Summary
Hier laten we zien hoe het aantal en de ruimtelijke verdeling van synaptische actieve zones in Drosophila melanogaster fotoreceptoren te kwantificeren, gemarkeerd met een genetisch gecodeerde moleculaire marker, en hun modulatie na langdurige blootstelling aan licht.
Abstract
Het zenuwstelsel de opmerkelijke aanpassingsvermogen en reageren op verschillende stimuli. Dit neurale aanpassing wordt grotendeels bereikt door middel van plasticiteit in de synaptische niveau. De actieve zone (AZ) is het gebied aan het presynaptische membraan dat neurotransmitter afgifte bevordert en bestaat uit een dichte verzameling van scaffold proteïnen. AZS van Drosophila melanogaster (Drosophila) fotoreceptoren ondergaan moleculaire remodeling na langdurige blootstelling aan natuurlijk omgevingslicht. Dus het niveau van neuronale activiteit kan de moleculaire samenstelling van de AZ herschikken en bijdragen aan de regulering van de functionele output.
Uitgaande van de blootstelling aan licht set-up voorbereiding op de immunohistochemie, dit protocol beschrijft hoe om het nummer, de ruimtelijke verdeling, en de delokalisatie niveau van synaptische moleculen aan AZS in Drosophila fotoreceptoren te kwantificeren. Met behulp van beeldanalyse software, clusters van de GFP gefuseerde AZ component Bruchpilot werden geïdentificeerd voor elke R8 fotoreceptor (R8) axon terminal. Gedetecteerd Bruchpilot plekken werden automatisch toegewezen aan individuele R8 axonen. Om de verdeling van de spot frequentie langs de axon te berekenen, implementeerden we een op maat gemaakte software plugin. Elke axon's start-point en end-point werden met de hand bepaald en de positie van elk Bruchpilot spot werd geprojecteerd op de verbindingslijn tussen begin- en eindpunt. Naast het aantal Bruchpilot clusters, we gekwantificeerd ook de delokalisatie niveau van Bruchpilot-GFP binnen de clusters. Deze metingen weerspiegelen in detail de ruimtelijk opgeloste synaptische dynamiek in een enkel neuron onder verschillende milieu-omstandigheden op prikkels.
Introduction
De modulatie van synaptische functie draagt bij aan de opmerkelijke vermogen van het zenuwstelsel om exact te voldoen of aanpassen aan veranderende milieu stimuli. Aanpassing van de presynaptische afgifte vesicle kans is een manier van het controleren synaptische sterkte 1. Synaptische vesikel afgifte vindt plaats op de actieve zone (AZ), een gespecialiseerde gebied van het presynaptische membraan 2. AZ wordt gekenmerkt door een cassette van specifieke eiwitten 3, 4. Meeste eiwitten dragen aan AZ samenstel zijn sterk geconserveerd in nematoden, insecten en zoogdieren 5. Recente studies suggereren dat het niveau van neuronale activiteit regelt de moleculaire samenstelling van de AZ, die op zijn beurt bijdraagt aan de regeling van de functionele geven zowel in vitro als in vivo 6, 7,> 8. We eerder geconstateerd dat fotoreceptor AZS ondergaan moleculaire remodeling in Drosophila na langdurige blootstelling aan natuurlijke omgevingslicht 9. In deze toestand hebben we vastgesteld dat het aantal Bruchpilot (Brp) -positieve AZS werd gereduceerd in de fotoreceptor axonen.
De Brp / CAST / ELKS familie eiwitten zijn fundamentele bouwstenen van AZS in gewervelde en ongewervelde synapsen 10. In Drosophila brp mutanten, opgeroepen blaasje release onderdrukt 11, 12. De 17 C-eindstandige aminozuurresten van Brp essentieel zijn voor synaptische blaasjes clustering in de Drosophila neuromusculaire junctie (NMJ) 13, 14. Deze studies toonden de centrale rol van dit molecuul in AZ inrichting en functie. Met een recent ontwikkelde genetische tool, Synaptic Tagging met Recombinatie (STAR), Brpkan worden waargenomen in vivo in specifieke celtypen, endogene expressieniveaus en één synaps resolutie 15. Dit instrument maakt het mogelijk om de endogene dynamiek van synapsen kwantitatief in het complex centrale zenuwstelsel evalueren.
Er zijn verschillende studies waaronder synaps kwantificering gebaseerd op gegevens verkregen van confocale microscopie geweest. Synaptische veranderingen werden geëvalueerd door meting van de lengte, het gebied, het volume, de dichtheid en het tellen op basis van geavanceerde softwaretoepassingen. Bijvoorbeeld, de freeware ImageJ biedt een kwantificering methode voor het totale synaptische gebied en synaptische dichtheid maatregelen op de Drosophila NMJ 16. Het aantal colocalization plaatsen van pre-en postsynaptische markers zijn gekwantificeerd met behulp van de plugin "Puncta Analyzer" beschikbaar op de ImageJ software platform 17. Als alternatief, een multi-paradigm numerieke computeromgeving gebaseerde programma Synapse Detector (synd), automatisch traceren dendrieten van neuronen gelabeld met een fluorescerende marker, en kwantificeert de synaptische eiwitniveaus als functie van de afstand van het cellichaam 18. De software Synaptic Puncta Analyse (SynPAnal), is ontworpen voor de snelle analyse van 2D-beelden van neuronen verkregen uit of confocale fluorescentiemicroscopie. De primaire functie van deze software is de automatische en snelle kwantificering van dichtheid en intensiteit van eiwitten puncta 19. Recent is een automatisch leren die synaps algoritme gegenereerd voor kwantificering van synaptische aantal 3D 20, gebruik te maken van de 3D-visualisatie Assisted Analysis (Vaa3D) software 21.
image commerciële analyse software zijn ook krachtige tools voor het synaptische kwantificeringen. Bijvoorbeeld, de fluorescentiegelabelde neurotransmitter receptoren of presynaptische AZ component zijn gekwantificeerd in drie dimensies met één synaps resolutie in C. elegans 22 of Drosophila olfactorisch systeem 23, 24, waardoor honderden synapsen snel te karakteriseren binnen een enkel monster.
Hier presenteren we een methode een aangepaste beeldanalyse software plug-in uitgevoerd in een multi-paradigma numerieke computeromgeving die toestaat om semi-automatisch verschillende aspecten van AZS, met inbegrip van hun aantal, de locatie en het niveau van verrijking van moleculaire componenten te analyseren het AZ. Aldus is deze complexe analyse konden we de dynamiek van synaptische bestanddelen in axon terminals onder verschillende omgevingsomstandigheden evalueren. Wij onderzochten het effect van blootstelling aan licht op de output synapsen van de volwassen vlieg fotoreceptoren. De procedure wordt uitgevoerd in drie stappen: 1)voorbereiding op blootstelling aan licht, 2) dissectie, immunohistochemie en confocale beeldvorming, en 3) beeldanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De in dit protocol beschreven experimentele procedures omvatten uitsluitend te werken met Drosophila en zijn niet onderworpen aan het welzijn van dieren wetten in Duitsland en Japan.
1. Light Exposure Voorwaarden
- Bereid vliegt dat sensless-flippase (sens-FLP) en bruchpilot-FRT-STOP-FRT-GFP (BRP-FSF-GFP) 15 dragen voor het visualiseren van Brp-GFP in fotoreceptor R8 neuronen (R8s). De genomische locus codeert brp bij een Bacterial Artificial Chromosome (BAC) werd gemodificeerd om het BRP-FSF-GFP-construct te genereren. In de vliegen voortzetting van deze gemodificeerde BAC Brp de expressie van GFP onder de controle van de endogene regulerende sequenties, maar beperkt tot R8 fotoreceptoren na sensless flippase-gemedieerde verwijdering van de FRT-STOP-FRT cassette 15. Merk op dat sens-FLP zelden tot expressie flippase in R7s.
- Houd de vliegen in een 12 h liGHT / 12 uur donker cyclus (LD) bij 25 ° C van het larvenstadium tot eclosion (Figuur 1A).
- Verzamel de vliegen 0-6 uur na eclosion en leg ze in een nieuw flesje met vlieg voedsel.
- Stel de flacons in een transparante rek gemaakt van acrylhars met drie stappen (hoogte 41 cm, een basis van 21 cm, een dikte van 4 cm en een hoogte van 13 cm voor elke stap) (Figuur 1B).
- Stel de afstand tussen de tandheugel en een LED-paneel om de verlichting te voorzien van een gemiddelde intensiteit van 1000 lux met een digitale lichtmeter (figuur 1C).
- Houd de vliegen gedurende 1-3 d onder één van de volgende voorwaarden: constante duisternis (DD), 12 uur licht / 12 uur donker cyclus (LD) of constant licht (LL) bij 25 ° C in een kleine incubator (Figuren 1A en 1C).
2. Dissection, Immunohistochemie en Imaging
- Ontleden fly hersenen met een tang, zet ze vast met 4% formaldehyde en immunostain met het primaire antilichaam tegen Chaoptin (01:50) en een tweede antilichaam voor visualisatie van fotoreceptoren basis van eerdere experimentele procedures 25. Kort:
- Bereid 0,1% Triton X-100 in PBS (0,1% PBT). Deze oplossing wordt gebruikt voor antilichaam penetratie te verbeteren.
- Verdoven vliegen op een CO 2 pad, het uitzoeken van de juiste genotype en overbrengen naar een petrischaal gevuld met 0,1% PBT.
- Plak de tang onder de neus respectievelijk trek de linker en rechter ogen met de andere tang.
- Verwijder de snuit en de trachea aan de hersenen.
- Breng de hersenen met de tang in een 1,5 ml buis die 150 ui 0,1% PBT bij kamertemperatuur.
- Binnen 10 min herhaal van 2.1.3 - 2.1.5 om zoveel hersens als mogelijk te verkrijgen.
- Voeg 50 ul van 16% formaldehyde in de buis en meng door pipetteren.
- Incubeer de hersenen in fixeermiddel bij kamertemperatuurgedurende 50 min.
- Was driemaal met 200 pl 0,1% PBT met een micropipet, met aandacht voor de hersenen te laten in de buis.
- Na de laatste wasbeurt, verwijder de 0,1% PBT en voeg het primaire antilichaam oplossing, bereid als volgt: voeg 196 ul van 0,3% PBT (0,3% Triton X-100 in PBS) 4 pl anti-Chaoptin antilichaam (uiteindelijke verdunning 1 : 50) voor het zichtbaar maken van fotoreceptoren.
- Incubeer de hersenen in de primaire antilichaamoplossing bij 4 ° CO / N.
- 3x wassen met 200 pl 0,1% PBT met een micropipet.
- Na de laatste wasbeurt, verwijder dan de 0,1% PBT en voeg 200 pi van de 0,3% PBT met een secundair antilichaam.
- Incubeer in het donker bij 4 ° CO / N.
- Was driemaal met 200 pl 0,1% PBT met een micropipet.
- Voor montage, zet twee kleine druppels (2 pi elk) van een fixeermiddel met een micropipet op het centrum van een microscoopglaasje ongeveer 2 cm distanvu van elkaar.
- Plaats twee dekglaasjes, één op elke druppel en een smalle spleet tussen de dekglaasjes van ongeveer 0,2 mm.
- Plaats 15 gl van een fixeermiddel bovenop het dekglaasje en voeg de hersenen met een micropipet in het fixeermiddel.
- Onder een stereomicroscoop, plaats de hersenen met de ventrale zijde omhoog in de smalle spleet tussen de twee dekglaasjes (figuur 2).
- Plaats een dekglaasje op de top en sluit de randen van het dekglaasje met behulp van duidelijke nagellak met het model (figuur 2) vast te stellen.
- Verkrijgen beelden van de hersenen met een confocale microscoop. Gebruik een 63x olie-immersie objectief (1.4 NA) en een 2.6X digitale zoom. Het genereren van meer dan 20 optische secties van de tweede optische ganglion medulla met een stapgrootte van 0,5 urn.
3. Productie van de Spots, Surface objecten, Start-points en end-points
- Om het nummer te kwantificeren, de distribution en de delokalisatie niveau van Brp-GFP puncta, opent u de stapel verkregen door confocale microscopie in beeldanalyse software en reconstrueren 3D-beelden (figuur 3A). Merk op dat de stap in dit onderzoek werd uitgevoerd met Imaris.
- Identificeer de Brp-GFP puncta met de contante detectiemodule voor elke R8 axon terminal.
- Selecteer 'nieuwe Spots toevoegen ".
- Selecteer "Segment slechts een regio van belang" in het algoritme instellingen. Selecteer een R8 axon terminal in het merg handmatig.
- Selecteer de bron kanaal van de Brp-GFP signaal.
OPMERKING: De R7 en R8 fotoreceptor axons werden immunolabeled met anti-Chaoptin (Figuur 3A). Alleen R8 echter bevat Brp-GFP puncta en kan dan ook gemakkelijk worden onderscheiden (Figuur 3A). Verder zou het eindpunt van R8 worden geïdentificeerd door de verdunning van het anti-Chaoptin-positieve axonen bij de ingang in de M3 medulla laag. - Stel de geschatte diameter XY to 0,35 pm en afvinken "Achtergrond aftrekken" in de spot detectie.
- Selecteer "Kwaliteit" in type filter en automatisch filteren. Klik vervolgens op afwerking.
- Herhaal van 3.2.1 t- 3.2.5 voor andere R axonen (Figuur 3B).
- Om de delokalisatie niveau van Brp-GFP in R8 axonen te meten, oppervlakte-objecten te genereren met de "Surface" functie voor elke axon (figuur 3C).
- Selecteer 'nieuwe Surfaces toevoegen ".
- Selecteer "Segment slechts een regio van belang" in het algoritme instellingen. Selecteer vervolgens een R8 axon terminals in het merg handmatig.
- Selecteer de bron kanaal van de fotoreceptoren.
- Afvinken "Smooth".
- Selecteer "Absolute Intensity" op de drempel.
- Controleer "Enable". "Seed Points Diameter" is 0,5 micrometer.
- Kies een filter Type "Kwaliteit" en "Aantal voxels", en vervolgens filteren votisch.
- Ga naar "Edit" en de stukken van de vlakken gegenereerd op andere niet-interessante axonen te verwijderen.
- Herhaal van 3.3.1 - 3.3.8 voor de andere R axonen (figuur 3C). Let op sommige oppervlak voorwerpen werden onderbroken vanwege de slankheid en de zwakke signaal in fotoreceptoren bij M2 laag, maar ze waren nog steeds beschouwd als één object van begin tot eind punten.
- Om de distributie van GFP-Brp puncta langs elke neuron in de medulla neuropil identificeren, definieert het beginpunt en eindpunt van het meetpunt functie (Figuur 3D).
- Selecteer 'nieuwe Meetpunten toevoegen ". Selecteer vervolgens "Edit" en selecteer "Surface Object" om kruisen met de top van het oppervlak objecten.
- Zet meetpunten op de top van het oppervlak objecten van R axonen in M1 laag in orde. Deze worden nu gedefinieerd als start-punten (Figuur 3D).
- Selecteer 'nieuwe Meetpunten toevoegen ".Selecteer vervolgens "Edit" en selecteer "Surface Object" om kruisen met de onderkant van het oppervlak objecten.
- Zet meetpunten op de bodem van het oppervlak van objecten R axonen in M3 laag in volgorde. Deze worden nu gedefinieerd als eindpunten (Figuur 3D).
- Om de achtergrond signaal van het GFP-kanaal af te trekken, het genereren oppervlak voorwerpen, vlekken, start-points en end-points voor twee R axonen in M6 laag (figuur 3E).
- Selecteer 'nieuwe Surfaces toevoegen ".
- Selecteer "Segment slechts een regio van belang" in het algoritme instellingen. Selecteer vervolgens een R7 axon terminal tussen de M5 en M6 laag handmatig.
- Selecteer de bron kanaal van de fotoreceptor.
- Afvinken "Smooth".
- Selecteer "Absolute Intensity" op de drempel.
- Kies een filter Type "Kwaliteit" en "Aantal voxels", vervolgens automatisch filteren.
- Selecteer 'nieuwe Spots toevoegen ";.
- Selecteer "Skip automatisch aanmaken, handmatig bewerken".
- Selecteer "Center of Object" en voeg een plek in het binnengebied van het oppervlak object gegenereerd uit 3.5.1 - 3.5.6.
- Herhaal van 3.5.1 - 3.5.9 voor een andere R7 axon terminal.
- Selecteer 'nieuwe Meetpunten toevoegen ". Selecteer vervolgens "Edit" en zet meetpunten op de top van de twee oppervlakte voorwerpen van het topje van de R7 axon terminal in M6 laag. Deze worden nu gedefinieerd als start-punten.
- Selecteer 'nieuwe Meetpunten toevoegen ". selecteer "Edit" en zet meetpunten op de bodem van de twee objecten oppervlak van de punt van de R7 axon terminal in M6 laag. Deze worden nu gedefinieerd als eindpunten (figuur 3E).
4. Berekening van het aantal Spots, Verspreiding van de Spot frequentie en het niveau van de Verrijking van Brp-GFP met een aangepaste afbeelding Data Analyse Software
- Kopieer het bestand"XtquantifySynapseSNR.m" en de map "functies" in de map Imaris XT Matlab. Merk op dat de omzetting in deze studie werd uitgevoerd met een aangepaste plugin in Matlab uitgevoerd. Download de plugin van de website ( https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo ).
- Open een dataset met n vlekken, n oppervlakken en 2 meetpunt objecten, die elk n meetpunten (bereid 3,1-3,4). Het eerste meetpunt object definieert de start posities voor alle axonen. Het tweede meetpunt object definieert de eindpositie van alle axonen. Beide meetpunt voorwerpen moeten hetzelfde aantal meetpunten (dat is het aantal axons) hebben.
- beeldverwerking uit te voeren >> CUSTOM> atsushis synaps detectie Vs 6.
- Controleer metadata en veranderen pixel maten in beeldanalyse software voor het geval het niet juist is.
- Kies een kanaal voor de performance van de intensiteit analyse van vlekken regio's en cytoplasmatische regio's (het kanaal met Brp-GFP).
- Definieer de bestandsnaam voor het exporteren van de resultaten.
- Definieer het aantal bakken en de axon lengte in procenten. Voer het aantal bins als "10" en het bereik van bakken als "100%" (Figuren 4A en 4B).
- Definieer de regio's van de plekken en de andere cytoplasmatische regio's voor de Brp-GFP delocalisatie analyse. Voer plekken straal als "0,35 micrometer" en de breedte van de omgeving als "50 pm". De straal plekken definieert de regio voor de puncta GFP-signaal (0,35 pm diameter, gecentreerd op één punctum). De breedte van de omgeving bepaalt het gebied voor het GFP-signaal in het cytoplasmatische gebied (50 urn diameter gecentreerd op het punctum, maar met alleen R8 en uitsluiting van alle spot gebieden in het cytoplasma) (figuren 4A en 4C).
- Wacht tot alle neuron maskers worden verwerkten geëxporteerd als PDF-bestanden (Figuren 4B en 4C) en een csv tafel voor verdere analyse in een spreadsheet. Het CSV tabel bevat het aantal van de plaatsen, de gemiddelde signaalintensiteit in de "cytoplasmatische gebied" en het maximale signaalintensiteit in de "spot" in elke bin voor R8 axonen.
- Open een dataset opgesteld 3.5 voor aftrekken van de achtergrond signaal.
- Voer de beeldverwerking zoals beschreven 4,3-4,9.
- Bereken het gemiddelde van het totale aantal en de verdeling van de Brp-GFP puncta in een spreadsheet (figuur 4D en 4E).
- Bereken het gemiddelde van de delocalisatie van Brp-GFP signaal in een spreadsheet door de verhouding van de gemiddelde intensiteit in het "cytoplasmatische gebied" gedeeld door de maximale intensiteit in de "spot" afgetrokken van de gemiddelde intensiteit in het achtergrondsignaal (Figuur 4F) .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De verbinding oog van Drosophila omvat ~ 780 ommatidia, elk met acht typen fotoreceptoren (R1-8). R7 en R8 project hun axonen naar de tweede optische ganglion, het merg, waar ze vormen synapsen in lagen M6 en M3, respectievelijk 26. Om het effect van langdurige blootstelling aan licht op de moleculaire samenstelling van fotoreceptor R8 actieve zones te onderzoeken, hebben we geprofiteerd van de methode STaR 15. Endogene expressie van Brp werden fluorescent gelabelde door flippen het stopcodon in BRP-FSF-GFP met een flippase uitgedrukt in R8 fotoreceptoren afgeleid van het sens-FLP. De vliegen werden gedurende 1 gehouden - 3 d na eclosion in LL, LD of DD voor dezelfde periode bij 25 ° C (Figuur 1A). De vliegen aan 1000 Lux licht bloot werden de vliegen geplaatst in een acrylhars rack (Figuur 1B) en bewaard op dezelfde afstandvan de LED-lichtbron in een kleine incubator (figuur 1C).
Na immunokleuring werden ontleed hersenen op een microscoopglaasje geplaatst in de nauwe spleet tussen twee dekglaasjes met de ventrale zijde van de hersenen naar boven voor visualisatie en kwantificatie van GFP-Brp puncta (figuur 2). Het verkregen Brp-GFP signaal gelokaliseerd op afzonderlijke puncta binnen R8 in de medulla (figuur 3A).
Om het aantal te tellen en meten van de verdeling van Brp-GFP puncta, en de delokalisatie niveau van Brp-GFP signaal in R8s te evalueren, werd een aangepaste beeldanalyse software plugin ontwikkeld in een multi-paradigma numerieke computeromgeving 9, 27. Aanvankelijk werden puncta gedetecteerd door een hoek detectie functie voor elke R8 (figuur 3B). Vervolgens oppervlaks van elke R8 werden gegenereerd voor beoordeling van de delokalisatie (afbeelding 3C). Tenslotte we bepaalde start--punten en eindpunten bovenaan M1 laag en de onderste laag van M3 op elke fotogeleider respectievelijk de AZ verdeling (figuur 3D) te meten. Surface voorwerpen, vlekken, start-points en end-points voor twee R7 axon terminals in M6 laag werden ook gegenereerd om de achtergrond signaal van GFP-kanaal (figuur 3E) af te trekken. De resultaten van het nummer (figuur 4D), de distributie (figuren 4A, 4B en 4E) en de delokalisatie niveau (Figuren 4A, 4C en 4F) automatisch berekend door de aangepaste plug-in geschreven in een multi-paradigma numerieke computeromgeving . We vonden dat het aantal discrete Brp puncta aanzienlijk werd verlaagd R8 fotoreceptoren vliegen in LL omstandigheden (figuur 4D en 4E) gehouden. Toevoegenitionally, vonden we dat R8 synapsen verspreid langs de axonale as van de M1 tot M3 laag, maar de dichtheid was hoger bij de M1 en M3 lagen (Figuur 4E). De delokalisatie niveau van Brp-GFP was onveranderd in alle lichtomstandigheden (Figuur 4F). Dit in tegenstelling tot de lokalisatie van een fluorescent gelabeld korte versie van Brp (Brp-short-kers) 28, die, zoals eerder gemeld 9 wordt duidelijk verspreid in LL (Figuur 4G). We gesuggereerd dat de gedelokaliseerd Brp-short-cherry signaal kan worden gerelateerd aan ongepaste behandeling van de Brp-kort fragment na het demonteren van het AZ 9. Onder andere geteste eiwitten AZ, fluorescent gelabeld DLiprin-α of Drosophila Rim bindend eiwit (DRBP) constructen vertonen een vermindering van het aantal puncta en een duidelijke delocalisatie in LL. In tegenstelling tot fluorescent gelabeld Dsyd-1 of Cacophony (Cac) doen een verhoogde cytoplasmatische signaal zelfs na LL (figuur 4G) niet weergegeven. Aldus meet systematisch of het signaal wordt cytoplasmatische van belang kunnen zijn voor het verwerken van AZ eiwitten begrijpen.
Figuur 1: Voorbereiding van de voorwaarden voor blootstelling aan Defined lichtintensiteit. (A) Belichting protocollen na Eclosion. DD, continue duisternis; LD, 12 uur licht / 12 uur donker; LL, constante blootstelling aan licht. Vlieg hersenen werden ontleed op de in de beugels (Aangepast van een voorgaande publicatie 9) maal. (B) Flesjes zijn uitgelijnd in een op maat gemaakte acryl transparant rack. (C) De acryl rek en twee LED panelen worden in een kleine incubator gebracht en aangepast om de vliegen blootstellen aan een lichtintensiteit van 1000 lux.s / ftp_upload / 55176 / 55176fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Voorbereiding van het monster. (A) geheel aangebracht hersenen preparaten. (B - D) Schematische tekening van de voorbereidingen. (C, D) Dwarsdoorsneden van de preparaten. De ventrale zijde van de hersenen omhoog (C) tussen dekglaasjes (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Genereren van de Spots, Surface objecten en meetpunten.
Figuur 4: Kwantificering van het aantal, de locatie en Delokalisatie Niveau van Brp-GFP Puncta. (A) Schematische tekening van de procedure gebruikt om het niveau van gedelokaliseerde Brp GFP-signaal in R8 meten. De Brp-GFP puncta worden geïdentificeerd en twee gebieden zijn vastgesteld om hen heen: de "spot" gebied en het "cytoplasma" gebied. De lijn tussen begin- en eindpunten is onderverdeeld in 10 partities. (B, C) Uitvoer van de aangepaste beeldanalyse software plugin geschreven in een multi-paradigma numerieke computeromgeving. Elke Brp-GFP punctum coördinaat wordt geprojecteerd op een lijn die het neuron van start-point naar eindpunt (B). Schaal bar, 5 micrometer. De Brp-GFP puncta geïdentificeerd en twee gebieden worden gedefinieerd omheen: de "spot" stippellijn het "cytoplasma" gebied (C), zoals schematisch weergegeven in (A). (D - F) Bar grafieken vergelijken van het totale aantal puncta (D), de distributie (E) en de delokalisatie niveau van Brp-GFP per R8 axon (F) in DD (83 axonen / 7 hersenen), LD (107 axonen / 5 hersenen) en LL (226 axonen / 15 hersenen). (G) Bar grafieken vergelijken van de delokalisatie niveau van Brp-short-kers in LD (74 axonen / 7 hersenen) en LL (70 axonen / 5 hersenen), GFP-DLiprin-α in LD (67 axonen / 7 hersenen) en LL (52 axonen / 6 hersenen), GFP-DRBP in LD (70 axonen / 7 hersenen) en LL (83 axonen / 6 hersenen), GFP-Dsyd-1 in LD (48 axonen / 5 hersenen) en LL (69 axonen / 7 hersenen), en Cac-GFP in LD (31 axonen / 5 hersenen) en LL (27 axonen / 5 hersenen). *** P <0,0001, ** p <0,001, * p <0,0 5, ns p> 0,05; ongepaarde t-test met correctie Welch tweezijdige. Fout balk toont standaardafwijking van het gemiddelde. De schematische tekening (A) en de gegevens (D), (E) en (G) zijn afgeleid van een eerdere publicatie 9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende Video: Beschrijving van de Data Processing uitgevoerd met de Imaris Plugin "Synapse Trafo". Bespreking van gegevensverwerking. Deze video bevat een korte lezing te illustreren de coördinaten transformatie en verwerking van gegevens stappen uitgevoerd door de Imaris plugin "synapse_trafo".5176 / theory_data_analysis_withaudio.avi "target =" _ blank "> Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie hebben we laten zien hoe de lichtomstandigheden te bereiden om vliegen bloot te stellen aan een gelijke lichtintensiteit. We gekwantificeerde niet alleen een aantal synaptische marker puncta maar kan ook ruimtelijk oplossen van de dichtheid van synapsen langs axonen en meet de delokalisatie niveau van het markereiwit in cytoplasmatische gebieden. Deze drie evaluaties kunnen we de details van de synaptische dynamiek enkel neuron niveau in verschillende milieu-omstandigheden te evalueren. Ons protocol kan worden aangepast aan verschillende synaptische eiwitten maar ook gegevens waarvan punctata signalen bevat.
Een kritische stap in het protocol is de montage van de hersenen. Drosophila fotoreceptoren projecteren hun axonen naar de tweede optische ganglion merg. Elke fotoreceptor axon eenvoudig kunnen worden gescand als gemonteerde hersenen terecht op een microscoopglaasje geplaatst. De correcte montage maakt ook de selectie van fotoreceptoren met de beeldanalyse Software functies gemakkelijker. Elke regio fotoreceptor moet handmatig worden geselecteerd voor het tellen van het aantal en de mate van delokalisatie puncta. De begin- en eindpunten zijn ook handmatig geselecteerd. Deze preparaten vereisen een relatief lange tijd totdat men overgaan tot de kwantificering. Het voordeel van R8 axonen is dat ze onvertakt en elke R8 axon gescheiden. Een eenvoudige geïsoleerde neuron zoals deze wordt aanbevolen voor deze toepassingen aangezien het noodzakelijk is om de juiste oppervlakte van het neuron definiëren. Bovendien, dit helpt te ontdoen van aspecifieke puncta en oppervlakken uit andere neuronen. Een beperking van deze benadering is echter de diepte van de z projectie. De signaalintensiteit van puncta krijgt minder diepere lagen van de z stack. Het voorbereiden van transparante hersenen door weefsel opruimmethoden zo'n SeeDB2 29 zou kunnen helpen om deze beperking te overwinnen en laat beeldvorming van een duidelijke gestippelde signaal nog dieper in de hersenen.
onze protocol kan mogelijk worden gebruikt voor het analyseren van de synaptische organisatie op een nano-schaal en met live-imaging. De combinatie van super-resolutie beeldvorming (bv, gestimuleerde emissie uitputting (STED) microscopie, stochastische optische reconstructie microscopie (STORM), foto geactiveerde lokalisatie microscopie (PALM), gestructureerde verlichting microscopie (SIM) etc.) met theoretische modellen heeft geavanceerde ons begrip van de structuur en moleculaire dynamica van synapsen. Bijvoorbeeld, de organisatie van nanoscopische Brp werd geëvalueerd één-moleculaire resolutie met superresolutie imaging door directe STORM (d STORM) en Drosophila NMJ 30. Ons protocol werd aangepast voor de kwantificering van de dynamiek van een enkele actieve zone molecuul op een presynaptische actieve zone en een enkele postsynaptische receptor in een postsynaptische zone om verder te begrijpen hoe synapsen worden geregeld op een mechanistische niveau. Bovendien zouden ons protocol worden gebruikt voor het visualiseren moleculairebeweging bij synapsen in levende dieren. In feite kan Brp-GFP worden gevisualiseerd zonder te vertrouwen op immunokleuring. Zo heeft presynaptische ontwikkeling R8 axons zijn afgebeeld in levende dieren met twee-foton microscopie 15. Het is mogelijk om het signaal punctata actieve zone bestanddelen in levende dieren volgen door het detecteren en analyseren van vlekken op verschillende tijdstippen omdat de oppervlakken en posities van specifieke neuronen zijn gedefinieerd in ons protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
We zijn dankbaar voor T. Stürner voor nuttige correcties, discussies en commentaar op het manuscript; SL Zipursky voor het verstrekken van vliegen voorraden; M Schölling voor het uitvoeren van beeldverwerking. Een deel van de beeldanalyse werd uitgevoerd bij A. Kakita het lab. Dit werk werd ondersteund door Alexander von Humboldt Foundation en JSPS Fellowships voor onderzoek in het buitenland (AS), JSPS Fellows (SH-S.), Grant-In- Steun voor start-up (24800024), inzake innovatieve Areas (25.110.713), Mochida, Takeda, Inamori, Daiichi-Sankyo, Toray Foundations (TS), DZNE basisfinanciering (GT) en DZNE Light Microscopy Facility (CM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vial | Hightech, Japan | MKC-20 | |
| Plug | Thermo Fisher Sciehtific, USA | AS-275 | |
| Customized transparent rack made of acrylic resin | Shin-Shin Corporation, Japan | a height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step | |
| Cool incubator | MITSUBISHI ELECTRIC, Japan | CN-40A | |
| LED panel | MISUMI, Japan | LEDXC170-W | |
| Digital light meter | CEM | DT-1301 | |
| Fly pad | Tokken, Japan | TK-HA03-S | |
| Petri dish (35 x 10 mm) | Greiner Bio-One International, Germany | 627102 | |
| PBS tablet | Takara, Japan | T900 | |
| Triton X-100 | Wako, Japan | 160-24751 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 1.5 mL tube | Sarstedt, Germany | A. 152X | |
| Formaldehyde 16% | NEM, Japan | 3152 | |
| Pipetman P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P-2 | Gilson | F144801 | |
| anti-chaoptin antibody | DSHB | 24B10 | |
| Alexa568-conjugated anti-mouse antibody | Life Technologies | A-11031 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Microscope slide (76 x 26 mm) | Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Germany | ||
| Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm) | Zeiss, Germany | 474030-9000-000 | |
| Industrial Microscopes | Olympus, Japan | SZ61-C-SET | |
| Stereo Microscope Lighting | Olympus, Japan | KL 1600 LED | |
| confocal microscopy | Zeiss, Germany | LSM780 | |
| Imaris | Bitplane, Switzerland | Version 7.6.4 or above | |
| Matlab | The MathWorks, Inc., USA | ||
| Excel for Mac | Microsoft |
References
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Synaptic Vesicle Pools and Dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (8), (2012).
