Summary
Здесь мы покажем , как определить число и пространственное распределение синаптических активных зон в дрозофилы фоторецепторов, выделенный с генетически закодированного молекулярным маркером, и их модуляция после длительного воздействия света.
Abstract
Нервная система обладает замечательной способностью приспосабливаться и реагировать на различные стимулы. Эта нейронная регулировка во многом достигается за счет пластичности на уровне синапса. Активная зона (АЗ) является областью на пресинаптической мембране, который опосредует высвобождение нейромедиаторов и состоит из плотной коллекции каркасных белков. AZS дрозофилы (Drosophila) фоторецепторы подвергаются молекулярной ремоделирования после продолжительного воздействия естественного окружающего света. Таким образом, уровень активности нейронов может перестраивать молекулярную состав AZ и внести свой вклад в регулирование функционального выхода.
Начиная с подготовки экспозиции света установленный вплоть до иммуногистохимии, этот протокол подробно описано , как определить число, пространственное распределение и уровень делокализации синаптических молекул на AZS в Drosophila фоторецепторов. С помощью анализа изображений SOFtware, были идентифицированы кластеры GFP-плавленого AZ компонент Bruchpilot для каждого R8 фоторецепторов (R8) аксона. Обнаруженные пятна Bruchpilot были автоматически присвоены отдельным аксонов R8. Для того, чтобы вычислить распределение частоты пятна вдоль аксона, мы реализовали плагин заказного программного обеспечения. старт-очку AXON и конечной точки были вручную определены и положение каждого пятна Bruchpilot проецировалось на соединительной линии между начальной и конечной точкой. Кроме того, количество кластеров Bruchpilot, мы также количественно уровень делокализации Bruchpilot-GFP внутри кластеров. Эти измерения отражают в деталях пространственно разрешенная динамика синаптические в одном нейроне при различных условиях окружающей среды на раздражители.
Introduction
Модуляция синаптической функции способствует замечательной способности нервной системы, чтобы точно реагировать или адаптации к изменению внешних стимулов. Регулировка пресинаптического вероятность выхода пузырек является одним из способов управления синаптическую силу 1. Synaptic релиз везикулы происходит в активной зоне (АЗ), специализированной области пресинаптической мембраны 2. АЗ характеризуется кассетой специфических белков 3, 4. Большинство белков , способствующих сборке AZ высоко консервативны у нематод, насекомых и млекопитающих 5. Недавние исследования показали, что уровень активности нейронов регулирует молекулярный состав АЗ, что в свою очередь способствует регуляции функционального выхода в пробирке и в естественных условиях 6, 7,> 8. Ранее мы обнаружили , что фоторецепторов AZS подвергаются молекулярной ремоделирования у дрозофилы после продолжительного воздействия естественного окружающего света 9. В этом состоянии, мы обнаружили, что количество Bruchpilot (BRP) -положительным AZS была снижена в фоторецепторных аксонов.
БРП / CAST / семьи ELKS белки являются основными строительными блоками AZS в позвоночных и беспозвоночных синапсах 10. В BRP мутантов Drosophila, вызванных релиз везикулы подавляется 11, 12. 17 С-концевые аминокислотные остатки BRP имеют важное значение для синаптической везикулы кластеризацию в Drosophila нервно - мышечном соединении (НМС) , 13, 14. Эти исследования показали центральную роль этой молекулы в организации и функции AZ. С помощью недавно разработанного генетического инструмента, Synaptic мечения с рекомбинацией (СтАР), BRPможно наблюдать в естественных условиях в конкретных типах клеток, на эндогенные уровни экспрессии и в одном разрешении синапса 15. Этот инструмент делает возможным оценить эндогенные динамику синапсов количественно в сложной центральной нервной системы.
Там было несколько исследований, в том числе синапсов количественными на основе данных, полученных из конфокальной микроскопии. Синаптические изменения были оценены путем измерения длины, площади, объема, плотности и подсчета числа, основанные на сложных программных приложений. Например, бесплатное программное обеспечение ImageJ предоставляет метод для количественного определения общей синаптической области и меры синаптической плотности в Drosophila NMJ 16. Число колокализации участков до и постсинаптических маркеров были количественно с помощью плагина "Puncta Analyzer" , доступных на ImageJ программной платформы 17. С другой стороны, несколько парПрограмма на основе adigm числовая вычислительная среда, синапс детектор (Synd), может автоматически отслеживать дендритов нейронов , меченных флуоресцентным маркером, а затем квантифицирует синаптические уровни белка в зависимости от расстояния от тела 18 клеток. Программное обеспечение Synaptic Puncta анализ (SynPAnal), был разработан для проведения экспресс-анализа 2D-изображений нейронов, полученных из конфокальной или флуоресцентной микроскопии. Основная функция этого программного обеспечения является автоматическое и быстрое количественное определение плотности и интенсивности белка Puncta 19. В последнее время , автоматический алгоритм обнаружения синапс обучения на основе был создан для количественного определения синаптической числа в 3D 20, воспользовавшись 3D визуализации-Assisted анализа (Vaa3D) программного обеспечения 21.
