Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Kalp Damar Cerrahisi sonra serum Örnekleri etkilenerek Sağlıklı Gönüllüler ve Bunların Göçmen Potansiyelden Endotel Ata Hücreleri İzolasyon

doi: 10.3791/55192 Published: February 14, 2017

Summary

Endotelyal Ata Hücreler (EPC'ler) önemlisi, iskemik dokuların neovaskülarizasyonu katılmaktadırlar. Bu yöntem, periferal kandan alınan insan EPC izolasyonunu, hem de kalp cerrahi hastalarında serum örneklerinde karşı göç potansiyelinin belirlenmesi açıklanmaktadır.

Abstract

Endotelyal Ata Hücreler (EPC'ler) hipoksi gibi patolojik koşullar altında kemik iliğinden alınırlar ve en önemlisi, iskemik dokuların neovaskülarizasyonu katılmaktadırlar. EPC kökeni, sınıflandırılması ve karakterizasyonu karmaşık; rağmen, EPC iki önemli alt tipleri kurulmuştur: sözde "erken" EPC ve geç akıbet EPC (geç-EPC) (sonradan as-erken EPC anılacaktır). Bu özellikleri sayesinde bu gibi in vitro kültür sırasında görünüşlerine göre sınıflandırılabilir. "Erken" EPC AK özgü medya periferal kandan alınan mononükleer hücrelerin kültürden sonra bir haftadan az görülürken, geç akıbet EPC 2-3 hafta sonra bulunabilir. Geç aşırı büyüme EPC, "erken" EPC endojen gibi çeşitli anjiyojenik faktörler eksprese eder, doğrudan esas olarak olgun endotel hücrelerine dönüştürmek kabiliyetleri sayesinde, neovaskülarizasyon dahil olmak üzere kabul edilmiştirlı kargo parakrin tarzda anjiyojenezi teşvik etmek. miyokardiyal iskemi / reperfüzyon (I / R) sırasında, çeşitli faktörler, kan damarı oluşumunun bölgelere EPC homing kontrol eder.

Makrofaj migrasyon inhibitör faktör (MIF) bir kemokin gibi pro-enflamatuar ve yayg ifade sitokin ve son zamanlarda fizyolojik konsantrasyonlarda 1 de EPC göç gibi önemli düzenleyici işlev tanımlanmıştır. İlginç bir şekilde, MIF hücre havuzları saklanır ve hızlı bir şekilde çok sayıda uyaranlara sonrası kan akımı içine (örneğin, miyokard enfarktüs) serbest bırakılabilir.
Bu protokol, serum örnekleri karşı in vitro göçü tahlillerinde kullanım için fibronektin kaplı plakalar üzerinde endotelyal büyüme faktörlerini ihtiva eden bir ortam içinde daha sonra kültür CD34-pozitif seçime göre yetişkin insan periferal kanından erken EPC güvenilir izolasyonu ve kültürü için bir yöntemi anlatmaktadır kalp cerrahisi hastalarının. Ayrıca,Diğer iyi bilinen bir anjiogenez uyarıcı sitokinler ile karşılaştırıldığında EPC kemotaksis üzerindeki MIF göç etkisi gösterilmiştir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Endotelyal progenitör hücreleri (EPC), insan kanında dolaşan ve endotelyal hücreler, 2 'farklılaşma yetisine sahiptir. Onlar vaskülojenez katılmak ve çeşitli şekillerde 3, 4 inflamasyon ve iskemi / reperfüzyon (İ / R) yaralanmalar yol açtığı hasarı en aza indirmek yeteneğine sahiptirler. Örneğin, EPC katalaz, glutatyon peroksidaz veya manganez süperoksit dismutazlar (MnSOD) 5 gibi hücre içi antioksidan enzimlerin yüksek seviyelerini göstermektedir. Oksidatif strese karşı yüksek direnç EPC iskemik hasar 6 sonra yüksek reaktif oksijen türlerinin (ROS) ile mikroçevrelerde çalışmasını sağlar. Önceki çalışmalarda da, EPC sayısı vasküler onarım ve EPC dolaşan bir azalma sayıda kardiyovasküler olay 7 oluşumunu öngörür ilişkili olabileceğine işaretclass = "xref"> 8. Ancak, bir EPC açık bir tanımı henüz bulunamamıştır. Şimdiye kadar var EPC için özel bir hücre yüzey markörü ya da tutarlı fenotip olup, bu hücreler arasında periferal kan 9'da çok nadirdir. Bir insan EPC yaralı endotel ve yeni vasküler yapıların yeniden inşasına katkıda bulunmak yeteneği ile dolaşan hücre olarak kabul edilmelidir.

izole edilmesi ve EPC karakterize bir yolu, fibronektine yapışma geçer. Böylece, bu hücrelerin kapasitesi Örnek 3, 10, 11, 1 kollajen tip göre kaplı kaplar fibronektine üstün yapışma göstermek için kullanılır. Bununla birlikte, diğer herhangi bir önceki ya da daha fazla saflaştırma aşaması olmadan fibronektin kaplı kaplar üzerinde mononükleer hücreleri kaplama miyeloid progenitör hücreler, monositler ve T lenfositleri 1 de dahil olmak üzere koloniler neden olduğunu buldu2, 13, 14. Ayrıca, bu durumda, trombositler tek çekirdekli hücre (MNC) fraksiyonu kontamine olabilir ve böylece yapışık hücreler 15 plazma zar proteinleri aktarın.

In vitro yapışma tahlilleri ile karakterize Bunun yanı sıra, farklı hücre yüzeyi markerlerinin bir arada EPC olarak kabul hücre türünü tanımlamak için kullanılır. Bu durumda, fibronektin aracılık ettiği yapışma, sonra, hücreler endotel benzeri özelliklerini ilgili analiz edilir. Bu işlem, iki endotelyal hücreye birleşik işaretleri, asetillenmiş düşük yoğunluklu lipoprotein (acLDL) ve vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptörü 2 (VEGFR-2, KDR), bir rol oynayabilir. Endotel hücreleri ve makrofajlar özellikle "çöpçü hücre yolu" 16 olarak adlandırılan bir süreçte acLDL almak için gösterilmiştir. Başka bir markör proteinin endotelyal ana VEGF reseptörü olarak KDRHücreler 17. Genel olarak EPC endotelyal büyüme faktörleri ve cenin dana serumu ile takviye edilmiş ortam içinde kültürlenir Ancak, makrofajlar da yanlış, sergi, endotel gibi işaretçi profili izole edilmiştir olabilir mümkündür. Daha önce gösterildiği gibi, endotel klimalı bir ortam içinde kültürlendi, eğer makrofajlar "endotel spesifik" proteinleri 18 ifade eder.

