Summary
Endoteliale progenitorceller (EPC'er) er afgørende involveret i neovaskularisering af iskæmiske væv. Denne metode beskriver isolering af menneskelige EPC'er fra perifert blod, samt identifikation af deres vandrende potentiale mod serumprøver af hjerte-kirurgiske patienter.
Abstract
Endoteliale progenitorceller (EPC'er) rekrutteres fra knoglemarven under patologiske tilstande som hypoxi og er afgørende involveret i neovaskularisering af iskæmiske væv. Oprindelsen, klassifikation og karakterisering af EPC'er er komplekse; Uanset, er der etableret to fremtrædende undertyper af EPC'er: såkaldt "tidlige" EPC'er (herefter benævnt tidlige-EPC'er) og sene-udvækst EPC'er (sen-EPC'er). De kan klassificeres ved biologiske egenskaber såvel som af deres udseende under in vitro dyrkning. Mens "tidlige" EPC'er vises i mindre end en uge efter dyrkning af perifert blod-afledte mononucleære celler i EF-specifikke medier, kan sene-udvækst EPC'er findes efter 2-3 uger. Late-udvækst EPC'er er blevet anerkendt for at være direkte involveret i neovaskularisering, primært gennem deres evne til at differentiere til modne endotelceller, mens "tidligt" EPC'er udtrykker forskellige angiogene faktorer som Endogenskellige last til fremme angiogenese i en parakrin måde. Under myocardial iskæmi / reperfusion (I / R), forskellige faktorer styrer målsøgning af EPC'er til områder af blodkar- dannelse.
Makrofag migration inhibitorisk faktor (MIF) er et chemokin-lignende pro-inflammatoriske og ubikvitært cytokin og blev for nylig beskrevet at fungere som central regulator af EPC'er migration ved fysiologiske koncentrationer 1. Interessant er MIF opbevaret i intracellulære puljer og kan hurtigt frigives i blodstrømmen efter flere stimuli (f.eks myokardieinfarkt).
Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til pålidelig isolering og dyrkning af tidlige EPC'er fra voksent humant perifert blod baseret på CD34-positiv selektion med efterfølgende dyrkning i medium indeholdende endotelvækstfaktorer på fibronectincoatede plader til anvendelse i in vitro migration assays mod serumprøver af hjerte-kirurgiske patienter. Endviderevandrende indflydelse af MIF på kemotaksi af EPC'er sammenlignet med andre kendte angiogenese-stimulerende cytokiner påvises.
Introduction
Endoteliale progenitorceller (EPC'er) cirkulerer i det menneskelige blod og har evnen til at differentiere til endotelceller 2. De deltager i vaskulogenese og er i stand til at minimere skader forårsaget af betændelse og iskæmi / reperfusion (I / R) skader på forskellige måder 3, 4. For eksempel EPC'er viser forhøjede niveauer af intracellulære antioxidant enzymer såsom katalase, glutathionperoxidase eller mangan superoxid dismutases (MnSOD) 5. Det forhøjede modstand mod oxidativ stress tillader EPC'er at fungere i mikromiljøer med forhøjede reaktive oxygenarter (ROS) efter iskæmisk skade 6. Tidligere undersøgelser viste også, at antallet af EPCs kan være korreleret til vaskulær reparation og at et reduceret antal cirkulerende EPC'er forudsiger forekomsten af kardiovaskulære hændelser 7,class = "xref"> 8. Men er ikke blevet fundet endnu, en klar definition af en EPC. Indtil nu er der ingen specifik celleoverflademarkør eller konsistent fænotype for EPC'er og disse celler er meget sjældne i det perifere blod 9. En menneskelig EPC bør betragtes som en cirkulerende celle med evnen til at bidrage til genopbygningen af de sårede endotel og nye vaskulære strukturer.
En måde at isolere og karakterisere EPC'er er gennem adhæsion til fibronectin. Derved er kapaciteten af disse celler anvendes til at vise en overlegen vedhæftning til fibronectin coatede skåle sammenlignet med type 1 collagen, fx 3, 10, 11. Andre fandt imidlertid, at udplade mononukleære celler på fibronectincoatede retter uden forudgående eller yderligere oprensningstrin fører til kolonier herunder myeloide progenitorceller, monocytter og T-lymfocytter 12, 13, 14. Desuden i dette tilfælde kan blodplader forurene det mononukleære celle (MNC) fraktion og derved overføre plasmamembranproteiner eventuelle adhærente celler 15.
Udover karakterisering gennem in vitro adhæsionsassays, er en kombination af forskellige celleoverflademarkører bruges til at beskrive en celletype betragtes som en EPC. I dette tilfælde, efter fibronectin-medieret adhæsion, cellerne analyseres om deres endoteliale-lignende egenskaber. I denne proces, de to endotheliale celleassocierede markører, acetyleret-lavdensitetslipoprotein (AcLDL) og vaskulær endotelvækstfaktor receptor 2 (VEGFR-2, KDR), spiller en rolle. Endotelceller og makrofager er blevet vist at specifikt tage op AcLDL i en proces kaldet "scavenger celle pathway" 16. Et andet markørprotein er KDR som den vigtigste VEGF-receptor på endotelceller 17. Men som EPC'er i almindelighed dyrkes i medier suppleret med endotelvækstfaktorer og føtalt kalveserum, er det muligt, at makrofager, der muligvis også er blevet fejlagtigt isoleret, udviser en endothelial-lignende markør profil. Som tidligere vist, hvis dyrkes i en endotel-konditioneret medium, makrofager udtrykker "endoteliale-specifik" proteiner 18.
