Summary
כאן אנו מראים כיצד לכמת את מספר הפריסה המרחבית של אזורי הפעילות הסינפטית קולטני האור תסיסנית, הדגיש עם סמן מולקולרי מקודדים גנטית, אפנון שלהם לאחר חשיפה ממושכת לאור.
Abstract
מערכת העצבים יש את היכולת המדהימה להסתגל ולהגיב לגירויים שונים. התאמה עצבית זו מושגת בעיקר באמצעות פלסטיות ברמה הסינפטי. האיזור הפעיל (AZ) הוא האזור על הממברנה presynaptic שמתווך שחרור הנוירוטרנסמיטר והוא מורכב מאוסף צפוף של חלבוני פיגום. AZS של תסיסנית (דרוזופילה) קולטני אור לעבור שיפוץ מולקולרי לאחר חשיפה ממושכת לאור הסביבה טבעי. כך רמת הפעילות עצבית יכולה לארגן מחדש את ההרכב המולקולרי של AZ ולתרום הסדרת הפלט הפונקציונלי.
החל מ בהכנת הגדרת חשיפה לאור על אימונוהיסטוכימיה, פרוטוקול זה מפרט כיצד לכמת את המספר, את הפריסה המרחבית, ורמת delocalization של מולקולות הסינפטי AZS ב קולטני האור תסיסנית. באמצעות ניתוח תמונה software, אשכולות של רכיב AZ-התמזג GFP Bruchpilot זוהו עבור כל קולטי אור R8 מסוף האקסון (R8). זוהו כתמי Bruchpilot חולקו באופן אוטומטי אקסונים R8 פרט. כדי לחשב את חלוקת תדר נקודה לאורך האקסון, יישמנו תוסף תוכנה מותאם אישית. כל סטארט-נקודת הקצה של האקסון הוגדרו באופן ידני ואת המיקום של כל נקודה ונקודת Bruchpilot היה מוקרן על הקו המחבר בין התחלת נקודת סיום. מלבד מספר אשכולות Bruchpilot, אנחנו גם לכמת את רמת delocalization של Bruchpilot-GFP בתוך אשכולות. מדידות אלה משקפים בפירוט את הדינמיקה הסינפטי נפתרה מרחבית ב נוירון בודד בתנאים סביבתיים שונים לגירויים.
Introduction
האפנון של פונקציה סינפטי תורם ליכולת המדהימה של מערכת העצבים להגיב בדיוק או להסתגל לשינוי לגירויים סביבתיים. התאמת הסתברות שחרור שלפוחית presynaptic היא אחת דרכים של שליטת כוח הסינפטי 1. שחרור שלפוחית סינפטית מתקיים האיזור הפעיל (AZ), אזור מיוחד של הקרום presynaptic 2. AZ מאופיין קסטה של חלבונים ספציפיים 3, 4. רוב החלבונים תורמים הרכבת AZ הם שמורים ביותר נמטודות, חרקים ויונקים 5. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי רמת הפעילות העצבית מסדיר את ההרכב המולקולרי של AZ, אשר בתורו תורם הסדרת פלט פונקציונלי הן במבחנה in vivo 6, 7,> 8. מצאנו בעבר כי AZS קולטי האור לעבור שיפוץ מולקולרי תסיסנית לאחר חשיפה ממושכת לאור 9 הסביבה טבעית. במצב זה, צפינו שמספר Bruchpilot (BRP) -positive AZS הופחת אקסונים קולטי האור.
החלבונים המשפחה BRP / CAST / Elks הם אבני הבניין הבסיסיות של AZS סינפסות חוליות ונטול עצמות 10. מוטנטים תסיסנית BRP, עורר שחרור שלפוחית מדוכא 11, 12. 17 שאריות חומצת אמינו C- מסוף של BRP חיוניים אשכולות שלפוחית סינפטית בצומת Neuromuscular תסיסנית (NMJ) 13, 14. מחקרים אלה הוכיחו את תפקידה המרכזי של מולקולה זו בארגון AZ ותפקוד. עם כלי גנטי שפותח לאחרונה, Synaptic תיוג עם רקומבינציה (כוכב), BRPניתן להבחין in vivo ב סוגי תאים מסוימים, ברמות ביטוי אנדוגני ברזולוציה סינפסה אחת 15. כלי זה עושה את זה אפשרי להעריך את הדינמיקה אנדוגני של סינפסות כמותית במערכת העצבים המרכזית המורכבת.