Программное обеспечение для анализа коммерческих изображений также являются мощными инструментами для синаптических количественными. Например, флуоресцентномеченые рецепторы нейротрансмиттеров или пресинаптический компонент АЗ измерялись количественно в трех измерениях с разрешением одного синапса в C. Элеганс 22 или обоняния дрозофила 23, 24, позволяя сотни синапсов, быстро охарактеризовать в пределах одного образца.
Здесь мы представляем метод с помощью специального программного обеспечения для анализа изображений плагин реализован в несколько парадигм численного вычислительной среды, которая позволяет анализировать полуавтоматически несколько аспектов AZS, в том числе их количество, распределение и уровень обогащения молекулярных компонентов в нажатия кнопки АЗ. Таким образом, этот комплексный анализ позволил нам оценить динамику синаптических компонентов в аксонов терминалов в различных экологических условиях. Мы исследовали влияние освещенности на выходных синапсах взрослых фоторецепторов мух. Процедура выполняется в три этапа: 1)подготовка к освещённости, 2) рассечение, иммуногистохимии и конфокальной микроскопии, и 3) анализа изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Экспериментальные методики , описанные в данном протоколе включают исключительно работать с дрозофилы и не подвергаются законы по защите животных в Германии и Японии.
1. Легкие условия экспонирования
- Подготовьте мух , которые переносят sensless-флиппазы (SENS-ФЛП) и bruchpilot-FRT-СТОП-FRT-GFP (БРП-FSF-GFP) 15 для визуализации BRP-GFP в фоторецепторов R8 нейронов (R8s). Геномные кодирующий локус BRP в бактериальный искусственную хромосому (BAC) был модифицирован для генерации этого BRP-FSF-GFP конструкции. В мух , несущих этом модифицированном BAC экспрессию BRP-GFP находится под контролем эндогенных регуляторных последовательностей, но ограничивается R8 фоторецепторов после sensless-флиппазы опосредованной удаления FRT-СТОП-FRT кассеты 15. Обратите внимание , что SENS-ФЛП редко выражает флиппазы в R7s.
- Держите мух в течение 12 ч LiGHT / 12 ч темнота (LD) при 25 ° C от стадии личинки до вылупления (фиг.1А).
- Сбор мух 0 - 6 ч после вылупления и поместить их в новый флакон, содержащий летучую пищу.
- Установить чаш в прозрачную стойку из акриловой смолы с тремя ступенями (с высоты 41 см, основание 21 см, толщиной 4 см и высотой 13 см для каждого шага) (рис 1b).
- Отрегулировать расстояние между стойкой и светодиодной панели , чтобы обеспечить освещение со средней интенсивностью 1000 люкс с использованием цифрового люксметр (фиг.1С).
- Держите мух в течение 1 - 3 дней при одном из следующих условий: постоянная темнота (DD), 12 ч свет / 12 ч темнота (LD), или постоянный свет (LL) при 25 ° С в небольшом инкубаторе (1А и 1С).
2. Вскрытие, Immunohistochemistry и обработка изображений
- Рассеките летать мозги с пинцетом, исправить их с 4% Formaldehyde и immunostain с первичным антителом против Chaoptin (1:50) и второе антитело , для визуализации фоторецепторов , основанных на ранее экспериментальных процедур 25. Кратко:
- Готовят 0,1% Тритон Х-100 в PBS (0,1% ПБТ). Этот раствор используют для улучшения проникновения антител ткани.
- Обезболить мух на CO 2 площадки, разобраться правильно генотип и перевести их в чашку Петри , заполненную 0,1% PBT.
- Палка щипцов под хоботка и снять правый и левый глаз соответственно с другими щипцами.
- Удалите хоботок и трахею, прикрепленную к мозгу.
- Передача мозга с пинцетом в пробирку, содержащую 1,5 мл 150 мкл 0,1% PBT при комнатной температуре.