Generelt er der to kategorier af EPC'er inden flere undertyper, som kan findes i blodet eller dyrkes in vitro. Sene-udvækst EPC'er (sen-EPC'er) vises efter 2-3 ugers kultur. Disse celler er integreret hurtigere i et monolag af humane navlestrengsveneendotelceller og kan danne kapillarrør 19. Desuden, såkaldte "early-EPC'er" cirkulerer i blodet i omkring en uge og handle i en mere passiv måde ved at levere angiogene molekyler, såsom vaskulær endotelvækstfaktor(VEGF), eller CXCL8 19. Patienter med koronararteriesygdom (CAD) viste signifikant lavere mængder af tidlige EPC'er sammenlignet med en kontrolgruppe uden CAD 20. Interessant nok viste den samme gruppe større mængder af sene EPC'er sammenlignet med en kontrolgruppe. En anden undersøgelse viste, at tidlig-EPC'er beskytter differentierede EPC'er fra apoptose under oxidative betingelser i en parakrin måde 6. Derfor kan tidlige EPC'er levere relevante beskyttende virkninger gennem migration af andre celler i en auto- eller parakrin måde i perifert blod.
Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til oprensning af tidlige EPC'er ved først at isolere PBMC-fraktionen fra humant perifert blod og efterfølgende isolering af CD34 + -celler fra PBMC-fraktionen for at rydde denne cellesuspension fra uønskede celler. CD34 er en markør, som anvendes til isolering af humane hæmatopoietiske stamceller 9 + -celler dyrkes på fibronectincoatede vævskulturplader overflader. Efter tre dage, ændres mediet, hvorved de mister alle ikke-adhærente celler. Endelig er isolerede EPC'er farves at kontrollere optagelsen af AcLDL og tilstedeværelsen af KDR som endotelcelle-markør ved anvendelse af fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS). Som en ekstra markering, analyserede vi blodplade endotelcelle-adhæsionsmolekyle (PECAM-1, CD31), som også forekommer på endotelceller.
Restaurering af beskadigede eller infarkt myokardie væv ved øget rekruttering af EPC'er hører til de intensivt undersøgte behandlingsstrategier i hjerte-kar-sygdomme. Imidlertid oversættelse af eksperimentelle resultater i klinisk praksis stadig udfordrende på grund af den komplekse cellulære samspil i det menneskelige legeme under forskellige patofysiologiske tilstande. Endvidere myocardial I / R kvæstelser udløse en overdreven sekretion af forskellige cytokiner, hormoner og vækst fac torer, der styrer målsøgning af EPC'er til områder af blodkardannelse 13. Som allerede vist, CXCL8, stromacelle--afledt faktor 1α (SDF-1α, CXCL12), VEGF og makrofag migration inhibitorisk faktor (MIF) er steget betydeligt i serumprøver efter myokardie I / R skade en. Blandt disse faktorer, MIF er en pleiotropisk chemokin-lignende cytokin med overvejende pro-inflammatoriske egenskaber. I modsætning til sin historiske navn, MIF har pro-migrerende funktioner, som en sand chemokin på forskellige celletyper 1, 21, 22. MIF-medierede celle rekruttering processer er blevet knyttet til kemokinreceptorer CXCR2 og CXCR4, der MIF binder til og aktiverer i en ikke-beslægtet måde 21. Notatet EPC'er udtrykker begge disse receptorer på deres overflade, som desuden bliver opreguleret under hypoxiske betingelserass = "xref"> 23, 24. Desuden, akkumulering tyder på, at MIF har en overordnet cardio-beskyttende virkning under I / R skade af hjertet 22, 25, 26. I den forbindelse er det blevet yderligere vist, at MIF kan understøtte neovaskularisering under hypoxisk stress, der er af særlig relevans, når man overvejer de begrænsede inddrivelse mekanismer skadelidte myocardium 27. Tidligere in vitro-undersøgelser og eksperimenter i prækliniske musemodeller forudsat første beviser om den rolle, MIF i EPC'er rekruttering 4. Notatet MIF også er en fremtrædende last protein EPC'er som kan frigives i løbet af EPC'er rekruttering inden iskæmiske steder 28. Men studier i kliniske omgivelser navnlig i sammenligning med andre (angiogene) serumcytokiner forblive undvigende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Blod til isolering af EPC'er blev opnået fra raske frivillige efter informeret samtykke i overensstemmelse med den lokale etiske komité. Serumprøver, der anvendes i migrationen assays blev opnået fra patienter, der undergik konventionel hjertekirurgi med brug af kardiopulmonal bypass (CPB). Eksklusionskriterier var akutte operationer, kendt eller mistænkt graviditet, patientens alder mindre end 18 år, og manglende indhente informeret samtykke. Serumprøver blev udtaget ud over kliniske rutinemæssige målinger (umiddelbart før kirurgi og umiddelbart efter myocardial reperfusion / åbning af aorta cross-clamp) og efterfølgende opbevaret ved -80 ° C indtil endelige analyse. Den institutionelle Review Board (Etik udvalg, RWTH Aachen University) godkendte denne undersøgelse. De patienter viste en gennemsnitlig alder på 68,6 år og en gennemsnitlig vægt på 81,7 kg. Pre-eksisterende sygdomme inkluderet: hypertension (65%), kronisk lungesygdom (19%), ekstra hjerte-arteriopati (16%), cerebral dysfunktion (6%), ustabil angina (3%), nyligt myokardieinfarkt (28% inden for 90 d), kronisk nyresygdom (14%), leversygdom (2%) og diabetes (34%).
1. Belægning af T75 Flask:
- Forbered 5 ml fibronectin opløsning (1 mg human fibronectin fortyndet i 15 ml ultrarent vand) per T75 kolbe.
- Føj løsningen på en T75 kolbe og vente, indtil vandet er fordampet. For at undgå unødvendige afbrydelser i løbet isolation proces på grund af fordampning, udføre denne proces på forhånd (f.eks natten over) og ved stuetemperatur. Denne løsning giver 4,44 pg fibronektin / cm2.
- Forbered endotelcellevækst medium MV2 ved at supplere det basale MV2 medium med vækstfaktoren kosttilskud fra producenten.
2. Isolering af endotel progenitorceller (EPC'er) fra 60 ml blod:
BEMÆRK: Da CD34-positiv selektion cocktail ennd de magnetiske perler er kommercielt tilgængelige i en kombineret udvælgelse kit, der er ingen koncentrationer tilvejebragt af producenten. Men omkring 100 pi af antistoffet er tilstrækkelige til forarbejdning indtil den 5 x 10 8 celler. De magnetiske perler fortyndes i vand, dextran-coatede og ca. 5,000x mindre i forhold til andre kommercielt tilgængelige perler. For yderligere information, se producentgaranti instruktioner.
- Bland blod (med eller uden antikoagulanter) 1: 1 med Ca2 + -Mg 2+ -fri PBS.
- Der tilsættes 15 ml densitetsgradient opløsning pr 50 ml rør. For yderligere information, se producentgaranti instruktioner.
- lag langsomt det fortyndede blod oven på densitetsgradient opløsning.
- Centrifuger prøverne ved 2500 xg i 30 min med langsom acceleration og uden bremsning.
- Omhyggeligt indsamle buffy coat lag af hver rør (figur 1) under anvendelse af en steril plastik pipette og sætte det ind et andet rør.Undgå opsamling af densitetsgradient opløsning. Den forventede PBMC Udbyttet er cirka 3-4 x 10 6 celler / ml blod.
Figur 1: densitetsgradientcentrifugering af Bbuffy Coat på Ficoll Solution. Vist er resultatet af densitetsgradientcentrifugering ved 2500 xg i 30 min på densitetsgradient opløsning. Afbildet er erythrocytter og granulocytter (rød), den mononukleare cellefraktion (hvidt lag), plasma (gul), og densiteten gradient opløsning (hvidlig). Klik her for at se en større version af dette tal.
- Fortynd mononukleære blodceller fraktion perifert med mindst 3 volumener PBS og blandes. Centrifuge ved stuetemperatur i 15 minutter ved 200 x g.
- Gentag trin 2.6 to gange. </ Li>
- Aspirere supernatanten og resuspender cellepelleten i 5 ml MV2 medium.
- Tilsæt 100 pi humant CD34-antistof (tilstrækkelig til forarbejdning indtil den 5 x 10 8 celler) pr anvendes fibrinlag og rotere i 15 minutter ved 37 ° C med 5% CO2.
- Tilsæt 50 pi dextran-coatede magnetiske perler pr anvendes fibrinlag og rotere i 10 minutter ved 37 ° C med 5% CO2.
- Efter inkubation overføres suspensionen til FACS-rør med et maksimum på 3 ml i hvert rør. Større mængder vil ikke være tilladt med magneten.
- Indsæt FACS rør (er) i magneten (er) og vent i 5 minutter.
- Supernatanten kasseres uden at trække FACS rør ud af magneten.
- Resuspender cellerne i hver FACS rør med 3 ml MV2 medium uden for magneten.
- Gentag trin 2,12-2,14 to gange.
- Træk FACS rør ud af magneterne og resuspender cellerne i 3 ml MV2 medium.
- Overfør cellesuspensionen i præ-coatede T75 flasks og tilføje 17 ml MV2 medium per kolbe.
BEMÆRK: Mediet skal skiftes efter 3 dage. Efter en uge, celler viser spindel-lignende strukturer (figur 2) og er klar til brug. For en overser af isolationen se figur 3.
Figur 2: Mikroskopisk Billede af isolerede EPC'er. Vist er et repræsentativt billede af isolerede tidlig EPC'er i en T75 kolbe før løsrivelse. Tilsyneladende er spindlen-lignende struktur EPC'er. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Flowchart Viser EPC Isolation Procedure. Afbildet er en ordning, showing af de enkelte trin af EPC isolation protokollen. For en mere detaljeret protokol se afsnit 2 i protokollen sektion.
3. Migration Assay
- Fjern mediet fra EPC'er i T75 kolbe.
- Vask med 5 ml PBS ved at ryste den grundigt.
- Fjern PBS og tilsæt 5 ml kommercielle celle løsrivelse løsning. Vent indtil cellerne er fritliggende (se under et mikroskop). Fremskynde løsrivelse ved forsigtigt at trykke på bunden af kolben.
- Når cellerne er fritliggende, hurtigt tilføje 5 ml af MV2 komplet medium og overføre cellesuspensionen til et andet rør.
- Centrifuger ved 2.000 xg i 5 min.
- Resuspender celler i 5-10 ml PBS og centrifugeres igen ved 2000 x g i 5 min.
- Gentag trin 3.6.
- Resuspender cellepelleten i MV2 sultede medium (50.000 celler i er behov 75 pi pr transmigration brønd).
BEMÆRK: Hvilket migration systemet er behov for, afhænger af celletypen og assay. Der er diff erent pore diametre og plade størrelser (antal brønde). For EPC'er en porestørrelse på 5 um i 96 brønd system er optimal. - Forbered migration pladen ved at tilsætte 235 pi serumprøven (serum fortyndet 1: 5 i MV2 sultede medium) ind i det nederste kammer (figur 4).
Figur 4: Migration Assay i et Modified Boyden Chamber. Vist er den generelle udformning af et modificeret Boyden kammer. Cellekultur skær (= øvre kammer) er angivet i mørkeblå og indsættes i det nedre kammer. Bunden (men ikke de vægge) af disse indsatse repræsenterer filtersystemet herunder porerne. (A) viser opsætningen på tidspunkt nul. (B) Efter et valgt tidspunkt cellerne migrerede gennem filteret mod en stimulus.fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
- Tilføj indsatsen kort før tilsætning af celle opløsningen.
- Tilføj 75 pi af cellen opløsning (= 50.000 celler) i det øverste kammer.
- Lad EPC'er migrere i 3 timer ved 37 ° C og 5% CO2 (migration afhænger celletype og system).
- For at undgå serum auto-fluorescens artefakter, kvantificere migrerede celler ved at tage billeder af brønden under et mikroskop og tælle cellerne ved hjælp af semi-automatiske software "ImageJ".
- Fjern det øverste kammer (indeholdende alle ikke-migrerede celler).
- Tilføj 70 pi 3,6% paraformaldehyd-opløsning, herunder Hoechst farvestof (fortyndet 1: 1.000). Pladen kan opbevares ved 37 ° C og 5% CO2 natten over.
- Centrifugeres pladen snart at få alle celler i den samme fokale plan ved 2.000 xg i 1-2 min.
- Tag 5 billeder per well (figur 5 og 6) med en 100 x forstørrelse.
Figur 5: Ordning viser placeringen af den taget billeder. Ordningen afbilder positionen af de fem taget billeder, som er nødvendige til bestemmelse af migrerede celler, i forhold til brønden. Billederne er taget til at tælle cellerne og beregne en middelværdi for hver brønd. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Mikroskopisk billede for Cell Kvantificering. Vist er et repræsentativt billede, som blev taget for celle kvantificering. Cellerne blev farvet og fikseret USIng Hoechst farvestof i 3,6% paraformaldehyd. Prikkerne repræsenterer fikseret og farvet endotheliale progenitorceller. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Tæl migrerede celler ved hjælp af semi-automatiske software "ImageJ" af National Institute of Health.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karakterisering af Isolerede endotel progenitorceller
Først blev optagelsen af AcLDL verificeret, samt ekspressionen af KDR, og CD31 på overfladen af det isolerede cellepopulation. Som figur 7a viser, 85,1% af de isolerede EPC'er viste en optagelse af AcLDL og udtrykte CD31. Figurerne 7b og 7c viser yderligere en homogen fordeling af begge mærker, selv om der synes at være en mindre population, negative for begge markører. I et andet trin, blev udført FACS-analyse af AcLDL i kombination med KDR. Figur 8a viser, at over 80% af de isolerede celler viste en optagelse af AcLDL og ekspressionen af KDR på deres overflade. Figur 8b og 8c viser homogeniteten af disse markører.
For at verificere importance af fibronectincoatede retter under dyrkning tid, en sammenligning af de tre markører mellem isolerede celler efter to dages dyrkning på en fibronectin-coatede overflade med isolerede EPC'er efter syv dages dyrkning på fibronectincoatede retter (som angivet i vores protokol) blev udført, både med tidligere CD34 + -selection. Som vist i figur 9a, kun 46,4% af to-dages-dyrkede celler viste en optagelse af AcLDL såvel som et udtryk for CD31 på deres overflade, sammenlignet med 85% af cellerne efter syv dages dyrkning på fibronectin. Endvidere histogrammerne (figur 9b og 9c) viser mindre intensitet af begge mærker efter to dages dyrkning sammenlignet med syv dage (fig 7b og 7c). Det samme gælder for en kombination af markørerne AcLDL og KDR. Efter to dages dyrkning på fibronectin, kun 68,0% af alle celler viste en optagelse af AcLDL såvel som et udtryk for KDR på deres overflade (figurs 10a-10c). Efter syv dages dyrkning på fibronectin, 83,6% af cellerne viste en optagelse af AcLDL og ekspression af KDR på deres overflade (8a-8c).
I et næste trin, blev betydningen af CD34 + -selection under isoleringen af EPC'er evalueret. Derfor valgte celler i overensstemmelse med denne protokol, herunder densitetsgradientcentrifugering og syv dages dyrkning på fibronektin, men som gik glip af CD34 + -selection blev isoleret. Som vist i figur 10a, over 18% af alle isolerede celler gør hverken udtrykkelige CD31 eller viser en optagelse af AcLDL, sammenlignet med mindre end 8% efter CD34 + -selection, som viser en CD31-ekspression og en optagelse af AcLDL (figur 7a) . Derudover viser fig 11b og 11c viser, at de isolerede celler er meget inhomogen med hensyn begge mærker i forhold til den tilknyttede
Serum cytokinniveauer under hjerteoperationer
For at identificere indflydelse af hjertekirurgi efter myocardial I / R på koncentrationerne af cirkulerende serumniveauer af MIF, CXCL12, CXCL8 og VEGF, blev serumprøver trukket præ- og intra-operativt for den efterfølgende analyse ved kommercielt tilgængeligt ELISA (figur 12) . Serumniveauer af MIF viste en signifikant intraoperativ stigning sammenlignet med basislinieværdier (100,3 ng / ml vs. 127,4 ng / ml, p = 0,027). Ligeledes viste CXCL12 niveauer en signifikant stigning i serum under kirurgi (0,101 ng / ml vs. 0,198 ng / ml, p = 0,011). Svarende til MIF og CXCL12, CXCL8 steg betydeligt i kirurgi (0,15 ng / mL vs. 0,3 ng / ml, p = 0,022). I contRast, har VEGF-koncentrationer ikke vist signifikante ændringer i løbet af observationsperioden (0,154 ng / mL vs. 0,134 ng / ml, p = 0,583) 1.
Migration Kapacitet endotel progenitorceller
For at undersøge den direkte virkning af patienternes serumprøver og deri indeholdte cytokiner / kemokiner / angiogene faktorer på EPC migration, en ex vivo migration under anvendelse serumprøver, der blev trukket før og under operationen, blev udført. EPC'er isoleret fra raske frivillige. Som vist i figur 13, EPC migration steg markant mod intra-operativt taget prøver i forhold til præ-operativt taget prøver (+ 35% i forhold til baseline, p = 0,047).
Da tidligere undersøgelser allerede vist, at I / R udløser en sekretion af sevrelle cytokiner der modulerer leukocyt kemotaxi og migration, migration assays under anvendelse af disse potentielle kemoattraktanter, herunder MIF, CXCL12, CXCL8, og VEGF blev udført. For at få en bedre forståelse af den betydning af disse cytokiner på EPC rekruttering in vivo, yderligere i forsøg vitro migration, anvendelse af de fysiologisk målte koncentrationer af de ovennævnte cytokiner til det nederste kammer af migrationen enheder blev udført, også.
Som MIF serumkoncentrationer mellem 100 og 130 ng / ml var blevet målt (Figur 12), en koncentration på 100 ng / ml rekombinant MIF blev anvendt, hvilket førte til en> 6 gange stigning i EPC migration sammenlignet med mediekontrol ( figur 14). I modsætning hertil serumkoncentrationerne af CXCL12, CXCL8, og VEGF var i størrelsesordenen 150 - 300pg / mL. Notatet har disse koncentrationer ikke mægle nogen effekt på EPC migration in vitro(Figur 14). Det er derfor tænkeligt, at blandt disse fire cytokiner, MIF udstiller den relative stærkeste indflydelse på EPC migration in vivo en.
Figur 7: FACS-analyse af isolerede EPC'er på dag 7. (a) Vist er optagelse af AcLDL og CD31 celleoverfladeekspression af isolerede EPC'er efter CD34 + selektion og 7 dage gammel kultur periode på fibronectincoatede retter. Øverst til venstre: Celler viser optagelse af AcLDL, men udtrykker ikke CD31. Øverst til højre: Celler viser optagelse af AcLDL og udtrykke CD31. Nederst til venstre: Celler viser ingen optagelse af AcLDL og udtrykker ikke CD31. Nederst til højre: Celler viser ingen optagelse af AcLDL, men udtrykker CD31. (B) Vist er histogram af PE-konjugeret AcLDL efter optagelse af isolerede EPC'er. (C) Vist er histogrammet af FITC-conjugated CD31-antistof efter binding til celleoverfladen CD31 af isolerede EPC'er. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: FACS-analyse af isolerede EPC'er på dag 7. (a) Vist er optagelse af AcLDL og KDR celleoverfladeekspression af isolerede EPC'er efter CD34 + selektion og 7 dage dyrkningsperiode på fibronectincoatede retter. Øverst til venstre: celler viser optagelse af AcLDL, men udtrykker ikke KDR. Øverst til højre: Celler viser optagelse af AcLDL og udtrykke KDR. Nederst til venstre: Celler viser ingen optagelse af AcLDL og udtrykker ikke KDR. Nederst til højre: Celler viser ingen optagelse af AcLDL, men udtrykker KDR. (B) Vist er histogram af PE-konjugeret AcLDL efter optagelse af isolerede EPC'er. (C) Vist erhistogram af FITC-konjugeret KDR antistof efter binding til celleoverfladen KDR af isolerede EPC'er. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: FACS-analyse af isolerede EPC'er på dag 2. (a) Vist er optagelse af AcLDL og CD31 celleoverfladeekspression af isolerede EPC'er efter CD34 + selektion og 2 dage dyrkningsperiode på fibronectincoatede retter. Øverst til venstre: celler viser optagelse af AcLDL, men udtrykker ikke CD31. Øverst til højre: Celler viser optagelse af AcLDL og udtrykke CD31. Nederst til venstre: Celler viser ingen optagelse af AcLDL og udtrykker ikke CD31. Nederst til højre: Celler viser ingen optagelse af AcLDL, men udtrykker CD31. (B) Vist er histogram af PE-konjugeret AcLDL efter optagelse af isolerede EPC'er. (
Figur 10: FACS-analyse af isolerede EPC'er på dag 2. (a) Vist er optagelse af AcLDL og KDR celleoverfladeekspression af isolerede EPC'er efter CD34 + selektion og 2 dage dyrkningsperiode på fibronectincoatede retter. Øverst til venstre: celler viser optagelse af AcLDL, men udtrykker ikke KDR. Øverst til højre: Celler viser optagelse af AcLDL og udtrykke KDR. Nederst til venstre: Celler viser ingen optagelse af AcLDL og udtrykker ikke KDR. Nederst til højre: Celler viser ingen optagelse af AcLDL, men udtrykker KDR. (B) Vist er histogram af PE-konjugeret AcLDL efter optagelseaf isolerede EPC'er. (C) Vist er histogrammet af FITC-konjugeret KDR antistof efter binding til celleoverfladen KDR af isolerede EPC'er. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 11: FACS-analyse af isolerede EPC'er på dag 7. (a) Vist er optagelse af AcLDL og CD31 celleoverfladeekspression af isolerede EPC'er uden forudgående CD34 + selektion, men inklusive 7 dage gammel kultur periode på fibronectincoatede retter. Øverst til venstre: Celler viser optagelse af AcLDL, men udtrykker ikke CD31. Øverst til højre: Celler viser optagelse af AcLDL og udtrykke CD31. Nederst til venstre: Celler viser ingen optagelse af AcLDL og udtrykker ikke CD31. Nederst til højre: Celler viser ingen optagelse af AcLDL, men udtrykker CD31. (B) Vister histogrammet af PE-konjugeret AcLDL efter optagelse af isolerede EPC'er. (C) Vist er histogrammet af FITC-konjugeret CD31-antistof efter binding til celleoverfladen CD31 af isolerede EPC'er. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 12: Serum cytokinniveauer under hjerteoperationer. Måling af serumkoncentrationer af CXCL8, VEGF, CXCL12, og MIF af patienter, der gennemgik hjertekirurgi under anvendelse af ELISA. Vist er middelværdier af præoperativ sammenlignet med intra-operative koncentrationer ± SEM (*: p <0,05; vs. præ-OP)
Figur 13: In Vitro Migration af EPC'er Mod Patient Serum. Vist er den intra-operative stigning i EPC migration af raske frivillige mod serumprøver fra patienter, som gennemgik hjertekirurgi. 50.000 celler per brønd i MV2 serumudsultet medium blev tilsat til det øvre kammer i et Transwell system. Serumprøverne i det nedre kammer blev fortyndet 1: 5 med det samme medium. Cellerne migreret i 3 timer ved 37 ° C og 5% CO2 gennem en 5 um membran. Søjlerne repræsenterer middelværdier ± SEM (*: p <0,05)
Figur 14: In vitro Migration af EPC'er Mod rekombinant Cytokiner. Vist er migration af EPC'er retning repræsentative koncentrationer af rekombinant CXCL8, CXCL12, VEGF, og MIF i forhold til serum udsultet medium (= baseline). Kun MIF var i standat mægle en øget migration EPC ved fysiologisk målte koncentrationer. De rekombinante cytokiner blev fortyndet i MV2 serumudsultet medium. Cellerne migreret i 3 timer gennem et 5 um membran. Søjlerne repræsenterer middelværdier ± SEM (**: p <0,01 vs. serumudsultet medium)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den første del af denne undersøgelse omfattede isolering af menneskelige EPC'er fra det perifere blod fra raske frivillige for at muliggøre en omfattende evaluering af blodet af hjerte kirurgi patienter. Derfor blev en densitetsgradientcentrifugering udført for at separere PBMC-fraktionen fra plasma, granulocytter og erythrocytter. At fjerne det meste af de kontaminerende blodplader, var dette cellefraktion udsættes for korte og langsomme vasketrin 29, 30. Derefter blev CD34 + -celler isoleret fra den resterende del til at adskille progenitorceller fra de resterende lymfocytter og monocytter. Endelig blev cellesuspensionen dyrket på fibronectin-overtrukne skåle i en kommercielt tilgængelig endotelcellevækst-medium for at separere endoteliale progenitorceller fra andre (progenitor) celler af myeloid herkomst 3. Notatet er det diskuteret, at blodplader kan vise en CD34 celle overflade expression, også. Selvom tidligere undersøgelser påvist binding af nogle anti-CD34 antistoffer til blodplader, kan dette være et artefakt på grund af sammenlægning af blodplader med andre (CD34-positive) celler 31, 32. Imidlertid kan de fleste blodplader separeres ved gentagne langsomme vasketrin. Udover blodplader, deres forstadier - megakaryocytter - do udtrykke dette hæmatopoietisk stamcelle-antigen og kan være til stede i perifert blod, selvom de primært findes i knoglemarven 33, 34. Desuden er det også beskrevet, at celleoverflademarkøren CD34, anvendes i denne protokol udtrykkes i meget lave niveauer på modne endotelceller 35. Derfor er det vigtigt at forsigtigt overveje en eventuel kontaminering med blodplader / megakaryocytter eller modne endotelceller, når man isolerer EPC'er. Derfor trin 2.6 er af særlig relevans under isolation af EPC'er at fjerne blodplader.
For at tydeliggøre betydningen af dyrkning af isolerede celler på fibronectincoatede retter, cellepopulationer efter to dage og syv dages dyrkning på fibronectin blev sammenlignet både med tidligere CD34-positiv selektion. På dag to, mindre end halvdelen af de isolerede celler viste en optagelse af AcLDL og samtidig udtryk for CD31 på deres overflade. Desuden kunne en mindre intens ekspression af begge markører på de vedrørende histogrammer ses. Disse data viser, at syv dages dyrkning på fibronectin i endotelcellespecifikt medium er nødvendige for at få EPCs viser karakteristiske endotheliale ekspressionsmønstre. I dette trin er det vigtigt at bruge den rigtige koncentration / mængde fibronectin. Wijelath og kolleger tidligere demonstreret, at fibronectin fremmer ekspressionen af endotelcellespecifikke lignende mønstre, sandsynligvis i kombination med VEGF 36.
