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Medicine

स्वस्थ स्वयंसेवकों और उनके प्रवासी संभावित सीरम नमूनों से प्रभावित कार्डिएक सर्जरी के बाद से endothelial पूर्वज कोशिकाओं का अलगाव

Published: February 14, 2017 doi: 10.3791/55192
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 4, 1, 5,6, 1
1Department of Intensive Care Medicine, University Hospital Aachen, 2Institute of Biochemistry and Molecular Biology, University Hospital Aachen, 3Department of Radiology, German Cancer Research Center, 4Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, University Hospital Aachen, 5Department of Vascular Biology, Institute for Stroke and Dementia Research (ISD), Klinikum der Universität München, 6Deutsches Zentrum für Herz-/Kreislaufkrankheiten (DZHK), Munich Heart Alliance

Summary

Endothelial पूर्वज कोशिकाओं (निर्यात संवर्धन परिषदों) महत्वपूर्ण इस्कीमिक ऊतकों की neovascularization में शामिल रहे हैं। इस विधि परिधीय रक्त से मानव निर्यात संवर्धन परिषदों के अलगाव, साथ ही हृदय शल्य चिकित्सा के रोगियों के सीरम नमूनों के खिलाफ उनके प्रवासी क्षमता की पहचान का वर्णन है।

Abstract

Endothelial पूर्वज कोशिकाओं (निर्यात संवर्धन परिषदों) हाइपोक्सिया जैसे रोग की स्थिति के तहत अस्थि मज्जा से भर्ती कर रहे हैं और महत्वपूर्ण इस्कीमिक ऊतकों की neovascularization में शामिल रहे हैं। मूल, वर्गीकरण और निर्यात संवर्धन परिषदों के लक्षण वर्णन जटिल कर रहे हैं; होते हुए भी, निर्यात संवर्धन परिषदों के दो प्रमुख उप-प्रकार स्थापित किया गया है: तथाकथित "जल्दी" निर्यात संवर्धन परिषदों और देर परिणाम निर्यात संवर्धन परिषदों (देर-निर्यात संवर्धन परिषदों) (बाद में के रूप में जल्दी-निर्यात संवर्धन परिषदों के लिए कहा गया है)। वे जैविक गुणों के साथ-साथ इन विट्रो संस्कृति के दौरान उनकी उपस्थिति से वर्गीकृत किया जा सकता है। "जल्दी" निर्यात संवर्धन परिषदों चुनाव आयोग विशिष्ट मीडिया में परिधीय रक्त प्राप्त mononuclear कोशिकाओं की संस्कृति के बाद कम से कम एक सप्ताह में दिखाई देते हैं, देर-परिणाम निर्यात संवर्धन परिषदों 2-3 सप्ताह के बाद पाया जा सकता है। देर परिणाम निर्यात संवर्धन परिषदों सीधे, neovascularization में शामिल होना मुख्य रूप से परिपक्व endothelial कोशिकाओं में अंतर करने की क्षमता के माध्यम से मान्यता दी गई है, जबकि "जल्दी" निर्यात संवर्धन परिषदों endogen के रूप में विभिन्न कारकों को व्यक्त एन्जियोजेनिकous माल एक पैराक्राइन ढंग से angiogenesis को बढ़ावा देने के लिए। myocardial ischemia / reperfusion (मैं / आर) के दौरान विभिन्न कारकों रक्त वाहिनियों के गठन के क्षेत्रों के लिए निर्यात संवर्धन परिषदों के घर वापस आना नियंत्रित करते हैं।

Macrophage प्रवास निरोधात्मक कारक (MIF) एक केमोकाइन की तरह समर्थक भड़काऊ और सर्वत्र व्यक्त साइटोकाइन है और हाल ही में शारीरिक सांद्रता 1 पर निर्यात संवर्धन परिषदों प्रवास के रूप में महत्वपूर्ण नियामक समारोह को वर्णित किया गया था। दिलचस्प बात यह है MIF intracellular पूल में जमा हो जाता है और तेजी से कई उत्तेजनाओं के बाद रक्त प्रवाह में जारी किया जा सकता है (उदाहरण के रोधगलन)।
इस प्रोटोकॉल वयस्क मानव परिधीय रक्त से विश्वसनीय अलगाव और जल्दी-निर्यात संवर्धन परिषदों की संस्कृति सीरम नमूनों के खिलाफ इन विट्रो प्रवास assays में उपयोग के लिए fibronectin लेपित प्लेटों पर endothelial वृद्धि कारकों युक्त मध्यम में बाद में संस्कृति के साथ CD34 पॉजिटिव चयन के आधार पर करने के लिए एक विधि का वर्णन हृदय शल्य चिकित्सा रोगियों की। इसके अलावा,अन्य प्रसिद्ध angiogenesis उत्तेजक साइटोकिन्स की तुलना में निर्यात संवर्धन परिषदों के chemotaxis पर MIF के प्रवासी प्रभाव प्रदर्शन किया है।

Introduction

Endothelial पूर्वज कोशिकाओं (निर्यात संवर्धन परिषदों) मानव रक्त में घूम और endothelial कोशिकाओं 2 में अंतर करने की क्षमता होती है। वे vasculogenesis में भाग लेने और विभिन्न तरीकों से 3, 4 में सूजन और ischemia / reperfusion (मैं / आर) चोटों की वजह से नुकसान को कम करने में सक्षम हैं। उदाहरण के लिए, निर्यात संवर्धन परिषदों Catalase, glutathione peroxidase या मैंगनीज सुपरऑक्साइड dismutases (MnSOD) 5 की तरह intracellular एंटीऑक्सीडेंट एंजाइमों का ऊंचा स्तर दिखा। ऑक्सीडेटिव तनाव के खिलाफ बुलंद प्रतिरोध निर्यात संवर्धन परिषदों ऊंचा प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) इस्कीमिक चोट 6 के बाद से microenvironments में कार्य करने के लिए अनुमति देता है। पिछले अध्ययनों से यह भी संकेत दिया है कि निर्यात संवर्धन परिषदों की संख्या नाड़ी की मरम्मत करने के लिए और निर्यात संवर्धन परिषदों घूम की संख्या कम हृदय की घटनाओं 7 की घटना भविष्यवाणी की है कि सहसंबद्ध किया जा सकता है,वर्ग = "xref"> 8। हालांकि, एक ईपीसी की स्पष्ट परिभाषा अभी तक नहीं पाया गया है। अब तक, वहाँ कोई विशेष कोशिका की सतह मार्कर या निर्यात संवर्धन परिषदों के लिए लगातार phenotype है और इन कोशिकाओं परिधीय रक्त 9 में बहुत दुर्लभ हैं। एक मानव ईपीसी क्षमता घायल endothelium और नए संवहनी संरचनाओं के पुनर्निर्माण में योगदान करने के साथ एक घूम सेल के रूप में माना जाना चाहिए।

अलग-थलग करने और निर्यात संवर्धन परिषदों निस्र्पक का एक तरीका यह फ़ाइब्रोनेक्टिन के लिए आसंजन के माध्यम से है। इस प्रकार, इन कोशिकाओं की क्षमता, 1 कोलेजन टाइप करने के लिए उदाहरण के लिए 3, 10, 11 के लिए की तुलना में लेपित व्यंजन fibronectin करने के लिए एक बेहतर आसंजन को दिखाने के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि, अन्य लोगों ने पाया है कि किसी भी पिछले या आगे की शुद्धि के बिना कदम fibronectin लेपित व्यंजन पर mononuclear कोशिकाओं चढ़ाना माइलॉयड पूर्वज कोशिकाओं, monocytes, और टी lymphocytes 1 सहित कालोनियों की ओर जाता है2, 13, 14। इसके अलावा, इस मामले में, प्लेटलेट्स mononuclear (एमएनसी) सेल अंश को दूषित कर सकता है और इस तरह की किसी भी पक्षपाती कोशिकाओं से 15 प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन हस्तांतरण।

