Analysera Synaptic Modulering av<em> Drosophila melanogaster</em> Fotoreceptorer Efter exponering för Förlängd ljus
Summary
Här visar vi hur man kan kvantifiera antalet och geografiska fördelningen av synaptiska aktiva zoner i Drosophila melanogaster fotoreceptorer, markeras med en genetiskt kodad molekylär markör, och deras modulering efter långvarig exponering för ljus.
Abstract
Nervsystemet har den anmärkningsvärda förmågan att anpassa sig och svara på olika stimuli. Denna neurala justering till stor del uppnås genom plasticitet på den synaptiska nivån. Active Zone (AZ) är den region i presynaptiska membranet som förmedlar neurotransmittorfrisättning och består av en tät samling av ställnings proteiner. AZS Drosophila melanogaster (Drosophila) fotoreceptorer undergår molekylär ombyggnad efter långvarig exponering för naturlig omgivande ljus. Sålunda kan nivån av neuronal aktivitet ordna den molekylära sammansättningen av AZ och bidra till regleringen av den funktionella utgången.
Med utgångspunkt från ljusexponering set-up förberedelse till immunohistokemi, detta protokoll beskriver hur att kvantifiera antalet, den rumsliga fördelningen och utlokalisering nivån synaptiska molekyler på AZS i Drosophila fotoreceptorer. Använda bildanalys SOFtware, kluster av GFP-smält AZ komponent Bruchpilot identifierades för varje R8 fotoreceptor (R8) axonet terminalen. Upptäckta Bruchpilot fläckarna automatiskt tilldelas enskilda R8 axoner. För att beräkna fördelningen av frekvens längs axonet, genomförde vi en kundanpassad programvara plugin. Varje axon startpunkten och slutpunkten var manuellt definierade och positionen för varje Bruchpilot plats projicerades på förbindelselinjen mellan start- och slutpunkten. Förutom antalet Bruchpilot kluster, kvantifieras vi också utlokalisering nivån Bruchpilot-GFP inom kluster. Dessa mätningar speglar i detalj spatialt upplösta synaptiska dynamik i en enda neuron under olika miljöförhållanden stimuli.
Introduction
Modulering av synaptisk funktion bidrar till den anmärkningsvärda förmågan hos nervsystemet att exakt svara eller anpassa sig till ändrade miljöstimuli. Justering av presynaptiska vesikler frigör sannolikhet är ett sätt att kontrollera synaptiska styrka en. Synaptisk vesikel frisättning äger rum vid den aktiva zonen (AZ), en specialiserad region i det presynaptiska membranet 2. AZ kännetecknas av en kassett av specifika proteiner 3, 4. De flesta proteiner som bidrar till AZ montering är mycket konserverade i nematoder, insekter och däggdjur 5. Nyligen genomförda studier tyder på att nivån på nervaktivitet reglerar den molekylära sammansättningen av AZ, vilket i sin tur bidrar till regleringen av den funktionella utgångs både in vitro och in vivo 6, 7,> 8. Vi fann tidigare att fotoreceptor AZS genomgår molekylär ombyggnad i Drosophila efter långvarig exponering för naturligt omgivningsljus 9. I detta tillstånd, observerade vi att antalet Bruchpilot (Brp) -positiv AZS reducerades i ljusmätare axoner.
BRP / CAST / ELKS familjen proteiner är grundläggande byggstenar i AZS i ryggradsdjur och ryggradslösa synapser 10. I Drosophila BRP mutanter, framkallade vesikler frisättningen undertrycks 11, 12. De 17 C-terminala aminosyraresterna i Brp är väsentliga för synaptisk vesikel klustring vid Drosophila Neuromuskulära förbindelsen (NMJ) 13, 14. Dessa studier visade centrala roll denna molekyl i AZ organisation och funktion. Med en nyutvecklad genetisk verktyg, Synaptic Märkning med rekombination (Star) BRPkan observeras in vivo i specifika celltyper, på endogena expressionsnivåer och vid en enda synaps upplösning 15. Detta verktyg gör det möjligt att utvärdera de endogena dynamiken i synapser kvantitativt i det komplexa centrala nervsystemet.
