך הייצור של מינרלי הורה להפליא 1. האתגר הוא לאפיין הן את תהליך הסלולר הדינמי ואת המבנים מינרליים מתוחכמים באמצעות שילוב של שיטות מיקרוסקופיה אופטית האלקטרון. של העלאת ה- pH התוך-תאי מעדיף את היווצרות גבישים 3 קאקו, ומכאן, זיהוי שלב בחיים כי יש pH גדל מגלה בזמן הסתיידות עשוי להיות התרחשות 2, 3.
תולעי השפופרת ממשפחת Serpulidae הם calcifiers נפוץ בים 4. זהו גם מודל חסר חוליות פופולרי עבור מחקר ימי, במיוחד biofouling 5, 6. במחקר זה, התהליך של הסתיידות בתאי mineralizing דורותbiomineralization ng הוא ציין. התהליך המהיר של מטמורפוזה כולל את הופעתה של מבני סידן פחם 7, 8.
אנו מדגימים כיצד מדידות pH הפנימיות יכול להתבצע על תולעת-שפופרת, וכיצד שלבי חיים ורקמות רלוונטיות הסתיידות יכולים להיות מוקרנים. לאחר השלב של עניין החיים מזוהה, הרקמה האחראית הסתיידות ניתן לאפיין ברזולוציה גבוהה באמצעות שיטות מיקרוסקופיה אלקטרוניות. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אנו קובעים את הזמן הדרוש סידן פחמתי להופיע לאחר אינדוקציה מותמרים. בשלב דומה של חיים לאחר מכן דמיין עם SEM-EDS להפצת רכב יסודות, ואת המינרלים שהופקדו נותחו באמצעות שתי שיטות מיקרוסקופיה אלקטרונית שונות, במיוחד SEM-EBSD ו FIB-TEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הקרנת 1. לחי שלב רקמות עניין עם הדמיה חיה
- תרבות הזחלים הימיים כדי כשירות על פי שיטות שדווחו בעבר 6, 7, 9. דגירת הזחלים תולעת-שפופרת ב 5 זחלים לכל צפיפות מיליליטר עם מי ים מסונן עם 10 לילה לפני הצהריים מיקרומטר SNARF-1. מכסה את המכל עם רדיד אלומיניום על מנת להגן על בדיקת הניאון מ צילום לבן.
- שימו לב הזחלים באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה. זחלים תולעת-שפופרת מוסמכת מוכנים מטמורפוזה ישחו בכיוון קדימה במקום בתנועה מעגלית.
- מעביר את הזחלים המוסמכים רשת 60 מיקרומטר. לחץ על הרשת נגד בצלחת פטרי, מתן גושפנקא טובה לשמור על נוזלים. לשחרר את החותם במהירות לשחרר וזורק את מי הים המכיל צבע פלואורסצנטי, שמירה על הזחלים.
- שטוף את הזחלים עם מי ים מלאכותי מסונן (FASW) פעמים, רשםונזהר שלא לייבש את הזחלים בתהליך.
- מניחים 10 עד 20 הזחלים מנות תחתית זכוכית דקה עם 5 מ"ל של FASW המכיל 10 -4 M isobutylmethylxanthine (IBMX) לצורך השגחה של תהליך המטמורפוזה.
- הכנס את הקוביות המסננות לזיהוי אות SNARF-1 (ערוץ 1: 580/30 Em 510/25 Ex; ערוץ 2: אקס 510/25 Em 640/35), ותמונת דסק"ש של הזחלים.
- מקם את זחלי מטמורפוזה תחת מטרת 20X, ואז, לייעל את זמן תריס (100-300 ms) מהיר מספיק כדי להבטיח תמונה ברורה של בעלי החיים היא נתפסה.
- גדר 1 מיקרומטר מרחק ללכוד Z-ערימה של כל שלושת הערוצים, כאשר הדמיה חייה, הדמיה כל שכבה עבור כל שלושת הערוצים לפני שעברתי את השכבה הבאה של z-הכיוון יאפשר מתאם טוב יותר בין ערוצים.
- תמונות גוניות אפורות יצוא עבור כל הערוצים והשכבות כקבצי TIF מתוכנת מיקרוסקופ: קובץ | יצוא | סוג TIF קובץ | הַתחָלָה.
- באמצעות ImageJ, im נמל את התמונה ברצף עבור כל ערוץ: קובץ | ייבוא | רצף תמונה.
- כדי לייבא ערוץ 1 λ 1 em, הזן החל תמונה 3 ו תוספת: 4.
- כדי לייבא ערוץ 2 λ 2 em, הזן החל תמונה 4 ו תוספת: 4.
- צור תמונה מורכבת על ידי חלוקת λ 2 em ידי em λ 1 עבור כל פיקסל שכבה בפיקסל (תהליך | מחשבון תמונה ... | קובץ תמונה 640 ננומטר "פרד" קובץ תמונה 580 ננומטר), כלומר 640/580 ננומטר יחס.
- תמונה בחר | שולחנות בדיקה | 16 צבעים.
- בחר לנתח | כלים | בר כיול.
- בדוק את השכבות השונות, זיהוי השכבה המכילה את ההטרוגניות ביותר. זה מספק את המידע השימושי ביותר בנוגע לחלוקת pH הפנימית.
- באמצעות הקשר בין יחס 640/580 ננומטר ו- pH, לבנות פרופיל עלילה כדי להמחיש את ההפצה של ה- pH הפנימי.
= "Jove_title"> 2. כיול הפנימי pH
- לאחר מכתים לילה של 20 זחלים על עם 10 מיקרומטר SNARF -1 לפנות בוקר, להוסיף פתרונות המניות של nigericin ו KCl לפצות 50 מיקרומטר nigericin ו -150 מ"מ KCl לכיול.
