Summary

Karakterisering av förkalkning händelser Använda Live Optiska och elektronmikroskopi tekniker i en marin Tubeworm

Published: February 28, 2017
doi:

Summary

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

Abstract

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals.

Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

Introduction

Biomineralisering är en komplex serie av händelser, som överbryggar en svit av cellulära aktiviteter resulterar i produktionen av utsökt beställda mineraler 1. Utmaningen är att karakterisera både dynamisk cellulär process och den sofistikerade mineral strukturer med hjälp av en kombination av optiska och elektronmikroskopi metoder. En förhöjning av intracellulärt pH gynnar bildningen av CaCO 3-kristaller, därav, att identifiera den livsstadium som har en ökad pH avslöjar den tid då förkalkning kommer sannolikt att förekomma två, tre.

De rörmaskar från familjen serpulidae är vanliga calcifiers i havet 4. Det är också en populär ryggradslös modell för marin forskning, särskilt i påväxt 5, 6. I denna studie, processen för förkalkning i mineraliserings fack During biomineralisering observeras. Den snabba processen med metamorfos inkluderar uppkomsten av kalciumkarbonatstrukturer 7, 8.

Vi visar hur den interna pH mätningar kan utföras på tubeworm, och hur livsstadier och vävnader som är relevanta för förkalkning kan screenas. Efter stadiet av intresse identifieras, kan vävnaden ansvarig för förkalkning karakteriseras med en högre upplösning med hjälp av elektronmikroskopi metoder. Med hjälp av fluorescerande mikroskopi, vi bestämma den tid som krävs för kalciumkarbonat för att visas efter metamorf induktion. En liknande skede av livet därefter visualiseras med SEM-EDS för elementarkompositionsfördelning, och den avsatta mineral analyserades med hjälp av två olika elektronmikroskopi metoder, särskilt SEM-EBSD och FIB-TEM.

Protocol

1. Screening för levnadsstadier och vävnaden av intresse med Live Imaging Kultur den marina larver till kompetens enligt tidigare rapporterade metoder 6, 7, 9. Inkubera tubeworm larver vid 5 larver per ml densitet med filtrerat havsvatten med 10 iM Snarf-01:00 natten. Täck behållaren med aluminiumfolie för att skydda den fluorescerande sonden från fotoblekning. Observera larver med hjälp av en dissek…

Representative Results

Följande är några observationer av förkalkning processen under metamorfos av tubeworm. Figur 1 visar att de pH-värden i närheten av kragen regionen är högre än de andra vävnader efter metamorfos. Figur 2i visar en tubeworm med homogen fördelning av Ca, vilket tyder på några större förkalkning händelser har börjat; Figur 2ii visar en tubeworm som har förkalkade under en längre period, vilket tyder på förkalkning har g…

Discussion

Levande optisk avbildning är en användbar metod för att observation cellulära händelser i en multicellulär organism. Här har den interna pH och kalcium jon indikatorer används för att mäta flödet av joner vid de mineraliseringssajter. I dessa regioner är aktiv jon pumpning krävs för att höja pH och Ca 2 + koncentration för att möjliggöra förkalkning 2, 3. Vid tillämpning fluorescerande molekyler för att studera en organism, är de…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to send a big thank you to Clemson Broadcast Productions, audio recording by J. Bright, Narration by A. D. McQuiston, Audio sweetening, K. Murphy, videography by G. Spake, Graphic arts by T. Messervy, Video editing by T. Messervy and E. Rodgers. Technical assistance and scientific advice was inspired by the advice of S. Kawada, S. Kubo, J. Hudson, T. Darroudi, D. Mulwee, H. Qian, Y. W. Lam, M. B. Johnstone, C. Campanati, A. C. Lane, and R. Dineshram. This study was funded by three GRF grants from the HKSAR-RGC (Grant Numbers: 705511P, 705112P, and 17304914).