Genel olarak, kanda bulunabilir ya da in vitro kültüre edilmesi daha alt tiplerinin içinde EPC iki kategori vardır. Geç akıbet EPC (geç-EPC) kültür 2-3 hafta sonra ortaya çıkar. Bu hücreler, insan göbek damarı endotelial hücrelerde bir tek tabaka halinde hızlı entegre edilmiştir ve kapiler tüpler 19 oluşturabilir. Bunun yanı sıra, örneğin vasküler endotelyal büyüme sağlayan anjiyojenik moleküller ile pasif bir şekilde yaklaşık bir hafta ile hareket için dolaşıma "erken EPC" olarak adlandırılanfaktörü (VEGF) veya CXCL8 19. Koroner arter hastalığı (KAH) olan hastalar KAH 20 olmadan bir kontrol grubuna göre erken EPC anlamlı derecede düşük miktarlarda gösterdi. İlginç bir şekilde, aynı grup bir kontrol grubu ile karşılaştırıldığında geç EPC yüksek miktarda göstermiştir. Başka bir çalışmada erken EPC parakrin tarzda 6 oksidatif koşullarında apoptozundan farklı EPC korumak olduğunu gösterdi. Bu nedenle erken EPC periferik kandan içinde otomatik veya parakrin şekilde diğer hücrelerin göç yoluyla ilgili koruyucu etki sağlayabilir.

Bu protokol, önce insan periferal kanından elde edilen PBMC fraksiyonu izole edilmesi ve daha sonra istenmeyen hücrelere bu hücre süspansiyonu temizlemek için PBMC-fraksiyondan CD34 + hücreleri izole ederek erken EPC saflaştırmak için bir yöntemi anlatmaktadır. CD34, insan hematopoietik kök hücrelerin 9 izolasyonu için kullanılan bir markeri olan + hücreleri fibronektin kaplı doku kültür yüzeyleri üzerinde kültürlenmiştir. Üç gün sonra, ortam, böylece tüm yapışmayan hücreler kaybederek değiştirilir. Son olarak, izole edilmiş bir EPC acLDL alımını ve floresan aktive hücre sınıflandırma (FACS) kullanılarak endotelyal hücre belirteci olarak KDR varlığını doğrulamak için boyanır. Ek bir işaretleyici olarak, endotel hücreleri üzerinde meydana trombosit endotelyal hücre yapışma molekülü (PECAM-1, CD31), analiz edilmiştir.

EPC gelişmiş işe zarar veya infarkt miyokard dokusunun restorasyonu kardiyovasküler hastalıklarda yoğun olarak araştırılmıştır tedavi stratejileri aittir. Ancak, klinik uygulamaya deney sonuçlarının çeviri çeşitli patofizyolojik koşullar sırasında insan vücudunda kompleks hücresel etkileşimi göz önüne alındığında, hala zordur. Ayrıca, miyokard I / R yaralanmalar çeşitli sitokinler, hormonlar ve büyüme fac aşırı salgılanmasını tetikler kan daman oluşumu 13 bölgelerine EPC homing kontrol ları. Daha önce gösterildiği gibi, CXCL8, stromal hücre türetilmiş faktör 1α (SDF-1α, CXCL12), VEGF ve makrofaj göçü önleme faktörü (MIF) önemli ölçüde miyokardiyal I / R hasarı 1 Aşağıdaki serum örneklerinde artmıştır. Bu faktörler arasında, MIF ağırlıklı olarak pro-enflamatuar özelliklere sahip bir pleiotropik kemokin benzeri bir sitokindir. Tarihsel adı aksine, MIF çeşitli hücre tipleri 1, 21, 22, gerçek bir kemokin olarak hareket Pro-göç fonksiyonları vardır. MIF aracılı hücre işe alım süreçleri MIF bağlanan ve olmayan bir soydaş bir şekilde 21 aktive kemokin reseptörleri CXCR2 ve CXCR4, bağlantılı olmuştur. Dikkat çekici bir şekilde, EPC ek hipoksik koşullar altında yukarı regüle olur kendi yüzeyi üzerinde bu reseptörlerin her ikisi de ekspreseeşek = "xref"> 23, 24. Ayrıca, biriken kanıtlar MIF kalp 22, 25, 26 I / R hasarı sırasında genel bir kardiyo-koruyucu etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Bu bağlamda, daha MIF yaralı miyokard 27 sınırlı kurtarmanın göz önüne alındığında, özellikle ilgili olan hipoksik stres sırasında neovaskülarizasyon destekleyebilir gösterilmiştir. Klinik öncesi fare modellerinde Önceki in vitro çalışmalar ve deneyler EPC işe 4 MİF rolü hakkında ilk kanıt sağlamıştır. Not, MIF da iskemik siteleri 28 içinde EPC işe sırasında serbest bırakılabilir EPC önemli bir kargo proteindir. Ancak, diğer (anjiyojenik) serum sitokin ile karşılaştırıldığında, özellikle de klinik ortamlarda yapılan çalışmalar halen mevcuttur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

EPC izolasyonu için kan yerel etik kurul uygun aydınlatılmış onam sonra sağlıklı gönüllülerden elde edilmiştir. göç deneylerinde kullanılan serum örnekleri kardiyopulmoner bypass (CPB) kullanımı ile konvansiyonel kalp cerrahisi uygulanan hastalarda elde edildi. Dışlama kriterleri acil işlemleri, bilinen ya da şüphelenilen gebelik vardı, 18 yıldan az yaş ve bilgilendirilmiş onam elde etmek için başarısızlık patient`s. Serum numuneleri rutin klinik ölçümleri (ameliyattan hemen önce ve hemen miyokardiyal reperfüzyon / aort çapraz kelepçenin açılması sonra) ve daha sonra, analiz zamanına kadar -80 ° C'de saklandı ilave olarak çizildi. kurumsal inceleme kurulu (Etik komitesi, RWTH Aachen Üniversitesi) bu çalışmayı onayladı. Hastalar 68,6 yıl ortalama yaşı ve 81.7 kg ortalama ağırlığı gösterdi. Önceden var olan hastalıklar şunlardır: hipertansiyon (% 65), kronik akciğer hastalığı (% 19), ekstra kardiyak arteriopati (% 16), serebral fonksiyon bozukluğu (% 6), stabil olmayan angina (% 3), son miyokard enfarktüsü (90 gün içerisinde% 28), kronik böbrek hastalığı (% 14), karaciğer hastalığı (% 2) ve diyabet (% 34).