- התאם את ה- pH של AFSW כיול עם לדלל NaOH או HCl, עד pH בסביבות 5.9 מושגת. הערת ערך ה- pH המדויק. מדד pH עם מד pH עם אלקטרודות זכוכית כי כבר מכויל על ידי מי ים מבוסס 2-אמינו-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (טריס) ו -2-aminopyridine 9.
- העבר הזחלים תולעת-שפופרת מוכתם אחד יחד עם נוזל עם pH ידוע מאכל יבש ונקי למדידת עוצמת האותות ב 640 ננומטר ו 580 ננומטר.
- חזור על שלבי 2.2 ו -2.3 לעוד ארבע נקודות pH הנעות בין 5.9 כדי 9.9. הם מייצגים מגוון של ערכים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית.
- בדוק כדי להבטיח את האותות מופיעים הומוגנית בכל הגוף החי. זה מצביע על כך pH התאי כבר דוארquilibrated עם מי הים הסביבתי.
- תמונה הזחלים תולעת-שפופרת בחמש סביבות pH מי ים שונים, להקליט בעוצמות כפי שמוצג "ערכי אפור" ב 640 ננומטר ב 580 ננומטר, כלומר, ללא וללא λ 2 ו λ 1 EXC.
3. ניתוח של ratiometric הדמיה נתונים
- הזן את הערך האפור כפי שהן נמדדות בחמישה מוקדים אקראיים או משטח של ריבית על בגיליון אלקטרוני.
- סמן כדי לראות את כיול חמש נקודות הראה קשר ליניארי כדי לציין pH התאי (למשל, משוואה כמו y = 0.30x - 1.47; y = ערך אפור; x = pH; R² = 0.934).
- חשב את ערכי ה- pH תוך-תאים מהמשוואה באמצעות היחס העוצם ננומטר 640/580 הנמדדים צעד 1.13.
שימור לדוגמא 4., התייבשות שמה עבור במיקרוסקופ אלקטרונים
- לשמר את שלב החיים של עניין עם paraformaldehyde 4%. במחקר זה, לתקן את וזרוע-רגליים 2-4 ימים לאחר מצורף, לשמור על בעלי החיים מקבעים עד ניתוח.
- עבודה במנדף, שלאחר לתקן את הדגימה עם בתמיסה מימית tetroxide אוסמיום 1% למשך 30 דקות כדי למזער הצטמקות רקמות במהלך תהליך התייבשות.
- מייבש את הדגימה עם סדרת אתנול מדורגת: אתנול 50% במשך 5 דקות, 70% אתנול למשך 5 דקות, 85% אתנול למשך 5 דקות, 95% אתנול למשך 5 דקות, ואתנול המוחלט ולבסוף למשך 5 דקות פעמים.
- עבודה במנדף, להוסיף 1: 1 פתרון של אתנול hexamethyldisilazane (HMDS) כדי הדגימה, המאפשר לנוזל להתאדות לגמרי.
- ב למכסה המנוע קטר, להוסיף 100% HMDS כדי הדגימה, המאפשר לנוזל להתאדות לגמרי.
- בעזרת סכין יהלום, להציג כמה חתכים כדי בצלחת התרבות, סביב כמה וזרוע-רגליים. מכוסה במכסה, להחזיק בתחתית הצלחת נגד בדל אלומיניום לשבור את המנה.
- תחת מיקרוסקופ לנתיחה, למצוא פיסת שבר המכיל תולעת-שפופרת ללא פגע.
- החל צבע כסף אל בדל אלומיניום ולאבטח את שבר את הבדל בזהירות. צבע מסביב לקצוות של שבר הפלסטיק להפחית טעינה.
5. איתור סידן עשיר אזור באמצעות SEM-EDS
- אבטח את בדל הדגימה על בעל המדגם.
- למדוד את גובהם של כל המכלול נגד המד מסופק עם מיקרוסקופ, התאמה גובה על ידי שחרור מכונת כביסת הנעילה והסיבוב לכתוב עד הדגימה היא בגובה רגיל, או להזין את הגובה כפי שנרשם.
- תודה אוויר לתוך תא חליפי מיקרוסקופ וסובב את דלת החדר פתוחה. החלק את מחזיק מדגם אל הקצה של המוט החליפין. ואז לסגור ולפנות את החדר.
- פתח את שסתום השער והחלק את מוט החליפין כלפי תא מיקרוסקופ. חלק את מוט החליפין כל הדרך להושיב בעל המדגם במלואו לתוך במת מיקרוסקופ. הסר את מוט החליפין ולסגור את שסתום השער.
- t קלטהוא לדגום ממדים ולשלוח הבמה לעמדה מוצא למקום המדגם מתחת לעמודת האלקטרונים.
- הגדר את רמת הוואקום הקאמרית 20-30 Pa במצב VP-SEM. הגדר את מתח מאיץ האלקטרונים עד 20 ק"ג ולהפוך את המתח הגבוה על.
- הרם את הבמה כדי מרחק עבודה מדגם של 10 מ"מ. רוכש בשידור חי ולאתר את הדגימה. למטב את התמונה התאמת אסטיגמציה ולהתמקד כנדרש.
- פתח את התוכנית SEM-EDS ובחר באפשרות מצב EDS-SEM. בחר באפשרות התפריט לרוץ מפת EDS.
- עדשה קבל שינוי והגדרות צמצם כדי להשיג זמן באישון ~ 30% בכל פעם בתהליך של 3 כמו נוטרו באמצעות מד השיעור בתכנית SEM-EDS. הפעל נהלי יישור קורה צמצם לאחר ביצוע שינויים בהגדרות קורות.