- В течение 10 мин повторяют от 2.1.3 - 2.1.5, чтобы получить как можно больше мозгов, как это возможно.
- Добавить 50 мкл 16% формальдегида в пробирку и перемешать с помощью пипетки.
- Выдержите мозги в закрепителя в комнатетемпература в течение 50 мин.
- Промыть три раза с 200 мкл 0,1% PBT с микропипетки, обращая внимание, чтобы оставить мозги в трубке.
- После последней промывки удалите 0,1% PBT и добавляют раствор первичного антитела, получали следующим образом: добавляют к 196 мкл 0,3% PBT (0,3% Тритон Х-100 в PBS) 4 мкл анти-Chaoptin антител (конечное разведение 1 : 50) для визуализации фоторецепторов.
- Выдержите мозги в растворе первичного антитела при 4 ° CO / N.
- Промыть 3 раза с 200 мкл 0,1% PBT с помощью микропипетки.
- После последней промывки удалите 0,1% PBT и добавляют 200 мкл 0,3% PBT, содержащее вторичное антитело.
- Инкубируют в темноте при 4 ° CO / N.
- Промыть три раза с 200 мкл 0,1% PBT с помощью микропипетки.
- Для монтажа, поставить два маленьких капель (2 мкл каждая) монтажной среды с помощью микропипетки в центре предметного стекла микроскопа приблизительно 2 см Количессть друг от друга.
- Поместите два покровных, по одному на каждую каплю и оставить узкую щель между покровные приблизительно на 0,2 мм.
- Поместите 15 мкл монтажной среды на верхней части покровного стекла и добавить мозг с помощью микропипетки в монтажную среду.
- Под микроскопом рассекает, поместите мозг с вентральной стороной вверх в узкий промежуток между двумя покровные (рис 2).
- Поместите покровное сверху и запечатать края покровного стекла с помощью прозрачной лак для ногтей , чтобы исправить образца (рисунок 2).
- Получение изображений головного мозга с помощью конфокальной микроскопии. Используйте 63X масло погружения линзы объектива (NA) 1.4 и цифровым зумом 2.6x. Генерирование более 20 оптических секций второго оптического ганглия мозговом с размером шага 0,5 мкм.
3. Генерация пятнах, надводных объектов, запуск точек и конечных точек
- Для того, чтобы определить число, в Distribution и уровень Делокализация BRP-GFP Puncta, открыть стек , полученный с помощью конфокальной микроскопии в области программного обеспечения для анализа изображений и воссоздавать 3D - изображений (рис 3А). Обратите внимание, что шаг в этом исследовании проводили с Imaris.
- Определение Puncta BRP-GFP модулем обнаружения пятна для каждого аксона R8.
- Выберите "Добавить новые места".
- Выберите "Сегмент только интересующей области" в настройках алгоритма. Выберите аксона R8 в мозговом вручную.
- Выберите канал источника сигнала BRP-GFP.
ПРИМЕЧАНИЕ: фоторецепторов аксоны R7 и R8 были immunolabeled с анти-Chaoptin (рис 3А). Только R8, хотя, содержит BRP-GFP Puncta и , таким образом , можно было бы легко отличить (Фиг.3А). Кроме того, конечная точка R8 может быть идентифицирован истончением анти-Chaoptin-позитивных аксонов в точке входа в продолговатом слой М3. - Установить оценочную диаметр XY тO 0,35 мкм и галочкой "вычитание фона" в обнаружении пятна.
- Выберите "Качество" в тип фильтра и фильтр автоматически. Затем нажмите кнопку Готово.
- Повторить от 3.2.1 t- 3.2.5 для других аксонов R (рис 3B).
- Для измерения уровня делокализации BRP-GFP в R8 аксонов, создавать объекты на поверхности с помощью функции "Поверхность" для каждого аксона (рис 3C).
- Выберите "Добавить новые поверхности".
- Выберите "Сегмент только интересующей области" в настройках алгоритма. Затем выберите аксона терминалов R8 в мозговом веществе вручную.
- Выберите исходный канал фоторецепторов.
- Отметьте "Smooth".
- Выберите "Абсолютная интенсивность" порога.
- Установите флажок "Включить". "Семенной Диаметр точек" составляет 0,5 мкм.
- Выбор типа фильтра "Качество" и "Количество вокселей", а затем фильтровать автоматизацчески.
- Перейдите к пункту "Edit" и удалить куски поверхностей, образующихся на других неинтересные аксонов.