इन विट्रो आसंजन assays के माध्यम से लक्षण वर्णन इसके अलावा, विभिन्न कोशिका की सतह मार्कर का एक संयोजन एक सेल प्रकार एक ईपीसी के रूप में माना वर्णन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इस मामले में, फ़ाइब्रोनेक्टिन की मध्यस्थता के बाद आसंजन, कोशिकाओं को अपनी endothelial-तरह विशेषताओं के विषय में विश्लेषण किया। इस प्रक्रिया में, दो endothelial सेल जुड़े मार्कर, acetylated-कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (acLDL) और संवहनी endothelial वृद्धि कारक रिसेप्टर 2 (VEGFR -2, KDR), एक भूमिका निभाते हैं। Endothelial कोशिकाओं और मैक्रोफेज विशेष रूप से एक प्रक्रिया "मेहतर सेल मार्ग" 16 बुलाया में acLDL को लेने के लिए दिखाया गया है। एक और मार्कर प्रोटीन endothelial पर मुख्य वीईजीएफ़ रिसेप्टर के रूप में KDR हैकोशिकाओं को 17। हालांकि, के रूप में सामान्य रूप में निर्यात संवर्धन परिषदों endothelial वृद्धि कारक है और भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ पूरक मीडिया में सुसंस्कृत हैं, यह संभव है कि मैक्रोफेज, गलती से भी अलग-थलग हो सकता है जो कुछ हुआ है, प्रदर्शनी एक endothelial-तरह मार्कर प्रोफ़ाइल। पहले से दिखाया गया है, यदि एक endothelial वातानुकूलित माध्यम में सुसंस्कृत, मैक्रोफेज एक्सप्रेस "endothelial-विशिष्ट" प्रोटीन 18।

सामान्य में, वहाँ रक्त में पाया जा सकता है या इन विट्रो में संवर्धित किया जा अधिक उपप्रकार के भीतर निर्यात संवर्धन परिषदों की दो श्रेणियां हैं। देर परिणाम निर्यात संवर्धन परिषदों (देर-निर्यात संवर्धन परिषदों) संस्कृति के 2-3 सप्ताह के बाद दिखाई देते हैं। इन कोशिकाओं को मानव नाल नस endothelial कोशिकाओं की एक monolayer में तेजी से एकीकृत कर रहे हैं और केशिका ट्यूब 19 फार्म कर सकते हैं। इसके अलावा, तथाकथित "जल्दी-निर्यात संवर्धन परिषदों" इस तरह के संवहनी endothelial वृद्धि के रूप में एन्जियोजेनिक अणुओं पहुंचाने के माध्यम से के बारे में एक सप्ताह के लिए और एक अधिक निष्क्रिय तरीके से कार्रवाई के लिए रक्त में प्रसारितकारक (VEGF), या CXCL8 19। कोरोनरी धमनी रोग (सीएडी) के साथ मरीजों को सीएडी 20 बिना एक नियंत्रण समूह की तुलना में जल्दी-निर्यात संवर्धन परिषदों की काफी कम मात्रा में पता चला है। दिलचस्प है, एक ही समूह के एक नियंत्रण समूह की तुलना में देर-निर्यात संवर्धन परिषदों की अधिक मात्रा से पता चला है। एक अन्य अध्ययन से पता चला है कि जल्दी-निर्यात संवर्धन परिषदों एक पैराक्राइन ढंग 6 में ऑक्सीडेटिव की शर्तों के तहत apoptosis से विभेदित निर्यात संवर्धन परिषदों की रक्षा करना। इसलिए, जल्दी निर्यात संवर्धन परिषदों परिधीय रक्त के भीतर एक ऑटो या पैराक्राइन तरीके से अन्य कोशिकाओं के प्रवास के माध्यम से प्रासंगिक सुरक्षात्मक प्रभाव प्रदान हो सकता है।

इस प्रोटोकॉल पहले मानव परिधीय रक्त से PBMC-अंश को अलग-थलग करने और बाद में अवांछित कोशिकाओं से इस सेल निलंबन स्पष्ट करने के PBMC-अंश से CD34 + कोशिकाओं को अलग-थलग करके जल्दी-निर्यात संवर्धन परिषदों को शुद्ध करने के लिए एक विधि का वर्णन है। CD34 एक मार्कर है, जो मानव hematopoietic स्टेम कोशिकाओं 9 के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जाता है + कोशिकाओं पर fibronectin लेपित टिशू कल्चर सतहों सुसंस्कृत हैं। तीन दिनों के बाद, मध्यम बदल जाता है, जिससे सभी गैर पक्षपाती कोशिकाओं को खोने। अंत में, अलग-थलग निर्यात संवर्धन परिषदों acLDL के तेज और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) का उपयोग करके endothelial सेल मार्कर के रूप में KDR की उपस्थिति सत्यापित करने के लिए दाग रहे हैं। एक अतिरिक्त मार्कर के रूप में, हम प्लेटलेट endothelial सेल आसंजन अणु (PECAM-1, CD31) है, जो भी endothelial कोशिकाओं पर होता है का विश्लेषण किया।

निर्यात संवर्धन परिषदों का बढ़ाया भर्ती से क्षतिग्रस्त या infarcted दौरे ऊतक की बहाली हृदय रोगों में अधिकता की जांच की उपचार रणनीतियों के अंतर्गत आता है। हालांकि, नैदानिक ​​व्यवहार में प्रयोगात्मक परिणामों का अनुवाद अभी भी विभिन्न pathophysiological शर्तों के दौरान मानव शरीर में जटिल सेलुलर परस्पर क्रिया दी चुनौती दे रहा है। इसके अलावा, मैं दौरे / आर चोटों विभिन्न साइटोकिन्स, हार्मोन और विकास कारकों का एक अत्यधिक स्राव ट्रिगर tors, जो रक्त वाहिनियों के गठन के 13 क्षेत्रों के लिए निर्यात संवर्धन परिषदों के घर वापस आना नियंत्रित करते हैं। पहले से ही दिखाया गया है, CXCL8, stromal सेल व्युत्पन्न कारक 1α (एसडीएफ 1α, CXCL12), वीईजीएफ़ और बृहतभक्षककोशिका प्रवास निरोधात्मक कारक (MIF) काफी सीरम नमूनों में दौरे मैं / आर चोट 1 निम्नलिखित बढ़ रहे हैं। इन कारकों के अलावा, MIF मुख्य रूप से समर्थक भड़काऊ विशेषताओं के साथ एक pleiotropic केमोकाइन की तरह साइटोकाइन है। अपनी ऐतिहासिक नाम के विपरीत, MIF विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं 1, 21, 22 पर एक सच्चे केमोकाइन के रूप में अभिनय, समर्थक प्रवासी कार्य किया है। MIF की मध्यस्थता सेल भर्ती प्रक्रियाओं केमोकाइन रिसेप्टर्स CXCR2 और CXCR4, जो MIF को बांधता है और एक गैर आत्मीय तरीके से 21 में सक्रिय करने के लिए जोड़ा गया है। ध्यान से, निर्यात संवर्धन परिषदों उनकी सतह, पर इन रिसेप्टर्स जो इसके अतिरिक्त hypoxic शर्तों के तहत विनियमित बनने के दोनों का इजहारगधा = "xref"> 23, 24। इसके अलावा, जमते सबूत से पता चलता MIF दिल 22, 25, 26 के लिए मैं / आर चोट के दौरान एक समग्र कार्डियो-सुरक्षात्मक प्रभाव पड़ता है। इस संदर्भ में, यह आगे कहा कि MIF hypoxic तनाव विशेष रूप से प्रासंगिक है कि, जब घायल मायोकार्डियम 27 के सीमित वसूली तंत्र पर विचार के दौरान neovascularization समर्थन कर सकते हैं दिखाया गया है। पिछला इन विट्रो अध्ययन और पूर्व नैदानिक माउस मॉडल में प्रयोगों निर्यात संवर्धन परिषदों भर्ती 4 में MIF की भूमिका के बारे में पहले सबूत मुहैया कराए। ध्यान से, MIF भी निर्यात संवर्धन परिषदों के एक प्रमुख माल प्रोटीन है कि इस्कीमिक साइटों 28 के भीतर निर्यात संवर्धन परिषदों भर्ती के दौरान जारी किया जा सकता है। हालांकि, अन्य (एन्जियोजेनिक) सीरम साइटोकिन्स के साथ तुलना में विशेष रूप से नैदानिक ​​सेटिंग में पढ़ाई के मायावी रहते हैं।