היו מספר מחקרים כולל quantifications סינפסה על בסיס נתונים המתקבלים מן מיקרוסקופיה confocal. שינויי Synaptic הוערכו על ידי מדידת האורך, באזור, ההיקף, הצפיפות וספירת המספר המבוססים על יישומי תוכנה מתוחכמים. למשל, ImageJ החופשית מספקת שיטת כימות לאזור הסינפטי הכולל ואמצעי צפיפות הסינפטי ב תסיסנית NMJ 16. מספר האתרים colocalization של סמנים טרום postsynaptic כבר לכמת באמצעות התוסף "Analyzer puncta" זמין על פלטפורמת ImageJ תוכנה 17. לחלופין, א-נקוב רבתכנית מבוססת סביבת מחשוב המספרית adigm, גלאי סינפסה (synd), יכולה לעקוב אחר דנדריטים של נוירונים שכותרתו אוטומטית עם סמן פלואורסצנטי, ולאחר מכן מכמתת את רמות החלבון הסינפטי כפונקציה של מרחק מגוף התא 18. תוכנת Synaptic puncta הניתוח (SynPAnal), תוכננה עבור הניתוח המהיר של תמונות 2D של נוירונים רכשו במיקרוסקופ confocal או פלואורסצנטי. התפקיד העיקרי של תוכנה זו היא כימות אוטומטית ומהירה של צפיפות ועוצמת חלבון puncta 19. לאחרונה, אלגוריתם זיהוי סינפסה אוטומטית מבוססי למידה נוצר כימות של מספר הסינפטי ב -3 D 20, ניצול של 3D ויזואליזציה בסיוע ניתוח (Vaa3D) תוכנה 21.
תוכנת ניתוח תמונה מסחרית הם גם כלים רבים עצמה עבור quantifications הסינפטי. למשל, fluorescentlyקולטני הנוירוטרנסמיטר שכותרתו או רכיב AZ presynaptic כבר לכמת בשלושה ממדים עם ברזולוציה יחיד סינפסה ב C. elegans 22 או מערכת חוש הריח תסיסנית 23, 24, המאפשר מאות סינפסות להתאפיין במהירות בתוך מדגם יחיד.
כאן, אנו מציגים שיטה ידי תוכנת ניתוח תמונה אישית תוספת מיושמת בסביבת מחשוב מספרית רבה הפרדיגמה המאפשרת לנתח חצי אוטומטית מגוון רחב של אספקטי AZS, לרבות מספרם, הפצה ברמת ההעשרה של רכיבים מולקולריים במדריך המפות. לפיכך, ניתוח מורכב זה אפשר לנו להעריך את הדינמיקה של רכיבים סינפטיים במסופי האקסון בתנאים סביבתיים שונים. חקרנו את שפעת חשיפת אור על סינפסות הפלט של קולטני אור זבוב בוגר. ההליך מתבצע בשלושה שלבים: 1)לקראת חשיפה לאור, 2) לנתיחה, אימונוהיסטוכימיה ו הדמיה confocal, ו -3) ניתוח התמונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוצדורות המתוארות בפרוטוקול זה כרוך עובדים אך ורק עם תסיסנית ואינם כפופות לחוקים רווחים בעלי חיים בגרמניה וביפן.
1. תנאי חשיפה לאור
- הכן זבובים שנושאים-flippase sensless (sens-FLP) ו bruchpilot-FRT-STOP-FRT-GFP (BRP-FSF-GFP) 15 המאפשר הדמיה BRP-GFP בנוירונים R8 קולטי האור (R8s). BRP קידוד מוקד גנומית בתוך כרומוזום בקטריאלי מלאכותי (BAC) שונה כדי ליצור מבנה זה BRP-FSF-GFP. בשנת הזבובים הנושאים BAC השונה זה הביטוי של BRP-GFP נמצא תחת השליטה של הרצפים רגולטוריים אנדוגני, אבל מוגבל קולטני אור R8 לאחר הסרה בתיווך sensless-flippase של קלטת FRT-STOP-FRT 15. שים לב sens-FLP לעתים רחוקות מבטא flippase ב R7s.
- שמור על זבובי li h 12ght / 12 שעות חושך מחזור (LD) במהירות של 25 ° C משלב הזחל עד eclosion (איור 1 א).
- אסוף הזבובים 6 - 0 שעות לאחר eclosion ולהכניס אותם לתוך בקבוקון חדש המכיל אוכל לטוס.
- הגדר את צלוחיות לתוך מתלה שקוף עשוי שרף אקרילי עם שלושה שלבים (לגובה של 41 ס"מ, בסיס של 21 ס"מ, עובי של 4 ס"מ וגובה של 13 ס"מ לכל שלב) (איור 1 ב).
- התאם את המרחק בין המתלה ולוח LED לספק את התאורה בעצמה ממוצעת של 1,000 לוקס באמצעות מד אור דיגיטלי (התרשים 1C).
- שמור על זבובים 1 - 3 ד תחת אחד מהתנאים הבאים: בחשכה מתמדת (DD), 12 אור H / 12 שעות חושך מחזור (LD), או אור קבוע (LL) של 25 מעלות צלזיוס חממה קטנה (איורים 1 א ו 1C).
2. Dissection, אימונוהיסטוכימיה והדמיה
- לנתח מוחות זבוב עם מלקחיים, לתקן אותם עם 4% FOrmaldehyde ו immunostain עם הנוגדן הראשוני נגד Chaoptin (1:50) ו נוגדן שני להדמיה של קולטני האור המבוסס על פרוצדורות קודמות 25. בקצרה:
- כן 0.1% Triton X-100 ב PBS (0.1% PBT). פתרון זה משמש כדי לשפר חדירה לרקמות נוגדן.
- להרדים זבובים על כרית CO 2, למיין את הגנוטיפ הנכון ולהעבירם צלחת פטרי המלאה 0.1% PBT.
