We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.
Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals.
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.
Biomineralisering är en komplex serie av händelser, som överbryggar en svit av cellulära aktiviteter resulterar i produktionen av utsökt beställda mineraler 1. Utmaningen är att karakterisera både dynamisk cellulär process och den sofistikerade mineral strukturer med hjälp av en kombination av optiska och elektronmikroskopi metoder. En förhöjning av intracellulärt pH gynnar bildningen av CaCO 3-kristaller, därav, att identifiera den livsstadium som har en ökad pH avslöjar den tid då förkalkning kommer sannolikt att förekomma två, tre.
De rörmaskar från familjen serpulidae är vanliga calcifiers i havet 4. Det är också en populär ryggradslös modell för marin forskning, särskilt i påväxt 5, 6. I denna studie, processen för förkalkning i mineraliserings fack During biomineralisering observeras. Den snabba processen med metamorfos inkluderar uppkomsten av kalciumkarbonatstrukturer 7, 8.
Vi visar hur den interna pH mätningar kan utföras på tubeworm, och hur livsstadier och vävnader som är relevanta för förkalkning kan screenas. Efter stadiet av intresse identifieras, kan vävnaden ansvarig för förkalkning karakteriseras med en högre upplösning med hjälp av elektronmikroskopi metoder. Med hjälp av fluorescerande mikroskopi, vi bestämma den tid som krävs för kalciumkarbonat för att visas efter metamorf induktion. En liknande skede av livet därefter visualiseras med SEM-EDS för elementarkompositionsfördelning, och den avsatta mineral analyserades med hjälp av två olika elektronmikroskopi metoder, särskilt SEM-EBSD och FIB-TEM.
Levande optisk avbildning är en användbar metod för att observation cellulära händelser i en multicellulär organism. Här har den interna pH och kalcium jon indikatorer används för att mäta flödet av joner vid de mineraliseringssajter. I dessa regioner är aktiv jon pumpning krävs för att höja pH och Ca 2 + koncentration för att möjliggöra förkalkning 2, 3. Vid tillämpning fluorescerande molekyler för att studera en organism, är de…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to send a big thank you to Clemson Broadcast Productions, audio recording by J. Bright, Narration by A. D. McQuiston, Audio sweetening, K. Murphy, videography by G. Spake, Graphic arts by T. Messervy, Video editing by T. Messervy and E. Rodgers. Technical assistance and scientific advice was inspired by the advice of S. Kawada, S. Kubo, J. Hudson, T. Darroudi, D. Mulwee, H. Qian, Y. W. Lam, M. B. Johnstone, C. Campanati, A. C. Lane, and R. Dineshram. This study was funded by three GRF grants from the HKSAR-RGC (Grant Numbers: 705511P, 705112P, and 17304914).
Hexamethyldisilazane | Electron Microscopy Sciences | 16700(EM) | |
Osmium Tetroxide 2% Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 19192 | |
IBMX 3-Isobutyl-1-methylxanthine | ThermoFisher Scientific | PHZ1124 | |
Nigericin, Free Acid | ThermoFisher Scientific | N7143-5MG | |
35-mm-diam dish, hole size 27 mm, Glass No.0, Non-coat | ThermoFisher Scientific | D110400 | |
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate | ThermoFisher Scientific | C-1271 | |
BDH Potassium Chloride, ACS Grade | VWR | BDH0258-500G | |
Paraformaldehyde reagent grade, crystalline |
Sigma | P6148 | |
1 M Hydrochloric Acid for Volumetric Analysis | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 083-01095 | |
0.05 M Sodium Hydroxide Solution for Volumetric Analysis | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 199-02185 | |
Calcein | Sigma | C0875 | |
FASW | Iwaki Co. Ltd. | Rei-sea Marine | |
Mixed Cellulose Ester Membranes; 47 mm dia, 0.45 µm | ADVANTEC | A045A047A | |
ethanol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 051-00476 | |
Artificial seawater for buffers | by SOP06 of DOE (1994), cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf | ||
Sodium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 191-01665 | |
Potassium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 163-03545 | |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 135-00165 | |
Calcium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 039-00475 | |
Sodium Sulfate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 197-03345 | |
Hydrochloric Acid | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 089-08415 | |
2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (tris) | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 207-06275 | |
2-aminopyridine | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 011-02775 | |
Orion 5-star Plus pH meter | Thermo Scientific | ||
PrpHecT ROSS Micro Combination pH Electrode 8220BNWP | Thermo Scientific | ||
Axiovision, Version 4.6, Axio Observer Z1 | Zeiss | ||
ImageJ | NIH, Bethesda, MD, USA | ||
HRTEM H500 | Hitachi | ||
SU6600 VPSEM | Hitachi | ||
NB5000 Focused Ion and Electron Beam (FIB-SEM) system | Hitachi |