T75 Flask 1. Kaplama:

  1. 5 ml fibronektin çözeltisi T75 şişesi başına (15 mL, aşırı saf su ile seyreltilir, 1 mg insan fibronektin) hazırlayın.
  2. T75 balona çözüm ekleyin ve su buharlaştırılır kadar bekleyin. Buharlaşma ile yalıtım işlemi sırasında gereksiz kesintileri önlemek için, önceden bu işlemi gerçekleştirmek (örneğin, gece boyunca) ve oda sıcaklığında karıştırılmıştır. Bu çözelti, 4.44 | ig fibronektin / cm 2 verir.
  3. üretici tarafından sağlanan büyüme faktörü takviyeleri ile bazal MV2 ortamı ilave ile endotel hücre büyüme ortamı mv2 hazırlayın.

60 ml Blood Endotelyal Ata Hücreler (EPC'ler) 2. izolasyonu:

NOT: CD34-pozitif seçim kokteyl a AsND manyetik boncuk üretici tarafından sağlanan herhangi bir yoğun olarak, kombine bir seçim kiti ticari olarak temin edilebilir. Bununla birlikte, antikorun yaklaşık 100 uL, 5 x 10 8 hücrelere kadar işlem için yeterlidir. Manyetik boncuklar su içinde seyreltilir, dekstran-kaplı ve yaklaşık 5,000X küçük olan diğer ticari olarak temin edilebilen boncuklar ile karşılaştırıldığında. Daha fazla bilgi için, imalatçının talimatlarına bakınız.

  1. Ca 2 + -MG 2 + içermeyen PBS ile 1: (veya antikoagülan olmadan) kan 1 karıştırın.
  2. 50 ml tüp başına yoğunluk gradyan çözeltisi 15 mL ekleyin. Daha fazla bilgi için, imalatçının talimatlarına bakınız.
  3. Yavaş yavaş yoğunluk gradyan çözeltisi üzerine seyreltilmiş kan tabaka.
  4. Santrifüj örnekleri yavaş ivme ile ve fren yapmadan 30 dakika boyunca 2.500 xg'de.
  5. Dikkatlice steril plastik pipet kullanarak her tüp (Şekil 1) buffy coat tabakası toplamak ve başka tüpe koydu.yoğunluk gradyan çözümün toplamaktan kaçının. Beklenen PBMC verimi yaklaşık 3-4 x 10 6 hücre / ml kan.

Şekil 1
Şekil 1: Ficoll Çözüm Bbuffy Coat Yoğunluk Gradient Santrifüj. yoğunluk gradyan çözeltisi ile 30 dakika boyunca 2500 x g'de yoğunluk gradyanlı santrifüj sonucu gösterilmiştir. eritrosit ve granülositler (kırmızı), mononükleer hücre fraksiyonu (beyaz tabaka), plazma (sarı) ve yoğunluk gradyan çözeltisi (beyazımsı) vardır tasvir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. PBS en az 3 hacim periferal kan tek çekirdekli hücre fraksiyonu seyreltin ve karıştırın. 200 x g'de 15 dakika boyunca oda sıcaklığında santrifüje.
  2. iki adımı tekrarlayın 2.6. </ Li>
  3. 5 ml MV2 ortam içinde yüzer ve tekrar süspansiyon hücre pelletini aspire.
  4. Kullanılan ince beyaz kat başına (5 x 10 8 hücrelere kadar işlemden geçmesi için yeterli) insan CD34 antikoru, 100 uL ilave edin ve% 5 CO2 ile 37 ° C 'de 15 dakika boyunca döner.
  5. Kullanılan ince beyaz kat başına dekstran-kaplı manyetik boncuklar 50 ul ekleyin ve% 5 CO2 ile 37 ° C 'de 10 dakika süre ile döner.
  6. İnkübasyondan sonra, her bir tüp içinde 3 ml maksimum FACS tüpler süspansiyon aktarın. Yüksek miktarlar mıknatıslı izin olmayacaktır.
  7. Mıknatıs (lar) FACS tüpü (ler) ini ve 5 dakika bekleyin.
  8. mıknatıs üzerinden FACS tüpleri çekmeden süpernatant atın.
  9. mıknatısın dış 3 mL MV2 ortamı her FACS tüpü içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
  10. Tekrarlayın kez 2.12-2.14 adımları.
  11. mıknatıslar dışında FACS tüpleri çekin ve 3 mL MV2 orta hücreleri tekrar süspansiyon.
  12. Önceden kaplanmış T75 f içine hücre süspansiyonu aktarınlasks ve şişe başına 17 mL MV2 orta ekleyin.
    NOT: orta 3 gün sonra değiştirilmelidir. Bir hafta sonra, hücreler iğ benzeri yapılar (Şekil 2) göstermek ve kullanıma hazırdır. Izolasyon bir overlook için, bakınız Şekil 3.

şekil 2
Şekil 2: İzole EPC mikroskobik görüntü. dekolmanı önce T75 şişesi içinde izole erken EPC bir temsili görüntüsüdür. Görünen EPC iğ gibi bir yapıdır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3: Akış Şeması EPC İzolasyon Prosedürü gösteriliyor. Tasvir bir program, showEPC izolasyon protokolü tek adımları ing. Daha ayrıntılı bir protokol için protokol bölümündeki Bölüm 2'ye bakınız.

3. Yer değiştirme tahlili

  1. T75 şişesi içinde EPC orta çıkarın.
  2. dikkatli bir şekilde sallayarak 5 ml PBS ile yıkayın.
  3. PBS çıkarın ve 5 ml ticari hücre dekolmanı çözüm ekleyin. Hücreler müstakil kadar (mikroskop altında kontrol edin) bekleyin. dikkatlice şişenin dibine vurarak dekolmanı hızlandırın.
  4. Hücreler müstakil zaman, hızlı bir şekilde MV2 tam orta 5 ml ilave edilir ve bir tüp içine hücre süspansiyonu aktarın.
  5. 5 dakika boyunca 2,000 x g'de santrifüjleyin.
  6. 5 dakika boyunca 2,000 x g hızında tekrar 5-10 ml PBS içinde hücreleri ve santrifüj yeniden süspanse edin.
  7. Adımı tekrarlayın 3.6.
  8. MV2 hasret ortamda hücre pelet (hicret kuyu başına 75 uL ihtiyaç vardır 50.000 hücreleri) süspanse edin.
    NOT: Gerekli olan göç sistemi hücre tipine ve tahlil bağlıdır. fark var erent gözenek çapları ve plaka boyutları (kuyuların sayısı). EPC 96 de sisteminde 5 um'lik bir gözenek büyüklüğü en uygunudur.
  9. Alt bölme (Şekil 4) içine serum örneğinin 235 uL ekleyerek göç tabak hazırlayın (mv2 hasret orta 5 serum 1 seyreltilmiş).