- היצמד המלקחיים מתחת החוטם ולמשוך את העיניים ימינה ושמאלה בהתאמה עם המלקחיים האחרים.
- הסר חוטם ואת קנה הנשימה המחובר למוח.
- מעבירים את המוח עם מלקחיים לתוך צינור 1.5 מ"ל המכיל 150 μL של PBT 0.1% ב RT.
- בתוך 10 דקות חוזרים מ 2.1.3 - 2.1.5 להשיג מוחות רבים ככל האפשר.
- הוסף 50 μL של פורמלדהיד 16% לתוך הצינור ומערבבים ידי pipetting.
- דגירת המוח מקבע ב חדרהטמפרטורה במשך 50 דקות.
- לשטוף שלוש פעמים עם 200 μL של 0.1% PBT עם micropipette, שם לב לעזוב את המוח בצינור.
- לאחר לשטוף האחרון, להסיר את PBT 0.1% ולהוסיף פתרון הנוגדן הראשוני, מוכן כדלקמן: להוסיף 196 μL של 0.3% PBT (0.3% Triton X-100 ב PBS) 4 μL של נוגדנים נגד Chaoptin (דילול סופי 1 : 50) להדמיה של קולטני אור.
- דגירת המוח בפתרון הנוגדן הראשוני ב 4 ° CO / N.
- 3x לשטוף עם 200 μL של PBT 0.1% עם micropipette.
- לאחר לשטוף האחרון, להסיר את PBT 0.1% ולהוסיף 200 μL של PBT 0.3% המכיל נוגדנים משני.
- דגירה זה בחושך ב 4 ° CO / N.
- לשטוף שלוש פעמים עם 200 μL של PBT 0.1% עם micropipette.
- עבור הרכבה, לשים שתי טיפות קטנות (2 μL כל אחת) של הרכבה בינונית עם micropipette במרכז של המיקרוסקופ שקופית בכ 2 ס"מ distaNCE אחד מהשני.
- מניחים שתי coverslips, אחד על כל טיפה ולהשאיר רווח צר בין coverslips של כ 0.2 מ"מ.
- מניח 15 μL של מדיום גובר על גבי coverslip ומוסיף את המוח עם micropipette לתוך המדיום הגובר.
- תחת מיקרוסקופ לנתח, מקם את המוח עם הצד הגחוני למעלה אל במרווח הצר שבין שני coverslips (איור 2).
- מניחים coverslip על גבי וסוגרים את הקצוות של coverslip באמצעות לק ברור לתקן את הדגימה (איור 2).
- להשיג תמונות של המוח באמצעות מיקרוסקופ confocal. השתמש עדשה אובייקטיבית טבילת 63X שמן (1.4 NA) ו זום דיגיטלי 2.6X. צור יותר מ -20 חלקים אופטיים של לשד גנגליון השני האופטי עם גודל צעד של 0.5 מיקרומטר.
דור 3. של הכתמים, אובייקטי Surface, Start-נקודות-נקודות קצה
- כדי לכמת את המספר, distribution ורמת delocalization של puncta BRP-GFP, לפתוח את המחסנית מתקבלת על ידי מיקרוסקופיה confocal בתוכנות ניתוח תמונה ולגבש מחדש תמונות 3D (איור 3 א). ראוי לציין, כי הצעד במחקר זה בוצע עם Imaris.
- זהה את puncta BRP-GFP על ידי מודול זיהוי נקודה עבור כל מסוף האקסון R8.
- בחר "הוסף כתמים חדשים".
- בחר "מגזר רק אזור של אינטרס" בהגדרות האלגוריתם. בחר מסוף האקסון R8 ב לשד באופן ידני.
- בחרו בערוץ מקור האות BRP-GFP.
הערה: אקסונים קולטי האור R7 ו R8 היו immunolabeled עם (איור 3 א) נגד Chaoptin. רק R8, אם כי, מכיל puncta BRP-GFP ויכול ובכך להבחין בקלות (איור 3 א). יתר על כן, נקודת הסיום של R8 יכול להיות מזוהה על ידי הדילול של אקסונים אנטי החיוביים-Chaoptin בנקודת הכניסה לתוך השכבה לשד M3. - הגדר את t בקוטר XY מוערךo 0.35 מיקרומטר ולטמן "חיסור רקע" באיתור המקום.
- בחר "איכות" בסוג לסנן ולסנן באופן אוטומטי. מכן לחץ על סיום.
- חזור מ 3.2.1 T- 3.2.5 עבור אקסונים R אחרים (איור 3 ב).
- כדי למדוד את רמת delocalization של BRP-GFP אקסונים R8, ליצור אובייקטים משטח עם הפונקציה "Surface" לכל האקסון (איור 3 ג).
- בחר "הוסף משטחים חדשים".
- בחר "מגזר רק אזור של אינטרס" בהגדרות האלגוריתם. ואז לבחור מסופי האקסון R8 ב לשד באופן ידני.
- בחרו בערוץ המקור של קולטני האור.
- בדוק את "חלקה".
- בחר "אינטנסיביות מוחלטת" הסף.