- Couteaux, R., Pecot-Dechavassine, M. [Synaptic vesicles and pouches at the level of "active zones" of the neuromuscular junction]. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 271 (25), 2346-2349 (1970).
- Schoch, S., Gundelfinger, E. D. Molecular organization of the presynaptic active zone. Cell and Tissue Research. 326 (2), 379-391 (2006).
- Sudhof, T. C. The Presynaptic Active Zone. Neuron. 75 (1), 11-25 (2012).
- Owald, D., Sigrist, S. J. Assembling the presynaptic active zone. Curr Opin Neurobiol. 19 (3), 311-318 (2009).
- Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive remodeling of the presynaptic cytomatrix upon homeostatic adaptation to network activity silencing. J Neurosci. 31 (28), 10189-10200 (2011).
- Matz, J., Gilyan, A., Kolar, A., McCarvill, T., Krueger, S. R. Rapid structural alterations of the active zone lead to sustained changes in neurotransmitter release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (19), 8836-8841 (2010).
- Spangler, S. A., et al. Liprin-alpha2 promotes the presynaptic recruitment and turnover of RIM1/CASK to facilitate synaptic transmission. J Cell Biol. 201 (6), 915-928 (2013).
- Sugie, A., et al. Molecular Remodeling of the Presynaptic Active Zone of Drosophila Photoreceptors via Activity-Dependent Feedback. Neuron. 86 (3), 711-725 (2015).
- Sigrist, S. J., Schmitz, D. Structural and functional plasticity of the cytoplasmic active zone. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 144-150 (2011).
- Kittel, R. J., et al. Active zone assembly and synaptic release. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 5), 939-941 (2006).
- Kittel, R. J., et al. Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release. Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).
- Hallermann, S., et al. Naked dense bodies provoke depression. J Neurosci. 30 (43), 14340-14345 (2010).
- Wagh, D. A., et al. Bruchpilot, a protein with homology to ELKS/CAST, is required for structural integrity and function of synaptic active zones in Drosophila. Neuron. 49 (6), 833-844 (2006).
- Chen, Y., et al. Cell-type-specific labeling of synapses in vivo through synaptic tagging with recombination. Neuron. 81 (2), 280-293 (2014).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (4), 490-493 (2012).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number. J Vis Exp. (45), (2010).
- Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. J Neurosci Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
- Danielson, E., Lee, S. H. SynPAnal: software for rapid quantification of the density and intensity of protein puncta from fluorescence microscopy images of neurons. PLoS One. 9 (12), e115298 (2014).
- Sanders, J., Singh, A., Sterne, G., Ye, B., Zhou, J. Learning-guided automatic three dimensional synapse quantification for drosophila neurons. BMC Bioinformatics. 16, 177 (2015).
- Peng, H., Ruan, Z., Atasoy, D., Sternson, S. Automatic reconstruction of 3D neuron structures using a graph-augmented deformable model. Bioinformatics. 26 (12), i38-i46 (2010).
- Sturt, B. L., Bamber, B. A. Automated quantification of synaptic fluorescence in C. elegans. J Vis Exp. (66), (2012).
- Kremer, M. C., et al. Structural long-term changes at mushroom body input synapses. Curr Biol. 20 (21), 1938-1944 (2010).
- Mosca, T. J., Luo, L. Synaptic organization of the Drosophila antennal lobe and its regulation by the Teneurins. Elife. 3, e03726 (2014).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
- Fischbach, K. F., Dittrich, A. P. M. The Optic Lobe of Drosophila-Melanogaster .1 A Golgi Analysis of Wild-Type Structure. Cell and Tissue Research. 258 (3), 441-475 (1989).
- Berger-Muller, S., et al. Assessing the role of cell-surface molecules in central synaptogenesis in the Drosophila visual system. PLoS One. 8 (12), e83732 (2013).
- Fouquet, W., et al. Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot. J Cell Biol. 186 (1), 129-145 (2009).
- Ke, M. T., et al. Super-Resolution Mapping of Neuronal Circuitry With an Index-Optimized Clearing Agent. Cell Rep. 14 (11), 2718-2732 (2016).
- Ehmann, N., et al. Quantitative super-resolution imaging of Bruchpilot distinguishes active zone states. Nat Commun. 5, 4650 (2014).