- בחר גדלה כך אורגניזם יחיד ממלא את השדה כולו מבט. הפעל את אפשרות תיקון ההיסחפות ללכוד תמונה בתכנית SEM-EDS.
- רוכשת map נתונים עם האורגניזם למלא את השדה כולו מבט, באמצעות להתעכב זמן של 50-100 ms. הפעל את המפה עד הנתונים מראים לוקליזציה ברורה של Ca בתוך האורגניזם (כ -15 דקות).
- כדי לקבל נתונים נקודים-כימות, לשנות את שעת התהליך עד 6 ולהתאים את חללית האלקטרונים לרכוש זמן באישון ~ 30%. הפעל צעדי יישור למטב את התמונה לפי צורך.
- בחר את הצבע אפשרות זיהוי בתוכנית SEM-EDS ולרכוש תמונה אחרת. באמצעות כלי נקודה האחת, לחץ על אזורים שהופיעו Ca עשיר במפת EDS, וכן שטחי Ca לקויים להשוואה. סרוק כל נקודה במשך זמן חיים של 30 שעות.
6. זיהוי מידע קריסטלוגרפיים של אזורים עשירים בסידן שימוש SEM-EBSD
- הסר דגימה המכיל שבר פלסטיק עניין מצד בדל דגימה שטוח להדביק על הפנים המשופעים של בדל 45 ° מראש מוטה באמצעות דבק מוליך כסף.
- הברג את הבדל על מדגם hמבוגרים ומצב הפנים זוויתי של הבדל (עם דגימה) לכיוון החלק הקדמי של בעל המדגם. הכנס את בעל המדגם לתוך התא של המיקרוסקופ באמצעות תא החליפין.
- הגדר את הוואקום הקאמרי 30 אבאי אלקטרונים מאיצים מתח עד 20 קילו. שלח המדגם מתחת לעמודה אלקטרונים להטות את הבמה 25 ° למקם את השטח מדגם כ 70 ° מנורמאלית אלומת אלקטרונים. סובב את המתח הגבוה על.
- הרם את הבמה כדי מרחק עבודה של ~ 18 מ"מ. השתמש העקיבה כדי להזיז את הבמה לאתר דגימה. הגדל את ההגדלה להפליל תכונות ספציפיות של עניין. יישר את הקורה כדי למטב את התמונה לפי הצורך.
- פתח את התוכנית SEM-EDS במצב EBSD. קלציט בחר ארגוניט כמו שלבים של עניין. הכנס את המצלמה EBSD ממרחק של 154 מ"מ. גדר תנאי מצלמת 1 x 1 binning ועת מסגרת 100 ms. באמצעות סריקת קרן מהר, לרכוש רקע.
הערה: קצב פריימים שונהייתכן שיידרש בהתאם חללית האלקטרונים; להתאים את מסגרת דולר בדיקה או מצלמה כדי להשיג אות של 90% על. - צילום תמונה בתוכנית SEM-EDS. השתמש בכלי במקום ניתוח ולחץ איפשהו על התמונה כדי לסרוק את הקורה בעניין זה. שים את חלון המצלמה כדי לראות אם בכלל דפוסי קיקוצ'י מזוהים.
- לחץ על אזורים שונים של התמונה כדי לסרוק אתרי הסתיידות פוטנציאל, התבוננות בחלון המצלמה בכל נקודה כדי לראות אם להקות קיקוצ'י נוכחות. אם דפוסי נוכחים ומתאימים לכל השלבים שנבחרו במסד הנתונים, הם יהיו צמודים באופן אוטומטי.
7. הכנת דוגמאות TEM שימוש FIB-SEM
- גמגום מעיל הדגימה SEM מוכן עם פלטינה או חומר דומה כדי ליצור שכבת מוליך.
- מניח את הקבוע בעבר, מיובש, רכובות דגימות לתוך הדיור של coater הגמגום ולהפוך את הכח על מנת להתחיל שאיבת התא למטה.
- לאחר הוואקום הקאמרי קורא 40 mTorr או פחות, סובב את מתג הגז על ולהגביר את זרימת גז הארגון להגיע לחץ קאמרי של 200 mTorr. התאם את זרימת הגז להשיג לחץ קאמרי סופי של 80 mTorr.
- סובב את מתג המתח על ולהגדיל את המתח להגיע זרם של 15 אמפר. כיוונתי את הטיימר ואת המעיל במשך זמן רב (~ 10 דקות) כדי ליצור שכבה עבה (~ 60 ננומטר) המגן על משטח הדגימה מפני נזק קרינה יון. להסדיר את המתח לשמור על הנוכחי יציב 15 mA.
- לאחר שסיים, כוח במורד coater כדי לשחרר את הוואקום ולהסיר המדגם.
- בורג בבסיס המוכן, גמגום מדגם מצופה על פוסט בורג M4 של בעל מדגם מכשיר. הדק עד יד חזקה, לשחרר את אום הנעילה, ולאחר מכן לסובב את הפוסט בעל מדגם כדי לשנות את הגובה של האסיפה. השתמש מד לייזר גובה ולהתאים את גובה להיות בתוך 1 מ"מ (= 0.04 אינץ ', כפי שהיא מוצגת בסרט) של supplie תקןד עם המכשיר.
- סגור את כל שסתומי אקדח FIB-SEM, ולאחר מכן להודות אוויר לתוך מנעל האוויר הבמה eucentric. לאחר הלחץ השווה עם הסביבה, חלק באוויר לנעול פתוח להדביק לבעל המדגם על החוד של מוט החליפין. סובב את הכפתור על קצה מוט החליפין למצב "הנעילה". סגור את מנעול האוויר ולפנות את תא מנעול האוויר.