- Повторите с 3.3.1 - 3.3.8 для других аксонов R (рис 3C). Примечание Некоторые объекты поверхности были прерваны из-за худобы и слабого сигнала в фоторецепторов в слое M2, но они по-прежнему рассматриваются как единый объект от начала до конечных точек.
- Для того, чтобы определить распределение BRP-GFP Puncta вдоль каждого нейрона в продолговатом нейропиля, определить начальную точку и конечную точку с функцией точки измерения (рис 3D).
- Выберите "Добавить новые точки измерения". Затем выберите "Edit" и выберите "Поверхность объекта" до пересечения с верхней части объектов поверхности.
- Помещенный точек измерения на верхней поверхности объектов R аксонов в слое M1 в порядке. Они в настоящее время определяется как старт-точек (рис 3D).
- Выберите "Добавить новые точки измерения".Затем выберите "Edit" и выберите "Поверхность объекта" до пересечения с нижней части объектов на поверхности.
- Помещенный точек измерения на нижней поверхности объектов R аксонов в слое М3 в порядке. Они теперь определяются как конечные точки (рис 3D).
- Для вычитания фонового сигнала из канала GFP, создавать объекты на поверхности, пятна, запуск точки и конечные точки для двух R аксонов в слое M6 (рис 3Е).
- Выберите "Добавить новые поверхности".
- Выберите "Сегмент только интересующей области" в настройках алгоритма. Затем выберите аксона R7 между M5 и M6 слой вручную.
- Выберите исходный канал фоторецептора.
- Отметьте "Smooth".
- Выберите "Абсолютная интенсивность" порога.
- Выбор типа фильтра "Качество" и "Количество вокселей", затем фильтр автоматически.
- Выберите "Добавить новые пятна";.
- Выберите "Пропустить автоматическое создание, редактирование вручную".
- Выберите "Центр Object" и добавить место во внутренней области поверхности объекта генерируется из 3.5.1 - 3.5.6.
- Повторить от 3.5.1 - 3.5.9 для другого аксона R7.
- Выберите "Добавить новые точки измерения". Затем выберите "Edit" и поставить точки измерения на вершине двух поверхностных объектов кончика аксона R7 в слое M6. Они в настоящее время определяется как старт-точек.
- Выберите "Добавить новые точки измерения". Затем выберите "Edit" и поставить точки измерения на дне двух поверхностных объектов кончика аксона R7 в слое M6. Они теперь определяются как конечные точки (рис 3e).
4. Расчет числа пятен, распространение пятна Частота и уровень обогащения BRP-GFP с Customized Image Анализ данных программного обеспечения
- Скопируйте файл"XtquantifySynapseSNR.m" и папка "функции" в папку Imaris XT Matlab. Обратите внимание, что расчет в данном исследовании был проведен с заказной плагин реализован в Matlab. Скачать плагин с веб - сайта ( https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo~~HEAD=pobj ).
- Откройте набор данных с п точек, п поверхностей и 2 точечных объектов измерения, каждая из которых содержит точек измерения (п, полученные из 3.1 - 3.4). Первый объект точка измерения определяет стартовые позиции для всех аксонов. Второй объект точка измерения определяет конечное положение всех аксонов. Оба объекта точка измерения должны иметь одинаковое число точек измерения (то есть число аксонов).
- Выполнение обработки изображений >> CUSTOM> atsushis обнаружения синапс Vs 6.
- Проверьте метаданные и изменять размеры пикселов в области программного обеспечения для анализа изображений в случае, если это не правильно.
- Выберите канал для перфорацияormance анализа интенсивности пятен регионов и цитоплазматических регионов (канал с BRP-GFP).
- Определите имя файла для экспорта результатов.
- Определить количество бункеров и длины аксонов в процентах. Введите количество бункеров , как "10" и диапазон бункеров , как "100%" (фиг.4А и 4В).
- Определить регионы пятен и других цитоплазматических регионах для анализа делокализации BRP-GFP. Введите пятна радиуса как "0,35 мкм" и шириной окружающего пространства, как "50 мкм". Радиус пятна определяет область для сигнала Puncta GFP (диаметр 0,35 мкм, с центром на одном Punctum). Ширина его окрестностей определяет область для сигнала GFP в цитоплазматической области (диаметром 50 мкм, с центром на Punctum, но в том числе и только R8 и исключая все выборочные участки в цитоплазме) (рис 4A и 4С).
