Caractérisation de calcification Events Utilisation en direct optiques et Electron Microscopy Techniques dans un tubeworm Marine

Introduction

Biominéralisation est une série complexe d'événements, qui relie une série d'activités cellulaires conduisant à la production de minéraux délicieusement commandés ^1. Le défi consiste à caractériser à la fois le processus cellulaire dynamique et les structures minérales sophistiquées utilisant une combinaison de méthodes de microscopie optique et électronique. Une élévation du pH intracellulaire favorise la formation de cristaux de CaCO _3, d' où l' identification du stade de développement qui a un pH accru indique le moment où la calcification est susceptible de se produire ^{2, 3.}

Les tubeworms de la famille Serpulidae sont calcifiants communes dans l'océan ^4. Il est également un modèle invertébré populaire pour la recherche marine, en particulier dans l' encrassement biologique ^{5, 6.} Dans cette étude, le processus de calcification dans les compartiments de minéralisateurs during biominéralisation est observée. Le processus rapide de la métamorphose comprend l'émergence de structures de carbonate de calcium ^{7, 8.}

Nous montrons comment interne des mesures pH peut être effectuée sur le tubeworm, et comment les étapes de la vie et les tissus concernés pour la calcification peuvent être criblés. Après l'étape de la vie d'intérêt est identifié, le tissu responsable de la calcification peut être caractérisée à une résolution supérieure en utilisant des méthodes de microscopie électronique. En utilisant la microscopie à fluorescence, on détermine le temps nécessaire pour le carbonate de calcium à apparaître après l'induction métamorphique. Une étape de vie similaire a ensuite été visualisée avec SEM-EDS pour la distribution de la composition élémentaire, et le minéral déposé a été analysé à l'aide de deux méthodes de microscopie électronique différents, en particulier SEM-EPCA et FIB-TEM.

Protocol

1. Dépistage de stades de la vie et de tissus d'intérêt avec l'imagerie en direct

1. La culture des larves marines de compétence selon des procédés rapportés précédemment ^{6, 7, 9.} Incuber les larves de tubeworm à 5 larves par densité ml d'eau de mer filtrée avec 10 uM SNARF-1 heures du jour au lendemain. Couvrez le récipient avec du papier d'aluminium pour protéger la sonde fluorescente de photo-blanchiment.
2. Observer les larves à l'aide d'un microscope de dissection. tubeworm compétente larves prêt pour la métamorphose va nager dans une direction vers l'avant au lieu d'un mouvement circulaire.
3. Transférer les larves compétentes à un maillage de 60 um. Appuyez sur la maille contre une boîte de Pétri, en fournissant une bonne étanchéité à retenir le liquide. Relâcher rapidement le joint pour libérer et jeter l'eau de mer contenant un colorant fluorescent, en conservant les larves.
4. Laver les larves avec l'eau de mer artificielle filtrée (FASW) deux fois, en prenantsoin de ne pas sécher les larves dans le processus.
5. Placez 10 à 20 larves dans les plats à fond de verre mince avec 5 ml de FASW contenant 10 ^-4 M isobutylméthylxanthine (IBMX) pour l' observation du processus de métamorphose.
6. Insérez les cubes de filtre pour détecter SNARF-1 signal (Canal 1: Ex 510/25 Em 580/30; Canal 2: Ex 510/25 Em 640/35) l'image DIC des larves, et.
7. Placez les larves de métamorphosant sous l'objectif 20X, puis, d'optimiser le temps d'obturation (100-300 ms) assez rapide pour assurer qu'une image claire des animaux vivants est capturé.
8. Set 1 um distance pour capturer une pile en Z de tous les trois canaux, lorsque l'image d'un animal vivant, chaque couche d'imagerie pour les trois canaux avant de passer à la couche suivante de la direction z permettrait une meilleure corrélation entre les canaux.
9. Export gris images d'échelle pour tous les canaux et les couches sous forme de fichiers TIF à partir du logiciel de microscope: Fichier | Export | Type de fichier TIF | Début.
10. Utiliser ImageJ, imle port de la séquence d'image pour chaque canal: Fichier | importation | séquence d'images.
    1. Pour importer le canal 1 λ ₁ ^em, entrez image de départ 3 et minimum: 4.
    2. Pour importer le canal 2 λ ₂ ^em, entrez image de départ 4 et minimum: 4.
11. Générer une image composite en divisant λ ₂ ^em par λ ₁ ^em pour chaque pixel de couche par pixel (Process | Calculatrice de l' image ... | fichier image 640 nm "fracture" du fichier d'image de 580 nm), soit 640/580 nm ratio.
12. Sélectionner l'image | Tables de recherche | 16 couleurs.
13. Sélectionnez Analyser | Outils | barre de calibrage.
14. Inspecter les différentes couches, l'identification de la couche contenant le plus hétérogène. Ceci permet d'obtenir les informations les plus utiles concernant la distribution de pH interne.
15. Utilisation de la relation entre le rapport 640/580 nm et pH, construire un profil de tracé pour visualiser la répartition du pH interne.