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Protocol

निर्यात संवर्धन परिषदों के अलगाव के लिए रक्त स्थानीय आचार समिति के अनुसार सूचित सहमति के बाद स्वस्थ स्वयंसेवकों से प्राप्त हुई थी। सीरम प्रवास assays में इस्तेमाल नमूने रोगियों है कि कार्डियोपल्मोनरी बाईपास (सीपीबी) के उपयोग के साथ पारंपरिक कार्डियक सर्जरी कराना से प्राप्त किया गया। अपवर्जन मानदंड आपातकालीन परिचालन, ज्ञात या संदिग्ध गर्भावस्था थे, 18 साल से कम उम्र के हैं, और सूचित सहमति प्राप्त करने के लिए विफलता patient`s। सीरम नमूनों नैदानिक ​​दिनचर्या माप (तुरंत सर्जरी से पहले और तुरंत महाधमनी पार दबाना के दौरे reperfusion / खोलने के बाद) और बाद में अंतिम विश्लेषण जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करने के अलावा तैयार किया गया। संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आचार समिति, RWTH आकिन विश्वविद्यालय) इस अध्ययन को मंजूरी दे दी। रोगियों 68.6 वर्ष की औसत उम्र और 81.7 किलो के एक औसत वजन दिखाया। पहले से मौजूद बीमारियों में शामिल हैं: उच्च रक्तचाप (65%), क्रोनिक फेफड़े के रोग (19%), अतिरिक्त हृदय धमनीविकृति (16%), मस्तिष्क रोग (6%), गलशोथ (3%), हाल ही में रोधगलन (के भीतर 90 घ 28%), क्रोनिक किडनी रोग (14%), जिगर की बीमारी (2%) और मधुमेह (34%)।

1. T75 कुप्पी की कोटिंग:

  1. 5 एमएल fibronectin समाधान T75 फ्लास्क प्रति (1 मिलीग्राम मानव fibronectin 15 एमएल ultrapure पानी में पतला) तैयार करें।
  2. एक T75 फ्लास्क समाधान जोड़ें और इंतजार जब तक पानी सुखाया जाता है। वाष्पीकरण के कारण अलगाव की प्रक्रिया के दौरान किसी भी अनावश्यक रुकावट से बचने के लिए अग्रिम में इस प्रक्रिया प्रदर्शन (जैसे रातोंरात) और कमरे के तापमान पर। यह समाधान 4.44 माइक्रोग्राम फ़ाइब्रोनेक्टिन / 2 सेमी देता है।
  3. वृद्धि कारक निर्माता द्वारा प्रदान की खुराक के साथ बेसल MV2 मध्यम सप्लीमेंट द्वारा endothelial सेल मध्यम विकास MV2 तैयार करें।

2. 60 मिलीलीटर रक्त से endothelial पूर्वज कोशिकाओं (निर्यात संवर्धन परिषदों) के अलगाव:

नोट: CD34 पॉजिटिव चयन कॉकटेल एक के रूप मेंएन डी चुंबकीय मोती निर्माता द्वारा प्रदान की कोई सांद्रता देखते हैं एक संयुक्त चयन किट में व्यावसायिक तौर पर उपलब्ध हैं। हालांकि, एंटीबॉडी के बारे में 100 μL 5 एक्स 10 8 कोशिकाओं तक प्रसंस्करण के लिए पर्याप्त हैं। चुंबकीय मोती पानी में पतला कर रहे हैं, dextran लेपित और के बारे में 5,000x छोटे अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मोतियों की तुलना में। अधिक जानकारी के लिए, manufacturer's निर्देश देखें।

  1. सीए 2 -Mg 2 + मुक्त पीबीएस के साथ 1: के साथ (या anticoagulants के बिना) रक्त 1 मिश्रण।
  2. प्रति 50 एमएल ट्यूब घनत्व ढाल समाधान के 15 एमएल जोड़ें। अधिक जानकारी के लिए, manufacturer's निर्देश देखें।
  3. धीरे-धीरे घनत्व ढाल समाधान के शीर्ष पर पतला खून परत।
  4. धीमी गति से तेजी के साथ और ब्रेक लगाना के बिना 30 मिनट के लिए 2500 XG पर अपकेंद्रित्र नमूने हैं।
  5. ध्यान से हर ट्यूब (चित्रा 1) एक बाँझ प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करने का बफी कोट परत जमा है और यह एक और ट्यूब में डाल दिया।घनत्व ढाल समाधान के संग्रह से बचें। उम्मीद PBMC उपज लगभग 3-4 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल रक्त है।

आकृति 1
चित्रा 1: Ficoll समाधान पर Bbuffy कोट का घनत्व ढाल centrifugation। दिखाया घनत्व ढाल समाधान पर 30 मिनट के लिए 2500 XG पर घनत्व ढाल centrifugation का परिणाम है। चित्रित एरिथ्रोसाइट्स और granulocytes (लाल), mononuclear सेल अंश (सफेद परत), प्लाज्मा (पीला), और घनत्व ढाल समाधान (सफेद) कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. पीबीएस के कम से कम 3 संस्करणों के साथ परिधीय रक्त mononuclear सेल अंश पतला और मिश्रण। 200 x जी पर 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अपकेंद्रित्र।
  2. दो बार दोहराएँ कदम 2.6। </ Li>
  3. 5 एमएल MV2 माध्यम में सतह पर तैरनेवाला और resuspend सेल गोली aspirate।
  4. मानव CD34 एंटीबॉडी के 100 μL (5 एक्स 10 8 कोशिकाओं तक प्रसंस्करण के लिए पर्याप्त) प्रति इस्तेमाल बफी कोट जोड़ें और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए बारी बारी से।
  5. Dextran लेपित प्रति इस्तेमाल बफी कोट चुंबकीय मोतियों की 50 μL जोड़ें और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए बारी बारी से।
  6. ऊष्मायन के बाद, प्रत्येक ट्यूब में 3 एमएल की एक अधिकतम के साथ FACS ट्यूबों के लिए निलंबन हस्तांतरण। अधिक मात्रा में चुंबक के साथ की अनुमति नहीं होगी।
  7. चुंबक (ओं) में FACS ट्यूब (ओं) डालें और 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।
  8. चुंबक से बाहर FACS ट्यूबों खींच के बिना सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  9. चुंबक के बाहर 3 एमएल MV2 माध्यम के साथ प्रत्येक FACS ट्यूब में कोशिकाओं Resuspend।
  10. दो बार दोहराएँ 2.12-2.14 कदम।
  11. मैग्नेट के बाहर FACS ट्यूबों खींचो और 3 एमएल MV2 माध्यम में कोशिकाओं resuspend।
  12. पूर्व लेपित T75 एफ में सेल निलंबन स्थानांतरणlasks और कुप्पी प्रति 17 एमएल MV2 माध्यम जोड़ें।
    ध्यान दें: मध्यम 3 दिनों के बाद बदला जाना चाहिए। एक सप्ताह के बाद, कोशिकाओं धुरी संरचनाओं की तरह (चित्रा 2) दिखाने के लिए और उपयोग करने के लिए तैयार हैं। अलगाव की अनदेखी के लिए यह आंकड़ा 3 देखें।