- Подождите, пока все нейронные маски не будут обработаныи экспортируются в виде PDF - файлов (рис 4В и 4С) и таблицы в формате CSV для дальнейшего анализа в таблице. Таблица CSV включает в себя количество пятен, средняя интенсивность сигнала в "цитоплазматическую области" и максимальной интенсивности сигнала в "пятно" в каждом бункере для всех аксонов R8.
- Откройте набор данных, подготовленный в 3.5 для вычитания фонового сигнала.
- Выполните обработку изображения, как описано в 4.3 - 4.9.
- Вычислить среднее значение общего количества и распределение Puncta BRP-GFP в таблице (рис 4D и 4E).
- Рассчитывают среднее значение делокализации сигнала BRP-GFP в электронной таблице отношением средней интенсивности в "цитоплазматическую области" , разделенному на максимальную интенсивность в «пятна» вычитают средней интенсивности в фоновый сигнал (рис 4F) ,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Соединение глаз дрозофилы содержит ~ 780 омматидиев, каждая из которых содержит восемь типов фоторецепторов (R1-8). R7 и R8 , проект свои аксоны второго оптического ганглия, костный мозг, где они образуют синапсы в слоях M6 и M3, соответственно 26. Для исследования влияния длительного воздействия света на молекулярный состав фоторецепторов R8 активных зон, мы воспользовались методом 15 - звездочных. Эндогенные уровни экспрессии BRP были помечены флуоресцентно листать из стоп - кодон в BRP-FSF-GFP с флиппазы , выраженной в R8 фоторецепторов , полученных из SENS-ФЛП. Мухи выдерживали в течение 1 - 3 дней , после вылупления в LL, LD или DD за тот же период времени при 25 ° С (рис 1А). Для того, чтобы выставить мух до 1000 Lux света, мухи были установлены в стойку акриловой смолы (Рисунок 1В) и держали на одинаковом расстоянииот светодиодного источника света в небольшом инкубаторе (рис 1C).
После иммунным окрашиванием, расчлененный мозги были помещены в узкую щель между двумя покровные на предметное стекло микроскопа с вентральной стороне мозга обращены вверх для визуализации и количественной оценки Puncta BRP-GFP (рисунок 2). Полученный BRP-GFP сигнал локализован в пределах отдельного Puncta R8 в продолговатом (рис 3А).
Для подсчета количества и измерить распределение BRP-GFP Puncta, а также оценить уровень делокализации BRP-GFP сигнала в R8s, настроенное программное обеспечение для анализа изображений плагин был разработан в несколько парадигм численного вычислительной среды 9, 27. Во - первых, Puncta были обнаружены с помощью функции обнаружения пятна для каждого R8 (рис 3B). Затем поверхностьс каждого R8 генерировались для оценки уровня делокализации (рис 3C). Наконец, мы определили старт-точки и конечные точки в верхней части слоя M1 и нижней части слоя M3 на каждом фоторецептора соответственно для измерения распределения AZ (рис 3D). Объекты поверхности, пятна, начинают точки и конечные точки для двух аксонов R7 в слое M6 были также генерироваться для вычитания фонового сигнала из канала GFP (рис 3Е). Результаты ряда (рис 4D), то (4A цифры, 4В и 4Е) распределения и уровня делокализации (Фигуры 4A, 4C и 4F) автоматически рассчитываются по обычаю плагин написан в несколько парадигм численного вычислительной среде , Мы обнаружили , что число БРП дискретного Puncta была значительно снижена в R8 фоторецепторов мух содержатся в условиях LL (Рисунки 4D и 4E). Добавитьitionally, мы обнаружили , что R8 синапсы были распределены по всей длине аксонов вала от M1 до слоя M3, но плотность была выше в слоях М1 и М3 (рис 4д). Уровень Делокализация BRP-GFP был неизменным при любых условиях освещенности (рис 4F). Это в отличие от локализации флуоресцентно меченый короткую версию BRP (BRP-короткого вишня) 28, который, как мы уже сообщали 9 становится ясно рассеянным в LL (рис 4G). Мы предположили , что делокализованы сигнал BRP-короткого вишня может быть связано с неадекватной обработкой BRP-короткого фрагмента после разборки из AZ 9. Среди других протестированных белков AZ, флуоресцентно помечены DLiprin-альфа или Drosophila Rim - связывающего белка (DRBP) конструкции отображает уменьшение количества Puncta и четкого делокализацию в LL. В противоположность этому, флуоресцентно помечены Dsyd-1 или Cacophony (ККА) делать не проявляют повышенную цитоплазматический сигнал даже после LL (рис 4G). Таким образом, измерение становится систематически ли сигнал цитоплазматического может иметь значение для понимания обработки AZ белков.