Şekil 4,
Şekil 4: Modifiye Boyden Odası Göç Testi. modifiye edilmiş Boyden odasının genel tasarım gösterilmektedir. Hücre kültür ekleri (= üst bölme), koyu mavi olarak ve alt bölme içine yerleştirilir. Bu ekler alt (ama duvarlar) gözenekler dahil filtre sistemini temsil etmektedir. (A) bir zaman noktasında sıfır kurulum gösterir. (B) seçilen zaman noktadan sonra, hücreler bir uyarıcı doğru filtre üzerinden geçirilir.fig4large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. kısa bir süre önce, hücre çözeltisi eklenerek ekleme ekleyin.
  2. Üst bölme içine hücre çözeltisinin 75 uL (= 50.000 hücre) ekleyin.
  3. EPC 2 (göç zamanı hücre tipine ve sistemine bağlıdır) 37 ° C'de 3 saat ve% 5 CO için göç edelim.
    1. Serum otomatik floresan eserler önlemek için, yarı-otomatik yazılım "ImageJ" kullanarak hücrelerin mikroskop altında iyi fotoğraf çekimi ile göç hücreleri ölçmek ve saymak.
  4. Üst bölme (bütün olan, taşınmayan hücreler ihtiva eder) çıkarın.
  5. (: 1,000 1 seyreltilmiş) Hoechst boyası dahil, 70 uL% 3.6 paraformaldehid çözüm ekleyin. Plaka 37 ° C ve% 5 CO2 gece boyunca saklanabilir.
  6. 1-2 dakika boyunca 2.000 xg'de aynı odak düzlemi içine tüm hücreleri elde etmek için kısa bir süre plaka santrifüj.
  7. w başına 5 fotoğraf çekmekell (Şekil 5 ve 6), bir 100x büyütme.

Şekil 5,
Şekil 5: Alınan Resimlerin Konumunu gösteriliyor Programı. Şema oyuk ile ilgili olarak, geçirilmiş hücrelerin saptanması için ihtiyaç duyulan beş alınan resim, konumunu göstermektedir. Resimler hücrelerin sayısı ve de her bir ortalama değeri hesaplamak için alınır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Şekil 6: Hücre Niceleme için mikroskobik görüntü. Hücre ölçümü için alınan bir temsili görüntü, olduğunu göstermiştir. Hücreler, lekeli ve USI sabitlendi% 3.6 paraformaldehid içinde ng Hoechst boyası. noktalar sabit ve endotelyal progenitör hücre lekeli temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından yarı otomatik yazılımlar "ImageJ" seçeneğini kullanarak, göç hücreleri saymak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

İzole Endotel Ata Hücreleri Karakterizasyonu

İlk olarak, acLDL alımı doğrulanmıştır, hem de izole edilmiş hücre popülasyonunun yüzeyinde KDR sentezlenmesi ve CD31. Şekil 7a görüldüğü gibi, izole EPC% 85.1 acLDL bir alımını gösterdi ve CD31 dile getirdi. Her iki belirteçleri negatif küçük bir nüfus, var gibi görünüyor olsa da Şekiller 7b ve 7c ayrıca, her iki belirteçlerin homojen dağılımını göstermektedir. İkinci bir aşamada, KDR ile kombinasyon halinde acLDL FACS analizi yapıldı. Şekil 8a, izole edilmiş hücrelerin% 80'inden fazlası acLDL bir alımını ve yüzeyi üzerinde KDR ekspresyonunu gösterdi göstermektedir. Şekiller 8B ve 8C, bu markerlerin homojenliğini gösterir.

önemini bir doğrulamak içinKültür süresi boyunca fibronektin kaplı yemekler e, (protokolde belirtilen) fibronektin kaplı kaplar üzerinde kültür yedi gün sonra izole edilmiş EPC bir fibronektin kaplı yüzey üzerinde kültür iki gün sonra izole edilmiş hücreler arasında üç belirteçlerin bir karşılaştırma önceki CD34 + -selection, her ikisi de gerçekleştirilmiştir. Şekil 9A'da gösterildiği gibi, iki günlük kültür hücrelerin sadece% 46.4 fibronektin kültürün yedi gün sonra hücreler% 85 ile karşılaştırıldığında, acLDL bir alımını ve bunların yüzeyi üzerinde CD31 ifadesi göstermiştir. Ayrıca, histogram (Şekil 9b ve 9c,) yedi gün ile karşılaştırıldığında kültür iki gün sonra her iki belirteçlerin daha yoğunluğunu gösterir (Şekil 7B ve 7C). Aynı belirteçler acLDL KDR bir kombinasyonu için de geçerlidir. Fibronektin kültürün iki gün sonra tüm hücrelerin sadece% 68.0 yüzeylerinde acLDL bir alımını ve KDR'nin bir ifade göstermiştir (Şekils 10a 10c). Fibronektin üzerindeki kültür yedi gün sonra, hücreler,% 83.6 yüzey (Şekil 8a-8c) ile KDR bir acLDL alınması ve ekspresyonu gösterdi.

Bir sonraki adımda, EPC izolasyonu sırasında CD34 + -selection önemi değerlendirildi. Bu nedenle hücreler yoğunluk gradyan santrifüj ve fibronektin kültürün yedi gün olmak üzere mevcut protokolüne uygun olarak seçilmiş, ancak hangi -selection izole edildi + CD34 kaçırdı. Şekil 10A'da gösterildiği üzere, izole edilmiş hücrelerin üzerinde 18% de ifade CD31, ne de bir CD31 ekspresyonu ve acLDL bir alımını göstermektedir CD34 + -selection, sonra en az% 8 ile karşılaştırıldığında acLDL bir alımını göstermektedir (Şekil 7) . Buna ek olarak, izole edilmiş bir hücre ile ilgili göre her iki belirteç ile ilgili çok homojen olmayan olduğu 11B ve 11C sayılı şekillerde + -selection bir hücre popülasyonu aynı işaretleri gösteren Trong> Şekiller 7B ve 7C.