1. Après coloration durant la nuit d'environ 20 larves avec 10 uM SNARF-1 AM, ajouter des solutions mères de nigéricine et KCl pour compenser 50 uM nigéricine et KCl 150 pour l'étalonnage.
2. Ajuster le pH de calibrage AFSW avec NaOH ou HCl dilué, jusqu'à un pH d'environ 5,9 est atteint. Notez la valeur de pH exact. Mesurer le pH avec un pH - mètre à électrode de verre qui a été calibré par l' eau de mer à base de 2-amino-2-hydroxyméthyl-1,3-propanediol (Tris) et de 2-aminopyridine ^9.
3. Transfert d'une larve de tubeworm teinté avec un liquide avec un pH connu pour un plat sec et propre pour la mesure de l'intensité des signaux à 640 nm et 580 nm.
4. Répétez les étapes 2.2 et 2.3 pour les quatre points de pH plus allant de 5,9 à 9,9. Ils représentent une gamme de valeurs physiologiquement pertinents.
5. Vérifiez pour assurer les signaux apparaissent homogène dans tout le corps de l'animal. Ceci indique que le pH intracellulaire a été equilibrated avec l'eau de mer de l'environnement.
6. Image les larves de tubeworm les cinq environnements d' eau de mer de pH différents, enregistrer les intensités indiquées comme «valeurs de gris" à 640 nm et à 580 nm, soit, λ ₂ ^exc et λ ₁ ^exc.

3. Analyse de Ratiométrique Imaging données

1. Entrez les valeurs de gris telle que mesurée à partir de cinq emplacements aléatoires ou d'une zone d'intérêt sur une feuille de calcul.
2. Vérifiez la calibration cinq points a montré une relation linéaire pour indiquer le pH intracellulaire (par exemple, l' équation comme y = 0.30x - 1,47; y = valeur de gris; x = pH; R² = 0,934).
3. Calculer les valeurs de pH intracellulaire à partir de l'équation en utilisant la 640/580 nm rapport d'intensité mesurée à l'étape 1.13.

4. Préservation de l'échantillon, Déshydratation et montage pour Microscopie électronique

1. Préserver l'étape de la vie d'intérêt avec 4% de paraformaldehyde. dans cette étude, Fixer les tubeworms 2-4 jours après la fixation, garder les animaux dans un fixateur jusqu'à l'analyse.
2. Travailler dans une hotte, post-fixer le spécimen avec osmium 1% solution aqueuse tétroxyde pendant 30 min pour minimiser le retrait des tissus pendant le processus de déshydratation.
3. Déshydrater l'échantillon avec une série d'éthanol à 50% d'éthanol pendant 5 minutes, 70% d'éthanol pendant 5 minutes, 85% d'éthanol pendant 5 minutes, 95% d'éthanol pendant 5 min, et enfin de l'éthanol absolu pendant 5 minutes deux fois.
4. En travaillant dans une hotte aspirante, ajouter une solution 1: 1 d'éthanol et d'hexaméthyldisilazane (HMDS) à l'échantillon, ce qui permet au liquide pour évaporer complètement.
5. Dans la hotte aspirante, ajouter 100% HMDS à l'échantillon, permettant au liquide pour évaporer complètement.
6. L'utilisation d'un couteau de diamant, introduire quelques coupes dans la boîte de culture, entourant quelques tubeworms. Avec le couvercle, maintenez le fond plat contre un talon d'aluminium pour briser le plat.
7. Sous un microscope de dissection, trouver un morceau fracturé contenant un tubeworm intact.
8. Appliquer la peinture d'argent à un talon d'aluminium et fixer le fragment de la fusée avec précaution. La peinture sur les bords du fragment de matière plastique afin de réduire la charge.