चित्र 2
चित्रा 2: पृथक निर्यात संवर्धन परिषदों के सूक्ष्म छवि। दिखाया एक T75 कुप्पी टुकड़ी के लिए पूर्व में अलग-थलग पड़ जल्दी-निर्यात संवर्धन परिषदों के एक प्रतिनिधि छवि है। स्पष्ट निर्यात संवर्धन परिषदों की धुरी की तरह संरचना है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: फ़्लोचार्ट ईपीसी अलगाव प्रक्रिया दिखा रहा है। चित्रित एक योजना, शो हैईपीसी अलगाव प्रोटोकॉल के एकल कदम हैैं। एक अधिक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए प्रोटोकॉल अनुभाग में धारा 2 देखें।

3. प्रवासन परख

  1. T75 फ्लास्क में निर्यात संवर्धन परिषदों से मध्यम निकालें।
  2. इसे ध्यान झटकों से 5 एमएल पीबीएस के साथ धो लें।
  3. पीबीएस निकालें और 5 एमएल वाणिज्यिक सेल टुकड़ी समाधान जोड़ें। रुको जब तक कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं (एक खुर्दबीन के नीचे की जांच)। ध्यान से कुप्पी के नीचे दोहन से सेना की टुकड़ी में तेजी लाने के।
  4. जब कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं, जल्दी से MV2 पूरा मध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें और एक और ट्यूब में सेल निलंबन हस्तांतरण।
  5. 5 मिनट के लिए 2,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
  6. 5 मिनट के लिए 2,000 XG पर फिर से 5-10 एमएल पीबीएस में कोशिकाओं और सेंट्रीफ्यूज Resuspend।
  7. दोहराएँ कदम 3.6।
  8. MV2 भूखे मध्यम में सेल गोली (स्थानांतरगमन में अच्छी तरह से प्रति 75 μL की जरूरत है 50,000 कोशिकाओं) Resuspend।
    नोट: जो प्रवास प्रणाली की जरूरत है सेल प्रकार और परख पर निर्भर करता है। वहाँ रचनाकार हैं erent ताकना व्यास और प्लेट आकार (कुओं की संख्या)। निर्यात संवर्धन परिषदों के लिए 96 अच्छी तरह से प्रणाली में 5 माइक्रोन के एक छेद के आकार इष्टतम है।
  9. निचले सदन (चित्रा 4) में: सीरम के नमूने के 235 μL जोड़कर प्रवास थाली तैयार (MV2 भूखे माध्यम में 5 सीरम 1 पतला)।

चित्रा 4
चित्रा 4: एक संशोधित Boyden चैंबर में प्रवासन परख। दिखाया एक संशोधित Boyden कक्ष के सामान्य डिजाइन है। सेल संस्कृति सम्मिलित करता है (= ऊपरी सदन) गहरे नीले रंग में संकेत कर रहे हैं और निचले सदन में डाला जाता है। इन आवेषण के नीचे (लेकिन दीवारों) pores सहित फिल्टर प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है। (क) समय बिंदु शून्य पर सेटअप दिखाता है। (ख) एक चुना समय बिंदु के बाद, कोशिकाओं को एक प्रोत्साहन की दिशा में फिल्टर के माध्यम से पलायन कर रहे हैं।fig4large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. शीघ्र ही डालने से पहले सेल समाधान जोड़ने जोड़ें।
  2. सेल के समाधान के 75 μL (= 50,000 कोशिकाओं) ऊपरी सदन में जोड़ें।
  3. निर्यात संवर्धन परिषदों 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे और 5% सीओ 2 (माइग्रेशन समय सेल प्रकार और सिस्टम पर निर्भर करता है) के लिए पलायन करते हैं।
    1. सीरम ऑटो प्रतिदीप्ति कलाकृतियों से बचने के लिए, अर्द्ध स्वचालित सॉफ्टवेयर "ImageJ" का उपयोग कोशिकाओं एक खुर्दबीन के नीचे अच्छी तरह से की तस्वीरें लेने से चले गए कोशिकाओं यों और गिनती।
  4. ऊपरी सदन (सभी गैर-माइग्रेट कोशिकाओं से युक्त) निकालें।
  5. 70 μL 3.6% paraformaldehyde समाधान जोड़ें, Hoechst डाई (1 पतला: 1000) भी शामिल है। प्लेट 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 रात भर में संग्रहित किया जा सकता है।
  6. शीघ्र ही थाली अपकेंद्रित्र 1-2 मिनट के लिए 2,000 XG पर ही फोकल हवाई जहाज़ में सभी कोशिकाओं को पाने के लिए।
  7. डब्ल्यू प्रति 5 तस्वीरें ले लोपक्ष (आंकड़े 5 और 6) एक 100x बढ़ाई साथ।

चित्रा 5
चित्रा 5: योजना के लिए गए चित्रों की स्थिति दिखा रहा है। इस योजना के पांच ली गई तस्वीरों, जो अच्छी तरह से करने के संबंध में चले गए कोशिकाओं के निर्धारण के लिए आवश्यक हैं की स्थिति को दर्शाया गया है। चित्रों कोशिकाओं की गिनती और अच्छी तरह से हर एक के लिए एक मतलब मूल्य की गणना करने के लिए लिया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: सेल मात्रा के लिए सूक्ष्म छवि। दिखाया एक प्रतिनिधि छवि है, जो सेल मात्रा का ठहराव के लिए ले जाया गया है। कोशिकाओं दाग और तय यूएसआई थे3.6% paraformaldehyde में एनजी Hoechst डाई। डॉट्स तय की और endothelial पूर्वज कोशिकाओं दाग का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा अर्द्ध स्वचालित सॉफ्टवेयर "ImageJ" की मदद से चले गए कोशिकाओं की गणना।