Det har gjorts flera studier inklusive synaps kvantifieringar baserade på data erhållna från konfokalmikroskopi. Synaptic ändringar har utvärderats genom att mäta längden, området, volym, densitet och räkna antalet baserad på avancerade program. Till exempel ger gratisprogram ImageJ en kvantifiering metod för total synaptiska området och synaptiska densitet åtgärder på Drosophila NMJ 16. Antalet colocalization platser av pre-och postsynaptiska markörer har kvantifierats med hjälp av plugin "puncta Analyzer" finns på ImageJ mjukvaruplattform 17. Alternativt kan en multi-paradigm numerisk datormiljö baserat program, Synapse Detector (synd), kan automatiskt spåra dendriter av nervceller märkta med en fluorescerande markör, och sedan kvantifierar synaptiska proteinnivåer som en funktion av avstånd från cellkroppen 18. Programvaran Synaptic puncta Analysis (SynPAnal), har utformats för snabb analys av 2D-bilder av nervceller som förvärvats från konfokala eller fluorescerande mikroskopi. Den primära funktionen av denna programvara är automatisk och snabb kvantifiering av densitet och intensitet av protein puncta 19. Nyligen har en automatisk inlärning baserad synaps detekteringsalgoritmen genererats för kvantifiering av synaptisk antal i 3D 20, att dra nytta av 3D-visualisering-Assisted analys (Vaa3D) programvara 21.
Kommersiell bildanalys programvara är också kraftfulla verktyg för synaptiska kvantifieringar. Till exempel, den fluorescensmärkta neurotransmittorreceptorer eller en presynaptisk AZ komponent har kvantifierats i tre dimensioner med en enda synaps upplösning i C. elegans 22 eller Drosophila luktsystemet 23, 24, vilket gör att hundratals synapser att snabbt karakteriseras i ett enda prov.
Här presenterar vi en metod en anpassad bildanalys mjukvara plug-in genomförs i en multi-paradigm numerisk datormiljö som gör det möjligt att analysera halvautomatiskt flera aspekter av AZS, inklusive deras antal, fördelning och graden av anrikning av molekylära komponenter AZ. Således får denna komplexa analys oss att utvärdera dynamiken i synaptiska komponenter i axonet terminaler under olika miljöförhållanden. Vi undersökte effekten av ljusexponering på utgångs synapser av vuxna flyga fotoreceptorer. Förfarandet utförs i tre steg: 1)förberedelse för ljusexponering, 2) dissekering, immunohistokemi och konfokal avbildning, och 3) bildanalys.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna studie visade vi hur man förbereder ljusförhållandena för att exponera flugor till en lika stor ljusintensitet. Vi kvantifierade inte bara antalet av en synaptisk markör puncta men skulle också kunna rumsligt lösa densiteten hos synapser längs axoner och mäta delokalisering nivå av markörproteinet i cytoplasmiska områdena. Dessa tre bedömningar ger oss möjlighet att utvärdera information om synaptiska dynamik vid enstaka neuron nivå i olika miljöförhållanden. Vår protokoll kan anpassas till o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma för T. Stürner för hjälp korrigeringar, diskussioner och kommentarer om manuskriptet; SL Zipursky för att ge fly lager; M Schölling för att utföra bildbehandling. En del av bildanalysen utfördes vid A. Kakita labb. Detta arbete stöddes av Alexander von Humboldt-stiftelsen och JSPS stipendier för forskning utomlands (AS), JSPS Fellows (SH-S.), Grant-In- Stöd till Start-up (24.800.024), på innovativa områden (25.110.713), Mochida, Takeda, Inamori, Daiichi-Sankyo, Toray Foundations (TS), DZNE basfinansiering (GT) och DZNE ljusmikroskopi Facility (CM).
Materials
| Vial | Hightech, Japan | MKC-20 | |
| Plug | Thermo Fisher Sciehtific, USA | AS-275 | |
| Customized transparent rack made of acrylic resin | Shin-Shin Corporation, Japan | a height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step | |
| Cool incubator | MITSUBISHI ELECTRIC, Japan | CN-40A | |
| LED panel | MISUMI, Japan | LEDXC170-W | |
| Digital light meter | CEM | DT-1301 | |
| Fly pad | Tokken, Japan | TK-HA03-S | |
| Petri dish (35 x 10 mm) | Greiner Bio-One International, Germany | 627102 | |
| PBS tablet | Takara, Japan | T900 | |
| Triton X-100 | Wako, Japan | 160-24751 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 1.5 ml tube | Sarstedt, Germany | A. 152X | |
| Formaldehyde 16% | NEM, Japan | 3152 | |
| Pipetman P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P-2 | Gilson | F144801 | |
| anti-chaoptin antibody | DSHB | 24B10 | |
| Alexa568-conjugated anti-mouse antibody | Life Technologies | A-11031 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Microscope slide (76 x 26 mm) | Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Germany | ||
| Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm) | Zeiss, Germany | 474030-9000-000 | |
| Industrial Microscopes | Olympus, Japan | SZ61-C-SET | |
| Stereo Microscope Lighting | Olympus, Japan | KL 1600 LED | |
| confocal microscopy | Zeiss, Germany | LSM780 | |
| Imaris | Bitplane, Switzerland | Version 7.6.4 or above | |
| Matlab | The MathWorks, Inc., USA | ||
| Excel for Mac | Microsoft |
References
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Synaptic Vesicle Pools and Dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (8), (2012).