5. Recherche d'un riche en calcium Région utilisant SEM-EDS

1. Fixer le talon de l'échantillon sur le porte-échantillon.
2. Mesurer la hauteur de la totalité de l'ensemble contre la jauge fournie avec le microscope, le réglage de la hauteur en desserrant la rondelle de blocage et en tournant le poste jusqu'à ce que le spécimen est à la hauteur standard, ou entrez la hauteur enregistrée.
3. Admettre l'air dans la chambre d'échange de microscope et balancer la porte de la chambre ouverte. Faire glisser le porte-échantillon sur l'extrémité de la tige d'échange. Puis fermez et évacuer la chambre.
4. Ouvrez la vanne et faites glisser la tige de change en direction de la chambre de microscope. Faites glisser la tige de change tout le chemin pour accueillir pleinement le porte-échantillon dans la platine du microscope. Retirer la tige d'échange et de fermer la vanne.
5. entrée til échantillonner les dimensions et envoyer la scène à la position d'accueil pour placer l'échantillon sous la colonne électronique.
6. Réglez le niveau de vide de la chambre à 20-30 Pa en mode VP-SEM. Réglez la tension d'accélération d'électrons à 20 kV et tourner la haute tension.
7. Soulever la scène à une distance échantillon de travail de 10 mm. Acquérir un flux en direct et de localiser le spécimen. Optimiser l'image de réglage de l'astigmatisme et de se concentrer si nécessaire.
8. Ouvrez le programme SEM-EDS et sélectionnez l'option du mode EDS-SEM. Sélectionnez l'option de menu pour exécuter une carte EDS.
9. Changement lentille de condenseur et les paramètres de l'ouverture pour obtenir un temps mort d'environ 30% à un temps de traitement de 3 comme contrôlé par le compteur de vitesse dans le programme SEM-EDS. Exécuter les procédures de faisceau et d'alignement de l'ouverture après avoir effectué des modifications apportées aux paramètres de faisceau.
10. Sélectionnez un grossissement de telle sorte qu'un seul organisme remplit tout le champ de vue. Activez l'option de correction de dérive et capturer une image dans le programme SEM-EDS.
11. Acquérir map données avec l'organisme remplissant la totalité du champ de vue, en utilisant un temps de séjour de 50-100 ms. Exécuter la carte jusqu'à ce que les données indiquent la localisation distincte de Ca dans l'organisme (environ 15 minutes).
12. Pour obtenir des données de point de quantification, modifier le temps de traitement à 6 et d'ajuster la sonde électronique pour acquérir un temps mort de ~ 30%. Exécutez les étapes d'alignement et d'optimiser l'image si nécessaire.
13. Sélectionnez le point et de l'option ID dans le programme SEM-EDS et d'acquérir une autre image. Utilisation de l'outil de point unique, cliquez sur les zones qui apparaissent Ca riche sur le plan EDS, ainsi que les zones déficitaires Ca aux fins de comparaison. Balayez chaque point pour un temps en direct de 30 s.

6. Identification cristallographique information du calcium Régions riches utilisant SEM-EPCA

1. Retirer plastique fragment contenant l'échantillon d'intérêt de plat spécimen stub et apposer sur la face inclinée d'un talon de 45 ° pré-incliné en utilisant l'argent adhésif conducteur.
2. Vissez l'embout sur l'échantillon hâgée et sa position, la face inclinée de la fusée (avec l'échantillon) vers l'avant du porte-échantillon. Insérez le porte-échantillon dans la chambre du microscope en utilisant la chambre d'échange.
3. Réglez la chambre sous vide à 30 Pa et électronique tension d'accélération de 20 kV. Envoyer l'échantillon au-dessous de la colonne électronique et d'inclinaison de 25 ° l'étape de placer la surface d'échantillon d'environ 70 ° par rapport à la normale au faisceau d'électrons. Tournez la haute tension.
4. Soulever la scène à une distance de travail de ~ 18 mm. Utilisez la boule de commande pour déplacer la scène et de localiser un spécimen. Augmenter le grossissement pour encadrer les caractéristiques spécifiques d'intérêt. Aligner le faisceau et d'optimiser l'image si nécessaire.
5. Ouvrez le programme SEM-EDS en mode EPCA. Sélectionnez calcite et aragonite comme phases d'intérêt. Insérer l'appareil EBSD à une distance de 154 mm. Définir les conditions de l'appareil photo 1 x 1 binning et un temps de trame de 100 ms. L'utilisation d'un raster de faisceau rapide, l'acquisition d'un arrière-plan.
   NOTE: Un taux différentpeuvent être nécessaires en fonction de la sonde électronique; régler la vitesse de défilement sonde ou appareil photo pour obtenir un signal d'environ 90%.
6. Capturer une image dans le programme SEM-EDS. Utilisez l'outil d'analyse spot et cliquez quelque part sur l'image pour balayer le faisceau sur ce point. Observez la fenêtre de la caméra pour voir si des motifs Kikuchi sont détectés.
7. Cliquez sur les différentes zones de l'image à analyser les sites de calcification potentiels, en observant la fenêtre de la caméra à chaque point pour voir si des bandes de Kikuchi sont présents. Si les modèles sont présents et correspondent à l'une des phases sélectionnées dans la base de données, ils seront automatiquement indexés.