- לאחר נעילת אוויר הבמה eucentric פונתה והלחץ תואם לזה של תא FIB-SEM, פתח את שסתום השער ולהכניס את המדגם על ידי לדחוף פנימה את מוט החליפין. החלק את מוט החליפין עד הסוף להושיב בעל מדגם בשלב מכשיר eucentric, ולאחר מכן סובב את מוט החליפין לתפקיד "הנעילה". החלק את מוט החליפין בחזרה החוצה ולסגור את שסתום השער.
- הזז את הבמה כדי למקם את המדגם תחת עמודת אלומת יונים. פתח את שסתומי השער לרכוש תמונת אלקטרונים משניים חייה-induced יון של FIB. השתמש הגדלה לשפלהסריקה סריקה מהירה כדי למזער את הנזק יון. אפס את המיקוד של קורה התצפית הנורמלי להעלות את גובה Z הבמה עד המדגם הוא בפוקוס. בשלב זה המדגם נמצא במיקום הצולב לנקודה שבה הן יון קורות האלקטרונים מתמקדים באותו המקום.
- שימוש בתמונה אלקטרונים מהשתיים מן SEM, לאתר את האזור של עניין הדגימה, באמצעות כדור העקיבה כדי להעביר את הדגימה סביב. תחומי העניין הם אזורים עשירים Ca כפי שנקבעו בעבר על ידי מיפוי EDS. סובב את הבמה לפי הצורך כדי לקבל את התכונות של עניין עולה בקנה אחד עם המסגרת של החלון.
- בממשק של חלון FIB, ללכוד תמונת מצב מהירה של הדגימה בהגדלה של 1,000X עם זום דיגיטלי נוסף 2X ולהסיק תבנית בתצהיר ~ 8 מיקרומטר x 2 מיקרומטר על פני השטח של עניין. גודל ההגדלה של התיבה בתצהיר עשוי להיות מותאם כדי להתאים תכונות בגדלים שונים. הגדר את תנאי הגמגום להפקיד הפחמן באמצעות 40 קקרן, 0.09 NA, באמצעות להתעכב זמן של 0.5 מיקרו-שניות למשך 5 דקות.
- לאחר בתצהיר של פחמן, לשנות את התנאים בתצהיר להפקיד טונגסטן באמצעות 40 kV, 0.7 קרן נה, והפקדה במשך 5 דקות כדי ליצור כובע טונגסטן ~ 2-3 מיקרומטר.
- לכידת תמונת מצב FIB באמצעות קרן תצפית להשתמש בכלי גמגום microsampling לצייר דפוס של ארבע קופסאות סביב הפקק טונגסטן. הגדר את התיבות העליונות ותחתונות להיות כ -15 מיקרומטר x 8 מיקרומטר; בתיבת 10 מיקרומטר התקינים x 5 מיקרומטר, ואת מיקרומטר תיבת 6 עזבה x 5 מיקרומטר, או גדולה מספיק כדי להקיף את השטח של עניין.
- לשנות את תנאי ייצור לחתוך באמצעות 40 ק, 19 קרן נה, ו להתעכב זמן של 50 מיקרו-שניות, ו 3-4 מסגרות הסריקה עבור כל התיבה. ואז לפברק דפוס. לאחר ייצור, שטח של עניין, עם שכבות C ו- W מגן, ידמה אי, עם כל החומר הסמוך הסיר על למעלה, למטה, ובצד ימין.
- הטה את הבמה 58 ° לשים את sample משטח נורמלי לעמודת האלקטרונים בזווית תלולה לעמודת היון. אתר את הישבן של מדגם "האי" באמצעות FIB וללכוד תמונה בהגדלה 1,000X וזום דיגיטלי 2-4X.
- צייר ~ 15 מיקרומטר x 2 מיקרומטר דפוס גמגום מעל החלק התחתון של הישבן של המדגם "האי", בסוף מאוד של איפה זה גלוי. לפברק את התיבה באמצעות קרן 4 NA במשך 3 דקות, או עד הקורה קצץ הדרך התחתונה של המדגם "האי".
- הטה את הבמה eucentric -58 ° ממיקומו הנוכחי (חזרה לאפס). הכנס את החללית טונגסטן microsampling ידי לחיצה על "בדיקה" בממשק FIB. בחר "MS" בלוח הבקרה בשלב ולהשתמש העקיבה כדי להזיז את החללית על פני החלק העליון של הדגימה.
- רוכש בשידור חי מן FIB בהגדלה של 1 kx ומקם את החללית כך הטיפ הוא בדיוק מעל הצד הימני של המכסה טונגסטן של microsample. בשעה שצפה בשידור חיSE תמונה מתוך SEM, משתמשת ידית שליטת Z של לוח הבמה כדי להוריד את החללית עד קשר כובע טונגסטן. זמזם יישמע פעם יצירת קשר.
- לכידת תמונה באמצעות FIB באמצעות קרן 40 kV, 0.01 NA, בהגדלה של זום דיגיטלי 1,000X ו 2X. השתמש בכלי בתצהיר כדי ליצור תיבת 2 מיקרומטר x 2 מיקרומטר מעל הקצה של החללית בו יצר קשר עם כובע טונגסטן של microsample.
- הגדר את התנאים להפקיד טונגסטן באמצעות 40 kV, 0.09 קרן נה, למשך 2 דקות ו להתעכב זמן של 0.5 מיקרו-שניות. ואז לפברק דפוס.
- צייר דפוס גמגום ~ 2 מיקרומטר x 5 מיקרומטר על הקצה השמאלי של microsample "זרוע" (שם הוא עדיין מחובר את חלק הארי של המדגם). לפברק הדפוס באמצעות 40 kV, 0.7 קרן נה, למשך 2 דקות, או עד הצפצוף עולה כי microsample כבר מנותק מן המדגם בתפזורת.
