We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.
Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals.
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.
Biomineralisation ist eine komplexe Reihe von Ereignissen, die eine Reihe von zellulären Aktivitäten überbrückt was zur Produktion von exquisit bestellt Mineralien 1. Die Herausforderung besteht darin, sowohl die dynamischen zellulären Prozess und die anspruchsvollen Mineralstrukturen unter Verwendung einer Kombination von optischen und Elektronenmikroskopie Verfahren zu charakterisieren. Eine Erhöhung der intrazellulären pH – Wert begünstigt die Bildung von CaCO 3 -Kristalle somit die Lebensstadium zu identifizieren , die einen erhöhten pH – Wert , die Zeit zeigt , wenn Verkalkung wahrscheinlich 2 werden vorkommendes, 3.
Die Röhrenwürmer aus der Familie Kalkröhrenwürmer sind gemeinsame Kalkbildner im Meer 4. Es ist auch ein beliebtes invertebrate Modell für die Meeresforschung, vor allem in Biofouling 5, 6. In dieser Studie duri der Prozess der Verkalkung Mineralisierungs Abteileng Biomineralisation beobachtet. Der rasche Prozess der Metamorphose schließt die Entstehung von Calciumcarbonat Strukturen 7, 8.
Wir zeigen, wie interne pH-Messungen auf der Röhrenwurm durchgeführt werden und wie Lebensphasen und Gewebe relevant für Verkalkung gescreent werden können. Nachdem der Lebensphase von Interesse identifiziert wird, kann das Gewebe verantwortlich für Verkalkung bei einer höheren Auflösungsmethoden unter Verwendung von Elektronenmikroskopie charakterisiert werden. Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie, bestimmen wir die Zeit für Calciumcarbonat erforderlich nach metamorphen Induktion zu erscheinen. Eine ähnliche Lebensphase wurde anschließend mit SEM-EDS für die Elementarzusammensetzungsverteilung sichtbar gemacht, und das abgelagerte Mineral wurde mit zwei verschiedenen Elektronenmikroskopie Methoden analysiert, und zwar SEM-EBSD und FIB-TEM.
Live optische Abbildung ist ein nützliches Verfahren für in einem mehrzelligen Organismus zellulärer Ereignisse zu beobachten. Hier internen pH-Wert und Calciumionen-Indikatoren wurden verwendet, um den Fluss von Ionen an den Mineralisierungs Standorten zu messen. In diesen Bereichen wird die aktive Ionenpump erforderlichen pH zu erhöhen , und Ca 2+ -Konzentration Verkalkungs 2, 3 zu ermöglichen. Wenn fluoreszierende Moleküle Anlegen eines Organ…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to send a big thank you to Clemson Broadcast Productions, audio recording by J. Bright, Narration by A. D. McQuiston, Audio sweetening, K. Murphy, videography by G. Spake, Graphic arts by T. Messervy, Video editing by T. Messervy and E. Rodgers. Technical assistance and scientific advice was inspired by the advice of S. Kawada, S. Kubo, J. Hudson, T. Darroudi, D. Mulwee, H. Qian, Y. W. Lam, M. B. Johnstone, C. Campanati, A. C. Lane, and R. Dineshram. This study was funded by three GRF grants from the HKSAR-RGC (Grant Numbers: 705511P, 705112P, and 17304914).
Hexamethyldisilazane | Electron Microscopy Sciences | 16700(EM) | |
Osmium Tetroxide 2% Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 19192 | |
IBMX 3-Isobutyl-1-methylxanthine | ThermoFisher Scientific | PHZ1124 | |
Nigericin, Free Acid | ThermoFisher Scientific | N7143-5MG | |
35-mm-diam dish, hole size 27 mm, Glass No.0, Non-coat | ThermoFisher Scientific | D110400 | |
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate | ThermoFisher Scientific | C-1271 | |
BDH Potassium Chloride, ACS Grade | VWR | BDH0258-500G | |
Paraformaldehyde reagent grade, crystalline |
Sigma | P6148 | |
1 M Hydrochloric Acid for Volumetric Analysis | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 083-01095 | |
0.05 M Sodium Hydroxide Solution for Volumetric Analysis | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 199-02185 | |
Calcein | Sigma | C0875 | |
FASW | Iwaki Co. Ltd. | Rei-sea Marine | |
Mixed Cellulose Ester Membranes; 47 mm dia, 0.45 µm | ADVANTEC | A045A047A | |
ethanol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 051-00476 | |
Artificial seawater for buffers | by SOP06 of DOE (1994), cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf | ||
Sodium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 191-01665 | |
Potassium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 163-03545 | |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 135-00165 | |
Calcium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 039-00475 | |
Sodium Sulfate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 197-03345 | |
Hydrochloric Acid | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 089-08415 | |
2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (tris) | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 207-06275 | |
2-aminopyridine | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 011-02775 | |
Orion 5-star Plus pH meter | Thermo Scientific | ||
PrpHecT ROSS Micro Combination pH Electrode 8220BNWP | Thermo Scientific | ||
Axiovision, Version 4.6, Axio Observer Z1 | Zeiss | ||
ImageJ | NIH, Bethesda, MD, USA | ||
HRTEM H500 | Hitachi | ||
SU6600 VPSEM | Hitachi | ||
NB5000 Focused Ion and Electron Beam (FIB-SEM) system | Hitachi |