7. TEM Préparation des échantillons utilisant FIB-SEM

1. Pulvérisez cathodiquement l'échantillon SEM préparées avec du platine ou un matériau similaire pour créer une couche conductrice.
   1. Placer les échantillons préalablement fixés, déshydratés et montés dans le boîtier de la coucheuse de pulvérisation et allumer l'appareil pour commencer le pompage de la chambre vers le bas.
   2. Une fois que le vide de la chambre lit 40 mTorr ou moins, tournez le commutateur de gaz sur et augmenter le flux de gaz d'argon pour atteindre une pression de chambre de 200 mTorr. Régler le débit de gaz pour obtenir une pression de la chambre finale de 80 mTorr.
   3. Tournez le commutateur de tension sur et augmenter la tension pour atteindre un courant de 15 mA. Régler la minuterie et le pelage pendant une période prolongée (~ 10 min) pour créer une couche épaisse (~ 60 nm) qui protège la surface de l'échantillon des dommages causés par une irradiation d'ions. Réguler la tension pour maintenir un 15 courant stable mA.
   4. Une fois terminé, éteignez le coucheuse pour libérer le vide et retirer l'échantillon.
2. Vissez la base du prêt, par pulvérisation cathodique échantillon revêtu sur la vis après M4 du porte-échantillon de l'instrument. Serrer jusqu'à ce que la main serré, desserrer l'écrou de blocage, puis faites pivoter le poste de porte-échantillon pour modifier la hauteur de l'ensemble. Utilisez la jauge de hauteur laser et ajuster la hauteur pour être à moins de 1 mm (= 0,04 pouces comme indiqué dans la vidéo) de la norme Supplied avec l'instrument.
3. Fermez toutes les vannes d'armes à feu dans le FIB-SEM, puis l'admission d'air dans le sas d'étape eucentrique. Une fois que la pression a égalisé avec l'environnement, faites glisser l'air de verrouillage ouvert et apposer le porte-échantillon sur les dents de la tige d'échange. Tournez le bouton à l'extrémité de la tige de change à la position "de verrouillage". Fermer le sas à air et à évacuer la chambre de sas d'air.
4. Une fois que le verrouillage de l'air de premier étage eucentrique a été évacuée et la pression correspond à celle de la chambre FIB-SEM, ouvrir la vanne et insérer l'échantillon en poussant la tige d'échange. Faites glisser la tige d'échange tout le chemin pour accueillir le porte-échantillon dans le stade instrument eucentrique, puis tourner la tige de change à la position "de déverrouillage". Faites glisser la tige d'échange arrière et fermer la vanne.
5. Déplacer la platine pour positionner l'échantillon dans la colonne de faisceau d'ions. Ouvrez les vannes et d'acquérir une image en direct d'électrons secondaires induits par ions du FIB. Utilisez un faible grossissement et unbalayage de trame rapide pour minimiser les dommages ions. Réinitialiser la focalisation du faisceau d'observation normale et augmenter la hauteur Z de la scène jusqu'à ce que l'échantillon est mis au point. À ce stade, l'échantillon est à la position de point de croisement où les deux ions et des faisceaux d'électrons sont concentrés au même endroit.
6. Utilisation de l'image secondaire d'électrons de la SEM, localiser la zone d'intérêt dans l'échantillon, en utilisant le trackball pour déplacer l'échantillon autour. Les domaines d'intérêt sont des zones riches Ca comme précédemment déterminées par la cartographie EDS. Tournez la scène comme nécessaire pour obtenir les caractéristiques d'intérêt en ligne avec le cadre de la fenêtre.
7. Sur l'interface de la fenêtre de FIB, capturer un aperçu rapide de l'échantillon à un grossissement de 1,000X avec un zoom numérique 2X supplémentaire et d'en tirer un modèle de dépôt ~ 8 pm x 2 pm sur la zone d'intérêt. La taille d'agrandissement de la zone de dépôt peut être ajustée pour tenir compte des caractéristiques de différentes tailles. Définissez les conditions de pulvérisation pour déposer du carbone en utilisant un 40 kV0,09 nA faisceau, en utilisant un temps de séjour de 0,5 ms pendant 5 min.
8. Après le dépôt du carbone, de modifier les conditions de dépôt pour déposer le tungstène en utilisant un kV 40, 0,7 nA faisceau, et le dépôt pendant 5 minutes pour générer un bouchon ~ 2-3 um de tungstène.
9. Capturer un instantané de FIB en utilisant le faisceau d'observation et utiliser l'outil Microprélèvement de pulvérisation pour dessiner un motif de quatre boîtes autour du bouchon de tungstène. Définissez les boîtes supérieure et inférieure à environ 15 pm x 8 pm; le droit boîte 10 pm x 5 pm, et la gauche boîte 6 pm x 5 pm, ou assez grand pour entourer la zone d'intérêt.
   1. Modifier les conditions de fabrication à l'aide d'un coupe kV 40, 19 nA faisceau, et un temps de séjour de 50 ms, et 3-4 cadres d'analyse pour chaque boîte. Puis fabriquer le modèle. Après la fabrication, la zone d'intérêt, avec des couches de protection C et W, ressemblera à une île, avec tout matériau adjacent enlevé sur le haut, en bas, et à droite.
10. Inclinez la scène 58 ° pour mettre le sampLe normale à la surface de la colonne électronique et à un angle aigu vers la colonne d'ions. Repérez l'arrière de l'échantillon «île» en utilisant la FIB et de capturer un instantané au 1,000X grossissement et 2-4x zoom numérique.