- השתמש ידית שליטה Z להעלות את החללית עם microsample המצורפת עדזה מנקה את המדגם בתפזורת, ולאחר מכן לחזור החללית. שלח במת eucentric משני הבית או עמדת Exchange.
- מניח חצי רשת נחושת לתוך מחזיק כניסת צד ולטעון בעל החדרת הטיהור בשלב הכניסה בצד. לפנות את התא והכנס את בעל כניסת הצד. הגדר את הבעל לתפקיד FIB.
- לחץ Side בלוח הבקרה בשלב ולהשתמש העקיבה להביא את הרשת במחצית לשדה הראייה בצג FIB. זוז לנקות שטח של הרשת חצי ולהשתמש ידית Z להביא את המשטח אל מוקד.
- לחץ בדיקה כדי להחדיר את המכשיר, לחץ MS בלוח הבקרה הבמה, ולהשתמש כפתור העקיבה ו- Z כדי למקם את microsample על גבי רשת חצי. מנמיכים את החללית עד המגעים microsample לרשת.
- לכידת תמונה על FIB בהגדלה 1,000X (זום 2X). השתמש בכלי בתצהיר ולצייר ~ 10 מיקרומטר x דפוס 3 מיקרומטר על הצד התחתון של microsample. טונגסטן פיקדון עם קרן 40 kV, 0.7 NA, באמצעות להתעכב tIME של 0.5 מיקרו-שניות במשך 3 דקות.
- השתמש גמגום כלי לצייר קטן 1 מיקרומטר x 3 מיקרומטר דפוס מעל קצה של החללית. לפברק דפוס באמצעות 40 kV, 0.7 NA הקורה בכל להתעכב זמן של 3 ms כדי לחתוך את החללית מן microsample. לחזור חללית פעם בחינם.
- לכידת תמונה FIB בהגדלה 5,000X ולצייר שתי תבניות גמגום 7 מיקרומטר x 4 מיקרומטר בחלק העליון והתחתון של microsample, השארת רווח מיקרומטר ~ 1 בין הקופסאות. מרכז את הדפוסים כדי לא לחתוך את הצדדים על ימין ועל שמאל של microsample. לפברק הן תבניות באמצעות 40 kV, 4 NA הקורה, ואת להתעכב זמן של 3 מיקרו-שניות, 2 דקות, הגדרת סריקה כיוון לעבר מרכז של microsample.
- לכידת תמונה אחרת באמצעות קרן תצפית FIB ב 5,000X. שינוי גודל קופסות הגמגום הקודמת ~ 6.5 מיקרומטר x 1 מיקרומטר, להתקרב יחד כדי להשאיר פער של ~ 0.5 מיקרומטר, לפברק באמצעות 40 kV, 0.7 קרן נה.
- הטיה לצד הכניסה הבמה 0.5 ° וכובעture אחר תמונה FIB. שינוי גודל קופסות הגמגום עד 6 מיקרומטר רחב. מקם את הדפוס העליון על הצד העליון של microsample לפברק באמצעות קרן 40 kV, 0.7 NA. הטה -0.5 ° וחזור עם דפוס גמגום התחתון בצד התחתון של microsample.
- בהמשך להקטין את רוחב התבנית על ידי ~ 0.5 מיקרומטר. הטה 0.5 ° גמגום בצד העליון של microsample באמצעות קרן 40 kV, 0.09 NA. חזור עם הצד התחתון ב -0.5 ° הטיה.
- הטה את ° הבמה 2.2 ולרכוש תמונה FIB ב 10,000X. שינוי גודל תבניות גמגום עד 5 מיקרומטר רחב ולשנות תנאי קרן עד 5 kV, 0.03 NA. מקם את התבנית העליונה מעל בצד העליון של microsample, ממש עד הקצה העליון, לפברק. הטה -2.2 ° וחזור עם הצד התחתון דפוס תחתון.
- חזור 5 צעדים טחינה kV עד microsample הופך אלקטרונים שקוף (~ 100 עובי ננומטר). לאחר שסיים, gunvalves הקרוב ולהסיר בעל כניסת צד.
8. Obtaining תבנית השתברות האזור שנבחר על TEM
- כדי להכין את המכשיר לניתוח, למלא היא דיואר צנצנות עם חנקן נוזלי ולהגדיר את המתח המאיץ ל -300 קילו.
- לאחר הכנת המדגם באמצעות FIB, להסיר את בעל כניסת צד מן FIB-SEM ולהתאים את המיקום סיכה כאלה כי אורך בעל תואם לזה של 300 קילו וולט TEM. סובב את הקצה בעל לעמדת התצפית הנכונה, שוב השוואתה בעל TEM הסטנדרטי כדי להבטיח אורינטצית מדגם נכונה.
- לחלופין, הסר את הרשת במחצית עם lamellae המצורפת מבעל FIB-SEM ומניחים בעל TEM סטנדרטי.
- טען את בעל מדגם לתוך תא החליפין של TEM ולפנות את החדר. ודא כי שסתום אקדח המכשיר נסגר האוויר הודה לתוך תא החליפין. לאחר קאמרית החליפין שאובים למטה, אזעקה נשמעת תישמע. סובב עם כיוון השעון בעל מדגם ולאפשר vacuאממ למשוך בעל המדגם ב למיקום התחנה הראשון.
- אפשר ואקום למכשיר להתאושש, ולאחר מכן פתח את שסתום אקדח. אפס את המיקוד גדל של גדלה של כ 10,000X.
