We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.
Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals.
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.
Biomineralization घटनाओं की एक जटिल श्रृंखला है, जो सेलुलर नजाकत का आदेश दिया खनिजों 1 के उत्पादन में जिसके परिणामस्वरूप गतिविधियों का एक सूट को पुल है। चुनौती दोनों गतिशील सेलुलर प्रक्रिया और ऑप्टिकल और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के तरीकों का एक संयोजन का उपयोग कर परिष्कृत खनिज संरचनाओं को चिह्नित करने के लिए है। Intracellular पीएच की ऊंचाई CaCO 3 क्रिस्टल के गठन के पक्ष में है, इसलिए, जीवन स्तर एक वृद्धि की पीएच है कि पहचान के समय जब कड़ा हो जाना संभावना 2, 3 उत्पन्न हो रहा है पता चलता है।
परिवार Serpulidae से tubeworms महासागर 4 में आम calcifiers हैं। यह भी विशेष रूप से जैव अवरोध 5, 6 में समुद्री अनुसंधान के लिए एक लोकप्रिय अकशेरुकी मॉडल है। इस अध्ययन में, mineralizing डिब्बों में कड़ा हो जाना करने की प्रक्रिया Duriएनजी biomineralization मनाया जाता है। कायापलट की तेजी से प्रक्रिया कैल्शियम कार्बोनेट संरचनाओं 7, 8 के उद्भव भी शामिल है।
हम कैसे आंतरिक पीएच माप tubeworm पर किया जा सकता का प्रदर्शन, और कैसे जीवन चरणों और कड़ा हो जाना के लिए प्रासंगिक ऊतकों की जांच की जा सकती है। ब्याज की जीवन स्तर के बाद की पहचान की है, ऊतक कड़ा हो जाना करने के लिए जिम्मेदार एक उच्च संकल्प इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तरीकों का उपयोग पर होती जा सकता है। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना, हम समय रूपांतरित शामिल होने के बाद प्रकट करने के लिए कैल्शियम कार्बोनेट के लिए आवश्यक का निर्धारण। जीवन का एक समान मंच बाद में मौलिक रचना वितरण के लिए SEM-ईडीएस के साथ कल्पना की गई थी, और जमा खनिज दो अलग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तरीकों, विशेष रूप से SEM-EBSD और मिथ्या-मंदिर का उपयोग विश्लेषण किया गया था।
लाइव ऑप्टिकल इमेजिंग एक बहुकोशिकीय जीव में सेलुलर घटनाओं के अवलोकन के लिए एक उपयोगी तरीका है। इधर, आंतरिक पीएच और कैल्शियम आयन संकेतक खनिज स्थलों पर आयनों के प्रवाह को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया। ?…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to send a big thank you to Clemson Broadcast Productions, audio recording by J. Bright, Narration by A. D. McQuiston, Audio sweetening, K. Murphy, videography by G. Spake, Graphic arts by T. Messervy, Video editing by T. Messervy and E. Rodgers. Technical assistance and scientific advice was inspired by the advice of S. Kawada, S. Kubo, J. Hudson, T. Darroudi, D. Mulwee, H. Qian, Y. W. Lam, M. B. Johnstone, C. Campanati, A. C. Lane, and R. Dineshram. This study was funded by three GRF grants from the HKSAR-RGC (Grant Numbers: 705511P, 705112P, and 17304914).
Hexamethyldisilazane | Electron Microscopy Sciences | 16700(EM) | |
Osmium Tetroxide 2% Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 19192 | |
IBMX 3-Isobutyl-1-methylxanthine | ThermoFisher Scientific | PHZ1124 | |
Nigericin, Free Acid | ThermoFisher Scientific | N7143-5MG | |
35-mm-diam dish, hole size 27 mm, Glass No.0, Non-coat | ThermoFisher Scientific | D110400 | |
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate | ThermoFisher Scientific | C-1271 | |
BDH Potassium Chloride, ACS Grade | VWR | BDH0258-500G | |
Paraformaldehyde reagent grade, crystalline |
Sigma | P6148 | |
1 M Hydrochloric Acid for Volumetric Analysis | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 083-01095 | |
0.05 M Sodium Hydroxide Solution for Volumetric Analysis | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 199-02185 | |
Calcein | Sigma | C0875 | |
FASW | Iwaki Co. Ltd. | Rei-sea Marine | |
Mixed Cellulose Ester Membranes; 47 mm dia, 0.45 µm | ADVANTEC | A045A047A | |
ethanol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 051-00476 | |
Artificial seawater for buffers | by SOP06 of DOE (1994), cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf | ||
Sodium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 191-01665 | |
Potassium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 163-03545 | |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 135-00165 | |
Calcium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 039-00475 | |
Sodium Sulfate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 197-03345 | |
Hydrochloric Acid | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 089-08415 | |
2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (tris) | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 207-06275 | |
2-aminopyridine | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 011-02775 | |
Orion 5-star Plus pH meter | Thermo Scientific | ||
PrpHecT ROSS Micro Combination pH Electrode 8220BNWP | Thermo Scientific | ||
Axiovision, Version 4.6, Axio Observer Z1 | Zeiss | ||
ImageJ | NIH, Bethesda, MD, USA | ||
HRTEM H500 | Hitachi | ||
SU6600 VPSEM | Hitachi | ||
NB5000 Focused Ion and Electron Beam (FIB-SEM) system | Hitachi |