Рисунок 1: Подготовка условий для экспозиции к Defined интенсивности света. (A) Легкие протоколы воздействия после вылупления. DD, непрерывная темнота; LD, 12 ч свет / 12 ч темно; LL, постоянное воздействие света. Fly мозги были вскрыты в моменты времени , указанные в скобках (адаптировано из предыдущей публикации 9). (B) Флаконы выровнены в настраиваемой прозрачной акриловой стойки. (C) Акриловая стойка и две светодиодные панели помещаются в небольшой инкубатор и регулировать , чтобы выставить мух к интенсивности света 1000 люкс.s / ftp_upload / 55176 / 55176fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Получение образца. (А) Сплошной смонтированный препараты головного мозга. (B - D) Схематическое изображение препаратов. (C, D) Сечения препаратов. Брюшная сторона мозги вверх (C) между покровные (D). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Генерация пятнах, надводных объектов и точек измерения.
Рисунок 4: Количественная количества, распределения и делокализации Уровень BRP-GFP Puncta. (А) Схематическое изображение процедуры , используемой для измерения уровня сигнала делокализованное BRP-GFP в R8. BRP-GFP Puncta определены и две области определены вокруг них: "пятно" область и "цитоплазматическую" область. Линия, соединяющая открывающим и закрывающим точек подразделяется на 10 разделов. (B, C) Выход из настраиваемой анализа изображений программное обеспечение плагин написан в несколько парадигм численного вычислительной среде. Каждый BRP-GFP Punctum координате проецируется на линии, представляющей нейрон от запуска роInt в конечную точку (B). Шкала бар, 5 мкм. BRP-GFP Puncta определены и две области определены вокруг них: "пятно" площадь и "цитоплазматический" область (С), так как схематизированы в (А). (D - F) гистограмм , сравнивающих общее количество Puncta (D), их распределение (Е) и уровня Делокализация BRP-GFP на R8 аксона (F) в DD (83 аксоны / 7 мозг), LD (107 аксоны / 5 мозг) и LL (226 аксоны / 15 мозги). (G) гистограмм , сравнивающих уровень делокализации BRP-короткого вишни в LD (74 аксоны / 7 мозги) и LL (70 аксоны / 5 мозги), GFP-DLiprin-альфа в LD (67 аксоны / 7 мозги) и LL (52 аксоны / 6 мозги), GFP-DRBP в LD (70 аксоны / 7 мозг) и LL (83 аксоны / 6 мозга), GFP-Dsyd-1 в LD (48 аксоны / 5 мозг) и LL (69 аксоны / 7 мозг) и САЦ-GFP в LD (31 аксоны / 5 мозг) и LL (27 аксоны / 5 мозги). *** Р <0,0001, ** р <0,001, * р <0,0 5, нс р> 0,05; непарный т тест с коррекцией Уэлша двумя хвостами. бар ошибки показывает стандартную ошибку среднего значения. Схематический чертеж в (А) , и данные в (D), (Е) и (G) , адаптированы из предыдущей публикации 9. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Справочная Видео: Описание обработки данных , выполненные с помощью Imaris плагин "Synapse Trafo". Обсуждение обработки данных. Это видео содержит короткую лекцию, чтобы проиллюстрировать преобразования и обработки данных, этапы, выполняемые Imaris плагин "synapse_trafo" координат.5176 / theory_data_analysis_withaudio.avi "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите сюда, чтобы просмотреть это видео. (Нажмите правой кнопкой мыши для загрузки.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В данном исследовании мы показали, как приготовить легкие условия, чтобы выставить мух равной интенсивности света. Мы не только количественно число синаптических маркеров Puncta, но и может пространственно решить плотность синапсов вдоль аксонов и измерить уровень делокализации маркерного белка в цитоплазме областях. Эти три оценки позволяют оценить детали синаптических динамики на одном уровне нейронов в различных условиях окружающей среды. Наш протокол может быть адаптирован к различным синаптических белков, но и к любым данным, содержащим точечные сигналы.
Важным шагом в рамках протокола является установка мозгов. Drosophila фоторецепторы проецировать свои аксоны второго оптического ганглия мозговом. Каждый фоторецептор аксонов может быть отсканированы прямолинейно, если смонтированные мозги были правильно размещены на предметное стекло микроскопа. Правильная установка также делает выбор фоторецепторов с анализа изображения Softwaповторно функций легче. Каждый регион фоторецепторов должен быть выбран вручную для подсчета количества и делокализации уровень Puncta. В открывающим и закрывающим точки также выбираются вручную. Эти препараты требуют относительно длительного времени, пока не может приступить к количественной оценке. Преимущество R8 аксонов в том, что они являются неразветвленные и каждый R8 аксон отдельно. Простой изолированный нейрон, таких как этот рекомендуется для этих приложений, так как необходимо, чтобы определить точную площадь нейроне. Кроме того, это помогает избавиться от неспецифической Puncta и поверхностей, полученных от других нейронов. Ограничением при таком подходе, однако, глубина проекции г. Интенсивность сигнала Puncta становится меньше в более глубоких слоях стека г. Подготовка прозрачных тканей мозга с помощью очистив методов такой SeeDB2 29 может помочь преодолеть это ограничение и разрешить съемку четкого сигнала точечными еще глубже в головном мозге.
Наши протоCol потенциально могут быть использованы для анализа синаптической организации в масштабе нано и с живого изображения. Объединение изображений сверхвысокого разрешения (например, вынужденное истощение выбросов (STED) микроскопия, стохастические оптической микроскопии реконструкции (STORM), фото активированный локализации микроскопии (PALM), структурированное освещение микроскопии (SIM) и т.д.) с теоретического моделирования продвинулась наше понимание структура и молекулярная динамика синапсов. Например, наноскопическая организация BRP была оценена в одной молекулярной разрешении с супер-разрешением изображения по прямой STORM (г STORM) в Drosophila NMJ 30. Наш протокол был адаптирован для количественной оценки динамики одной активной молекулы зоны в пресинаптической активной зоне и одного постсинаптического рецептора на постсинаптической зону для дальнейшего понимания того, как синапсы регулируются на механистической уровне. Кроме того, наш протокол может быть использован для визуализации молекулярнойДвижение в синапсах в живых животных. На самом деле, BRP-GFP можно визуализировать, не полагаясь на иммунное окрашивание. Таким образом, развитие в пресинаптических R8 аксонов была изображается в живых животных с двухфотонной микроскопии 15. Можно отслеживать пунктат сигнал активных компонентов зоны в живых организмах животных путем обнаружения и анализа пятен в различные моменты времени так как поверхности и позиции определенных нейронов определяются в нашем протоколе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарны Т. Sturner за полезные корректировки, обсуждения и замечания по рукописи; SL Zipursky для обеспечения запасов мух; M Schölling для выполнения обработки изображений. Часть анализа изображений была выполнена в лаборатории А. Kakita в. Эта работа была поддержана Александра фон Гумбольдта и стипендий JSPS по научным исследованиям за рубежом (AS), JSPS Fellows (SH-S.), Грант-In- помощи для запуска (24800024), по инновационным районам (25110713), Мотида, Takeda, Inamori, Daiichi-Sankyo, Toray Foundations (TS), DZNE основное финансирование (GT) и DZNE световой микроскопии Facility (CM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vial | Hightech, Japan | MKC-20 | |
| Plug | Thermo Fisher Sciehtific, USA | AS-275 | |
| Customized transparent rack made of acrylic resin | Shin-Shin Corporation, Japan | a height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step | |
| Cool incubator | MITSUBISHI ELECTRIC, Japan | CN-40A | |
| LED panel | MISUMI, Japan | LEDXC170-W | |
| Digital light meter | CEM | DT-1301 | |
| Fly pad | Tokken, Japan | TK-HA03-S | |
| Petri dish (35 x 10 mm) | Greiner Bio-One International, Germany | 627102 | |
| PBS tablet | Takara, Japan | T900 | |
| Triton X-100 | Wako, Japan | 160-24751 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 1.5 mL tube | Sarstedt, Germany | A. 152X | |
| Formaldehyde 16% | NEM, Japan | 3152 | |
| Pipetman P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P-2 | Gilson | F144801 | |
| anti-chaoptin antibody | DSHB | 24B10 | |
| Alexa568-conjugated anti-mouse antibody | Life Technologies | A-11031 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Microscope slide (76 x 26 mm) | Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Germany | ||
| Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm) | Zeiss, Germany | 474030-9000-000 | |
| Industrial Microscopes | Olympus, Japan | SZ61-C-SET | |
| Stereo Microscope Lighting | Olympus, Japan | KL 1600 LED | |
| confocal microscopy | Zeiss, Germany | LSM780 | |
| Imaris | Bitplane, Switzerland | Version 7.6.4 or above | |
| Matlab | The MathWorks, Inc., USA | ||
| Excel for Mac | Microsoft |
References
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Synaptic Vesicle Pools and Dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (8), (2012).