- בדוק "הפעל". "זרע נקודות קוטר" הוא 0.5 מיקרומטר.
- סוג "איכות" מסנן בחר "מספר ווקסלים", ולאחר מכן לסנן אוטומציהקאלי.
- יש להקליק על "ערוך" ולמחוק את החלקים של משטחים שנוצרו על אקסונים אחרים שאינם מעניינים.
- חזור מ 3.3.1 - 3.3.8 עבור אקסונים R אחרים (איור 3 ג). הערה כמה חפצי משטח נקטעו בגלל הרזון ואת האות החלשה קולטני אור ב שכבת M2, אבל הם עדיין נחשבו כאובייקט יחיד מהתחילה ועד לנקודות קצה.
- כדי לזהות את חלוקת puncta BRP-GFP לאורך כל נוירון neuropil המוארך, להגדיר את נקודת ההתחלה ואת נקודת הסיום עם נקודת פונקציה מדידה (איור 3D).
- בחר "הוסף נקודות מדידה חדשות". לאחר מכן בחר "ערוך" ובחר "Surface של אובייקט" כדי לחתוך עם החלק העליון של אובייקטי השטח.
- שים נקודות מדידה על גבי חפצי שטח של אקסונים R בשכבת M1 כדי. אלה מוגדרים כיום-נקודות התחלה (איור 3D).
- בחר "הוסף נקודות מדידה חדשות".לאחר מכן בחר "ערוך" ובחר "Surface של אובייקט" כדי לחתוך עם התחתונים של אובייקטי השטח.
- שים נקודות מדידה על התחתונים של אובייקטי השטח של אקסונים R בשכבת M3 כדי. אלה מוגדרים כיום נקודות קצה (איור 3D).
- כדי להפחית את אות הרקע מערוץ GFP, ליצור אובייקטים השטח, כתמים, סטארט-נקודות נקודות קצה עבור שני אקסונים R בשכבה M6 (איור 3E).
- בחר "הוסף משטחים חדשים".
- בחר "מגזר רק אזור של אינטרס" בהגדרות האלגוריתם. לאחר מכן בחר מסוף האקסון R7 בין שכבת M5 ו M6 ידני.
- בחרו בערוץ מקור קולטי האור.
- בדוק את "חלקה".
- בחר "אינטנסיביות מוחלטת" הסף.
- בחר סוג מסנן "איכות" ו "מספר ווקסלים", ואז לסנן באופן אוטומטי.
- בחר באפשרות "הוסף כתמים חדשים";.
- בחר "דלג על יצירה אוטומטית, לערוך באופן ידני".
- בחר "מרכז של אובייקט" ולהוסיף נקודה באזור הפנימי של האובייקט משטח המופק 3.5.1 - 3.5.6.
- חזור מ 3.5.1 - 3.5.9 לעוד מסוף האקסון R7.
- בחר "הוסף נקודות מדידה חדשות". לאחר מכן בחר "ערוך" ולשים נקודות מדידה על גבי שני אובייקטי השטח של קצה האקסון מסוף R7 בשכבת M6. אלה הם עכשיו מוגדר-נקודות התחלה.
- בחר "הוסף נקודות מדידה חדשות". לאחר מכן בחר "ערוך" ולשים נקודות מדידה על החלק התחתון של שני אובייקטי השטח של קצה האקסון מסוף R7 בשכבת M6. אלה מוגדרים כיום נקודות קצה (איור 3E).
4. חישוב מספר הכתמים, הפצה של תדר ספוט ודרג העשרת BRP-GFP עם תמונה אישית תוכנת ניתוח נתונים
- העתק את הקובץ"XtquantifySynapseSNR.m" ואת התיקייה "פונקציות" לתוך תיקיית matlab XT Imaris. ראוי לציין, כי החישוב במחקר זה בוצע באמצעות תוסף אישית מיושם ב- Matlab. הורד את התוסף מהאתר ( https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo ).
- פתח במערך עם n נקודות, n משטחים ו -2 חפצי נקודת מדידה, כל נקודות מדידת n המכילות (שהוכנו 3.1 - 3.4). מטרת נקודת המדידה הראשונה מגדירה את מיקומי ההתחלה עבור כל האקסונים. מטרת נקודת המדידה השנייה מגדירה את מיקום הסיום של כל האקסונים. שני אובייקטים נקודת המדידה צריכים יש את אותו מספר של נקודות המדידה (כלומר מספר אקסונים).
- Execute עיבוד תמונה >> CUSTOM> atsushis זיהוי סינפסה Vs 6.
- בדוק metadata ולשנות בגדלי פיקסל תוכנת ניתוח תמונה במקרה זה אינו נכון.
- בחר ערוץ עבור Performance של הניתוח העוצם אזורים כתמים ואזורי cytoplasmic (הערוץ עם BRP-GFP).
- הגדר את שם הקובץ לייצוא התוצאות.
- הגדר את מספר פחי ואורך האקסון באחוזים. הזן את מספר הפחים כמו "10" ומגוון פחים כמו "100%" (איורי 4 א ו -4).