Materials

Hexamethyldisilazane  Electron Microscopy Sciences 16700(EM)
Osmium Tetroxide 2% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 19192
IBMX 3-Isobutyl-1-methylxanthine ThermoFisher Scientific PHZ1124
Nigericin, Free Acid ThermoFisher Scientific N7143-5MG
35-mm-diam dish, hole size 27 mm, Glass No.0, Non-coat ThermoFisher Scientific D110400
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate ThermoFisher Scientific C-1271
BDH Potassium Chloride, ACS Grade VWR BDH0258-500G
Paraformaldehyde
reagent grade, crystalline
Sigma P6148
1 M Hydrochloric Acid for Volumetric Analysis Wako Pure Chemical Industries, Ltd 083-01095
0.05 M Sodium Hydroxide Solution for Volumetric Analysis Wako Pure Chemical Industries, Ltd 199-02185
Calcein Sigma C0875
FASW Iwaki Co. Ltd. Rei-sea Marine
Mixed Cellulose Ester Membranes; 47 mm dia, 0.45 µm ADVANTEC A045A047A
ethanol Wako Pure Chemical Industries, Ltd 051-00476
Artificial seawater for buffers by SOP06 of DOE (1994), cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf
Sodium Chloride Wako Pure Chemical Industries, Ltd 191-01665
Potassium Chloride Wako Pure Chemical Industries, Ltd 163-03545
Magnesium Chloride Hexahydrate Wako Pure Chemical Industries, Ltd 135-00165
Calcium Chloride Wako Pure Chemical Industries, Ltd 039-00475
Sodium Sulfate Wako Pure Chemical Industries, Ltd 197-03345
Hydrochloric Acid Wako Pure Chemical Industries, Ltd 089-08415
2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (tris) Wako Pure Chemical Industries, Ltd 207-06275
2-aminopyridine Wako Pure Chemical Industries, Ltd 011-02775
Orion 5-star Plus pH meter Thermo Scientific
PrpHecT ROSS Micro Combination pH Electrode 8220BNWP Thermo Scientific
Axiovision, Version 4.6, Axio Observer Z1 Zeiss
ImageJ NIH, Bethesda, MD, USA
HRTEM H500 Hitachi
SU6600 VPSEM Hitachi
NB5000 Focused Ion and Electron Beam (FIB-SEM) system Hitachi 

References

  1. Aizenberg, J., et al. Skeleton of Euplectella sp.: structural hierarchy from the nanoscale to the macroscale. Science. 309 (5732), 275-278 (2005).
  2. de Nooijer, L. J., Toyofuku, T., Oguri, K., Nomaki, H., Kitazato, H. Intracellular pH distribution in foraminifera determined by the fluorescent probe HPTS. Limnol Oceanogr Methods. 6 (11), 610-618 (2008).
  3. de Nooijer, L. J., Langer, G., Nehrke, G., Bijma, J. Physiological controls on seawater uptake and calcification in the benthic foraminifer Ammonia tepida. Biogeosciences. 6 (11), 2669-2675 (2009).
  4. Smith, A. M., Riedi, M. A., Winter, D. J. Temperate reefs in a changing ocean: skeletal carbonate mineralogy of serpulids. Mar Biol. 160 (9), 1-14 (2013).
  5. Carpizo-Ituarte, E., Hadfield, M. Stimulation of metamorphosis in the polychaete Hydroides elegans Haswell (Serpulidae). Biol. Bull. 194 (1), 14 (1998).
  6. Bryan, P. J., Kreider, J. L., Qian, P. Y. Settlement of the serpulid polychaete Hydroides elegans (Haswell) on the arborescent bryozoan Bugula neritina (L.): evidence of a chemically mediated relationship. J Exp Mar Biol Ecol. 220, 171-190 (1998).
  7. Chan, V. B. S., et al. Evidence of compositional and ultrastructural shifts during the development of calcareous tubes in the biofouling tubeworm, Hydroides elegans. J. Struct. Biol. 189 (3), 230-237 (2015).
  8. Dickson, A. G., Goyet, C. . Handbook of methods for the analysis of the various parameters of the carbon dioxide system in sea water. Version 2. , (1994).
  9. Chan, V. B. S., et al. Direct deposition of crystalline aragonite in the controlled biomineralization of the calcareous tubeworm. Front Mar Sci. 2, 97 (2015).
  10. Bond, J., Varley, J. Use of flow cytometry and SNARF to calibrate and measure intracellular pH in NS0 cells. Cytometry A. 64, 43-50 (2005).
  11. Lloyd, G. E. Atomic number and crystallographic contrast images with the SEM: a review of backscattered electron techniques. Mineral Mag. 51, 3-19 (1987).
  12. Perez-Huerta, A., Dauphin, Y., Cuif, J. P., Cusack, M. High resolution electron backscatter diffraction (EBSD) data from calcite biominerals in recent gastropod shells. Micron. 42 (3), 246-251 (2011).
  13. Bandli, B. R., Gunter, M. E. Electron backscatter diffraction from unpolished particulate specimens: examples of particle identification and application to inhalable mineral particulate identification. Am. Mineral. 97, 1269-1273 (2012).
  14. Hayat, M. A. . Principles and techniques of electron microscopy: biological applications. , (2000).
  15. Wirth, R. Focused Ion Beam (FIB) combined with SEM and TEM: Advanced analytical tools for studies of chemical composition, microstructure and crystal structure in geomaterials on a nanometre scale. Chem Geo. 261, 217-229 (2009).
  16. Volkert, C. A., Minor, A. M. Focused ion beam microscopy and micromachining. MRS Bull. 32, 389-399 (2007).
  17. Kudo, M., et al. Microtexture of larval shell of oyster, Crassostrea nippona: A FIB-TEM study. J. Struct. Biol. 169 (1), 1-5 (2009).

Play Video

Cite This Article
Chan, V. B. S., Toyofuku, T., Wetzel, G., Saraf, L., Thiyagarajan, V., Mount, A. S. Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm. J. Vis. Exp. (120), e55164, doi:10.3791/55164 (2017).

View Video