Summary

Un<em> Ex Vivo</em> Metodo per Time-Lapse Imaging di coltura Rat mesenteriche microvascolari Networks

Published: February 09, 2017
doi:

Summary

Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.

Abstract

L'angiogenesi, definita come la crescita di nuovi vasi sanguigni da vasi preesistenti, coinvolge le cellule endoteliali, periciti, cellule muscolari lisce, cellule del sistema immunitario, e il coordinamento con i vasi linfatici e nervi. Il multi-cella, interazioni multi-sistema comportano la necessità di ricerca di angiogenesi in un ambiente fisiologicamente rilevanti. Così, mentre l'uso di modelli di coltura cellulare in vitro hanno fornito intuizioni meccanicistici, una critica comune è che essi non riassumono la complessità associata con una rete microvascolare. L'obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare la possibilità di fare confronti time-lapse di reti microvascolari intatte, prima e dopo la stimolazione dell'angiogenesi nei tessuti di ratto coltivate mesentere. tessuti coltivati ​​contengono reti microvascolari che mantengono la loro gerarchia. etichettatura immunoistochimica conferma la presenza di cellule endoteliali, cellule muscolari lisce, periciti, vasi sanguigni e vasi linfatici. In unddition, etichettatura dei tessuti con BSI-lectina consente un confronto time-lapse di aree di rete locali prima e dopo la stimolazione siero o fattore di crescita caratterizzato da un aumento della germinazione capillare e densità dei vasi. Rispetto ai modelli comuni di coltura cellulare, questo metodo fornisce uno strumento per gli studi di lignaggio delle cellule endoteliali e specifica valutazione dei farmaci angiogenico tessuto in fisiologicamente rilevanti reti microvascolari.

Introduction

Crescita della rete microvascolare e rimodellamento sono denominatori comuni per la funzione dei tessuti, la guarigione della ferita, e molteplici patologie e un processo chiave è l'angiogenesi, definita come la crescita di nuovi vasi sanguigni da quelli esistenti 1, 2. Per Tissue Engineering nuovi vasi o la progettazione di terapie basate angiogenici, comprendendo l'importanza delle dinamiche cellulari coinvolti nell'angiogenesi è fondamentale. Tuttavia, questo processo è complesso. Può variare in punti specifici all'interno di una rete microvascolare e coinvolge più tipi di cellule (ad esempio cellule endoteliali, cellule muscolari lisce, periciti, macrofagi, cellule staminali) e sistemi multipli (reti linfatici e reti neurali). Sebbene i modelli in vitro hanno contribuito enormemente ad esaminare il rapporto tra le diverse cellule coinvolte nell'angiogenesi 3, la loro rilevanza fisiologica può essere compromessa a causa di thei r limitata complessità e il fatto che essi non riflettono strettamente uno scenario in vivo. Per superare queste limitazioni, sistemi di coltura tridimensionale 3, ex vivo modelli di tessuto 4, sistemi microfluidici 5, 6, e 7 modelli di calcolo sono stati sviluppati e introdotti negli ultimi anni. Tuttavia, vi è ancora la necessità di un modello con funzionalità time-lapse per studiare l'angiogenesi in reti microvascolari intatti ex vivo. La creazione di nuovi modelli di time-lapse per gli studi di angiogenesi con quel livello di complessità fornirà uno strumento prezioso per comprendere i meccanismi alla base che regolano l'angiogenesi e per migliorare le terapie.

Un modello potenziale che permette alla ex vivo indagini dell'angiogenesi attraverso una rete microvascolare intatto è il modello di cultura mesentere ratto> 8. Nel recente lavoro, abbiamo dimostrato che il sangue e le reti microvascolari linfatici rimangono vitali dopo la cultura. Ancora più importante, il mesentere modello di cultura del ratto può essere utilizzato per studiare le interazioni funzionali periciti-endoteliale di cellule del sangue, e le connessioni delle cellule endoteliali linfatiche, e time-lapse imaging. L'obiettivo di questo lavoro è quello di fornire il nostro protocollo per il metodo time-lapse imaging. I nostri risultati rappresentativi documentano le molteplici tipi di cellule che rimangono vitali dopo la stimolazione dell'angiogenesi con siero e offrono esempi di utilizzo di questo metodo per quantificare specifiche risposte angiogenici dei tessuti così come endoteliali studi di monitoraggio delle cellule.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali e le procedure sono state approvate dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale della Tulane University (IACUC). 1. Procedura di impostazione chirurgica strumenti Autoclave, forniture chirurgiche, e le forniture di cultura prima dell'intervento. forniture chirurgiche per ogni ratto sono: 1 telo, 1 telo con foro pre-cut (0,5 x 1,5 in) al centro, garze, e 1 underpad assorbente. Strumenti chirurgici includono: 1 bisturi con lama…