11. Dessinez un motif de pulvérisation ~ 15 pm x 2 pm sur le fond de la face arrière de l'échantillon «île», à la fin de l'endroit où il est visible. Fabriquez la boîte en utilisant un faisceau 4 nA pendant 3 minutes, ou jusqu'à ce que le faisceau a coupé à travers le fond de l'échantillon «île».
12. Inclinez la scène eucentrique -58 ° par rapport à la position actuelle (retour à zéro). Insérez la sonde de Microprélèvement de tungstène en cliquant sur "Probe In" dans l'interface FIB. Sélectionnez "MS" sur le panneau de contrôle de la scène et utiliser la boule de commande pour déplacer la sonde au-dessus de l'échantillon.
13. Acquérir un flux en direct de la FIB à un grossissement de 1 kx et positionner la sonde de telle sorte que la pointe se trouve directement au-dessus du côté droit de la coiffe de tungstène du microéchantillon. Tout en observant un livel'image SE de la SEM, utilisez le bouton de commande Z du panneau de scène pour descendre la sonde jusqu'à ce qu'il touche le cap de tungstène. Un signal sonore retentit une fois le contact a été faite.
14. Capturer un instantané en utilisant le FIB en utilisant un 40 kV, 0,01 faisceau nA, à un grossissement de zoom numérique 1,000X et 2X. Utilisez l'outil de dépôt pour dessiner une zone x 2 pm 2 pm sur la pointe de la sonde où elle a pris contact avec le bouchon de tungstène du microéchantillon.
    1. Fixer les conditions de dépôt du tungstène en utilisant un 40 kV, 0,09 faisceau nA pendant 2 min et un temps de séjour de 0,5 ps. Puis fabriquer le modèle.
15. Dessinez un motif de pulvérisation ~ 2 um x 5 um sur l'extrémité gauche du microéchantillon "bras" (où il est encore relié à la masse de l'échantillon). Fabriquez le modèle en utilisant un 40 kV, 0,7 nA faisceau, pendant 2 minutes, ou jusqu'à ce que le bip indique que le microéchantillon a été détaché de l'échantillon en vrac.
16. Utilisez le bouton de commande Z pour soulever la sonde avec microéchantillon attachée jusqu'àil efface l'échantillon en vrac, puis rétracter la sonde. Envoyer la scène de eucentrique soit à la maison ou de la position de change.
17. Placez un cuivre demi-grille dans un porte d'entrée latérale et charger le support dans la chambre de purge à l'étape d'entrée latérale. Evacuer la chambre et insérez le porte d'entrée latérale. Réglez le support à la position de FIB.
18. Appuyez sur Side sur le panneau de contrôle de la scène et utiliser la boule de commande pour amener la demi-grille en vue sur le moniteur FIB. Déplacer pour nettoyer la zone de la demi-grille et utiliser le bouton Z pour amener la surface dans le foyer.
19. Appuyez sur la sonde pour insérer la sonde, appuyez sur MS sur le panneau de commande de l'étage, et utiliser le bouton de trackball et Z pour positionner le microéchantillon sur la moitié grille. Abaisser la sonde jusqu'à ce que les contacts de microéchantillon la grille.
20. Capturer une image sur le FIB à 1,000X grossissement (zoom 2X). Utilisez l'outil de dépôt et dessiner un motif ~ 10 um x 3 um sur le côté inférieur du microéchantillon. tungstène fort avec un 40 kV, 0,7 nA faisceau, en utilisant un arrêt time de 0,5 ms pour 3 min.
21. Utilisez l'outil de pulvérisation et d'en tirer un petit motif x 3 pm 1 pm sur la pointe de la sonde. Fabriquez le modèle en utilisant un 40 kV, 0,7 nA faisceau à un temps de séjour de 3 ms pour couper la sonde loin de microéchantillon. Rentrez la sonde une fois libre.
22. Capturer une image de FIB à 5000 x grossissement et dessiner deux motifs de pulvérisation 7 pm x 4 um en haut et en bas du microéchantillon, en laissant un espace de 1 um ~ entre les cases. Centrez les motifs afin de ne pas couper les côtés gauche et droit du microéchantillon. Fabriquez les deux motifs à l'aide d'un kV 40, 4 faisceau nA, et un temps de séjour de 3 ms, pendant 2 minutes, le réglage de la direction de trame vers le centre du microéchantillon.
23. Capturer une autre image en utilisant le faisceau d'observation de FIB à 5000 x. Redimensionner les boîtes de pulvérisation précédentes pour ~ 6,5 um x 1 pm, se rapprocher de laisser un espace d'environ 0,5 um, et fabriquer en utilisant un 40 kV, 0,7 nA faisceau.
24. Inclinez le stade de l'entrée latérale de 0,5 ° et bouchonture une autre image de FIB. Redimensionner les boîtes de pulvérisation à 6 m de large. Placez le modèle supérieur sur la face supérieure du microéchantillon et fabriquer en utilisant un 40 kV, 0,7 nA faisceau. Inclinez -0.5 ° et répéter avec le motif de pulvérisation inférieur et côté inférieur du microéchantillon.
25. diminuer encore la largeur du motif de ~ 0,5 um. Inclinez 0,5 ° et pulvériser la face supérieure du microéchantillon en utilisant un 40 kV, 0,09 faisceau nA. Répéter l'opération avec le côté inférieur à -0,5 ° d'inclinaison.
26. Inclinez l'étape 2.2 ° et acquérir une image de FIB à 10.000 fois. Redimensionner des motifs de pulvérisation à 5 m de large et de changer les conditions de faisceau à 5 kV, 0,03 nA. Positionner le motif dessus sur le côté supérieur du microéchantillon, jusqu'au bord supérieur, et fabriquer. Inclinez -2.2 ° et répéter avec le côté inférieur et le motif de fond.
27. Répéter les étapes 5 kV de broyage jusqu'à ce que le microéchantillon devient électronique transparente (épaisseur ~ 100 nm). Une fois terminé, gunvalves fermer et retirer le support d'entrée latérale.