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Representative Results

पृथक endothelial पूर्वज कोशिकाओं की विशेषता

सबसे पहले, acLDL के तेज सत्यापित किया गया था, साथ ही पृथक सेल की आबादी की सतह पर KDR की अभिव्यक्ति, और CD31। चित्रा 7A शो के रूप में, अलग-थलग निर्यात संवर्धन परिषदों के 85.1% acLDL की एक तेज दिखाया और CD31 व्यक्त किया। आंकड़े 7B और 7c आगे, हालांकि वहां एक छोटी आबादी, दोनों मार्करों के लिए नकारात्मक हो रहा है दोनों मार्कर का एक समरूप वितरण प्रदर्शित करता है। एक दूसरे चरण में, KDR के साथ संयोजन में acLDL के FACS विश्लेषण किया गया था। चित्रा 8A से पता चलता है कि अलग कक्षों का 80% से अधिक acLDL की एक तेज और उनकी सतह पर KDR की अभिव्यक्ति दिखाया। आंकड़े 8B और 8C इन मार्करों की एकरूपता दिखा।

importanc सत्यापित करने के लिएसंस्कृति के समय के दौरान fibronectin लेपित व्यंजन का ई, fibronectin लेपित व्यंजन पर संस्कृति के सात दिनों के बाद अलग-थलग निर्यात संवर्धन परिषदों (के रूप में हमारे प्रोटोकॉल में कहा गया है) के साथ एक fibronectin लेपित सतह पर संस्कृति के दो दिनों के बाद अलग कक्षों के बीच तीन मार्कर की तुलना प्रदर्शन किया गया था, दोनों पिछले CD34 + -selection के साथ। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 9a, दो दिन से संवर्धित कोशिकाओं का केवल 46.4% फ़ाइब्रोनेक्टिन पर संस्कृति के सात दिनों के बाद कोशिकाओं का 85% की तुलना में acLDL की एक तेज करने के साथ ही उनकी सतह पर CD31 की अभिव्यक्ति दिखाया। इसके अलावा, histograms (आंकड़े 9b और 9c) संस्कृति के दो दिनों के सात दिनों की तुलना में बाद दोनों मार्कर की तीव्रता कम दिखाने (आंकड़े 7B और 7C)। एक ही मार्कर acLDL और KDR का एक संयोजन के लिए सच है। फ़ाइब्रोनेक्टिन पर संस्कृति के दो दिनों के बाद, सभी कोशिकाओं का केवल 68.0% उनकी सतह पर acLDL की एक तेज करने के साथ ही KDR की अभिव्यक्ति से पता चला है (चित्राएस 10A-10C)। फ़ाइब्रोनेक्टिन पर संस्कृति के सात दिनों के बाद, कोशिकाओं की 83.6% उनकी सतह (आंकड़े 8A-8c) पर acLDL की एक तेज और KDR की अभिव्यक्ति दिखाया।

एक अगले चरण में, CD34 + -selection निर्यात संवर्धन परिषदों के अलगाव के दौरान के महत्व पर मूल्यांकन किया गया था। इसलिए, कोशिकाओं घनत्व ढाल centrifugation और fibronectin पर संस्कृति के सात दिनों के सहित उपस्थित प्रोटोकॉल के अनुसार चयन किया है, लेकिन जो CD34 + -selection अलग थे याद किया। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 10A, सभी अलग कक्षों का 18% न एक्सप्रेस CD31 करते और न ही CD34 + -selection है, जो एक CD31 अभिव्यक्ति और acLDL की एक तेज दिखाने के बाद कम से कम 8% की तुलना में acLDL की एक तेज, दिखाने (चित्रा 7A) । इसके अलावा, आंकड़े 11b और 11C चलता है कि अलग कक्षों संबंधित की तुलना में दोनों मार्कर के बारे में बहुत inhomogeneous हैं 7c पिछले CD34 + -selection के साथ एक सेल की आबादी में एक ही मार्कर दिखा।

कार्डिएक सर्जरी के दौरान सीरम cytokine स्तर

निम्नलिखित MIF, CXCL12, CXCL8 और वीईजीएफ़ के सीरम स्तर घूम की सांद्रता पर मायोकार्डियल मैं / आर हृदय शल्य चिकित्सा के प्रभाव की पहचान करने के लिए, सीरम नमूनों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एलिसा (चित्रा 12) ने बाद के विश्लेषण के लिए तैयार किया गया है पूर्व और इंट्रा-ऑपरेशन । MIF के सीरम का स्तर (100.3 एनजी / एमएल बनाम 127.4 एनजी / एमएल, पी = 0.027) आधारभूत मूल्यों की तुलना में एक महत्वपूर्ण अंतर शल्य चिकित्सा वृद्धि देखी गई। इसी तरह, CXCL12 स्तरों सर्जरी के दौरान सीरम में उल्लेखनीय वृद्धि (0.101 एनजी / एमएल बनाम 0.198 एनजी / एमएल, पी = 0.011) से पता चला। MIF और CXCL12 के लिए इसी प्रकार, CXCL8 काफी सर्जरी के दौरान वृद्धि हुई (0.15 एनजी / एमएल बनाम 0.3 एनजी / एमएल, पी = 0.022)। शेष भाग मेंRAST, वीईजीएफ़ सांद्रता प्रेक्षण अवधि के दौरान किसी भी महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं दिखा था (0.154 एनजी / एमएल बनाम 0.134 एनजी / एमएल, पी = 0.583) 1।

Endothelial पूर्वज कोशिकाओं के प्रवास क्षमता

Patients' सीरम नमूनों का सीधा प्रभाव की जांच और उसमें ईपीसी प्रवास पर साइटोकिन्स / chemokines / एन्जियोजेनिक कारकों निहित करने के लिए, एक पूर्व vivo प्रवास सीरम नमूनों का उपयोग परख है, जो तैयार किया गया पहले और सर्जरी के दौरान, प्रदर्शन किया गया था। निर्यात संवर्धन परिषदों स्वस्थ स्वयंसेवकों से अलग थे। जैसा कि चित्र 13 में दर्शाया गया है, ईपीसी पलायन दर काफी पूर्व ऑपरेशन लिया नमूनों की तुलना में इंट्रा-ऑपरेशन लिया नमूनों की ओर बढ़ गई (+ 35% आधारभूत की तुलना में, पी = 0.047)।

पिछले अध्ययनों में पहले से ही है कि मैं प्रदर्शन के बाद से / आर सेव की एक स्राव से चलाता हैआम साइटोकिन्स कि ल्युकोसैट chemotaxis और प्रवास, प्रवास assays MIF, CXCL12, CXCL8, और वीईजीएफ़ सहित इन संभावित chemoattractants, का उपयोग कर मिलाना प्रदर्शन किया गया। भी विवो में ईपीसी भर्ती पर इन साइटोकिन्स, इन विट्रो पलायन प्रयोगों में अतिरिक्त के प्रभाव का एक बेहतर समझ पाने के लिए, प्रवास उपकरणों प्रदर्शन किया गया के निचले सदन के लिए ऊपर साइटोकिन्स के physiologically मापा सांद्रता लागू करने,।

के रूप में 100 और 130 के बीच एनजी MIF सीरम सांद्रता / एमएल (चित्रा 12), 100 एनजी की एकाग्रता मापा गया था / पुनः संयोजक MIF एमएल इस्तेमाल किया गया था, जो मध्यम नियंत्रण की तुलना में ईपीसी प्रवास में एक> 6 गुना वृद्धि (करने के लिए नेतृत्व चित्रा 14)। 300 स्नातकोत्तर / एमएल - इसके विपरीत, CXCL12, CXCL8, और वीईजीएफ़ के सीरम सांद्रता 150 की रेंज में थे। ध्यान से, इन सांद्रता इन विट्रो में ईपीसी प्रवास पर कोई असर मध्यस्थता नहीं किया(चित्रा 14)। ऐसा नहीं है कि इन चार साइटोकिन्स बीच, MIF विवो 1 में ईपीसी प्रवास पर रिश्तेदार मजबूत प्रभाव को दर्शाती है इसलिए बोधगम्य है।