Kalp Cerrahisinde Serum Sitokin Düzeyleri

MIF CXCL12, CXCL8 VEGF ve dolaşımdaki seviyelerinin konsantrasyonlarına miyokard I / R, aşağıdaki kalp cerrahisi etkisini belirlemek için, serum örnekleri, ticari olarak temin edilebilen ELISA (Şekil 12) ile daha sonra analiz için öncesi ve ameliyat çizildi . MIF serum düzeyleri (100.3 ng / ml vs 127.4 ng / ml, p = 0.027) başlangıç değerlerine göre anlamlı intraoperatif artış gösterdi. Benzer şekilde, CXCL12 seviyeleri ameliyat sırasında serum önemli bir artış (0.101 ng / ml vs 0.198 ng / ml, p = 0.011) göstermiştir. MIF ve CXCL12 benzer şekilde, CXCL8 belirgin bir şekilde (0.15 ng / ml vs 0.3 ng / ml, p = 0.022), ameliyat sırasında artmıştır. Çürük içinderast, VEGF konsantrasyonları gözlem süresi boyunca önemli bir değişiklik göstermemiştir (0.154 ng / ml vs 0.134 ng / ml, p = 0.583) 1.

Endotel Ata Hücreleri Göç Kapasitesi

Bunların bireylerin serum numunelerinin doğrudan etkisini araştırmak ve burada EPC göç ilgili sitokinler / kemokinler / anjiyojenik faktörler ihtiva etmek için önce ve ameliyat sırasında çekilen Serum numuneleri kullanılarak bir ex vivo göçü deneyi, uygulandı. EPC sağlıklı gönüllülerden izole edilmiştir. Şekil 13'te gösterildiği gibi, EPC geçiş oranı önemli ölçüde Ameliyat öncesi alınan numunelere göre ameliyat alınan numunelerin doğru artış (taban çizgisine göre +% 35, p = 0.047).

önceki çalışmalar zaten ben gösterdi beri / R sev bir salgılanmasını tetiklerMİF, CXCL12, CXCL8 ve VEGF dahil olmak üzere bu potansiyel chemoattractants kullanarak lökosit kemotaksisini ve göç, göç deneyleri modüle eral sitokinler yapıldı. Çok cihazlar yapılmıştır göç alt odasına yukarıdaki sitokinlerin fizyolojik ölçülen konsantrasyonları uygulayarak, in vitro göç deneyleri ek in vivo EPC işe bu sitokinlerin etkisi daha iyi anlamak için.

100 ve 130 ng MIF serum konsantrasyonları / ml (Şekil 12), 100 ng konsantrasyonu ölçülmüştür olduğu gibi / yeniden birleştirici MIF mL ortam kontrolü ile karşılaştırıldığında EPC göç bir> 6-katlık bir artışa (yol açan, kullanılan Şekil 14). 300 pg / ml - Buna karşılık, CXCL12, CXCL8 ve VEGF konsantrasyonu 150 aralığında idi. Unutmayın ki, bu konsantrasyonlar in vitro EPC göç üzerinde herhangi bir etkisi aracılık etmedi(Şekil 14). Dört sitokinler arasında, MİF vivo 1 EPC göç konusunda göreceli güçlü etkisini gösterir bu nedenle düşünülebilir.

Şekil 7,
Şekil 7: Gün 7. İzole EPC FACS Analizi (a) fibronektin kaplı yemekler CD34 + seçimi ve 7 günlük kültür süre sonra izole EPC acLDL ve CD31 hücre yüzey ifadesinin alımı gösterilmektedir. Üst sol: Hücreler acLDL alımını göstermektedir, ancak CD31 ifade etmezler. Üst sağ: Hücreler acLDL alımını göstermektedir ve CD31 ifade eder. Sol alt: Hücreler acLDL hiçbir alımını göstermektedir ve CD31 ifade yoktur. Sağ alt: Hücreler acLDL hiçbir alımını göstermektedir, ancak CD31 ifade eder. Gösterilen (b) izole EPC tarafından alımından sonra PE-konjuge acLDL histogramı olduğunu. Gösterilen (c) FITC conj histogramı iseİzole EPC hücre yüzeyi CD31 için bağlama sonra ugated CD31 antikoru. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 8,
Şekil 8: 7. günde İzole EPC FACS analizi, (a) fibronektin kaplı kaplar üzerinde CD34 + seçimi ve 7 günlük kültür süresinden sonra izole EPC acLDL KDR hücre yüzeyi ekspresyonu alımı gösterilmektedir. Üst sol: hücreler acLDL alımını göstermektedir, ancak KDR ifade etmezler. Üst sağ: Hücreler acLDL alımını göstermektedir ve KDR ifade eder. Sol alt: Hücreler acLDL hiçbir alımını göstermektedir ve KDR ifade yoktur. Sağ alt: Hücreler acLDL hiçbir alımını göstermektedir, ancak KDR ifade eder. Gösterilen (b) izole EPC tarafından alımından sonra PE-konjuge acLDL histogramı olduğunu. Gösterilen (c)İzole EPC hücre yüzey KDR bağlandıktan sonra FITC ile konjüge edilmiş KDR antikoru histogram. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 9,
Şekil 9: Gün 2. İzole EPC FACS Analizi (a) fibronektin kaplı yemekler CD34 + seçimi ve 2 günlük kültür süre sonra izole EPC acLDL ve CD31 hücre yüzey ifadesinin alımı gösterilmektedir. Üst sol: hücreler acLDL alımını göstermektedir, ancak CD31 ifade etmezler. Üst sağ: Hücreler acLDL alımını göstermektedir ve CD31 ifade eder. Sol alt: Hücreler acLDL hiçbir alımını göstermektedir ve CD31 ifade yoktur. Sağ alt: Hücreler acLDL hiçbir alımını göstermektedir, ancak CD31 ifade eder. Gösterilen (b) izole EPC tarafından alımından sonra PE-konjuge acLDL histogramı olduğunu. ( Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 10,
Şekil 10: 2. günde İzole EPC FACS analizi, (a) fibronektin kaplı kaplar üzerinde CD34 + seçimi ve 2 günlük kültür süresinden sonra izole EPC acLDL KDR hücre yüzeyi ekspresyonu alımı gösterilmektedir. Üst sol: hücreler acLDL alımını göstermektedir, ancak KDR ifade etmezler. Üst sağ: Hücreler acLDL alımını göstermektedir ve KDR ifade eder. Sol alt: Hücreler acLDL hiçbir alımını göstermektedir ve KDR ifade yoktur. Sağ alt: Hücreler acLDL hiçbir alımını göstermektedir, ancak KDR ifade eder. Gösterilen (b) alındıktan sonra PE-konjuge acLDL histogramı iseİzole EPC tarafından. Gösterilen (c) izole edilmiş EPC hücre yüzey KDR bağlandıktan sonra FITC-konjüge, KDR antikoru histogramıdır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 11,
Şekil 11: Gün 7. İzole EPC FACS Analizi (a) fibronektin kaplı yemekleri 7 günlük kültür dönemi dahil olmak üzere önceki CD34 + seçim olmadan izole EPC acLDL ve CD31 hücre yüzey ifadesinin alımı, ama gösterilmektedir. Üst sol: Hücreler acLDL alımını göstermektedir, ancak CD31 ifade etmezler. Üst sağ: Hücreler acLDL alımını göstermektedir ve CD31 ifade eder. Sol alt: Hücreler acLDL hiçbir alımını göstermektedir ve CD31 ifade yoktur. Sağ alt: Hücreler acLDL hiçbir alımını göstermektedir, ancak CD31 ifade eder. (B) Gösterildiİzole EPC tarafından alınmasından sonra PE-konjuge acLDL bir histogramıdır. Gösterilen (c) izole edilmiş EPC hücre yüzeyi CD31 için bağlama sonra FITC ile konjuge CD31 antikoru histogramıdır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 12,
Şekil 12: Kalp Cerrahisi Sırasında Serum Sitokin Düzeyleri. ELISA kullanılarak kalp cerrahisi uygulanan CXCL8, VEGF, CXCL12 ve hastaların MİF serum konsantrasyonlarının ölçülmesi. ± SEM intra-operatif konsantrasyonlara göre ameliyat öncesi ortalama değerler olarak gösterilir (*: p <0.05; genel ameliyat öncesi)