8. Obtenir motif sélectionné Zone Diffraction sur un TEM

1. Pour préparer l'instrument pour l'analyse, à la fois remplir Dewar flacons avec de l'azote liquide et régler la tension d'accélération à 300 kV.
2. Après la préparation de l'échantillon à l'aide du FIB, retirer le support de la FIB-SEM latéral d'entrée et de régler la position de la broche de telle sorte que la longueur du support correspond à celle du MET 300 kV. Tournez la pointe du support à la position d'observation correcte, encore une fois en le comparant au titulaire du TEM standard pour assurer l'orientation correcte de l'échantillon.
   1. Vous pouvez également retirer la demi-grille à lamelles joint du support FIB-SEM et la place dans le porte-TEM standard.
3. Chargez le porte-échantillon dans la chambre d'échange de TEM et évacuer la chambre. Assurez-vous que la vanne de pistolet instrument est fermé à chaque fois que l'air est admis dans la chambre d'échange. Une fois que la chambre d'échange a pompé vers le bas, une alarme sonore retentit. Tourner le porte-échantillon dans le sens horaire et de permettre l'vacuum pour tirer le porte-échantillon pour la première position d'arrêt.
4. Laisser le vide de l'appareil pour récupérer, puis ouvrir la vanne du pistolet. Réinitialiser la mise au point et zoom à un grossissement d'environ 10.000 fois.
5. Utilisez les boutons d'alignement pour déplacer le faisceau vers le centre de l'écran luminescent. Contrat et d'élargir le faisceau et faire en sorte que tout mouvement du faisceau est concentrique. Réglez pour condenseur stigmatisme si nécessaire.
6. Faire tourner le porte-échantillon dans le sens antihoraire et laisser le vide pour tirer le support à fond dans la colonne. Utilisez le mouvement des boutons de scène pour naviguer et localiser l'échantillon.
7. Augmenter l'agrandissement de l'échantillon et d'ajuster la hauteur Z jusqu'à ce que l'échantillon est mis au point. Utilisez les oculaires optiques nécessaires.
8. Insérez l'appareil photo et retirez l'écran luminescent. Développez le faisceau comme nécessaire pour éviter la sursaturation de l'appareil photo. Régler les paramètres de mise au point et de la caméra, puis commencer à l'acquisition pour capturer une image.
9. Pour acquérir un diagramme de diffraction, le premier centrecaractéristique d'intérêt. Retirez l'ouverture de l'objectif et insérez l'ouverture de diffraction.
10. Changer le mode de la lentille de diffraction en appuyant sur le bouton DIFF sur le panneau de commande et utiliser le bouton de commande DIFF pour rétrécir le faisceau.
11. Insérez le blanker que nécessaire pour empêcher le centre du diagramme de diffraction de la combustion de l'écran de la caméra ou du phosphore. Lancer l'acquisition de l'appareil photo pour capturer une image du motif.

Representative Results

Voici quelques observations du processus de calcification au cours de la métamorphose du tubeworm. La figure 1 montre que les valeurs de pH proches de la région de col est plus élevé que dans les autres tissus après la métamorphose. Figure 2i montre un tubeworm avec une distribution homogène de Ca, ce qui suggère pas d' événements majeurs de calcification ont commencé; Figure 2ii montre un tubeworm qui a calcifiée pour une période plus longue, ce qui suggère la calcification est allé au - delà du point d'intérêt de temps; Figure 2iii montre un tubeworm avec le stade de calcification d'intérêt, qui a été sélectionné pour une analyse plus approfondie pour comprendre le tissu responsable de la minéralisation. La figure 3 montre les valeurs de pH plus élevées sont corrélées avec les signaux plus élevés d'ions Ca à la fois une coloration calcéine et la cartographie SEM-EDX. A partir de ces observations, le tissu de l'étape de la vie d'intérêt a été examiné lors d'une salutrésolution gher en utilisant une technique plus localisée, SEM-EPCA. Lors de la découverte de la phase minérale, la figure 4 illustre l'application d' un faisceau d'ions focalisé pour soulever le matériau d'intérêt pour l' analyse TEM et sélectionné zone de diffraction pour confirmer la cristallinité du minéral.