- הגדר את האזורים של הכתמים באזורים ציטופלסמית האחרים לניתוח delocalization BRP-GFP. זן כתמי רדיוס כמו "0.35 מיקרומטר" ורוחב של השטח המקיף אותה כמו "50 מיקרומטר". רדיוס כתמים מגדיר באזור לאות GFP puncta (0.35 מיקרומטר קוטר, התרכזו פונקטום אחד). רוחב השטח המקיף אותה מגדיר באזור לאות GFP באזור cytoplasmic (50 מיקרומטר קוטר, מרוכז על פונקטום, אבל כולל רק R8 ולמעט בכל תחומי נקודה בציטופלסמה) (תרשימים 4 א ו 4C).
- חכה עד שכל מסכות נוירון מעובדותוייצא כקובצי PDF (איורים 4 ב ו 4C) ושולחן CSV לניתוח נוסף בגיליון אלקטרוני. טבלת CSV הכוללת את מספר הנקודות, את עוצמת האות הממוצעת של "שטח cytoplasmic" ואת עוצמת האות המרבית "נקודה" בכל bin עבור כל האקסונים R8.
- פתח במערך ערוך 3.5 לגריעת אות הרקע.
- לבצע עיבוד תמונה כמו נפרשים מימי 4.3 - 4.9.
- חשב את הממוצע של מספר הכולל והחלוקה של puncta BRP-GFP בתוך (4D דמויות 4E) גיליון אלקטרוני.
- חישוב הממוצע של delocalization של האות BRP-GFP בגיליון אלקטרוני על ידי היחס בין עוצמת הממוצע של "שטח cytoplasmic" מחולק העוצמה המקסימלית של "נקודה" מופחתים מעוצמת הממוצע אות הרקע (איור 4F) .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
העין המתחמת של תסיסנית מורכבת ~ 780 האומטידיה, שכל אחת מהן מכיל שמונה סוגים של קולטני אור (R1-8). R7 ו R8 פרויקט האקסונים שלהם אל גנגליון השני האופטי, הלשד, שם הם יוצרים סינפסות בשכבות M6 ו M3, בהתאמה 26. כדי לחקור את ההשפעה של חשיפה ממושכת אור על ההרכב המולקולרי של אזורי R8 קולטי האור פעיל, לקחנו את היתרון של שיטת הכוכבים 15. רמות ביטוי אנדוגני של BRP תויגו fluorescently ידי מרפרף את קודון עצירה ב BRP-FSF-GFP עם flippase לידי ביטוי קולטני האור R8 נגזר sens-FLP. הזבובים הוחזקו במשך 1 - 3 ד לאחר eclosion ב LL, LD או DD לאותו פרק זמן של 25 מעלות צלזיוס (איור 1 א). כדי לחשוף את הזבובים 1,000 Lux אור, הזבובים היו התקבעו מתל שרף אקרילי (האיור 1B) והמשיכו באותו המרחקממקור אור LED חממה קטנה (איור 1 ג).
לאחר immunostaining, המוח גזור הונחו לתוך הפער הצר שבין שני coverslips בשקופית מיקרוסקופ עם הצד הגחוני של המוח כלפי מעלה להדמיה וכימות של puncta BRP-GFP (איור 2). האות BRP-GFP וכתוצאה מקומי puncta נבדלת בתוך R8 ב (איור 3 א) לשד.
כדי לספור את המספר ולמדוד את חלוקת puncta BRP-GFP, וכדי להעריך את רמת delocalization של אות BRP-GFP ב R8s, תוסף תוכנה לניתוח תמונה אישית פותח בסביבת מחשוב מספרית רב הפרדיגמה 9, 27. בהתחלה, puncta אותרו על ידי פונקציית זיהוי מקום לכל R8 (איור 3 ב). בהמשך לכך, שטחהים של כל R8 נוצר עבור הערכת רמת delocalization (איור 3 ג). לבסוף, הגדרנו סטארט-נקודות נקודות קצה בראש שכבת M1 והחלק התחתון של שכבת M3 על כל קולטי האור בהתאמה למדוד את חלוקת AZ (איור 3D). אובייקטים Surface, כתמים, סטארט-נקודות נקודות קצה עבור שני מסופי האקסון R7 בשכבה M6 נוצרו גם כדי להפחית את אות הרקע מערוץ GFP (איור 3E). התוצאות של המספר (האיור 4D), חלוקה (איורי 4 א, 4 ב ו 4E) ורמת delocalization (איורים 4 א, 4C ו 4F) מחושבות באופן אוטומטי על ידי מנהג תוספת בכתב בסביבת מחשוב מספרית רבה הפרדיגמה . מצאנו כי מספר puncta דיסקרטית BRP הופחת משמעותית קולטני האור R8 של זבובים לפי תנאי האריזה LL (4D דמויות 4E). לְהוֹסִיףitionally, מצאנו כי סינפסות R8 חולקו לכל אורך פיר axonal מן M1 לשכבה M3, אבל הצפיפות הייתה גבוהה בשכבות M1 ו- M3 (איור 4E). רמת delocalization של BRP-GFP נותר ללא שינוי בכל תנאי האור (איור 4F). זאת בניגוד ל לוקליזציה של fluorescently מתויג גרסה קצרה של BRP (BRP-קצר-דובדבן) 28, אשר, כפי שכבר דיווחנו בעבר 9 הופך מתפזרת בבירור LL (איור 4G). הצענו את האות BRP-קצר-דובדבן delocalized עשויים להיות קשורים עיבוד הולם של שבר BRP-קצר לאחר פירוק מן AZ 9. בין חלבוני AZ בדוקים אחרים, fluorescently מתויג DLiprin-α או תסיסנית רים חלבון מחייב (DRBP) בונה להציג צמצום מספר puncta וכן delocalization ברור LL. לעומת זאת, fluorescently מתויג Dsyd-1 או קקופוניה (CAC) לעשות לא להציג אות cytoplasmic מוגברת גם לאחר LL (איור 4G). לפיכך, מדידה שיטתית אם האות הופך ציטופלסמית עשויים להיות רלוונטי גם להבין את העיבוד של חלבוני AZ.
איור 1: הכנת תנאי חשיפה עוצמת אור מוגדר. (א) פרוטוקולים חשיפה לאור לאחר eclosion. DD, חושך רציף; LD, 12 שעות אור / 12 כהה h; LL, חשיפה מתמדת לאור. מוח לעוף נותחו במועדים המצוינים בסוגריים (מעובד מתוך פרסום קודם 9). בקבוקי (B) מיושרים מתלה שקוף אקריליק אישית. (ג) מתל אקריליק ושני לוחות LED מוכנסים בתוך חממה קטנה והותאמנו לחשוף את הזבובים על עוצמת אור של 1,000 לוקס.s / ftp_upload / 55,176 / 55176fig1large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: הכנת הדגימה. (א) הכנות מוח רכובים פריטים. (B - D) ציור סכמטי של ההכנות. (C, D) בחתכים של ההכנות. הצד הגחוני של המוח הוא עד (ג) בין coverslips (D). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: הדור של כתמים, אובייקטים ועיבוד משטחים נקודות מדידה.
איור 4: כימות של המספר, ההפצה Delocalization הרמה של BRP-GFP puncta. (א) ציור סכמטי של הליך מנוצל כדי למדוד את רמת האות BRP-GFP delocalized ב R8. Puncta BRP-GFP מזוהים ושני אזורים מוגדרים סביבם: באזור "נקודה" ואזור "cytoplasmic". הקו המחבר סטארט נקודות קצה מתחלק ב 10 מחיצות. (B, C) פלט מן תוסף תוכנה לניתוח תמונה אישית בכתב בסביבת מחשוב מספרית רבה פרדיגמה. כל פונקטום BRP-GFP קואורדינטות צפוי קו המייצג את נוירון מ-פו ההתחלהint לסיים נקודות (B). סרגל קנה מידה, 5 מיקרומטר. Puncta BRP-GFP מזוהים ושני אזורים מוגדרים סביבם: באזור "נקודה" ואזור "cytoplasmic" (C), כמו schematized ב (א). (D - F) גרפים בר להשוות את המספר הכולל של puncta (D), תפוצתם (E) ורמת delocalization של BRP-GFP לכל האקסון R8 (F) ב DD (83 אקסונים / 7 המוח), LD (107 אקסונים / 5 המוח) ול"ל (226 אקסונים / 15 מוחות). (G) גרפים בר השוואה של רמת delocalization של דובדבן BRP-קצר LD (74 אקסונים / 7 המוח) ול"ל (70 אקסונים / 5 המוח), GFP-DLiprin-α ב LD (67 אקסונים / 7 המוח) ול"ל (52 אקסונים / 6 המוח), GFP-DRBP ב LD (70 אקסונים / 7 המוח) ול"ל (83 אקסונים / 6 המוח), GFP-Dsyd-1 ב LD (48 אקסונים / 5 המוח) ול"ל (69 אקסונים / 7 מוח), ו CAC-GFP ב LD (31 אקסונים / 5 מוח) ול"ל (27 אקסונים / 5 מוח). *** P <0.0001, ** p <0.001, * p <0.0 5, ns p> 0.05; מבחן t מזווג עם התיקון של וולש שני זנב. שגיאת עמודות מציגות שגיאת התקן של הממוצע. הציור הסכמטי ב (א) ואת הנתונים (ד), (ה) ו- (ז) מעובדים מנתונים פרסום קודם 9. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
וידאו משלימה: תיאור של עיבוד הנתונים נערכים עם תוסף Imaris "סינפסה Trafo". דיון של עיבוד נתונים. סרטון זה כולל הרצאה קצרה על מנת להמחיש את לתאם מדרגות עיבוד טרנספורמציה ונתונים שבוצעו על ידי תוסף Imaris "synapse_trafo".5176 / theory_data_analysis_withaudio.avi "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר זה, הראינו כיצד להכין את תנאי התאורה לחשוף זבובים אל עוצמת אור שווה. אנחנו לכמת לא רק את המספר של puncta סמן הסינפטי אלא גם יכולים מרחבית לפתור את הצפיפות של סינפסות לאורך אקסונים למדוד את רמת delocalization של חלבון הסמן באזורי cytoplasmic. הערכות שלוש אלה מאפשרים לנו להעריך את הפרטים של דינמיקה הסינפטי ברמת נוירון הבודדה בתנאים סביבתיים שונים. הפרוטוקול שלנו יכול להיות מותאם חלבונים סינפטיים שונים אלא גם לכל נתונים המכילים אותות punctate.