Şekil 13,
13 Şekil: Benn Hasta Serum Doğru EPC Vitro Göç. kardiyak cerrahi uygulanan hastalarda, serum örneklerinde karşı sağlıklı gönüllülerin EPC göç intra-operatif artış olduğunu göstermiştir. MV2 Serum aç ortamda oyuk başına 50,000 hücre, bir Transwell sisteminin üst bölmeye eklendi. Aynı ortam ile 5: alt bölme serum numuneleri 1 oranında seyreltildi. Hücreler, 5 um'lik bir membrandan 37 ° C ve% 5 CO2 seviyesinde 3 saat boyunca göç. çubuklar, ortalama ± SEM değerlerini temsil eder (*: P <0.05)

Şekil 14
Şekil 14: Rekombinant Sitokinler Doğru EPC İn Vitro Göç ise. rekombinant CXCL8 temsili konsantrasyonlarının doğru EPC göç olduğunu göstermiştir, CXCL12, VEGF ve MIF serum hasret ortamda (= Baz) ile karşılaştırıldığında. Sadece MIF başardıfizyolojik ölçülen konsantrasyonlarda artan bir EPC göç arabuluculuk. rekombinant sitokinler MV2 serumu aç ortam içinde seyreltildi. Hücreler, 5 um'lik bir membrandan 3 saat boyunca göç. (: P <0.01 vs serum hasret orta **) bar ± SEM ortalama değerleri temsil

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu çalışmanın ilk bölümü kalp cerrahisi hastalarının kan kapsamlı bir değerlendirmesini sağlamak için sağlıklı gönüllülerin periferik kandan insan EPC izolasyonunu dahil. Bu nedenle, bir yoğunluk gradyan santrifüj plazma granülosit ve eritrositlerden PBMC fraksiyonu ayırmak için yapılmıştır. Kirletici trombosit en çıkarmak için, hücre fraksiyonu, kısa tabi tutuldu ve yavaş yıkama, 30 29 adım. Daha sonra, CD34 + hücreleri, kalan lenfositler ve monositler projenitör hücreleri ayırmak için geriye kalan fraksiyon izole edilmiştir. Son olarak, hücre süspansiyonu myeloid 3 diğer (progenitör) hücrelerden endotelyal progenitör hücre ayrılması için bir ticari olarak temin edilebilen endotelyal hücre büyüme ortamı içinde fibronektin kaplı kaplar üzerinde kültürlenmiştir. notun, trombositler CD34 hücre yüzey express gösterebilir olduğu tartışılmaktadırion, çok. Daha önceki çalışmalar trombositlere bazı anti-CD34 antikorlarının bağlanma gösterdi, ancak bu durum, diğer (CD34-pozitif) hücre 31, 32 trombosit topaklaşması için yapay doku olabilir. Bununla birlikte, çoğu trombosit tekrar yavaş yıkama adımları ile ayrılabilir. Trombosit yanında, bunların öncüleri - megakaryositler - Bu hematopoietik progenitör hücre antijeni ifade yoktur ve esas olarak kemik iliğinde 33, 34 bulunmaktadır, ancak, çevresel kanda mevcut olabilir. Ayrıca, aynı zamanda, bu protokolde kullanılan hücre yüzey işaretleyici CD34, olgun endotel hücreleri 35 çok düşük seviyelerde ifade edildiği açıklanmaktadır. Bu nedenle, EPC izole dikkatlice, trombosit / megakaryositler ya da olgun endotel hücreleri tarafından olası bir kontaminasyon dikkate alınması önemlidir. Bu nedenle, adım 2.6, izolasyon sırasında özellikle önemlidirEPC n trombositleri çıkarmak için.

İki gün ve fibronektinin kültürün yedi gün sonra fibronektin kaplı yemekler, hücre popülasyonlarının izole hücrelerin kültürlenmesi önemini açıklamak için önceki CD34-pozitif seçim ile hem karşılaştırıldı. Günde iki, izole edilmiş hücrelerin daha az yarısı yüzeyinde CD31 bir acLDL alınması ve aynı anda sentezlenmesini göstermiştir. Ayrıca, ilgili histogramlar hem markerlerin daha az yoğun bir sentezleme görülebilir. Bu veriler, endotelyal hücreye spesifik bir ortam içinde fibronektin kültürün yedi gün karakteristik endotel ekspresyonu gösteren EPC elde etmek için gerekli olduğunu göstermektedir. Bu adımda, bu fibronektin doğru konsantrasyon / miktarının kullanılması önem taşımaktadır. Wijelath ve arkadaşları, daha önce fibronektin VEGF 36 ile kombinasyon halinde, büyük olasılıkla endotel hücre benzeri kalıpları ekspresyonunu teşvik ettiğini gösterdi.