Figure 1: cartographie du pH intracellulaire du tubeworm (de Chan et al 2015).. À 71 h après le traitement IBMX, un tubeworm, elegans Hydroides, ce qui représente un taux plus lent de la métamorphose montre une grande hétérogénéité dans la distribution de pH intracellulaire. l'image DIC (en haut à gauche) et pseudocolorized images composites générées à partir des valeurs de gris à 640 nm divisée par des valeurs de gris à 580 nm (en haut à droite) sont représentés. Les valeurs de gris calculé à partir du rapport 640/580 nm est proportionnelle au pH intracellulaire. Le profiles valeurs de gris des images composites à partir des, ont été converties en valeurs de pH intracellulaire sur la distance le long de l'axe longitudinal du corps de la tubeworm (panneau inférieur). La relation entre le pH intracellulaire et le rapport 640/580 nm en émission a été établi par l' étalonnage in vitro (y = 0.30x - 1,47; R ² = 0,934; y, valeur de gris; x, pH intracellulaire). Les régions à pH intracellulaire pH supérieur à 8,5 (en rouge) correspondent aux régions où les structures calcifiées ont été trouvés. Barres d'échelle = 100 um; c, collier; b, lobes branchiales; fourmi, anteior; après, postérieure. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: Identification de l'étape de la vie d'intérêt en utilisant SEM-EDS.
Tubeworms à différentspoint de métamorphose de temps ont été criblées pour capturer la scène nouvellement calcification pour une analyse ultérieure (i) Un jour 1 post-métamorphique tubeworm montre une répartition homogène du signal de Ca (ii) Une journée tubeworm 2 post-métamorphique croissance plus rapide montre un anneau court signal Ca (iii) Un jour de plus en plus 2 après métamorphique tubeworm plus lent montre des taches de signaux Ca. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: Caractérisation des signaux Ca en utilisant la microscopie en direct (de Chan et al 2015).. (I-iv) SEM-EDS (v-vii) et SEM-EBSD (viii-x). La distribution d'ions calcium sous forme corrélé au signal de calcéine à 31 h et 53 h après la métamorphose des Hydroides elegans. Les images DIC (panneau de gauche, 3i et iii) et til calcéine signal (panneau de gauche, 2ii et iv) sont présentés. Microscopie électronique corrélative sur le jour 2 post-métamorphiques elegans Hydroides détecté taches de structures calcifiées, comme le montre une faible tension (5 kV) image MEB (panneau du milieu, 3v). SEM-EDS cartographie d'analyse, réalisée à 20 kV, montre une distribution hétérogène de calcium (panneau du milieu, 3vi, Ca, en jaune). Le contenu Ca sont présentés sous forme de nombres superposant un détail de surface inférieure tension (5 kV) image de la tubeworm, le Ca contenu (% de poids moléculaire, les points décimaux sont alignés pour montrer l'emplacement de la tache analyses) obtenu de la tache quantification ( avec SEM-EDS à 20 kV) (panneau du milieu; 3vii). Les régions ayant une teneur en Ca est supérieur à 15% en poids en moles sont susceptibles d'être calcifiées. analyse SEM-EBSD des régions riches en calcium est illuastrated dans le panneau droit de 2viii-x. Les régions riches en calcium (boîte blanche) comme trouvés dans les résultats SEM-EDS ont été analysés avec EPCA (panneau de droite; 3viii) (ii) Le cercle (panneau de droite;3iX) indique le site d'analyse EBSD; un motif Kikuchi (panneau de droite; 2x) suggère que le site est aragonite depuis l'interface du logiciel / EPCA de microanalyse EDS. c, collier; b, lobes branchiales; ant, antérieure; après, postérieure. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4: Caractérisation de la structure cristalline en utilisant FIB-TEM (de Chan et al 2015).. (I) La région présentant un motif Kikuchi de EPCA a été excisée pour préparer un échantillon de TEM, (ii) le matériau environnant enlevé excisé par un faisceau ionique focalisé (FIB) technique (vue de dessus), (iii) le matériel a été soulevée à l'aide d'un sonde de tungstène (vue de côté), (iv) l'échantillon avec une épaisseur finale de ~ 200 nm, qui a été obtenu à une tension inférieure. zones encerclées (v) étaientanalysés pour la présence de motif de diffraction dans une région sélectionnée TEM (vi), montrant un motif monocristalline d'aragonite. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

l'imagerie optique en temps réel est un procédé utile pour observer des événements cellulaires dans un organisme multicellulaire. Ici, les indicateurs de pH et des ions calcium internes ont été utilisés pour mesurer le flux d'ions au niveau des sites de minéralisation. Dans ces régions, le pompage de l' ion actif est nécessaire pour élever le pH et la concentration en ^{Ca2 +} pour permettre la calcification ^{2, 3.} Lors de l'application des molécules fluorescentes pour étudier un organisme, il est essentiel de veiller à ce que la concentration utilisée présente une toxicité négligeable et permet à l'organisme d'effectuer de façon physiologiquement pertinente. Une concentration de coloration plus faible serait moins toxique et est généralement associée à un temps plus long coloration ^10. Il est important de maintenir une faible densité des larves au cours de la période d'incubation, ce qui minimise la privation d'oxygène et de l'accumulation des déchets dans la période de coloration.