- Couteaux, R., Pecot-Dechavassine, M. [Synaptic vesicles and pouches at the level of "active zones" of the neuromuscular junction]. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 271 (25), 2346-2349 (1970).
- Schoch, S., Gundelfinger, E. D. Molecular organization of the presynaptic active zone. Cell and Tissue Research. 326 (2), 379-391 (2006).
- Sudhof, T. C. The Presynaptic Active Zone. Neuron. 75 (1), 11-25 (2012).
- Owald, D., Sigrist, S. J. Assembling the presynaptic active zone. Curr Opin Neurobiol. 19 (3), 311-318 (2009).
- Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive remodeling of the presynaptic cytomatrix upon homeostatic adaptation to network activity silencing. J Neurosci. 31 (28), 10189-10200 (2011).
- Matz, J., Gilyan, A., Kolar, A., McCarvill, T., Krueger, S. R. Rapid structural alterations of the active zone lead to sustained changes in neurotransmitter release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (19), 8836-8841 (2010).
- Spangler, S. A., et al. Liprin-alpha2 promotes the presynaptic recruitment and turnover of RIM1/CASK to facilitate synaptic transmission. J Cell Biol. 201 (6), 915-928 (2013).
- Sugie, A., et al. Molecular Remodeling of the Presynaptic Active Zone of Drosophila Photoreceptors via Activity-Dependent Feedback. Neuron. 86 (3), 711-725 (2015).
- Sigrist, S. J., Schmitz, D. Structural and functional plasticity of the cytoplasmic active zone. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 144-150 (2011).
- Kittel, R. J., et al. Active zone assembly and synaptic release. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 5), 939-941 (2006).
- Kittel, R. J., et al. Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release. Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).
- Hallermann, S., et al. Naked dense bodies provoke depression. J Neurosci. 30 (43), 14340-14345 (2010).
- Wagh, D. A., et al. Bruchpilot, a protein with homology to ELKS/CAST, is required for structural integrity and function of synaptic active zones in Drosophila. Neuron. 49 (6), 833-844 (2006).
- Chen, Y., et al. Cell-type-specific labeling of synapses in vivo through synaptic tagging with recombination. Neuron. 81 (2), 280-293 (2014).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (4), 490-493 (2012).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number. J Vis Exp. (45), (2010).
- Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. J Neurosci Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
- Danielson, E., Lee, S. H. SynPAnal: software for rapid quantification of the density and intensity of protein puncta from fluorescence microscopy images of neurons. PLoS One. 9 (12), e115298 (2014).
- Sanders, J., Singh, A., Sterne, G., Ye, B., Zhou, J. Learning-guided automatic three dimensional synapse quantification for drosophila neurons. BMC Bioinformatics. 16, 177 (2015).
- Peng, H., Ruan, Z., Atasoy, D., Sternson, S. Automatic reconstruction of 3D neuron structures using a graph-augmented deformable model. Bioinformatics. 26 (12), i38-i46 (2010).
- Sturt, B. L., Bamber, B. A. Automated quantification of synaptic fluorescence in C. elegans. J Vis Exp. (66), (2012).
- Kremer, M. C., et al. Structural long-term changes at mushroom body input synapses. Curr Biol. 20 (21), 1938-1944 (2010).
- Mosca, T. J., Luo, L. Synaptic organization of the Drosophila antennal lobe and its regulation by the Teneurins. Elife. 3, e03726 (2014).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
- Fischbach, K. F., Dittrich, A. P. M. The Optic Lobe of Drosophila-Melanogaster .1 A Golgi Analysis of Wild-Type Structure. Cell and Tissue Research. 258 (3), 441-475 (1989).
- Berger-Muller, S., et al. Assessing the role of cell-surface molecules in central synaptogenesis in the Drosophila visual system. PLoS One. 8 (12), e83732 (2013).
- Fouquet, W., et al. Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot. J Cell Biol. 186 (1), 129-145 (2009).
- Ke, M. T., et al. Super-Resolution Mapping of Neuronal Circuitry With an Index-Optimized Clearing Agent. Cell Rep. 14 (11), 2718-2732 (2016).
- Ehmann, N., et al. Quantitative super-resolution imaging of Bruchpilot distinguishes active zone states. Nat Commun. 5, 4650 (2014).