Representative Results

Dopo 3 giorni in coltura, tessuti sono stati etichettati con un / morti kit di sopravvivenza / citotossicità diretta per dimostrare la fattibilità del microcircolo nel ratto mesentere cultura modello (Figura 2A). La maggior parte delle cellule presenti nel mesentere è rimasto vitale nella cultura in cui le cellule endoteliali sono stati individuati in base alla loro posizione nei segmenti microvascolari. Proliferazione delle cellule endoteliali è stata confermata anc…

Discussion

Questo protocollo documenta un metodo per l'utilizzo del modello di cultura di ratto mesentere come uno strumento ex vivo per l'imaging time-lapse di crescita della rete microvascolare. Impieghi precedenti nel nostro laboratorio ha stabilito l'uso del nostro modello di 1) angiogenesi 8, 2) linfoangiogenesi 8, 3) periciti-endoteliali interazioni cellulare 8, e 4) anti-angiogenico test anti-droga 9. La poss…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by National Institutes of Health Grant 5-P20GM103629 to WLM and the Tulane Center for Aging. We would like to thank Matthew Nice for his help with editing the protocol text.

Materials

Drape Cardinal Health 4012 12”x12” Bio-Shield Regular Sterilization Wraps
Scalpel Handle Roboz Surgical Instrument RS-9843 Scalpel Handle, #3; Solid; 4" Length
Sterile Surgical Blade Cincinnati Surgical 0110 Stainless Steel; Size 10
Culture Dish (60mm) Thermo Scientific 130181 10/Sleeve
Graefe Forcep (curved tweezers) Roboz Surgical Instrument RS-5135 Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4" Length
Graefe Forcep (straight tweezers) Roboz Surgical Instrument RS-5130 Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8mm Tip Width; 4" Length
Noyes Micro Scissor Roboz Surgical Instrument RS-5677 Noyes Micro Dissecting Spring Scissors;
Straight, Sharp-Blunt Points; 13mm Cutting Edge; 0.25mm Tip Width, 4 1/2" Overall Length
Gauze Pads FisherBrand 13-761-52 Non-Sterile Cotton Gauze Sponges; 4"x4" 12-Ply
Cotton-Tippled Applicators FisherBrand 23-400-124 6" Length; Wooden Shaft; Single Use Only
6-Well Plate Fisher Scientific 08-772-49 Flat Bottom with Low Evaporation Lid; Polystyrene; Non-Pyrogenic
Sterile Syring 5ml Fisher Scientific 14-829-45 Luer-Lok Tip
Sterile Bowl Medical Action Industries Inc. 01232 32 oz. Peel Pouch; Blue; Sterile Single Use
6-Well Plate Inserts (CellCrown Inserts) SIGMA Z681792-3EA 6-Well Plate Inserts; Non-Sterile
Polycarbonate Filter Membrane SIGMA TMTP04700 Isopore Membrane Filter; Polycarbonate; Hydrophilic; 5.0 µm, 47 mm, White Plain
Name Company Catalog Number Comments/Description
Beuthanasia Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordered from MWI Veterinary Supply) MWI #: 011168 Active Ingredient: Per 100mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50mg phenytoin sodium 
Ketamine Fort Dodge Animal Health (Ordered from MWI Veterinary Supply) MWI #: 000680 Kateset 100 mg/ml
Xylazine LLOYD. Inc. (Ordered from MWI Veterinary Supply) MWI #: 000680 Anased 100 mg/ml
Saline Baxter 2F7122
PBS Invitrogen 14040-133
MEM Invitrogen 11095080
PenStrep Invitrogen 15140-122
FBS Invitrogen 16000-044
BSA Jackson ImmunoResearch 001-000-162
Saponin  SIGMA S7900-100G
Isopropyl Alcohol Fisher Scientific S25372
Povidone-Iodine Operand 82-226
Hydrochloric Acid SIGMA 320331
Methanol Fisher Scientific 67-56-1
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5
FITC-conjugated Lectin SIGMA L9381-2MG
Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody SIGMA AB5320
PECAM (CD31) Antibody BD Biosciences 555026
LYVE-1 Antibody AngioBio Co. 11-034
Goat Anti-Rabbit Cy2-conjugated Antibody Jackson ImmunoResearch 111-585-144
Goat Anti-Mouse Cy3-conjugated Antibody Jackson ImmunoResearch 115-227-003
Streptavidin Cy3-conjugated Antibody Jackson ImmunoResearch 016-160-084
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit Invitrogen L3224
Normal Goat Serum  Jackson ImmunoResearch 005-000-121
5-Bromo-2'-Deoxyuridine SIGMA B5002
Monoclonal Mouse Anti-Bromodeoxyuridine                        Clone Bu20a Dako M074401-8
Mouse Anti-Rat CD11b  AbD Serotec MCA275R

References

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Cite This Article
Azimi, M. S., Motherwell, J. M., Murfee, W. L. An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks. J. Vis. Exp. (120), e55183, doi:10.3791/55183 (2017).

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