Bir sonraki stprotokol EP hücre süspansiyonu CD34 + -selection önemi ve daha önce CD34 + -selection olmadan fibronektin kaplı kaplar üzerinde kültür 7 gün sonra izole edilmiş hücreler karşılaştırılarak incelenmiştir. Her iki işaretçileri (acLDL alımı ve CD31 ekspresyonu) eksik hücrelerin miktarı bu adımda da dahil olmak üzere izolasyon ile karşılaştırıldığında önceki CD34 + -selection olmadan hücre izolasyonu sonra çok daha yüksek oldu. CD34 + -selection izole hücreler ile karşılaştırıldığında CD31 homojen olmayan ifadesi ile belirtildiği gibi İlginç bir şekilde, fibronektin ile kültür yedi gün sonra, hücreler, eksik CD34 + -selection, daha az homojen bir hücre popülasyonunu göstermiştir. Bu veriler, CD34 + -selection diğer monositler / makrofajlar arasından EPC sıralamak için gerekli olduğunu göstermektedir. Bu protokol kurulması sırasında, 37 ° C'de MV2 ortam içinde CD34 + -selection daha düşük TE ile karşılaştırıldığında, hayatta kalan hücrelerin sayısının artmasına yol açtığı bulunmuşturihtiyacı mperatures, ihtiyatlı gelecekteki çalışmalarda araştırılması gereken. Bu, 37 ° C 'de bu protokol, kalsiyum ihtiva eden bir ortamda antikor inkübasyon uygulanırken spesifik olmayan etkileşimleri ve bağlanması neden olabileceğini kabul gerekir. Gelecekte, düşük sıcaklıklarda kalsiyum eksik tampon sistemleri test edilmiş ve bu potansiyel karıştırıcı faktör önlemek için kurulmalıdır.

Daha önce (örneğin, insan göbek damarı endotel hücreleri, HUVEC) 37 farklı hücre tipleri için tarif edildiği gibi Özellikle, serum numuneleri ile, hücre göçü deneyler ilk analizi sırasında ölçümler, önce bir floresan mikroplaka okuyucu ve hücrelerin kalsein-boyaması kullanılarak yapıldı. odaları arasında farklı sönme değerleri tek başına serum numuneleri, aynı zamanda orta sadece zaten dikkatli düşünülmesi gereken ölçülen floresan, üzerinde dikkate değer bir etkiye sahip olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, We bizim protokol uyarladı ve hücreler yarı otomatik yazılım tarafından ışık mikroskobu aracılığıyla gözlenen ve sayılabilir hangi bir ölçüm sistemine geçti.