चित्रा 7
चित्रा 7: दिन 7 पर पृथक निर्यात संवर्धन परिषदों के FACS विश्लेषण (एक) दिखाया CD34 + चयन और fibronectin लेपित व्यंजन पर 7 दिन संस्कृति अवधि के बाद अलग-थलग निर्यात संवर्धन परिषदों के acLDL और CD31 कोशिका की सतह अभिव्यक्ति के तेज है। ऊपरी बाएँ: प्रकोष्ठों acLDL के तेज दिखा, लेकिन CD31 व्यक्त नहीं करते। ऊपरी सही: प्रकोष्ठों acLDL के तेज दिखाने के लिए और CD31 व्यक्त करते हैं। नीचे छोड़ दिया: प्रकोष्ठों acLDL का कोई तेज दिखाने के लिए और CD31 व्यक्त नहीं करते। नीचे सही: प्रकोष्ठों acLDL का कोई तेज दिखा, लेकिन CD31 व्यक्त करते हैं। (ख) दिखाया पृथक निर्यात संवर्धन परिषदों द्वारा तेज बाद पीई संयुग्मित acLDL के हिस्टोग्राम है। (ग) में दिखाया गया FITC-conj के हिस्टोग्राम हैपृथक निर्यात संवर्धन परिषदों की कोशिका की सतह CD31 के लिए बाध्य करने के बाद ugated CD31 एंटीबॉडी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आंकड़ा 8
8 चित्रा: दिन 7 पर पृथक निर्यात संवर्धन परिषदों के FACS विश्लेषण (एक) दिखाया CD34 + चयन और fibronectin लेपित व्यंजन पर 7 दिन संस्कृति अवधि के बाद अलग-थलग निर्यात संवर्धन परिषदों के acLDL और KDR कोशिका की सतह अभिव्यक्ति के तेज है। ऊपरी बाएँ: कोशिकाओं acLDL के तेज दिखा, लेकिन KDR व्यक्त नहीं करते। ऊपरी सही: प्रकोष्ठों acLDL के तेज दिखाने के लिए और KDR व्यक्त करते हैं। नीचे छोड़ दिया: प्रकोष्ठों acLDL का कोई तेज दिखाने के लिए और KDR व्यक्त नहीं करते। नीचे सही: प्रकोष्ठों acLDL का कोई तेज दिखा, लेकिन KDR व्यक्त करते हैं। (ख) दिखाया पृथक निर्यात संवर्धन परिषदों द्वारा तेज बाद पीई संयुग्मित acLDL के हिस्टोग्राम है। (ग) दिखाया गया हैपृथक निर्यात संवर्धन परिषदों की कोशिका की सतह KDR के लिए बाध्य करने के बाद FITC संयुग्मित KDR एंटीबॉडी के हिस्टोग्राम। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

9 चित्रा
चित्रा 9: 2 दिवस पर अलग निर्यात संवर्धन परिषदों के FACS विश्लेषण (एक) दिखाया CD34 + चयन और fibronectin लेपित व्यंजन पर 2 दिन संस्कृति अवधि के बाद अलग-थलग निर्यात संवर्धन परिषदों के acLDL और CD31 कोशिका की सतह अभिव्यक्ति के तेज है। ऊपरी बाएँ: कोशिकाओं acLDL के तेज दिखा, लेकिन CD31 व्यक्त नहीं करते। ऊपरी सही: प्रकोष्ठों acLDL के तेज दिखाने के लिए और CD31 व्यक्त करते हैं। नीचे छोड़ दिया: प्रकोष्ठों acLDL का कोई तेज दिखाने के लिए और CD31 व्यक्त नहीं करते। नीचे सही: प्रकोष्ठों acLDL का कोई तेज दिखा, लेकिन CD31 व्यक्त करते हैं। (ख) दिखाया पृथक निर्यात संवर्धन परिषदों द्वारा तेज बाद पीई संयुग्मित acLDL के हिस्टोग्राम है। ( यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 10
चित्रा 10: 2 दिवस पर अलग निर्यात संवर्धन परिषदों के FACS विश्लेषण (एक) दिखाया CD34 + चयन और fibronectin लेपित व्यंजन पर 2 दिन संस्कृति अवधि के बाद अलग-थलग निर्यात संवर्धन परिषदों के acLDL और KDR कोशिका की सतह अभिव्यक्ति के तेज है। ऊपरी बाएँ: कोशिकाओं acLDL के तेज दिखा, लेकिन KDR व्यक्त नहीं करते। ऊपरी सही: प्रकोष्ठों acLDL के तेज दिखाने के लिए और KDR व्यक्त करते हैं। नीचे छोड़ दिया: प्रकोष्ठों acLDL का कोई तेज दिखाने के लिए और KDR व्यक्त नहीं करते। नीचे सही: प्रकोष्ठों acLDL का कोई तेज दिखा, लेकिन KDR व्यक्त करते हैं। (ख) दिखाया तेज बाद पीई संयुग्मित acLDL के हिस्टोग्राम हैपृथक निर्यात संवर्धन परिषदों द्वारा। (ग) में दिखाया गया पृथक निर्यात संवर्धन परिषदों की कोशिका की सतह KDR के लिए बाध्य करने के बाद FITC संयुग्मित KDR एंटीबॉडी के हिस्टोग्राम है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

11 चित्रा
चित्रा 11: दिन 7 पर पृथक निर्यात संवर्धन परिषदों के FACS विश्लेषण (एक) दिखाया पिछले CD34 + चयन के बिना पृथक निर्यात संवर्धन परिषदों के acLDL और CD31 कोशिका की सतह अभिव्यक्ति के तेज है, लेकिन fibronectin लेपित व्यंजन पर 7 दिन संस्कृति की अवधि भी शामिल है। ऊपरी बाएँ: प्रकोष्ठों acLDL के तेज दिखा, लेकिन CD31 व्यक्त नहीं करते। ऊपरी सही: प्रकोष्ठों acLDL के तेज दिखाने के लिए और CD31 व्यक्त करते हैं। नीचे छोड़ दिया: प्रकोष्ठों acLDL का कोई तेज दिखाने के लिए और CD31 व्यक्त नहीं करते। नीचे सही: प्रकोष्ठों acLDL का कोई तेज दिखा, लेकिन CD31 व्यक्त करते हैं। (ख) से पता चलापृथक निर्यात संवर्धन परिषदों द्वारा तेज बाद पीई संयुग्मित acLDL के हिस्टोग्राम है। (ग) में दिखाया गया पृथक निर्यात संवर्धन परिषदों की कोशिका की सतह CD31 के लिए बाध्य करने के बाद FITC संयुग्मित CD31 एंटीबॉडी के हिस्टोग्राम है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 12
चित्रा 12: कार्डिएक सर्जरी के दौरान सीरम साइटोकाइन स्तर। CXCL8, वीईजीएफ़, CXCL12, और रोगियों के MIF के सीरम सांद्रता है कि हृदय शल्य चिकित्सा एलिसा का उपयोग कर कीमोथैरेपी के मापन। दिखाया पूर्व ऑपरेटिव ± SEM के अंतर ऑपरेटिव सांद्रता की तुलना में मूल्यों का मतलब कर रहे हैं (*: पी <0.05; बनाम पूर्व सेशन)

चित्रा 13
चित्रा 13: मैंn रोगी सीरम की ओर निर्यात संवर्धन परिषदों के इन विट्रो प्रवासन। दिखाया रोगियों, जो कार्डियक सर्जरी कराना के सीरम नमूनों की दिशा में स्वस्थ स्वयंसेवकों के ईपीसी प्रवास में अंतर ऑपरेटिव वृद्धि हुई है। MV2 सीरम की कमी से जूझ माध्यम में अच्छी तरह से प्रति 50,000 कोशिकाओं को एक Transwell प्रणाली के ऊपरी सदन के लिए जोड़ा गया था। एक ही माध्यम के साथ 5: निचले सदन में सीरम नमूनों 1 पतला थे। कोशिकाओं को एक 5 माइक्रोन झिल्ली के माध्यम से 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर 3 घंटे के लिए चले गए। सलाखों ± SEM के मतलब मूल्यों का प्रतिनिधित्व (*: पी <0.05)

चित्रा 14
चित्रा 14: संयोजक साइटोकिन्स की ओर निर्यात संवर्धन परिषदों के इन विट्रो प्रवास में। दिखाया पुनः संयोजक CXCL8 के प्रतिनिधि सांद्रता की ओर निर्यात संवर्धन परिषदों के पलायन है, CXCL12, वीईजीएफ़, और MIF सीरम की कमी से जूझ मध्यम (= आधारभूत) की तुलना में। केवल MIF में सक्षम थाphysiologically मापा सांद्रता में एक बढ़ा ईपीसी प्रवास मध्यस्थता करने के लिए। पुनः संयोजक साइटोकिन्स MV2 सीरम की कमी से जूझ माध्यम में पतला कर रहे थे। कोशिकाओं को एक 5 माइक्रोन झिल्ली के माध्यम से 3 घंटे के लिए चले गए। (: पी <0.01 बनाम सीरम की कमी से जूझ मध्यम **) सलाखों ± SEM के मतलब मूल्यों का प्रतिनिधित्व

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Discussion

इस अध्ययन के पहले भाग के कार्डियक सर्जरी के रोगियों के खून की एक व्यापक मूल्यांकन सक्षम करने के लिए स्वस्थ स्वयंसेवकों के परिधीय रक्त से मानव निर्यात संवर्धन परिषदों के अलगाव शामिल थे। इसलिए, एक घनत्व ढाल centrifugation प्लाज्मा, granulocytes और एरिथ्रोसाइट्स से PBMC अंश अलग करने के लिए किया गया था। दूषित प्लेटलेट्स की सबसे को दूर करने के लिए, इस सेल अंश कम के अधीन था और धीमी गति से धोने कदम 29, 30। अगले, CD34 + कोशिकाओं शेष लिम्फोसाइटों, और monocytes से पूर्वज कोशिकाओं को अलग करने के लिए शेष अंश से अलग थे। अंत में, सेल निलंबन एक वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध endothelial सेल मध्यम विकास अन्य (पूर्वज) माइलॉयड वंश 3 की कोशिकाओं से endothelial पूर्वज कोशिकाओं को अलग करने में fibronectin लेपित व्यंजन पर संवर्धित किया गया था। ध्यान से, यह चर्चा की है प्लेटलेट्स एक CD34 कोशिका की सतह एक्सप्रेस दिखा सकते हैं किआयन भी है। हालांकि पिछले अध्ययनों प्लेटलेट्स के लिए कुछ विरोधी CD34 एंटीबॉडी के बंधन का प्रदर्शन किया, यह अन्य (CD34 पॉजिटिव) कोशिकाओं 31, 32 के साथ प्लेटलेट्स के एकत्रीकरण के कारण एक मूर्ति हो सकता है। हालांकि, ज्यादातर प्लेटलेट्स दोहराया धीमी गति से धोने कदम से अलग किया जा सकता है। प्लेटलेट्स के अलावा, उनके पूर्ववर्ती - megakaryocytes - इस hematopoietic पूर्वज सेल प्रतिजन व्यक्त करते हैं और, परिधीय रक्त में मौजूद हो सकता है, हालांकि वे मुख्य रूप से अस्थि मज्जा 33, 34 में पाए जाते हैं। इसके अलावा, यह भी वर्णित है कि कोशिका की सतह मार्कर CD34, इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल परिपक्व endothelial कोशिकाओं 35 पर बहुत कम स्तर में व्यक्त किया जाता है। इसलिए, यह सावधानी से, प्लेटलेट्स / megakaryocytes या परिपक्व endothelial कोशिकाओं द्वारा एक संभावित संक्रमण पर विचार करने के लिए जब निर्यात संवर्धन परिषदों को अलग-थलग महत्वपूर्ण है। इसलिए, 2.6 कदम isolatio के दौरान विशेष रूप से प्रासंगिक हैनिर्यात संवर्धन परिषदों के एन प्लेटलेट्स निकालने के लिए।

दो दिन और फ़ाइब्रोनेक्टिन पर संस्कृति के सात दिनों के बाद fibronectin लेपित व्यंजन, सेल आबादी पर अलग कक्षों संवर्धन के महत्व को स्पष्ट करने के लिए पिछले CD34 पॉजिटिव चयन के साथ दोनों की तुलना में थे। दो दिन, अलग कक्षों में से आधे से भी कम समय उनकी सतह पर acLDL की एक तेज और CD31 के एक साथ अभिव्यक्ति दिखाया। इसके अलावा, के बारे में histograms पर दोनों मार्कर का एक कम तीव्र अभिव्यक्ति देखा जा सकता है। इन आंकड़ों से पता चलता है कि endothelial सेल विशिष्ट माध्यम में फ़ाइब्रोनेक्टिन पर संस्कृति के सात दिनों के लक्षण endothelial अभिव्यक्ति पैटर्न दिखा निर्यात संवर्धन परिषदों पाने के लिए जरूरी हैं। इस चरण में, यह महत्व फ़ाइब्रोनेक्टिन की सही एकाग्रता / राशि का उपयोग करने के लिए है। Wijelath और उनके सहयोगियों ने पहले प्रदर्शन किया है कि फ़ाइब्रोनेक्टिन endothelial सेल की तरह पैटर्न, वीईजीएफ़ 36 के साथ संयोजन में सबसे अधिक संभावना की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देता है।

अगले सेंट मेंप्रोटोकॉल के ईपी, CD34 + सेल निलंबन के -selection के महत्व की जांच की थी, fibronectin लेपित व्यंजन पर संस्कृति के 7 दिनों के बाद अलग-थलग साथ और पिछले CD34 + -selection बिना कोशिकाओं की तुलना। दोनों मार्कर (acLDL तेज और CD31 अभिव्यक्ति) लापता कोशिकाओं की मात्रा पिछले CD34 + -selection इस कदम सहित अलगाव की तुलना में बिना सेल अलगाव के बाद बहुत अधिक था। के रूप में कोशिकाओं, CD34 + -selection के साथ अलग-थलग करने की तुलना में CD31 के inhomogeneous अभिव्यक्ति ने संकेत दिया दिलचस्प है, फ़ाइब्रोनेक्टिन पर संस्कृति के सात दिनों के बाद, कोशिकाओं लापता CD34 + -selection, एक कम समरूप सेल की आबादी दिखाया। इन आंकड़ों से पता चलता है कि CD34 + -selection अन्य monocytes / मैक्रोफेज से निर्यात संवर्धन परिषदों को सुलझाने के लिए आवश्यक है। इस प्रोटोकॉल की स्थापना के दौरान हमने पाया कि CD34 + 37 डिग्री सेल्सियस पर MV2 माध्यम में -selection जब बहुत कम ते के साथ तुलना में जीवित कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि की ओर जाता है,mperatures है, जो जरूरत सावधानी से भविष्य के अध्ययनों में जांच की जा सके। हम जानते हैं कि जब 37 डिग्री सेल्सियस पर इस प्रोटोकॉल, कैल्शियम युक्त मध्यम में एंटीबॉडी ऊष्मायन आवेदन करने वाले गैर विशिष्ट बातचीत और बाध्यकारी को जन्म दे सकती स्वीकार किया है। भविष्य में, बफर सिस्टम कम तापमान पर कैल्शियम की कमी का परीक्षण किया और इस संभावित confounding कारक से बचने के लिए स्थापित किया जाना चाहिए।

विशेष रूप से, सीरम नमूनों के साथ सेल प्रवास प्रयोगों के बारे में हमारी प्रारंभिक विश्लेषण के दौरान, माप पहले एक प्रतिदीप्ति microplate रीडर और कोशिकाओं के calcein-धुंधला का उपयोग, जैसा कि पहले विभिन्न कोशिकाओं प्रकार के लिए वर्णित (जैसे मानव नाल नस endothelial कोशिकाओं, HUVEC) 37 प्रदर्शन किया गया। कक्षों के बीच अलग अलग विलुप्त होने के मूल्यों संकेत दिया अकेले न केवल सीरम नमूनों, लेकिन यह भी मध्यम पहले ही मापा प्रतिदीप्ति, जो सावधानी से विचार करने की जरूरत पर एक उल्लेखनीय प्रभाव पड़ता है। इसलिए, wई हमारे प्रोटोकॉल अनुकूलित और एक माप प्रणाली है जिसमें कोशिकाओं प्रकाश माइक्रोस्कोपी के माध्यम से देखा जा सकता है और गिना एक अर्द्ध स्वचालित सॉफ्टवेयर द्वारा करने के लिए बंद कर दिया।

निर्यात संवर्धन परिषदों परिधीय रक्त में कोशिकाओं का लगभग 0.1% के लिए खाते और यह इन विशिष्ट कोशिकाओं 38 को अलग-थलग करने के लिए मुश्किल है हालांकि अध्ययन के एक प्रभावशाली संख्या संकेत दिया है कि निर्यात संवर्धन परिषदों लाभकारी प्रभाव प्रदान करते हैं और अंगों में और मायोकार्डियम 39 में इस्कीमिक घटनाओं के बाद ऊतक vascularization सुधार हो सकता है 40। फिर भी, यह अभी भी नैदानिक ​​व्यवहार में इन निष्कर्षों को अनुवाद करने के लिए और इसके नैदानिक ​​प्रासंगिकता का मूल्यांकन करने के लिए एक सतत चुनौती है। कारणों से अलग chemoattractants के स्राव, जो पहले 22, 41 दिखाया गया है पर कई perioperative कारकों का महत्वपूर्ण प्रभाव के कारण हो सकता है। इसलिए, इस अध्ययन, अलग सी की भूमिका के दूसरे भाग मेंदौरे में खोज की सेटिंग में निर्यात संवर्धन परिषदों के पलायन पर ytokines / आर मूल्यांकन किया गया। इसलिए, कार्डियक सर्जरी के रोगियों में साइटोकिन्स के सीरम सांद्रता मापा गया। MIF, साथ ही CXCL12 और CXCL8 एक महत्वपूर्ण अंतर ऑपरेटिव वृद्धि देखी गई। जब इन निष्कर्षों इन विट्रो प्रयोगों में वापस अनुवाद, वर्तमान परिणामों का प्रदर्शन न तो एक CXCL12- है और न ही इन विट्रो में मापा शारीरिक सांद्रता में ईपीसी प्रवास पर CXCL8 की मध्यस्थता प्रभाव नहीं है। वर्णित ईपीसी अलगाव मॉडल और बाद में पलायन परख का प्रयोग, MIF ईपीसी पलायन 42 का एक प्रमुख मध्यस्थ के रूप में पहचान की थी। इस संदर्भ में, Kanzler एट अल। एक प्रयोगात्मक माउस मॉडल है कि MIF और वीईजीएफ़ हाइपोक्सिया 23 के तहत ईपीसी प्रवास पर मजबूत प्रभाव प्रदान में प्रदर्शन किया। दिलचस्प बात यह है वीईजीएफ़ की माप दिखाने वीईजीएफ़ रक्त सांद्रता में कोई महत्वपूर्ण अंतर ऑपरेटिव परिवर्तन, जो बाध्यकारी ओ से हो सकता है कि वहाँएफ वीईजीएफ़ हेपरिन के intraoperative मानकीकृत आवेदन करने के लिए। इसलिए, MIF कार्डियक सर्जरी के रोगियों में निर्यात संवर्धन परिषदों की भर्ती में एन्जियोजेनिक chemokines के बीच में एक प्रमुख भूमिका निभा सकते हैं और आरंभ और अभी तक चोट के बाद 43, 44 की साइट के लिए निर्यात संवर्धन परिषदों की तस्करी के माध्यम से मायोकार्डियल मैं / आर चिकित्सा की प्रक्रिया में योगदान कर सकते, के रूप में MIF स्तरों तुरंत वृद्धि हुई है के बाद दौरे मैं / आर, यह सट्टा रहता निर्यात संवर्धन परिषदों की भर्ती पर MIF की मध्यस्थता प्रभाव हृदय remodeling और angiogenesis, जिसके बाद दौरे मैं / आर 23 दिल की विफलता की रोकथाम में महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है प्रभावित कर सकते हैं कि क्या। हालांकि, इस तरह के विश्लेषण के लिए आगे बढ़ने से पहले, यह महत्वपूर्ण है आगे निर्यात संवर्धन परिषदों के विभिन्न उपप्रकार को चिह्नित करने और मानव जीव विज्ञान में अपनी कार्यात्मक भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए। इस संबंध में वर्तमान प्रोटोकॉल मैं कैसे सक्षम करने के लिए मानव परिधीय रक्त से निर्यात संवर्धन परिषदों को अलग-थलग करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करता हैआगे व्यापक लक्षण वर्णन और भविष्य के अध्ययन टीएस।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों कोई स्वीकृतियां है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibronectin Biochrom AG L7117 Coating of T-75 flasks
Aqua ad iniectabilia Fresenius Kabi
Endothelial cell growth medium MV2 Promo Cell C-22221
Endothelial cell growth medium MV2 SupplementMix Promo Cell C-39226
Ficoll-Paque plus GE Healthcare 17-1440-03 Density centrifugation
EasySep human CD34 positive Selection Kit Stemcell Technologies 18056 Isolation of CD34+ cells
EasySep magnet Stemcell Technologies 18000
Accutase Sigma-Aldrich A6964-100ML Detachment of cells
Corning HTS transwell 96 well permeable supports Sigma-Aldrich CLS3387-8EA Migration system
Hoechst solution ThermoFisher 33342 Staining of migrated cells
ImageJ National institutes of health xxx Counting of migrated cells

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References

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चिकित्सा अंक 120 endothelial पूर्वज कोशिकाओं अलगाव प्रोटोकॉल बृहतभक्षककोशिका प्रवास निरोधात्मक कारक हृदय शल्य चिकित्सा प्रवास परख
स्वस्थ स्वयंसेवकों और उनके प्रवासी संभावित सीरम नमूनों से प्रभावित कार्डिएक सर्जरी के बाद से endothelial पूर्वज कोशिकाओं का अलगाव
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Emontzpohl, C., Simons, D., Kraemer, … More

Emontzpohl, C., Simons, D., Kraemer, S., Goetzenich, A., Marx, G., Bernhagen, J., Stoppe, C. Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery. J. Vis. Exp. (120), e55192, doi:10.3791/55192 (2017).

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