- השתמש ידיות יישור להסיט את אלומת למרכז המסך זרחן. חוזה ולהרחיב את הקורה ולוודא שכל תנועת הקורה קונצנטריים. כוונן עבור stigmatism הקבל לפי הצורך.
- סובב את בעל מדגם השעון ולאפשר ואקום כדי למשוך את בעל במלואו לתוך הטור. השתמש ידיות התנועה הבמה כדי לנווט ולאתר המדגם.
- הגדל הגדלה על המדגם ולהתאים את גובה Z עד המדגם הוא בפוקוס. השתמש העיניים האופטית לפי צורך.
- הכנס את המצלמה ולהסיר את מסך זרחן. להרחיב את קרן הפרטים הדרושים על מנת למנוע oversaturating המצלמה. שנה את הפרמטרים של מיקוד ואת המצלמה, ולאחר מכן להתחיל רכישה ללכוד תמונה.
- כדי לרכוש תבנית עקיפה, מרכז ראשוןתכונה של עניין. הסר את צמצם המטרה והכנס את הצמצם העקיף.
- שינוי מצב העדשה העקיף על ידי לחיצה על כפתור DIFF בלוח הבקרה ולהשתמש ידית שליטת השוואה על לכווץ את הקורה.
- הכנס את השמיכה ככל שתידרש כדי למנוע במרכז הדפוס העקיף מהשריפה במסך המצלמה או זרחן. התחל רכישת המצלמה כדי ללכוד תמונה של התבנית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
להלן כמה תצפיות של תהליך הסתיידות במהלך המטמורפוזה של תולעת-שפופרת. איור 1 מראה כי ערכי ה- pH ליד אזור צווארון גבוה ברקמות אחרות לאחר מטמורפוזה. 2i האיור מראה תולעת-שפופרת עם חלוקה הומוגנית של Ca, דבר מצביע נקבעה אירועי הסתיידות גדולים החלו; איור 2ii תערוכות תולעת-שפופרת אשר מסויד לתקופה ארוכה יותר, דבר המצביע על הסתיידות כבר עבר את נקודת הזמן של עניין; איור 2iii תערוכות תולעת-שפופרת עם שלב ההסתיידות של עניין, אשר נבחר לצורך ניתוח נוסף כדי להבין את הרקמות אחראיות מינרליזציה. איור 3 מציג את ערכי ה- pH הגבוהים מתואמים עם אותות יון Ca הגבוהים משני מכתים calcein ו SEM-EDX מיפוי. בעקבות תצפיות אלה רקמת משלב החיים של עניין נבדקת היירזולוציה gher בטכניקה מקומית יותר, SEM-EBSD. עם הגילוי בשלב מינרליים, איור 4 מראה את היישום של אלומת יונים ממוקדת להרים את החומר של עניין עבור TEM וניתוח עקיפת האזור נבחר כדי לאשר את crystallinity של המינרל.
איור 1: מיפוי pH תאי של תולעת-שפופרת (מאל et Chan 2015.). בשעת 71 שעות לאחר טיפול IBMX, תולעת-שפופרת, elegans Hydroides, מייצגת בין היתר בשל האטת מטמורפוזה מדגימה ההטרוגניות גדול בחלוקת pH התאית. תמונה DIC (למעלה משמאל) pseudocolorized תמונות מרוכבים המופק ערכי האפור ב 640 ננומטר מחולק ערכי אפור ב 580 ננומטר (למעלה מימין) מוצגים. הערכים האפורים מחושבים המייחס ננומטר 640/580 פרופורציונאלי pH התאי. Profiles של הערכים האפורים מהתמונות מרוכבים, הוסבו ערכי pH תאי על המרחק לאורך ציר הגוף האורך של תולעת-שפופרת (הפנל תחתון). הקשר בין רמת חומציות התאית יחס 640/580 ננומטר הפליטה הוקם על ידי במבחנת כיול (y = 0.30x - 1.47; R 2 = 0.934; y, ערך אפור; x, pH התאי). אזורים עם pH תאי מעל pH 8.5 (באדום) הם המתאימים לאזורים בם מבנים מסוידים נמצאו. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר; ג, צווארון; ב, אונות branchial; נמלה, anteior; פוסט, אחוריים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: זיהוי שלב בחיים של עניין באמצעות SEM-EDS.
תולעי שפופרת בשעה שונהנקודת מטמורפוזה זמן הוקרנה כדי ללכוד את במת calcifying החדשה לניתוח נוסף (i) יום 1 תולעת-שפופרת שלאחר מותמרים מציגה את חלוקת הומוגנית של אות Ca (ii) יום 2 גדל מהר שלאחר מותמרים תולעת-שפופרת מראה צלצול קצר של אות Ca (iii) תולעת-שפופרת מותמרים פוסט גדלתי לאט יום 2 מראה כתמים של אות Ca. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: אפיון אותות Ca באמצעות מיקרוסקופ חי (מ צ'אן ואח 2015.). (I-IV), SEM-EDS (נ-ז) ו SEM-EBSD (viii-x). חלוקת יון סידן כמו בקורלציה לאות calcein 31 שעות ו -53 שעות לאחר המטמורפוזה של elegans Hydroides. התמונות DIC (פאנל משמאל, 3i ו- III) ו- Tהוא calcein אות (פאנל משמאל, 2ii ו- IV) מוצגים. במיקרוסקופ אלקטרונים גומל על elegans Hydroides 2 שלאחר מותמרים יום זוהה כתמים של מבנים מסויד, כפי שמוצג בתמונה SEM במתח נמוך (5 kV) (פאנל באמצע, 3v). SEM-EDS מיפוי וניתוח, ביצע ב 20 kV, תערוכות חלוקה הטרוגנית של סידן (פאנל באמצע, 3vi, Ca; בצהוב). תכני Ca מוצגים כמספרים שכיסה פרט פנים גדול יותר של מתח נמוך (5 kV) תמונה של תולעת-שפופרת, את Ca תוכן (% mol wt, נקודות עשרוניות מיושרות אף להציג את מיקומם של נקודה ניתוחית) המתקבל כימות נקודה ( עם SEM-EDS ב- 20 kV) (פאנל באמצע; 3vii). אזורים עם תוכן Ca גבוה מ -15% mol wt צפויים להיות מבנים מסוידים. ניתוח SEM-EBSD של אזורי סידן העשירים illuastrated בלוח הימני של-x 2viii. האזורים עשירים בסידן (קופסה לבנה) כפי שנמצאו בתוצאות SEM-EDS נותחו נוספת עם EBSD (פאנל מימין; 3viii) (ii) המעגל (פאנל מימין;3ix) מציין את אתר ניתוח EBSD; דפוס קיקוצ'י (פאנל מימין; 2x) ניתן להסיק כי האתר הוא aragonitic מממשק התוכנה microanalysis EDS / EBSD. ג, צווארון; ב, אונות branchial; נמלה, קדמי; פוסט, אחוריים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: אפיון המבנה הגבישי באמצעות FIB-TEM (מ צ'אן ואח 2015.). האזור (i) מפגין דפוס קיקוצ'י מ EBSD היה ניכר להכין מדגם TEM, (ii) החומר שמסביב הסיר נכרת על ידי אלומת יונים ממוקדים (FIB) טכניקה (מבט מלמעלה), (iii) את החומר הוסר באמצעות בדיקת טונגסטן (מבט מצד), (iv) מדגם עם עובי סופי של ננומטר ~ 200, אשר התקבל במתח נמוך. חגו באזור (v) היונתח את קיומו של דפוס עקיף שנבחר-אזור בתוך TEM (vi), מראה דפוס של ארגוניט יחיד גביש. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
דימות אופטי Live הוא שיטה יעילה עבור התבוננות אירועים הסלולר ב אורגניזם רב-תאי. הנה, יון pH וסידן פנימי אינדיקטורים שימשו למדידת השטף של יונים באתרי מינרליזציה. באזורים אלה, יון שאיבה פעילה נדרשה להעלות pH ו Ca 2 + ריכוז לאפשר הסתיידות 2, 3. כאשר פונים מולקולות ניאון ללמוד אורגניזם, זה הוא קריטי על מנת להבטיח כי ריכוז בשימוש יש רעילות זניחה ומאפשר האורגניזם לבצע באופן רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. ריכוז מכתים תחתון יהיה פחות רעיל והוא בדרך כלל בשילוב עם זמן מכתים עוד 10. חשוב לשמור על צפיפות נמוכה של זחלים בזמן הדגירה, מזעור מחסור בחמצן והצטברות פסולת בתקופה המכתימה.
לפני רודף שיטות FIB / TEM, אשר כרוכים מקומיהאזור של עניין, חשוב להקרין דרך שלב בחיים ורקמות עניין בשיטות ברזולוציה נמוכה כמו SEM-EDS ו- SEM-EBSD. התבוננות הדגימה תחת מצב backscattered מאפשרת הדמיה של רכב ביחס יסודות שבו בניגוד מצית וקושר למשקל אטומי כבד 11. לכן, תמונות SEM-BSE גם לספק הערכה של שבו יסודות כבדים כמו יוני סידן כדוריות שומנים מוכתמות אוסמיום ממוקמים. ניתוח SEM-EDS מאפשר מיפוי ספציפי יותר של יוני סידן על הדגימות. עם זאת, זה לא לאשר את קיומו של גבישי קאקו 3. SEM-EBSD מאפשר זיהוי של מבנים גבישיים, אם כי שיטות EBSD קונבנציונליות דורשות משטח מלוטש 12. מחקר זה מדגים כיצד SEM-EBSD על מדגם לא מלוטש יכול לספק מידע שימושי. זרם קרן 20 kV מאפשר יותר עומק הניתוח על פני השטח המדגמים. לכן, EBSD היא שיטה רצויה לזהותבנוכחות biomineral, במיוחד על דגימות ביולוגיות קטנות, תמות כמו זחלים ימיים. למרות הדגימות המלוטשות היו תמסורנה שלילי שווא כאשר מינרלים אינם מול גלאי בסביבות 70 מעלות, לראות דפוס קיקוצ'י נחשב עדויות חד משמעיות של שלב מינרלי האזור של עניין 13.
במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (TEM) מאפשר אפיון מבני של מגוון רחב יותר של חומרים 14. אלומת יונים ממוקדת (FIB) מאפשר חילוץ אתרים ספציפיים והכנת מדגם עם ממדים אופייני לניתוח TEM 15. לכן, טכניקת FIB / TEM היא שיטה מתאימה לנתח biomaterials חדש מופקד אזור מקומי. מכשירי FIB-SEM משולבים גם לאפשר תצפית ללא ניזק של דגימה באמצעות שימוש טור אלומת אלקטרונים משולב. ציפוי טונגסטן גמגום של הדגימה מגדיל מוליכות ומגבלות יון iנזק mplantation הקרנה של המדגם 16. שימוש אלומת יונים ממוקד דק עם להתעכב זמן נמוך מאפשר טחינה של חומרים אורגניים. בתוך FIB-SEM, תכונה של עניין מיוחדת ניתן לחלץ מתוך דגימה בתפזורת דלילה אלקטרוני שקיפות לניתוח TEM 17. בגלל האנרגיה הגבוהה של אלומת יונים, חומרים גבישיים יכול להתברר כבלתי אמורפי. זו עלולה להתרחש בעת הכנת lamella דק לניתוח TEM ויכול להיות מתן באמצעות אלומת יוני מתח נמוכה מאיצה כדי להסיר את שכבת אמורפי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hexamethyldisilazane | Electron Microscopy Sciences | 16700(EM) | |
| Osmium Tetroxide 2% Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 19192 | |
| IBMX 3-Isobutyl-1-methylxanthine | ThermoFisher Scientific | PHZ1124 | |
| Nigericin, Free Acid | ThermoFisher Scientific | N7143-5MG | |
| 35 mm diameter dish, hole size 27 mm, Glass No.0, Non-coat | ThermoFisher Scientific | D110400 | |
| 5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate | ThermoFisher Scientific | C-1271 | |
| BDH Potassium Chloride, ACS Grade | VWR | BDH0258-500G | |
| Paraformaldehyde reagent grade, crystalline |
Sigma | P6148 | |
| 1 M Hydrochloric Acid for Volumetric Analysis | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 083-01095 | |
| 0.05 M Sodium Hydroxide Solution for Volumetric Analysis | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 199-02185 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | |
| FASW | Iwaki Co. Ltd. | Rei-sea Marine | |
| Mixed Cellulose Ester Membranes; 47 mm dia, 0.45 µm | ADVANTEC | A045A047A | |
| ethanol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 051-00476 | |
| Artificial seawater for buffers | by SOP06 of DOE (1994), cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf | ||
| Sodium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 191-01665 | |
| Potassium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 163-03545 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 135-00165 | |
| Calcium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 039-00475 | |
| Sodium Sulfate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 197-03345 | |
| Hydrochloric Acid | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 089-08415 | |
| 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (tris) | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 207-06275 | |
| 2-aminopyridine | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 011-02775 | |
| Orion 5-star Plus pH meter | Thermo Scientific | ||
| PrpHecT ROSS Micro Combination pH Electrode 8220BNWP | Thermo Scientific | ||
| Axiovision, Version 4.6, Axio Observer Z1 | Zeiss | ||
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD, USA | ||
| HRTEM H500 | Hitachi | ||
| SU6600 VPSEM | Hitachi | ||
| NB5000 Focused Ion and Electron Beam (FIB-SEM) system | Hitachi |
References
- Aizenberg, J., et al. Skeleton of Euplectella sp.: structural hierarchy from the nanoscale to the macroscale. Science. 309 (5732), 275-278 (2005).
- de Nooijer, L. J., Toyofuku, T., Oguri, K., Nomaki, H., Kitazato, H. Intracellular pH distribution in foraminifera determined by the fluorescent probe HPTS. Limnol Oceanogr Methods. 6 (11), 610-618 (2008).
- de Nooijer, L. J., Langer, G., Nehrke, G., Bijma, J. Physiological controls on seawater uptake and calcification in the benthic foraminifer Ammonia tepida. Biogeosciences. 6 (11), 2669-2675 (2009).
- Smith, A. M., Riedi, M. A., Winter, D. J. Temperate reefs in a changing ocean: skeletal carbonate mineralogy of serpulids. Mar Biol. 160 (9), 1-14 (2013).
- Carpizo-Ituarte, E., Hadfield, M. Stimulation of metamorphosis in the polychaete Hydroides elegans Haswell (Serpulidae). Biol. Bull. 194 (1), 14 (1998).
- Bryan, P. J., Kreider, J. L., Qian, P. Y. Settlement of the serpulid polychaete Hydroides elegans (Haswell) on the arborescent bryozoan Bugula neritina (L.): evidence of a chemically mediated relationship. J Exp Mar Biol Ecol. 220, 171-190 (1998).
- Chan, V. B. S., et al. Evidence of compositional and ultrastructural shifts during the development of calcareous tubes in the biofouling tubeworm, Hydroides elegans. J. Struct. Biol. 189 (3), 230-237 (2015).
- DOE. Handbook of methods for the analysis of the various parameters of the carbon dioxide system in sea water. Version 2. Dickson, A. G., Goyet, C. , ORNL/CDIAC-74 (1994).
- Chan, V. B. S., et al. Direct deposition of crystalline aragonite in the controlled biomineralization of the calcareous tubeworm. Front Mar Sci. 2, 97 (2015).
- Bond, J., Varley, J. Use of flow cytometry and SNARF to calibrate and measure intracellular pH in NS0 cells. Cytometry A. 64, 43-50 (2005).
- Lloyd, G. E. Atomic number and crystallographic contrast images with the SEM: a review of backscattered electron techniques. Mineral Mag. 51, 3-19 (1987).
- Perez-Huerta, A., Dauphin, Y., Cuif, J. P., Cusack, M. High resolution electron backscatter diffraction (EBSD) data from calcite biominerals in recent gastropod shells. Micron. 42 (3), 246-251 (2011).
- Bandli, B. R., Gunter, M. E. Electron backscatter diffraction from unpolished particulate specimens: examples of particle identification and application to inhalable mineral particulate identification. Am. Mineral. 97, 1269-1273 (2012).
- Hayat, M. A. Principles and techniques of electron microscopy: biological applications. , Cambridge University Press. (2000).
- Wirth, R. Focused Ion Beam (FIB) combined with SEM and TEM: Advanced analytical tools for studies of chemical composition, microstructure and crystal structure in geomaterials on a nanometre scale. Chem Geo. 261, 217-229 (2009).
- Volkert, C. A., Minor, A. M. Focused ion beam microscopy and micromachining. MRS Bull. 32, 389-399 (2007).
- Kudo, M., et al. Microtexture of larval shell of oyster, Crassostrea nippona: A FIB-TEM study. J. Struct. Biol. 169 (1), 1-5 (2009).