- Couteaux, R., Pecot-Dechavassine, M. [Synaptic vesicles and pouches at the level of "active zones" of the neuromuscular junction]. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 271 (25), 2346-2349 (1970).
- Schoch, S., Gundelfinger, E. D. Molecular organization of the presynaptic active zone. Cell and Tissue Research. 326 (2), 379-391 (2006).
- Sudhof, T. C. The Presynaptic Active Zone. Neuron. 75 (1), 11-25 (2012).
- Owald, D., Sigrist, S. J. Assembling the presynaptic active zone. Curr Opin Neurobiol. 19 (3), 311-318 (2009).
- Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive remodeling of the presynaptic cytomatrix upon homeostatic adaptation to network activity silencing. J Neurosci. 31 (28), 10189-10200 (2011).
- Matz, J., Gilyan, A., Kolar, A., McCarvill, T., Krueger, S. R. Rapid structural alterations of the active zone lead to sustained changes in neurotransmitter release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (19), 8836-8841 (2010).
- Spangler, S. A., et al. Liprin-alpha2 promotes the presynaptic recruitment and turnover of RIM1/CASK to facilitate synaptic transmission. J Cell Biol. 201 (6), 915-928 (2013).
- Sugie, A., et al. Molecular Remodeling of the Presynaptic Active Zone of Drosophila Photoreceptors via Activity-Dependent Feedback. Neuron. 86 (3), 711-725 (2015).
- Sigrist, S. J., Schmitz, D. Structural and functional plasticity of the cytoplasmic active zone. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 144-150 (2011).
- Kittel, R. J., et al. Active zone assembly and synaptic release. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 5), 939-941 (2006).
- Kittel, R. J., et al. Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release. Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).
- Hallermann, S., et al. Naked dense bodies provoke depression. J Neurosci. 30 (43), 14340-14345 (2010).
- Wagh, D. A., et al. Bruchpilot, a protein with homology to ELKS/CAST, is required for structural integrity and function of synaptic active zones in Drosophila. Neuron. 49 (6), 833-844 (2006).
- Chen, Y., et al. Cell-type-specific labeling of synapses in vivo through synaptic tagging with recombination. Neuron. 81 (2), 280-293 (2014).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (4), 490-493 (2012).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number. J Vis Exp. (45), (2010).
- Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. J Neurosci Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
- Danielson, E., Lee, S. H. SynPAnal: software for rapid quantification of the density and intensity of protein puncta from fluorescence microscopy images of neurons. PLoS One. 9 (12), e115298 (2014).
- Sanders, J., Singh, A., Sterne, G., Ye, B., Zhou, J. Learning-guided automatic three dimensional synapse quantification for drosophila neurons. BMC Bioinformatics. 16, 177 (2015).
- Peng, H., Ruan, Z., Atasoy, D., Sternson, S. Automatic reconstruction of 3D neuron structures using a graph-augmented deformable model. Bioinformatics. 26 (12), i38-i46 (2010).
- Sturt, B. L., Bamber, B. A. Automated quantification of synaptic fluorescence in C. elegans. J Vis Exp. (66), (2012).
- Kremer, M. C., et al. Structural long-term changes at mushroom body input synapses. Curr Biol. 20 (21), 1938-1944 (2010).
- Mosca, T. J., Luo, L. Synaptic organization of the Drosophila antennal lobe and its regulation by the Teneurins. Elife. 3, e03726 (2014).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
- Fischbach, K. F., Dittrich, A. P. M. The Optic Lobe of Drosophila-Melanogaster .1 A Golgi Analysis of Wild-Type Structure. Cell and Tissue Research. 258 (3), 441-475 (1989).
- Berger-Muller, S., et al. Assessing the role of cell-surface molecules in central synaptogenesis in the Drosophila visual system. PLoS One. 8 (12), e83732 (2013).
- Fouquet, W., et al. Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot. J Cell Biol. 186 (1), 129-145 (2009).
- Ke, M. T., et al. Super-Resolution Mapping of Neuronal Circuitry With an Index-Optimized Clearing Agent. Cell Rep. 14 (11), 2718-2732 (2016).
- Ehmann, N., et al. Quantitative super-resolution imaging of Bruchpilot distinguishes active zone states. Nat Commun. 5, 4650 (2014).