שלב קריטי בתוך הפרוטוקול הוא ההרכבה של המוח. קולטני אור תסיסנית להקרין האקסונים שלהם אל לשד גנגליון השני האופטי. האקסון קולטי אור כל ניתן לסרוק בצורה ישירה אם המוח הרכוב הונח כראוי בשקופית מיקרוסקופ. ההרכבה הנכונה גם עושה את הבחירה של קולטני אור עם Softwa ניתוח תמונהמחדש פונקציות קלות. יש באזור קולטי אור כל אשר ייבחר ידני לספירה במספר וברמת delocalization של puncta. סטארט נקודות קצה הם גם שנבחרו באופן ידני. תכשירים אלה דורשים זמן רב יחסית עד אחד יכול להמשיך כימות. היתרון של אקסונים R8 הוא שהם unbranched וכל האקסון R8 הוא נפרד. תא עצב בודד פשוט כמו זה מומלץ עבור יישומים אלה שכן יש צורך להגדיר את האזור המדויק של הנוירון. בנוסף, זה עוזר להיפטר של puncta הספציפי ומשטחים נגזרים נוירונים אחרים. מגבלה בגישה זו, עם זאת, היא העומק של הקרנת z. עוצמת האות של puncta מקבלת פחות בשכבות עמוקות יותר של מחסנית z. הכנת מוח שקוף בשיטות ניקוי רקמות כזה SeeDB2 29 עשויה לעזור להתגבר על מגבלה זו ולאפשר הדמיה של אות punctate ברורה עוד יותר במוח.
פרוטו שלנוcol יכול לשמש לניתוח ארגון הסינפטי ב בקנה מידה ננו ועם הדמיה לחיות. שילוב הדמיה סופר-רזולוציה (למשל, מגורה דלדול פליטה (STED) מיקרוסקופיה, מיקרוסקופית שיקום אופטיים סטוכסטיים (STORM), מיקרוסקופיה לוקליזציה מופעל צילום (PALM), מיקרוסקופיה תאורה מובנה (SIM) וכו ') עם מודלים תיאורטיים התקדמה הבנתנו את מבנה ודינמיקה מולקולרית של סינפסות. לדוגמה, הארגון הננוסקופי של BRP הוערך ברזולוציה חד מולקולריות עם הדמיה סופר-רזולוציה בסערה ישירה (STORM ד) על תסיסנית NMJ 30. הפרוטוקול שלנו הותאם כימות של דינמיקה של מולקולת אזור פעילה אחד בכל אזור presynaptic הפעיל של קולטן postsynaptic יחיד בכל אזור postsynaptic כדי להבין יותר כיצד סינפסות מוסדרים ברמה מכניסטית. יתר על כן, הפרוטוקול שלנו יכול לשמש כדי לחזות מולקולריתנועה ב סינפסות ב בעלי חיים. למעשה, BRP-GFP ניתן דמיינו ללא הסתמכות על immunostaining. לפיכך, פיתוח presynaptic אקסונים R8 כבר צלם בבעלי חיים עם מיקרוסקופיה שני פוטונים 15. אפשר לעקוב אחר אות punctate של רכיבי אזור פעילים חיות בעלות על ידי איתור והניתוח כתם בנקודות זמן שונות מאז המשטחים והעמדות של נוירונים ספציפיים מוגדרים בפרוטוקול שלנו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מודים ט סטרנר עבור תיקונים מועילים, דיוני הערות על כתב היד; SL Zipursky למתן מניות לטוס; M Schölling לביצוע עיבוד תמונה. חלק ניתוח התמונה בוצע במעבדה של א Kakita. עבודה זו נתמכה על ידי אלכסנדר פון הומבולדט קרן JSPs מלגות למחקר בחו"ל (AS), עמיתי JSPs (SH-S.), גרנט-in-Aid עבור Start-up (24,800,024), על תחומים חדשניים (25,110,713), Mochida, טאקדה, Inamori, Daiichi Sankyo-, יסודות אליפות טוראי (TS), מימון הליבה DZNE (GT) ו DZNE מתקן מיקרוסקופית אור (CM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vial | Hightech, Japan | MKC-20 | |
| Plug | Thermo Fisher Sciehtific, USA | AS-275 | |
| Customized transparent rack made of acrylic resin | Shin-Shin Corporation, Japan | a height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step | |
| Cool incubator | MITSUBISHI ELECTRIC, Japan | CN-40A | |
| LED panel | MISUMI, Japan | LEDXC170-W | |
| Digital light meter | CEM | DT-1301 | |
| Fly pad | Tokken, Japan | TK-HA03-S | |
| Petri dish (35 x 10 mm) | Greiner Bio-One International, Germany | 627102 | |
| PBS tablet | Takara, Japan | T900 | |
| Triton X-100 | Wako, Japan | 160-24751 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 1.5 mL tube | Sarstedt, Germany | A. 152X | |
| Formaldehyde 16% | NEM, Japan | 3152 | |
| Pipetman P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P-2 | Gilson | F144801 | |
| anti-chaoptin antibody | DSHB | 24B10 | |
| Alexa568-conjugated anti-mouse antibody | Life Technologies | A-11031 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Microscope slide (76 x 26 mm) | Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Germany | ||
| Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm) | Zeiss, Germany | 474030-9000-000 | |
| Industrial Microscopes | Olympus, Japan | SZ61-C-SET | |
| Stereo Microscope Lighting | Olympus, Japan | KL 1600 LED | |
| confocal microscopy | Zeiss, Germany | LSM780 | |
| Imaris | Bitplane, Switzerland | Version 7.6.4 or above | |
| Matlab | The MathWorks, Inc., USA | ||
| Excel for Mac | Microsoft |
References
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Synaptic Vesicle Pools and Dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (8), (2012).
- Couteaux, R., Pecot-Dechavassine, M. [Synaptic vesicles and pouches at the level of "active zones" of the neuromuscular junction]. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 271 (25), 2346-2349 (1970).
- Schoch, S., Gundelfinger, E. D. Molecular organization of the presynaptic active zone. Cell and Tissue Research. 326 (2), 379-391 (2006).
- Sudhof, T. C. The Presynaptic Active Zone. Neuron. 75 (1), 11-25 (2012).
- Owald, D., Sigrist, S. J. Assembling the presynaptic active zone. Curr Opin Neurobiol. 19 (3), 311-318 (2009).
- Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive remodeling of the presynaptic cytomatrix upon homeostatic adaptation to network activity silencing. J Neurosci. 31 (28), 10189-10200 (2011).
- Matz, J., Gilyan, A., Kolar, A., McCarvill, T., Krueger, S. R. Rapid structural alterations of the active zone lead to sustained changes in neurotransmitter release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (19), 8836-8841 (2010).
- Spangler, S. A., et al. Liprin-alpha2 promotes the presynaptic recruitment and turnover of RIM1/CASK to facilitate synaptic transmission. J Cell Biol. 201 (6), 915-928 (2013).
- Sugie, A., et al. Molecular Remodeling of the Presynaptic Active Zone of Drosophila Photoreceptors via Activity-Dependent Feedback. Neuron. 86 (3), 711-725 (2015).
- Sigrist, S. J., Schmitz, D. Structural and functional plasticity of the cytoplasmic active zone. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 144-150 (2011).
- Kittel, R. J., et al. Active zone assembly and synaptic release. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 5), 939-941 (2006).
- Kittel, R. J., et al. Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release. Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).
- Hallermann, S., et al. Naked dense bodies provoke depression. J Neurosci. 30 (43), 14340-14345 (2010).
- Wagh, D. A., et al. Bruchpilot, a protein with homology to ELKS/CAST, is required for structural integrity and function of synaptic active zones in Drosophila. Neuron. 49 (6), 833-844 (2006).
- Chen, Y., et al. Cell-type-specific labeling of synapses in vivo through synaptic tagging with recombination. Neuron. 81 (2), 280-293 (2014).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (4), 490-493 (2012).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number. J Vis Exp. (45), (2010).
- Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. J Neurosci Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
- Danielson, E., Lee, S. H. SynPAnal: software for rapid quantification of the density and intensity of protein puncta from fluorescence microscopy images of neurons. PLoS One. 9 (12), e115298 (2014).
- Sanders, J., Singh, A., Sterne, G., Ye, B., Zhou, J. Learning-guided automatic three dimensional synapse quantification for drosophila neurons. BMC Bioinformatics. 16, 177 (2015).
- Peng, H., Ruan, Z., Atasoy, D., Sternson, S. Automatic reconstruction of 3D neuron structures using a graph-augmented deformable model. Bioinformatics. 26 (12), i38-i46 (2010).
- Sturt, B. L., Bamber, B. A. Automated quantification of synaptic fluorescence in C. elegans. J Vis Exp. (66), (2012).
- Kremer, M. C., et al. Structural long-term changes at mushroom body input synapses. Curr Biol. 20 (21), 1938-1944 (2010).
- Mosca, T. J., Luo, L. Synaptic organization of the Drosophila antennal lobe and its regulation by the Teneurins. Elife. 3, e03726 (2014).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
- Fischbach, K. F., Dittrich, A. P. M. The Optic Lobe of Drosophila-Melanogaster .1 A Golgi Analysis of Wild-Type Structure. Cell and Tissue Research. 258 (3), 441-475 (1989).
- Berger-Muller, S., et al. Assessing the role of cell-surface molecules in central synaptogenesis in the Drosophila visual system. PLoS One. 8 (12), e83732 (2013).
- Fouquet, W., et al. Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot. J Cell Biol. 186 (1), 129-145 (2009).
- Ke, M. T., et al. Super-Resolution Mapping of Neuronal Circuitry With an Index-Optimized Clearing Agent. Cell Rep. 14 (11), 2718-2732 (2016).
- Ehmann, N., et al. Quantitative super-resolution imaging of Bruchpilot distinguishes active zone states. Nat Commun. 5, 4650 (2014).