EPC periferik kandan hücrelerin yaklaşık% 0.1 için hesap ve bu belirli hücreleri 38 izole etmek zor olsa da çalışmaların etkileyici bir numara EPC yararlı etkiler sağlar ve bacaklarda ve miyokardın 39 iskemik olaylardan sonra doku vaskülarizasyon artırabilir belirtti 40. Ancak, hala klinik uygulamaya bu bulguları çevirmek ve klinik önemini değerlendirmek için devam eden bir sorundur. Nedenleri daha önce 22 41 gösterilmiştir farklı chemoattractants salgılanmasına, birçok perioperatif faktörlerin önemli etkisi nedeniyle olabilir. Bu nedenle, bu çalışmada, farklı c rolünün ikinci bölümündemiyokard I ortamında EPC göç konusunda ytokines / R değerlendirildi. Bu nedenle, kalp cerrahisi hastalarında serum sitokin konsantrasyonları ölçüldü. MIF yanı sıra CXCL12 ve CXCL8 önemli bir intra-operatif bir artış göstermiştir. Lütfen vitro deneylerde içine bu bulgular çeviri yaparken, mevcut sonuçlar CXCL12- ne in vitro ölçülen fizyolojik konsantrasyonlarda EPC göçle ilgili CXCL8 aracılı etkisi ne olduğunu gösterdi. Tarif edilen EPC izolasyon modeli ve daha sonra göç deneyi kullanılarak, MIF EPC göç 42 baskın bir aracısı olarak tespit edilmiştir. Bu bağlamda, Kanzler ve ark. MIF ve VEGF hipoksi 23 altında EPC göç üzerinde güçlü etki sağlamak deneysel fare modelinde gösterdi. İlginç bir şekilde, VEGF ölçümleri bağlama o kaynaklanabilecek VEGF kan konsantrasyonlarında anlamlı bir intra-operatif bir değişiklik olduğunu göstermektedirheparin intraoperatif standart uygulama f VEGF. Bu nedenle, MIF kardiyak cerrahi hastalarında EPC işe anjiyogenik kemokin arasında baskın rol oynayabilir gibi, başlatmak ve Yine yaralanma 43, 44 siteye EPC ticareti yoluyla miyokard I / R sonrası iyileşme sürecine katkıda bulunabilir MİF seviyeleri miyokard İ / R, o EPC istihdamı konusunda MIF aracılı etki miyokard I / R 23 sonra kalp yetmezliğinin önlenmesinde önemli etkileri vardır kalp biçimlenme ve anjiyogenez etkileyebilir ister spekülatif kalır hemen sonra arttı. Bununla birlikte, bu analiz geçmeden önce, ayrıca EPC farklı alt tipi karakterize etmek ve insan biyolojisinde fonksiyonel rolünü değerlendirmek için önemlidir. Bu bağlamda, bu protokol, i sağlamak için insan periferal kanından EPC izole nasıl güvenilir bir yöntem sağlardaha kapsamlı karakterizasyonu ve gelecekteki çalışmalar ts.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Yazarlar hiçbir onayları var.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibronectin Biochrom AG L7117 Coating of T-75 flasks
Aqua ad iniectabilia Fresenius Kabi
Endothelial cell growth medium MV2 Promo Cell C-22221
Endothelial cell growth medium MV2 SupplementMix Promo Cell C-39226
Ficoll-Paque plus GE Healthcare 17-1440-03 Density centrifugation
EasySep human CD34 positive Selection Kit Stemcell Technologies 18056 Isolation of CD34+ cells
EasySep magnet Stemcell Technologies 18000
Accutase Sigma-Aldrich A6964-100ML Detachment of cells
Corning HTS transwell 96 well permeable supports Sigma-Aldrich CLS3387-8EA Migration system
Hoechst solution ThermoFisher 33342 Staining of migrated cells
ImageJ National institutes of health xxx Counting of migrated cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Emontzpohl, C., et al. Key role of MIF in the migration of endothelial progenitor cells in patients during cardiac surgery. Int J Cardiol. 181C, 284-287 (2014).
  2. Smadja, D. M., et al. Interleukin 8 is differently expressed and modulated by PAR-1 activation in early and late endothelial progenitor cells. J Cell Mol Med. 13, (8B), 2534-2546 (2009).
  3. Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275, (5302), 964-967 (1997).
  4. Simons, D., et al. Hypoxia-induced endothelial secretion of macrophage migration inhibitory factor and role in endothelial progenitor cell recruitment. J Cell Mol Med. 15, (3), 668-678 (2011).
  5. Dernbach, E., et al. Antioxidative stress-associated genes in circulating progenitor cells: evidence for enhanced resistance against oxidative stress. Blood. 104, (12), 3591-3597 (2004).
  6. Yang, Z., et al. Paracrine factors secreted by endothelial progenitor cells prevent oxidative stress-induced apoptosis of mature endothelial cells. Atherosclerosis. 211, (1), 103-109 (2010).
  7. Asahara, T., Kawamoto, A., Masuda, H. Concise review: Circulating endothelial progenitor cells for vascular medicine. Stem Cells. 29, (11), 1650-1655 (2011).
  8. Schmidt-Lucke, C., et al. Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events: proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair. Circulation. 111, (22), 2981-2987 (2005).
  9. Yoder, M. C. Human endothelial progenitor cells. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, (7), a006692 (2012).
  10. Ito, H., et al. Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin. Cancer Res. 59, (23), 5875-5877 (1999).
  11. Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 348, (7), 593-600 (2003).
  12. Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, (5), 1801-1809 (2007).
  13. Rohde, E., et al. Blood monocytes mimic endothelial progenitor cells. Stem Cells. 24, (2), 357-367 (2006).
  14. Rohde, E., et al. Immune cells mimic the morphology of endothelial progenitor colonies in vitro. Stem Cells. 25, (7), 1746-1752 (2007).
  15. Prokopi, M., et al. Proteomic analysis reveals presence of platelet microparticles in endothelial progenitor cell cultures. Blood. 114, (3), 723-732 (2009).
  16. Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein. J Cell Biol. 99, (6), 2034-2040 (1984).
  17. Koch, S., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by vascular endothelial growth factor receptors. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, (7), a006502 (2012).
  18. Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28, (9), 1584-1595 (2008).
  19. Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, (2), 288-293 (2004).
  20. Tagawa, S., et al. Determination of Early and Late Endothelial Progenitor Cells in Peripheral Circulation and Their Clinical Association with Coronary Artery Disease. Int J Vasc Med. 2015 (2015).
  21. Bernhagen, J., et al. MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment. Nat Med. 13, (5), 587-596 (2007).
  22. Stoppe, C., et al. Interaction of MIF Family Proteins in Myocardial Ischemia/Reperfusion Damage and Their Influence on Clinical Outcome of Cardiac Surgery Patients. Antioxid Redox Signal. 23, (11), 865-879 (2015).
  23. Kanzler, I., et al. Differential roles of angiogenic chemokines in endothelial progenitor cell-induced angiogenesis. Basic Res Cardiol. 108, (1), 310 (2013).
  24. Walenta, K. L., Bettink, S., Bohm, M., Friedrich, E. B. Differential chemokine receptor expression regulates functional specialization of endothelial progenitor cell subpopulations. Basic Res Cardiol. 106, (2), 299-305 (2011).
  25. Rassaf, T., Weber, C., Bernhagen, J. Macrophage migration inhibitory factor in myocardial ischaemia/reperfusion injury. Cardiovasc Res. 102, (2), 321-328 (2014).
  26. Stoppe, C., et al. High postoperative blood levels of macrophage migration inhibitory factor are associated with less organ dysfunction in patients after cardiac surgery. Mol Med. 18, 843-850 (2012).
  27. Amin, M. A., et al. Migration inhibitory factor mediates angiogenesis via mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol kinase. Circ Res. 93, (4), 321-329 (2003).
  28. Kupatt, C., et al. Embryonic endothelial progenitor cells expressing a broad range of proangiogenic and remodeling factors enhance vascularization and tissue recovery in acute and chronic ischemia. FASEB J. 19, (11), 1576-1578 (2005).
  29. Colotta, F., et al. Expression of a monocyte chemotactic cytokine by human mononuclear phagocytes. J Immunol. 148, (3), 760-765 (1992).
  30. Casale, T. B., Kaliner, M. A rapid method for isolation of human mononuclear cells free of significant platelet contamination. J Immunol Methods. 55, (3), 347-353 (1982).
  31. Lewandowska, K., Kaplan, D., Husel, W. CD34 expression on platelets. Platelets. 14, (2), 83-87 (2003).
  32. Stellos, K., et al. Platelet-derived stromal cell-derived factor-1 regulates adhesion and promotes differentiation of human CD34+ cells to endothelial progenitor cells. Circulation. 117, (2), 206-215 (2008).
  33. Thornton, M. A., Poncz, M. In vitro expansion of megakaryocytes from peripheral blood hematopoietic progenitors. Methods Mol Med. 31, 337-345 (1999).
  34. Ivetic, N., et al. Producing megakaryocytes from a human peripheral blood source. Transfusion. 56, (5), 1066-1074 (2016).
  35. Friedrich, E. B., Walenta, K., Scharlau, J., Nickenig, G., Werner, N. CD34-/CD133+/VEGFR-2+ endothelial progenitor cell subpopulation with potent vasoregenerative capacities. Circ Res. 98, (3), e20-e25 (2006).
  36. Wijelath, E. S., et al. Novel vascular endothelial growth factor binding domains of fibronectin enhance vascular endothelial growth factor biological activity. Circ Res. 91, (1), 25-31 (2002).
  37. Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3, (1), 107-124 (2011).
  38. Yao, E. H., et al. Effects of the antioxidative beta-blocker celiprolol on endothelial progenitor cells in hypertensive rats. Am J Hypertens. 21, (9), 1062-1068 (2008).
  39. Takahashi, T., et al. Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nat Med. 5, (4), 434-438 (1999).
  40. Kawamoto, A., et al. Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia. Circulation. 103, (5), 634-637 (2001).
  41. Kim, B. S., et al. Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients. J Cardiovasc Transl Res. 9, (3), 230-238 (2016).
  42. Frangogiannis, N. G., Smith, C. W., Entman, M. L. The inflammatory response in myocardial infarction. Cardiovasc Res. 53, (1), 31-47 (2002).
  43. Zernecke, A., Bernhagen, J., Weber, C. Macrophage migration inhibitory factor in cardiovascular disease. Circulation. 117, (12), 1594-1602 (2008).
  44. White, D. A., et al. Pro-inflammatory action of MIF in acute myocardial infarction via activation of peripheral blood mononuclear cells. PLoS One. 8, (10), e76206 (2013).
Kalp Damar Cerrahisi sonra serum Örnekleri etkilenerek Sağlıklı Gönüllüler ve Bunların Göçmen Potansiyelden Endotel Ata Hücreleri İzolasyon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Emontzpohl, C., Simons, D., Kraemer, S., Goetzenich, A., Marx, G., Bernhagen, J., Stoppe, C. Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery. J. Vis. Exp. (120), e55192, doi:10.3791/55192 (2017).More

Emontzpohl, C., Simons, D., Kraemer, S., Goetzenich, A., Marx, G., Bernhagen, J., Stoppe, C. Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery. J. Vis. Exp. (120), e55192, doi:10.3791/55192 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter