Summary
Ici , nous montrons comment quantifier le nombre et la répartition spatiale des zones actives synaptiques dans Drosophila melanogaster photorécepteurs, mis en évidence avec un marqueur moléculaire codé génétiquement, et leur modulation après une exposition prolongée à la lumière.
Abstract
Le système nerveux a la remarquable capacité d'adaptation et de répondre à différents stimuli. Cet ajustement neuronal est largement atteint grâce à la plasticité au niveau synaptique. La zone active (AZ) est la région à la membrane présynaptique qui médie la libération des neurotransmetteurs et est composé d'une collection dense de protéines d'échafaudage. AZS de Drosophila melanogaster (drosophile) photorécepteurs subir un remodelage moléculaire après une exposition prolongée à la lumière ambiante naturelle. Ainsi, le niveau de l'activité neuronale peut réorganiser la composition moléculaire de l'AZ et de contribuer à la régulation de la sortie fonctionnelle.
A partir de l'exposition à la lumière de préparation mis en place pour l'immunohistochimie, ce protocole détaille comment quantifier le nombre, la répartition spatiale, et le niveau de délocalisation des molécules synaptiques à AZS dans les photorécepteurs de drosophile. En utilisant l'analyse d'image software, des grappes de l'AZ composant GFP fusionné Bruchpilot ont été identifiés pour chaque photorécepteur R8 (R8) terminaison axonale. taches Bruchpilot détectées sont automatiquement affectées à axones R8 individuels. Pour calculer la distribution de fréquence ponctuelle le long de l'axone, nous avons implémenté un plugin personnalisé. de point de départ de chaque axone et point final ont été définis manuellement et la position de chaque tache Bruchpilot a été projeté sur la ligne de liaison entre le début et la fin du point. Outre le nombre de grappes Bruchpilot, nous avons également quantifié le niveau de délocalisation de Bruchpilot-GFP dans les clusters. Ces mesures reflètent en détail la dynamique synaptiques résolus spatialement dans un seul neurone dans différentes conditions environnementales aux stimuli.
Introduction
La modulation de la fonction synaptique contribue à la remarquable capacité du système nerveux pour répondre précisément ou adapter à l'évolution des stimuli environnementaux. Réglage de la libération des vésicules présynaptique probabilité est un moyen de contrôler la force synaptique 1. La libération des vésicules synaptiques a lieu à la zone active (AZ), une région spécialisée de la membrane présynaptique 2. AZ est caractérisée par une cassette de protéines spécifiques 3, 4. La plupart des protéines qui contribuent à AZ assemblage sont hautement conservés dans les nématodes, les insectes et les mammifères 5. Des études récentes suggèrent que le niveau de l' activité neuronale régule la composition moléculaire de l'AZ, qui à son tour contribue à la régulation de la sortie fonctionnelle à la fois in vitro et in vivo 6, 7,> 8. Nous avons déjà constaté que AZS photoréceptrices subissent un remodelage moléculaire chez la drosophile après une exposition prolongée à la lumière ambiante naturelle 9. Dans cette condition, nous avons observé que le nombre de Bruchpilot (Brp) -positif AZS a été réduit dans les axones photoréceptrices.
Les protéines Brp / CAST / famille ELKS sont des blocs de construction fondamentaux de AZS dans vertébrées et invertébrées synapses 10. Chez les mutants de Drosophila BRP, a évoqué la libération des vésicules est supprimée 11, 12. Les 17 résidus C-terminaux acides aminés de Brp sont essentiels pour le regroupement des vésicules synaptiques au Drosophile Jonction neuromusculaire (NMJ) 13, 14. Ces études ont démontré le rôle central de cette molécule dans l'organisation et la fonction AZ. Avec un outil génétique récemment mis au point, Synaptic Tagging avec Recombinaison (StAR), Brppeut être observée in vivo dans des types cellulaires spécifiques, à des niveaux d'expression endogènes et à une résolution de 15 synapses unique. Cet outil rend possible d'évaluer la dynamique endogène de synapses quantitativement dans le système nerveux central complexe.
Il y a eu plusieurs études, y compris quantifications synaptiques à partir des données obtenues à partir de la microscopie confocale. modifications synaptiques ont été évalués en mesurant la longueur, la zone, le volume, la densité et le comptage du nombre basé sur des applications logicielles sophistiquées. Par exemple, le ImageJ freeware fournit une méthode de quantification pour la zone synaptique totale et des mesures de densité synaptiques au Drosophile NMJ 16. Le nombre de sites de colocalisation des marqueurs pré et post - synaptiques ont été quantifiées à l' aide du plug - in "punctas Analyzer" disponible sur la plate - forme de logiciel ImageJ 17. Alternativement, un multi-pairprogramme basé adigm environnement de calcul numérique, Synapse détecteur (SYND), peut automatiquement tracer dendrites des neurones marqués avec un marqueur fluorescent, puis quantifie les niveaux de protéines synaptiques en fonction de la distance du corps de cellule 18. Le logiciel Synaptic punctas Analysis (SynPAnal), a été conçu pour l'analyse rapide des images 2D de neurones acquises par microscopie confocale ou fluorescent. La fonction principale de ce logiciel est la quantification automatique et rapide de la densité et de l' intensité de la protéine 19 lacrymaux. Récemment, un algorithme automatique basé sur l' apprentissage de détection de synapse a été généré pour la quantification du nombre synaptique en 3D 20, en profitant du logiciel d' analyse 3D Visualization assistée (Vaa3D) 21.
logiciel d'analyse d'image commerciale sont également des outils puissants pour quantifications synaptiques. Par exemple, la fluorescence,les récepteurs des neurotransmetteurs marqué ou un composant AZ présynaptique ont été quantifiés en trois dimensions avec une résolution individuelle synapses dans C. elegans 22 ou le système olfactif de drosophile 23, 24, permettant à des centaines de synapses à caractériser rapidement dans un seul échantillon.
Ici, nous présentons une méthode par un logiciel d'analyse d'image personnalisée plug-in mis en œuvre dans un environnement de calcul numérique multi-paradigme qui permet d'analyser semi-automatiquement plusieurs aspects de AZS, y compris leur nombre, la répartition et le niveau d'enrichissement de composants moléculaires l'AZ. Ainsi, cette analyse complexe nous a permis d'évaluer la dynamique des composantes synaptiques dans les terminaisons axonales dans différentes conditions environnementales. Nous avons étudié l'effet de l'exposition à la lumière sur les synapses de sortie des photorécepteurs de mouches adultes. La procédure est réalisée en trois étapes: 1)préparation pour exposition à la lumière, 2) la dissection, l'immunohistochimie et l'imagerie confocale, et 3) l'analyse d'image.
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Protocol
Les procédures expérimentales décrites dans ce protocole impliquent travaillent exclusivement avec la drosophile et ne sont pas soumis à des lois sur la protection des animaux en Allemagne et au Japon.
1. Exposition à la lumière Conditions
- Préparer les mouches qui transportent sensless-flippase (sens-flp) et Bruchpilot-FRT-STOP-FRT-gfp (brp-FSF-gfp) 15 pour la visualisation de Brp-GFP dans les neurones R8 photoréceptrices (R8). La génomique brp de codage de locus dans un chromosome artificiel bactérien (BAC) a été modifié pour générer cette construction brp-FSF-gfp. Dans les mouches portant ce BAC modifié l'expression de Brp-GFP est sous le contrôle des séquences régulatrices endogènes, mais limitée à photorécepteurs R8 après sensless-flippase élimination médiée de la cassette FRT-STOP-FRT 15. Notez que sens-flp rarement exprime flippase en R7s.
- Gardez les mouches dans un 12 h light / 12 h cycle d' obscurité (LD) à 25 ° C du stade larvaire jusqu'à eclosion (figure 1A).
- Recueillir les mouches 0 - 6 h après l'éclosion et les placer dans un nouveau flacon contenant de la nourriture à la mouche.
- Fixer les flacons dans un râtelier transparent constitué d' une résine acrylique avec trois étapes ( d' une hauteur de 41 cm, une base de 21 cm, une épaisseur de 4 cm et une hauteur de 13 cm pour chaque étape) (figure 1B).
- Réglez la distance entre la crémaillère et un panneau à LED pour fournir l'éclairage avec une intensité moyenne de 1000 lux à l' aide d' un compteur numérique de la lumière (figure 1C).
- Gardez les mouches pour 1 - 3 d dans l' une des conditions suivantes: obscurité constante (DD), 12 h de lumière / 12 h cycle d' obscurité (LD), ou de la lumière constante (LL) à 25 ° C dans un petit incubateur (Figures 1A et 1C).
2. Dissection, immunohistochimie et imagerie
- Disséquer le cerveau des mouches avec des pinces, les fixer avec 4% formaldehyde et immunocoloration avec l'anticorps primaire contre Chaoptin (01:50) et un second anticorps pour la visualisation des photorécepteurs , en fonction de procédures expérimentales antérieures 25. Brièvement:
- Préparer 0,1% de Triton X-100 dans du PBS (0,1% PBT). Cette solution est utilisée pour améliorer la pénétration dans les tissus anticorps.
- Anesthetize mouches sur un bloc CO 2, trier le bon génotype et de les transférer à une boîte de Pétri remplie de 0,1% PBT.
- Collez la pince sous la trompe et retirez droite et à gauche les yeux respectivement avec les autres pinces.
- Retirer la trompe et la trachée attachée au cerveau.
- Transférer le cerveau avec la pince dans un tube de 1,5 ml contenant 150 pi de 0,1% PBT à la température ambiante.
- Dans les 10 min de répétition 2.1.3 - 2.1.5 pour obtenir autant de cerveaux que possible.
- Ajouter 50 ul de 16% de formaldéhyde dans le tube et mélanger par pipetage.
- Incuber les cerveaux dans un fixateur à la salletempérature pendant 50 min.
- Laver trois fois avec 200 pi de 0,1% PBT avec une micropipette, en accordant une attention à laisser le cerveau dans le tube.
- Après le dernier lavage, retirer le 0,1% PBT et ajouter la solution d'anticorps primaire, préparé comme suit: ajouter 196 ul de 0,3% PBT (0,3% de Triton X-100 dans du PBS) 4 pi d'anti-Chaoptin anticorps (dilution finale 1 : 50) pour la visualisation des photorécepteurs.
- Laisser incuber le cerveau dans la solution d'anticorps primaire à 4 ° CO / N.
- Lavage 3x avec 200 ul de 0,1% de PBT avec une micropipette.
- Après le dernier lavage, retirer le 0,1% PBT et ajouter 200 ul du PBT 0,3% contenant un anticorps secondaire.
- Incuber dans l'obscurité à 4 ° CO / N.
- Laver trois fois avec 200 pi de 0,1% de PBT avec une micropipette.
- Pour le montage, placer deux petites gouttes (2 pi chacun) d'un support de montage avec une micropipette au centre d'une lame de microscope à environ 2 cm distance de l'autre.
- Placez deux lamelles, l'une sur chaque goutte et laisser un espace étroit entre les lamelles d'environ 0,2 mm.
- Placer 15 ul d'un milieu de montage sur le dessus de la lamelle couvre-objet et ajouter le cerveau avec une micro-pipette dans le milieu de montage.
- Sous un microscope de dissection, positionner le cerveau avec la face ventrale vers le haut dans l'espace étroit entre les deux lamelles (figure 2).
- Placez une lamelle sur le dessus et sceller les bords de la lamelle à l' aide de vernis à ongles transparent pour fixer l'échantillon (figure 2).
- Obtenir des images du cerveau avec un microscope confocal. Utilisez un objectif 63X à immersion d'huile objectif (1.4 NA) et un zoom numérique 2,6x. Générer plus de 20 sections optiques du second ganglion rachidien optique avec une taille de pas de 0,5 um.
3. Génération des taches, des objets de surface, des points de départ et End-points
- Pour quantifier le nombre, la distribution et le niveau de Brp-GFP puncta délocalisation, ouvrez la pile obtenue par microscopie confocale dans le logiciel d'analyse d'images et de reconstituer des images 3D (Figure 3A). Notez que l'étape dans cette étude a été réalisée avec Imaris.
- Identifier les points lacrymaux Brp-GFP par le module de détection de l'angle pour chaque terminal axone R8.
- Sélectionnez "Ajouter de nouveaux Spots".
- Sélectionnez "Segment seulement une région d'intérêt" dans les paramètres de l'algorithme. Sélectionnez un terminal axone R8 dans le bulbe rachidien manuellement.
- Sélectionnez le canal source du signal Brp-GFP.
REMARQUE: Les axones photoréceptrices R7 et R8 ont été immunomarquées avec un anti-Chaoptin (figure 3A). Seulement R8, cependant, contient Brp-GFP puncta et pourrait donc être facilement distingué (figure 3A). En outre, le point final de R8 pourrait être identifiée par l'amincissement des axones anti-Chaoptin positifs au point dans la couche rachidien M3 d'entrée. - Réglez le diamètre XY estimé to 0,35 pm et cocher "soustraction de fond" dans la détection de l'angle.
- Sélectionnez «Qualité» dans le type de filtre et filtrer automatiquement. Puis cliquez sur Terminer.
- Répéter de 3.2.1 3.2.5 T- pour d' autres axones R (figure 3B).
- Pour mesurer le niveau de délocalisation de Brp-GFP dans les axones R8, générer des objets de surface avec la fonction "Surface" pour chaque axone (figure 3C).
- Sélectionnez "Ajouter de nouvelles surfaces".
- Sélectionnez "Segment seulement une région d'intérêt" dans les paramètres de l'algorithme. Ensuite, sélectionnez une R8 terminaisons axonales dans le medulla manuellement.
- Sélectionnez le canal source des photorécepteurs.
- Cochez "Lisser".
- Sélectionnez "Intensité absolue" dans le seuil.
- Cochez la case "Activer". "Points de semences Diamètre" est de 0,5 um.
- Sélectionner le type de filtre "Qualité" et "Nombre de voxels", puis filtrer automatiquement.
- Allez sur "Edit" et supprimer les morceaux de surfaces générées sur d'autres axones non intéressants.
- Répéter de 3.3.1 - 3.3.8 pour d' autres axones R (Figure 3C). Remarque Certains objets de surface ont été interrompues en raison de la minceur et le faible signal dans les photorécepteurs à couche M2, mais ils étaient encore considérés comme un objet unique du début à des points d'extrémité.
- Pour identifier la distribution de Brp-GFP puncta le long de chaque neurone dans le neuropile rachidien, définir le début du point et point final avec la fonction de point de mesure (Figure 3D).
- Sélectionnez "Ajouter de nouveaux points de mesure". Ensuite, sélectionnez "Modifier" et sélectionnez "Surface d'objet" à couper avec le haut de la surface des objets.
- Mettez les points de mesure sur des objets de surface des axones R dans la couche M1 dans l'ordre. Ceux - ci sont maintenant définies comme start-points (Figure 3D).
- Sélectionnez "Ajouter de nouveaux points de mesure".Ensuite, sélectionnez "Modifier" et sélectionnez "Surface d'objet" à couper avec le fond des objets de surface.
- Placer des points de mesure sur le fond des objets de surface des axones R dans la couche de M3 dans l'ordre. Ceux - ci sont maintenant définies comme points d' extrémité (Figure 3D).
- Pour soustraire le signal de fond du canal de GFP, générer des objets de surface, des taches, des start-points et points d' extrémité pour deux axones R dans M6 couche (Figure 3E).
- Sélectionnez "Ajouter de nouvelles surfaces".
- Sélectionnez "Segment seulement une région d'intérêt" dans les paramètres de l'algorithme. Ensuite, sélectionnez un terminal axone R7 entre M5 et M6 couche manuellement.
- Sélectionnez le canal source du photorécepteur.
- Cochez "Lisser".
- Sélectionnez "Intensité absolue" dans le seuil.
- Sélectionner le type de filtre "Qualité" et "Nombre de voxels", puis filtrer automatiquement.
- Sélectionnez "Ajouter de nouveaux Spots";.
- Sélectionnez "Ignorer la création automatique, modifier manuellement".
- Sélectionnez "Center of Object" et ajouter une tache dans la zone intérieure de l'objet de surface générée à partir de 3.5.1 - 3.5.6.
- Répéter de 3.5.1 - 3.5.9 pour un autre terminal axone R7.
- Sélectionnez "Ajouter de nouveaux points de mesure". Ensuite, sélectionnez "Modifier" et mettre des points de mesure au-dessus des deux objets de surface de la pointe de la terminaison axonale R7 dans la couche M6. Ceux-ci sont maintenant définies comme start-points.
- Sélectionnez "Ajouter de nouveaux points de mesure". Ensuite, sélectionnez "Modifier" et mettre des points de mesure sur le fond des deux objets de surface de la pointe de la terminaison axonale R7 dans la couche M6. Ceux - ci sont maintenant définies comme points d' extrémité (Figure 3E).
4. Calcul du nombre de points, la distribution de la fréquence de spot et le niveau d'enrichissement de Brp-GFP avec une image personnalisée du logiciel d'analyse de données
- Copiez le fichier"XtquantifySynapseSNR.m" et le dossier "fonctions" dans le dossier MATLAB Imaris XT. A noter que le calcul de cette étude a été réalisée avec un plug-in personnalisé mis en oeuvre dans Matlab. Téléchargez le plugin sur le site Web ( https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo ).
- Ouvrez un ensemble de données à n points, n surfaces et 2 mesure des objets ponctuels, contenant chacun des points de mesure n (préparés 3,1 à 3,4). Le premier objet de point de mesure définit les positions de départ pour tous les axones. Le deuxième objet de point de mesure définit la position de fin de tous les axones. Les deux objets de points de mesure ont besoin d'avoir le même nombre de points de mesure (qui est le nombre d'axones).
- Exécuter le traitement d'image >> CUSTOM> atsushis détection de synapse Vs 6.
- Vérifiez les métadonnées et modifier la taille des pixels dans le logiciel d'analyse d'image dans le cas où il est inexact.
- Sélectionnez le canal pour la perfORMANCE de l'analyse de l'intensité des taches régions et les régions cytoplasmiques (le canal avec Brp-GFP).
- Définir le nom du fichier pour exporter les résultats.
- Définir le nombre de bacs et de la longueur des axones en pour cent. Entrez le nombre de bacs que "10" et la gamme de bacs que "100%" (figures 4A et 4B).
- Définir les régions des taches et les autres régions cytoplasmiques pour l'analyse de la délocalisation Brp-GFP. Entrez taches rayon que "0,35 um" et la largeur de la zone comme "50 um" entourant. Le rayon des spots définit la région pour le signal puncta GFP (0,35 um de diamètre, centrée sur un punctum). La largeur de la zone environnante définit la région pour le signal de la GFP dans la région cytoplasmique (50 um de diamètre, centré sur le point lacrymal, mais dont seulement R8 et excluant toutes les zones ponctuelles dans le cytoplasme) (figures 4A et 4C).
- Attendez jusqu'à ce que tous les masques de neurones sont traitéset exportés sous forme de fichiers PDF (figures 4B et 4C) et une table de csv pour une analyse ultérieure dans un tableur. Le tableau csv comprend le nombre de taches, l'intensité moyenne du signal dans la «zone cytoplasmique» et l'intensité maximale du signal dans le «spot» dans chaque bac pour tous les axones R8.
- Ouvrez un ensemble de données préparé à 3,5 pour la soustraction du signal d'arrière-plan.
- Effectuer le traitement d'image comme décrit 4,3 à 4,9.
- Calculer la moyenne du nombre total et la répartition de la puncta Brp-GFP dans une feuille de calcul (figures 4D et 4E).
- Calculer la moyenne de la délocalisation des signaux Brp-GFP dans une feuille de calcul par le rapport entre l'intensité moyenne dans la «zone cytoplasmique» divisée par l'intensité maximale dans le "spot" soustraite par l'intensité moyenne du signal d'arrière - plan (figure 4F) .
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Representative Results
L'œil composé de la drosophile comprend ~ 780 ommatidia, contenant chacun huit types de photorécepteurs (R1-8). R7 et R8 projet leurs axones à la deuxième ganglion optique, le bulbe rachidien, où ils forment des synapses dans les couches M6 et M3, respectivement 26. Pour étudier l'effet de l' exposition prolongée à la lumière de la composition moléculaire de photorécepteurs zones actives R8, nous avons profité de la méthode STaR 15. Les niveaux d'expression endogènes de Brp ont été marquées par fluorescence en retournant le codon d'arrêt dans BRP- FSF gfp avec un flippase exprimé dans les photorécepteurs R8 dérivées du sens-FLP. Les mouches ont été conservés pendant 1-3 jours après l' éclosion de LL, LD ou DD pour la même période de temps à 25 ° C (figure 1A). Pour exposer les mouches à 1000 Lux lumière, les mouches ont été mis dans une armoire de résine acrylique (figure 1B) et conservés à la même distanceà partir de la source lumineuse à DEL dans un petit incubateur (figure 1C).
Après immunomarquage, les cerveaux disséqués ont été placés dans l'espace étroit entre deux lamelles sur une lame de microscope avec la face ventrale du cerveau tournées vers le haut pour la visualisation et la quantification de la puncta Brp-GFP (figure 2). Le signal Brp-GFP résultante localisée à puncta distincte au sein de R8 dans la moelle (figure 3A).
Pour compter le nombre et mesurer la distribution de Brp-GFP lacrymaux, et d'évaluer le niveau du signal Brp-GFP dans R8s délocalisation, une analyse d'image plugin personnalisé a été développé dans un environnement multi-paradigme numérique informatique 9, 27. Dans un premier temps , puncta ont été détectés par une fonction de détection de l' angle pour chaque R8 (figure 3B). Par la suite, la surfaces de chaque R8 ont été générés pour l' évaluation du niveau de la délocalisation (figure 3C). Enfin, nous avons défini les start-points et points d' extrémité au sommet de la couche M1 et le fond de la couche M3 sur chaque photorécepteur respectivement pour mesurer la distribution AZ (Figure 3D). Objets de surface, des taches, des start-points et points d' extrémité pour deux terminaisons axonales R7 dans la couche M6 ont également été générés pour soustraire le signal de fond de la GFP canal (Figure 3E). Les résultats du numéro (Figure 4D), la distribution (figures 4A, 4B et 4E) et le niveau de délocalisation (figures 4A, 4C et 4F) sont calculés automatiquement par la coutume plug-in écrit dans un environnement de calcul numérique multi-paradigme . Nous avons constaté que le nombre de Brp puncta discrète a été significativement réduite dans les photorécepteurs R8 de mouches gardés dans des conditions de LL (figures 4D et 4E). Ajouteritionally, nous avons trouvé que les synapses R8 ont été distribués tout le long de l'arbre axonal de la M1 à la couche M3, mais la densité était plus élevée au niveau des couches M1 et M3 (Figure 4E). Le niveau de Brp-GFP délocalisation était inchangé dans toutes les conditions de lumière (Figure 4F). Ceci est en contraste avec la localisation d'une fluorescence tagged version courte de Brp (Brp-court-cerise) 28, qui, comme nous l' avons indiqué précédemment 9 devient clairement diffusé dans LL (Figure 4G). Nous avons suggéré que le signal délocalisée Brp-court-cerise pourrait être liée à un traitement inapproprié du Brp-court fragment après démontage du AZ 9. Parmi d' autres protéines AZ testés, marqués par fluorescence Binding Protein (DRBP) constructions DLiprin-a ou Drosophila Rim affichent une réduction du nombre de points lacrymaux et une délocalisation nette LL. En revanche, marqués par fluorescence Dsyd-1 ou Cacophony (Cac) font ne pas afficher un signal cytoplasmique augmenté même après LL (Figure 4G). Ainsi, la mesure systématique si le signal devient cytoplasmique pourrait être pertinent pour comprendre le traitement des protéines AZ.
Figure 1: Préparation des conditions d'exposition à l' intensité de la lumière défini. (A) des protocoles d'exposition à la lumière après l' éclosion. DD, obscurité continue; LD, 12 h de lumière / 12 h d'obscurité; LL, une exposition constante à la lumière. Fly cerveaux ont été disséqués aux moments indiqués dans les parenthèses (Adapté d'une publication précédente 9). (B) Les tubes sont alignés dans un support acrylique transparent sur mesure. (C) Le chariot acrylique et deux panneaux LED sont placés dans un petit incubateur et ajustées afin d' exposer les mouches à une intensité lumineuse de 1000 lux.s / ftp_upload / 55176 / 55176fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Préparation de l'échantillon. (A) tout monté les préparations du cerveau. (B - D) Schéma de la préparation. (C, D) Les coupes de la préparation. La face ventrale du cerveau est en place (C) entre les lamelles (D). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Génération des taches, des objets de surface et des points de mesure.
Figure 4: Quantification du numéro, Distribution et Délocalisation Niveau de Brp-GFP punctas. (A) Schéma de la procédure utilisée pour mesurer le niveau de signal de Brp-délocalisée GFP dans R8. Le puncta Brp-GFP sont identifiés et deux zones sont définies autour d'eux: la zone "spot" et la zone "cytoplasmique". La ligne reliant début et de points d'extrémité est subdivisé en 10 partitions. (B, C) Sortie de l'analyse d'image plugin personnalisé écrit dans un environnement de calcul numérique multi-paradigme. Chaque punctum Brp-GFP coordonnée est projetée à une ligne représentant le neurone de la start-point pour mettre fin à -point (B). Barre d'échelle, 5 um. Le puncta Brp-GFP sont identifiés et deux zones sont définies autour d' eux: la zone "spot" et la zone "cytoplasmique" (C), comme schématisé en (A). (D - F) Bar graphiques comparant le nombre total de points lacrymaux (D), leur distribution (E) et le niveau de délocalisation de Brp-GFP par axone R8 (F) dans le document DD (83 axones / 7 cerveaux), LD (107 axones / 5 cerveaux) et LL (226 axones / 15 cerveaux). (G) Bar graphiques comparant le niveau de délocalisation de Brp-court-cherry en LD (74 axones / 7 cerveaux) et LL (70 axones / 5 cerveaux), GFP-DLiprin-α en LD (67 axones / 7 cerveaux) et LL (52 axones / 6 cerveaux), GFP-DRBP en LD (70 axones / 7 cerveaux) et LL (83 axones / 6 cerveaux), GFP-Dsyd-1 en LD (48 axones / 5 cerveaux) et LL (69 axones / 7 cerveaux), et Cac-GFP en LD (31 axones / 5 cerveaux) et LL (27 axones / 5 cerveaux). *** P <0,0001 ** p <0,001, * p <0,0 5, ns p> 0,05; test t non apparié avec correction de Welch à deux queues. barre d'erreur indique l'erreur standard de la moyenne. Le dessin schématique en (A) et les données (D), (E) et (G) sont adaptés à partir d' une publication précédente 9. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Vidéo supplémentaire: Description du traitement des données Exécutée avec le Plugin Imaris "Synapse Trafo". Discussion du traitement des données. Cette vidéo contient une courte conférence pour illustrer la transformation et de traitement des données des étapes effectuées par le Imaris plugin "synapse_trafo" coordonnées.5176 / theory_data_analysis_withaudio.avi "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo. (Faites un clic droit pour télécharger.)
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Discussion
Dans cette étude, nous avons montré comment préparer les conditions de lumière pour exposer les mouches à une intensité lumineuse égale. Nous avons quantifié non seulement le nombre d'un marqueur puncta synaptique, mais pourrait aussi spatialement résoudre la densité des synapses le long des axones et de mesurer le niveau de la protéine marqueur dans les zones cytoplasmiques de délocalisation. Ces trois évaluations nous permettent d'évaluer les détails de la dynamique synaptiques au niveau du neurone unique dans différentes conditions environnementales. Notre protocole peut être adapté à différentes protéines synaptiques, mais également toutes les données qui contient des signaux de punctiformes.
Une étape critique dans le protocole est le montage des cerveaux. Photorécepteurs de drosophile projettent leurs axones vers la deuxième ganglion medulla optique. Chaque axone photorécepteur peut être balayée si les cerveaux carrément montés ont été correctement placés sur une lame de microscope. Le montage correct permet également la sélection des photorécepteurs avec l'analyse d'image software des fonctions plus faciles. Chaque région de photorécepteur doit être sélectionné manuellement pour compter le nombre et la délocalisation niveau de lacrymaux. Les start et points d'extrémité sont également sélectionnés manuellement. Ces préparations nécessitent un temps relativement long jusqu'à ce que l'on peut procéder à la quantification. L'avantage de R8 axones est qu'ils sont non ramifiés, et chaque R8 est séparé axone. Un neurone isolé simple tel que celui-ci est recommandé pour ces applications car il est nécessaire de définir la zone exacte du neurone. De plus, cela aide à se débarrasser des lacrymaux et des surfaces dérivées d'autres neurones non spécifique. Une limitation à cette approche, cependant, est la profondeur de la saillie z. L'intensité du signal de puncta obtient moins dans les couches plus profondes de la z pile. Préparation de cerveaux transparents par des méthodes de tissus de compensation un tel SeeDB2 29 pourrait aider à surmonter cette limitation et permettre l' imagerie d'un signal clair punctate encore plus profondément dans le cerveau.
Notre protocol peut potentiellement être utilisé pour l'analyse de l'organisation synaptique à l'échelle nano et l'imagerie en direct. La combinaison de super-résolution d' imagerie (par exemple, l' émission stimulée déplétion (STED) microscopie, la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM), Microscopie Palm (PALM), la microscopie d'éclairage structuré (SIM) , etc.) avec la modélisation théorique a fait progresser notre compréhension de la la structure et la dynamique moléculaire des synapses. Par exemple, l'organisation nanoscopique de Brp a été évaluée à une résolution unique moléculaire avec de super-résolution par imagerie directe STORM (d STORM) à la Drosophila NMJ 30. Notre protocole a été adapté pour la quantification de la dynamique d'une seule molécule de zone active à une zone active présynaptique et d'un seul récepteur postsynaptique dans une zone post-synaptique pour mieux comprendre comment les synapses sont réglementées à un niveau mécaniste. Par ailleurs, notre protocole peut être utilisé pour visualiser moléculairemouvement au niveau des synapses chez les animaux vivants. En fait, Brp-GFP peut être visualisé sans compter sur immunocoloration. Ainsi, le développement présynaptique dans les axones R8 a été imagée d'animaux vivants par microscopie à deux photons 15. Il est possible de suivre le signal de punctiformes des composants de la zone active chez des animaux vivants en détectant et en analysant des points à différents points dans le temps étant donné que les surfaces et les positions des neurones spécifiques sont définis dans notre protocole.
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Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants à T. Stürner pour les corrections utiles, des discussions et des commentaires sur le manuscrit; SL Zipursky pour fournir des stocks de mouches; M Schölling pour effectuer un traitement d'image. Une partie de l'analyse d'image a été réalisée au laboratoire de A. Kakita. Ce travail a été soutenu par la fondation Alexander von Humboldt et bourses JSPS pour la recherche à l'étranger (AS), JSPS Fellows (SH-S.), Grant-In Aide pour le démarrage (24800024), sur les zones innovantes (25110713), Mochida, Takeda, Inamori, Daiichi-Sankyo, Fondations Toray (TS), le financement de base DZNE (GT) et des installations DZNE Lumière Microscopy (CM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vial | Hightech, Japan | MKC-20 | |
| Plug | Thermo Fisher Sciehtific, USA | AS-275 | |
| Customized transparent rack made of acrylic resin | Shin-Shin Corporation, Japan | a height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step | |
| Cool incubator | MITSUBISHI ELECTRIC, Japan | CN-40A | |
| LED panel | MISUMI, Japan | LEDXC170-W | |
| Digital light meter | CEM | DT-1301 | |
| Fly pad | Tokken, Japan | TK-HA03-S | |
| Petri dish (35 x 10 mm) | Greiner Bio-One International, Germany | 627102 | |
| PBS tablet | Takara, Japan | T900 | |
| Triton X-100 | Wako, Japan | 160-24751 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 1.5 mL tube | Sarstedt, Germany | A. 152X | |
| Formaldehyde 16% | NEM, Japan | 3152 | |
| Pipetman P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P-2 | Gilson | F144801 | |
| anti-chaoptin antibody | DSHB | 24B10 | |
| Alexa568-conjugated anti-mouse antibody | Life Technologies | A-11031 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Microscope slide (76 x 26 mm) | Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Germany | ||
| Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm) | Zeiss, Germany | 474030-9000-000 | |
| Industrial Microscopes | Olympus, Japan | SZ61-C-SET | |
| Stereo Microscope Lighting | Olympus, Japan | KL 1600 LED | |
| confocal microscopy | Zeiss, Germany | LSM780 | |
| Imaris | Bitplane, Switzerland | Version 7.6.4 or above | |
| Matlab | The MathWorks, Inc., USA | ||
| Excel for Mac | Microsoft |
References
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