Analysere Synaptic Modulation av<em> Drosophila melanogaster</em> Fotoreseptorer etter eksponering for Langvarig lys

Summary

Her viser vi hvordan du kan kvantifisere antallet og romlig fordeling av synaptiske aktive soner i Drosophila melanogaster fotoreseptorer, markert med en genetisk kodet molekylær markør, og deres modulering etter langvarig eksponering for lys.

Abstract

Nervesystemet har bemerkelsesverdig evne til å tilpasse seg og reagere på ulike stimuli. Dette nevrale justeringen er i stor grad oppnådd gjennom plastisitet på den synaptiske nivå. Den aktive sone (A) er den region på den presynaptiske membranen som medierer nevrotransmitter-frigjøring, og er sammensatt av en tett samling av stillas proteiner. AZS av bananflue (Drosophila) fotoreseptorer gjennomgå molekylær ombygging etter langvarig eksponering for naturlig lys fra omgivelsene. Således kan nivået av neuronal aktivitet kan flytte den molekylære sammensetning av AZ og bidra til regulering av den funksjonelle utgang.

Starter fra lyseksponering oppsett forberedelse til immunhistokjemi, denne protokollen detaljer hvordan å kvantifisere antallet, den romlige fordelingen, og delokalisering nivået av synaptiske molekyler ved AZS i Drosophila fotoreseptorer. Ved hjelp av bildeanalyse software, klynger av GFP-smeltet AZ komponent Bruchpilot ble identifisert for hver R8 fotoreseptoren (R8) axon terminalen. Oppdages Bruchpilot flekker ble automatisk tildelt individuelle R8 aksoner. For å beregne fordelingen av sted frekvens langs aksonet, gjennomførte vi en tilpasset programvare plugin. Hver axon start-punktet og sluttpunktet er manuelt definert og posisjonen for hver Bruchpilot flekk ble projisert på forbindelseslinjen mellom start- og sluttpunktet. I tillegg til antall Bruchpilot klynger, vi også kvantifisert delokalisering nivået Bruchpilot-GFP innenfor klynger. Disse målingene gjenspeiler i detalj romlig løst synaptiske dynamikk i en enkelt nervecelle under ulike miljøforhold på stimuli.

Introduction

Modulering av synaptisk funksjon bidrar til bemerkelsesverdig evne til nervesystemet til nettopp svare eller tilpasse seg endrede miljømessige stimuli. Justering av presynaptiske vesikler utgivelsen sannsynlighet er en måte å kontrollere synaptisk styrke ^en. Synaptic vesicle utgivelsen finner sted på Active Zone (AZ), et spesialisert område av den presynaptiske membranen ^2. AZ er karakterisert ved en kassett av spesifikke proteiner ^{3, 4.} De fleste proteiner som bidrar til AZ montering er høyt konservert i nematoder, insekter og pattedyr ^5. Nylige studier tyder på at nivået av neuronal aktivitet regulerer den molekylære sammensetning av AZ, som i sin tur bidrar til regulering av den funksjonelle utgangs både in vitro og in vivo ^{6, 7,}> 8. Vi har tidligere funnet at fotoreseptorlidelser AZS gjennomgå molekylær ombygging i Drosophila etter langvarig eksponering for naturlig lys fra omgivelsene ^9. I denne tilstanden, observerte vi at antall Bruchpilot (BRP) -positivt AZS ble redusert i fotoreseptorlidelser aksoner.

BRP / CAST / elg familie proteiner er grunnleggende byggesteinene i AZS i virveldyr og virvelløse synapser ^10. I Drosophila BRP mutanter, fremkalt vesikkel utgivelsen er undertrykt ^{11, 12.} De 17 C-terminale aminosyrerester BRP er avgjørende for synaptisk vesikkel clustering på Drosophila nevromuskulær Junction (NMJ) ^{13, 14.} Disse studiene viste den sentrale rollen til dette molekylet i AZ organisasjon og funksjon. Med en nylig utviklet genetiske verktøy, Synaptic Tagging med rekombinasjon (STAR) BRPkan observeres in vivo i spesifikke celletyper, i det endogene ekspresjonsnivåer og ved et enkelt synapse oppløsning ^15. Dette verktøyet gjør det mulig å evaluere de endogene dynamikken i synapser kvantitativt i det komplekse sentralnervesystemet.

Det har vært flere studier inkludert synapse kvantifisering basert på data fra konfokalmikroskopi. Synaptiske endringer har blitt evaluert ved å måle lengden, området, volumet, densiteten og telling av antallet basert på avanserte programmer. For eksempel gir freeware ImageJ en kvantifisering metode for total synaptiske området og tiltak synaptiske tetthet på Drosophila NMJ ^16. Antallet colocalization områder av pre og postsynaptisk markører er kvantifisert ved hjelp av plugin "puncta Analyzer" tilgjengelig på ImageJ programvareplattform ^17. Alternativt kan en multi-parpsykososial numerisk datamiljø basert program, Synapse Detector (synd), kan automatisk spore dendritter av nerveceller merket med en fluoriserende fargestoff, og deretter kvantifiserer synaptic protein nivåer som funksjon av avstand fra cellekroppen ^18. Programvaren Synaptic puncta Analysis (SynPAnal), har blitt designet for rask analyse av 2D-bilder av nevroner kjøpt fra confocal eller fluorescerende mikroskopi. Den primære funksjonen til denne programvare er automatisk og hurtig kvantifisering av tetthet og intensiteten av protein puncta ^19. Nylig har en automatisk læringsbasert synapse algoritme blitt generert for kvantifisering av synaptisk nummer i 3D ^20, drar nytte av 3D-visualisering-pasning Analysis (Vaa3D) programvare ^21.

Kommersiell bildeanalyse programvare er også kraftige verktøy for synaptiske quantifications. For eksempel, det fluorescensmerkede nevrotransmitterreseptorer eller en presynaptisk A-komponent er kvantifisert i tre dimensjoner med enkelt-synapse oppløsning i C. elegans ²² eller Drosophila luktsystemet ^{23, 24,} slik at hundrevis av synapser å være raskt karakteriseres innen en enkelt prøve.

Her presenterer vi en fremgangsmåte ved et tilpasset programvare for bildeanalyse plug-in implementert i en multi paradigme numerisk datamiljø som gjør det mulig å analysere halvautomatisk flere aspekter av AZS, inkludert deres antall, fordeling og graden av anrikning av molekylære komponenter til AZ. Således dette kompleks analyse tillot oss å evaluere dynamikken i synaptiske komponenter i axon terminaler under forskjellige miljøbetingelser. Vi undersøkte effekten av lyseksponering på utgangs synapsene av voksen fluefotoreseptorer. Fremgangsmåten utføres i tre trinn: 1)forberedelse for lyseksponering, 2) disseksjon, immunhistokjemi og konfokal avbildning, og 3) bildeanalyse.

Protocol

De eksperimentelle prosedyrer beskrevet i denne protokollen innebærer utelukkende jobbe med Drosophila og er ikke utsatt for dyrevelferd lover i Tyskland og Japan. 1. lyseksponering betingelser Forbered fluer som bærer sensless-flippase (sens-FLP) og bruchpilot-FRT-STOP-FRT-GFP (BRP-FSF-GFP) 15 for å visualisere Brp-GFP i fotoreseptorlidelser R8 nevroner (R8s). Den genomiske locus koding brp innenfor …

Representative Results

Den sammensatte øye Drosophila består ~ 780 ommatidia, som hver inneholder åtte typer fotoreseptorer (R1-8). R7 og R8 prosjekt deres axoner til den andre optikken ganglion, medulla, hvor de danner synapser i lag M6 og M3, henholdsvis 26. For å undersøke effekten av langvarig eksponering for lys på den molekylære sammensetningen av fotoreseptorlidelser R8 aktive soner, vi tok fordel av Star metoden 15. Endogene uttrykk nivåe…

Discussion

I denne studien viste vi hvordan vi skal forberede lysforholdene å eksponere fluer til en lik lysintensitet. Vi kvantifisert ikke bare antallet en synaptisk markør puncta men kan også romlig løse tettheten av synapser langs axoner og måle delokalisering nivå av markørproteinet i cytoplasmatiske områder. Disse tre analysene tillate oss å vurdere detaljene i synaptiske dynamikk på ett nevron nivå i ulike miljøforhold. Vår protokollen kan tilpasses ulike synaptiske proteiner, men også eventuelle data som inne…

Materials

Vial	Hightech, Japan	MKC-20
Plug	Thermo Fisher Sciehtific, USA	AS-275
Customized transparent rack made of acrylic resin	Shin-Shin Corporation, Japan		a height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step
Cool incubator	MITSUBISHI ELECTRIC, Japan	CN-40A
LED panel	MISUMI, Japan	LEDXC170-W
Digital light meter	CEM	DT-1301
Fly pad	Tokken, Japan	TK-HA03-S
Petri dish (35 x 10 mm)	Greiner Bio-One International, Germany	627102
PBS tablet	Takara, Japan	T900
Triton X-100	Wako, Japan	160-24751
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20
1.5 ml tube	Sarstedt, Germany	A. 152X
Formaldehyde 16%	NEM, Japan	3152
Pipetman P-200	Gilson	F123601
Pipetman P-20	Gilson	F123600
Pipetman P-2	Gilson	F144801
anti-chaoptin antibody	DSHB	24B10
Alexa568-conjugated anti-mouse antibody	Life Technologies	A-11031
VECTASHIELD Mounting Medium	Vector Laboratories, Inc.	H-1000
Microscope slide (76 x 26 mm)	Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Germany
Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm)	Zeiss, Germany	474030-9000-000
Industrial Microscopes	Olympus, Japan	SZ61-C-SET
Stereo Microscope Lighting	Olympus, Japan	KL 1600 LED
confocal microscopy	Zeiss, Germany	LSM780
Imaris	Bitplane, Switzerland		Version 7.6.4 or above
Matlab	The MathWorks, Inc., USA
Excel for Mac	Microsoft