Avant de poursuivre les méthodes FIB / TEM, qui implique une localiséerégion d'intérêt, il est essentiel à l'écran par le stade de la vie et de tissu d'intérêt en utilisant des méthodes de résolution inférieure comme SEM-EDS et SEM-EPCA. Observer l'échantillon en mode rétrodiffusé permet de visualiser la composition élémentaire relative où un contraste plus clair est en corrélation avec plus lourd poids atomique ^11. Par conséquent, les images SEM-ESB fournissent également une estimation de l'endroit où se trouvent les éléments plus lourds comme les ions calcium et osmium colorés globules lipidiques. analyse par SEM-EDS, permet de cartographier plus spécifique des ions calcium sur les échantillons. Cependant, il ne confirme pas la présence de CaCO ₃ cristallin. SEM-EBSD permet la détection de structures cristallines, bien que les méthodes de EPCA classiques nécessitent une surface polie ^12. Cette étude montre comment SEM-EPCA sur un échantillon fruste peut fournir des informations utiles. Un courant de faisceau de 20 kV permet une plus grande profondeur de l'analyse à la surface de l'échantillon. Par conséquent, EBSD est un procédé souhaitable de détecterla présence de biomineral, en particulier sur de petits échantillons biologiques intacts comme larves marines. Bien que les échantillons frustes donneraient des faux négatifs lorsque les minéraux ne sont pas confrontés au détecteur à environ 70 °, voir un motif Kikuchi est considéré comme une preuve non équivoque d'une phase minérale à la région d'intérêt ^13.

Microscopie électronique à transmission (MET) permet la caractérisation structurale d'une plus large gamme de matériaux ^14. Le faisceau ionique focalisé (FIB) permet pour le site d' extraction et de préparation d'un échantillon avec des dimensions typiques pour l' analyse TEM ¹⁵ spécifique. Par conséquent, la technique FIB / TEM est une méthode appropriée pour analyser les biomatériaux nouvellement déposés à une zone localisée. instruments FIB-SEM combinés permettent également l'observation sans dommage d'un échantillon par l'utilisation d'une colonne de faisceau d'électrons intégré. Tungsten pulvérisation revêtement de l'échantillon augmente la conductivité et les limites d'ions implantation et l' irradiation des dommages de l'échantillon ^16. L'utilisation d'un faisceau d'ions finement focalisé avec un temps de séjour bas permet le broyage de matériaux organiques. A l' intérieur du FIB-SEM, une caractéristique particulière d'intérêt peut être extrait d'un échantillon en vrac et amincie d'électrons transparence pour l' analyse TEM ^17. En raison de la forte énergie du faisceau d'ions, les matériaux cristallins peuvent être rendus amorphes. Cela peut se produire lors de la préparation d'une fine lamelle d'analyse TEM et peuvent être atténués en utilisant un faible faisceau d'ions de tension d'accélération pour éliminer la couche amorphe.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hexamethyldisilazane	Electron Microscopy Sciences	16700(EM)
Osmium Tetroxide 2% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	19192
IBMX 3-Isobutyl-1-methylxanthine	ThermoFisher Scientific	PHZ1124
Nigericin, Free Acid	ThermoFisher Scientific	N7143-5MG
35 mm diameter dish, hole size 27 mm, Glass No.0, Non-coat	ThermoFisher Scientific	D110400
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate	ThermoFisher Scientific	C-1271
BDH Potassium Chloride, ACS Grade	VWR	BDH0258-500G
Paraformaldehyde reagent grade, crystalline	Sigma	P6148
1 M Hydrochloric Acid for Volumetric Analysis	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	083-01095
0.05 M Sodium Hydroxide Solution for Volumetric Analysis	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	199-02185
Calcein	Sigma	C0875
FASW	Iwaki Co. Ltd.	Rei-sea Marine
Mixed Cellulose Ester Membranes; 47 mm dia, 0.45 µm	ADVANTEC	A045A047A
ethanol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	051-00476
Artificial seawater for buffers			by SOP06 of DOE (1994), cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf
Sodium Chloride	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	191-01665
Potassium Chloride	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	163-03545
Magnesium Chloride Hexahydrate	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	135-00165
Calcium Chloride	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	039-00475
Sodium Sulfate	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	197-03345
Hydrochloric Acid	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	089-08415
2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (tris)	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	207-06275
2-aminopyridine	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	011-02775
Orion 5-star Plus pH meter	Thermo Scientific
PrpHecT ROSS Micro Combination pH Electrode 8220BNWP	Thermo Scientific
Axiovision, Version 4.6, Axio Observer Z1	Zeiss
ImageJ	NIH, Bethesda, MD, USA
HRTEM H500	Hitachi
SU6600 VPSEM	Hitachi
NB5000 Focused Ion and Electron Beam (FIB-SEM) system	Hitachi