I næste mep af protokollen, blev betydningen af CD34 + -selection af cellesuspensionen undersøgt, sammenligne celler isoleret efter 7 dages kultur på fibronectincoatede retter, med og uden forudgående CD34 + -selection. Mængden af celler mangler begge mærker (AcLDL optagelses- og CD31 ekspression) var meget højere efter celle isolation uden forudgående CD34 + -selection forhold til isolation, herunder dette trin. Interessant, efter syv dages dyrkning på fibronectin, celler mangler CD34 + -selection viste en mindre homogen cellepopulation, som indikeret ved inhomogent ekspression af CD31 sammenlignet med celler, isoleret med CD34 + -selection. Disse data viser, at CD34 + -selection er nødvendigt at sortere ud EPC'er fra andre monocytter / makrofager. Under etableringen af denne protokol, fandt vi, at CD34 + -selection i MV2 medium ved 37 ° C fører til et øget antal overlevende celler, sammenlignet med meget lavere temperatures, som skal forsigtigt undersøgt i fremtidige studier. Vi må erkende, at ved anvendelsen af denne protokol, antistof inkubation i calcium-medium ved 37 ° C kan føre til ikke-specifikke interaktioner og binding. I fremtiden bør buffersystemer mangler calcium ved lavere temperaturer testes og etableret for at undgå denne potentielle forstyrrende element.
Især under vores foreløbige analyse af cellemigration eksperimenter med serumprøver, målinger blev først udført ved anvendelse af et fluorescens-mikropladelæser og calcein-farvning af cellerne, som tidligere beskrevet for forskellige typer celler (f.eks humane navleveneendotelceller, HUVEC) 37. De forskellige ekstinktionsværdier mellem kamrene indikerede, at ikke kun de serumprøver alene, men også mediet allerede har en bemærkelsesværdig indflydelse på den målte fluorescens, som skal betragtes med skepsis. Derfor we tilpasset vores protokol og skiftede til et målesystem i hvilket cellerne kan observeres via lysmikroskopi og talt ved en semi-automatiseret software.
Mens EPC'er udgør ca. 0,1% af celler i det perifere blod, og det er vanskeligt at isolere disse specifikke celler 38, et imponerende antal undersøgelser indikerede, at EPC'er kan tilvejebringe fordelagtige virkninger og forbedre væv vaskularisering efter iskæmiske hændelser i lemmer og i myocardiet 39 , 40. Men det er stadig en løbende udfordring at omsætte disse resultater til klinisk praksis og vurdere den kliniske relevans. Årsagerne kan skyldes den betydelige indflydelse mange perioperative faktorer på sekretionen af forskellige kemoattraktanter, som tidligere 22, 41 er blevet vist. Derfor, i den anden del af denne undersøgelse, rolle forskellige Cytokines for migration af EPC'er i fastsættelsen af myokardie I / R blev evalueret. Derfor blev serumkoncentrationen af cytokiner i hjertekirurgi patienter målt. MIF, samt CXCL12 og CXCL8 viste en signifikant intraoperativ stigning. Ved omregning disse resultater tilbage i in vitro-forsøg, foreliggende resultater viste, at der hverken er en CXCL12- eller CXCL8-medieret effekt på EPC migration på de målte fysiologiske koncentrationer in vitro. Anvendelse af den beskrevne EPC isolation model og den efterfølgende migrering assayet blev MIF identificeret som en fremherskende mediator af EPC migration 42. I denne sammenhæng Kanzler et al. demonstreret i en eksperimentel musemodel, som MIF og VEGF giver den stærkeste effekt på EPC migration under hypoxi 23. Interessant målinger af VEGF viser, at der ikke er nogen væsentlig intraoperativ ændring i VEGF blodkoncentrationer, som kan resultere i at binde of VEGF til intraoperativ standardiseret anvendelse af heparin. Derfor kan MIF spille en fremtrædende rolle blandt de angiogene kemokiner i rekrutteringen af EPC'er i hjerte-kirurgi patienter og kan igangsætte og bidrage til helingsprocessen efter myokardie I / R gennem handel med EPC'er til skadestedet 43, 44 Men som multilaterale interbankgebyrer steg umiddelbart efter myokardie i / R, er det stadig spekulativt, om MIF-medieret effekt på rekruttering af EPC'er kan påvirke hjerte-remodellering og angiogenese, der har betydelige konsekvenser for forebyggelse af hjertesvigt efter myokardie i / R 23. Men før videre til en sådan analyse, er det vigtigt yderligere at karakterisere de forskellige undertyper af EPC'er og at vurdere dets funktionelle rolle i human biologi. I denne forbindelse den nuværende protokol giver en pålidelig metode til at isolere EPC'er fra humant perifert blod for at aktivere its yderligere omfattende karakterisering og fremtidige undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen bekræftelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin | Biochrom AG | L7117 | Coating of T-75 flasks |
| Aqua ad iniectabilia | Fresenius Kabi | ||
| Endothelial cell growth medium MV2 | Promo Cell | C-22221 | |
| Endothelial cell growth medium MV2 SupplementMix | Promo Cell | C-39226 | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | Density centrifugation |
| EasySep human CD34 positive Selection Kit | Stemcell Technologies | 18056 | Isolation of CD34+ cells |
| EasySep magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | Detachment of cells |
| Corning HTS transwell 96 well permeable supports | Sigma-Aldrich | CLS3387-8EA | Migration system |
| Hoechst solution | ThermoFisher | 33342 | Staining of migrated cells |
| ImageJ | National institutes of health | xxx | Counting of migrated cells |
References
- Emontzpohl, C., et al. Key role of MIF in the migration of endothelial progenitor cells in patients during cardiac surgery. Int J Cardiol. 181C, 284-287 (2014).
- Smadja, D. M., et al. Interleukin 8 is differently expressed and modulated by PAR-1 activation in early and late endothelial progenitor cells. J Cell Mol Med. 13 (8B), 2534-2546 (2009).
- Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
- Simons, D., et al. Hypoxia-induced endothelial secretion of macrophage migration inhibitory factor and role in endothelial progenitor cell recruitment. J Cell Mol Med. 15 (3), 668-678 (2011).
- Dernbach, E., et al. Antioxidative stress-associated genes in circulating progenitor cells: evidence for enhanced resistance against oxidative stress. Blood. 104 (12), 3591-3597 (2004).
- Yang, Z., et al. Paracrine factors secreted by endothelial progenitor cells prevent oxidative stress-induced apoptosis of mature endothelial cells. Atherosclerosis. 211 (1), 103-109 (2010).
- Asahara, T., Kawamoto, A., Masuda, H. Concise review: Circulating endothelial progenitor cells for vascular medicine. Stem Cells. 29 (11), 1650-1655 (2011).
- Schmidt-Lucke, C., et al. Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events: proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair. Circulation. 111 (22), 2981-2987 (2005).
- Yoder, M. C. Human endothelial progenitor cells. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006692 (2012).
- Ito, H., et al. Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin. Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Rohde, E., et al. Blood monocytes mimic endothelial progenitor cells. Stem Cells. 24 (2), 357-367 (2006).
- Rohde, E., et al. Immune cells mimic the morphology of endothelial progenitor colonies in vitro. Stem Cells. 25 (7), 1746-1752 (2007).
- Prokopi, M., et al. Proteomic analysis reveals presence of platelet microparticles in endothelial progenitor cell cultures. Blood. 114 (3), 723-732 (2009).
- Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein. J Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).
- Koch, S., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by vascular endothelial growth factor receptors. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006502 (2012).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).
- Tagawa, S., et al. Determination of Early and Late Endothelial Progenitor Cells in Peripheral Circulation and Their Clinical Association with Coronary Artery Disease. Int J Vasc Med. , 2015 (2015).
- Bernhagen, J., et al. MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment. Nat Med. 13 (5), 587-596 (2007).
- Stoppe, C., et al. Interaction of MIF Family Proteins in Myocardial Ischemia/Reperfusion Damage and Their Influence on Clinical Outcome of Cardiac Surgery Patients. Antioxid Redox Signal. 23 (11), 865-879 (2015).
- Kanzler, I., et al. Differential roles of angiogenic chemokines in endothelial progenitor cell-induced angiogenesis. Basic Res Cardiol. 108 (1), 310 (2013).
- Walenta, K. L., Bettink, S., Bohm, M., Friedrich, E. B. Differential chemokine receptor expression regulates functional specialization of endothelial progenitor cell subpopulations. Basic Res Cardiol. 106 (2), 299-305 (2011).
- Rassaf, T., Weber, C., Bernhagen, J. Macrophage migration inhibitory factor in myocardial ischaemia/reperfusion injury. Cardiovasc Res. 102 (2), 321-328 (2014).
- Stoppe, C., et al. High postoperative blood levels of macrophage migration inhibitory factor are associated with less organ dysfunction in patients after cardiac surgery. Mol Med. 18, 843-850 (2012).
- Amin, M. A., et al. Migration inhibitory factor mediates angiogenesis via mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol kinase. Circ Res. 93 (4), 321-329 (2003).
- Kupatt, C., et al. Embryonic endothelial progenitor cells expressing a broad range of proangiogenic and remodeling factors enhance vascularization and tissue recovery in acute and chronic ischemia. FASEB J. 19 (11), 1576-1578 (2005).
- Colotta, F., et al. Expression of a monocyte chemotactic cytokine by human mononuclear phagocytes. J Immunol. 148 (3), 760-765 (1992).
- Casale, T. B., Kaliner, M. A rapid method for isolation of human mononuclear cells free of significant platelet contamination. J Immunol Methods. 55 (3), 347-353 (1982).
- Lewandowska, K., Kaplan, D., Husel, W. CD34 expression on platelets. Platelets. 14 (2), 83-87 (2003).
- Stellos, K., et al. Platelet-derived stromal cell-derived factor-1 regulates adhesion and promotes differentiation of human CD34+ cells to endothelial progenitor cells. Circulation. 117 (2), 206-215 (2008).
- Thornton, M. A., Poncz, M. In vitro expansion of megakaryocytes from peripheral blood hematopoietic progenitors. Methods Mol Med. 31, 337-345 (1999).
- Ivetic, N., et al. Producing megakaryocytes from a human peripheral blood source. Transfusion. 56 (5), 1066-1074 (2016).
- Friedrich, E. B., Walenta, K., Scharlau, J., Nickenig, G., Werner, N. CD34-/CD133+/VEGFR-2+ endothelial progenitor cell subpopulation with potent vasoregenerative capacities. Circ Res. 98 (3), e20-e25 (2006).
- Wijelath, E. S., et al. Novel vascular endothelial growth factor binding domains of fibronectin enhance vascular endothelial growth factor biological activity. Circ Res. 91 (1), 25-31 (2002).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Yao, E. H., et al. Effects of the antioxidative beta-blocker celiprolol on endothelial progenitor cells in hypertensive rats. Am J Hypertens. 21 (9), 1062-1068 (2008).
- Takahashi, T., et al. Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nat Med. 5 (4), 434-438 (1999).
- Kawamoto, A., et al. Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia. Circulation. 103 (5), 634-637 (2001).
- Kim, B. S., et al. Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients. J Cardiovasc Transl Res. 9 (3), 230-238 (2016).
- Frangogiannis, N. G., Smith, C. W., Entman, M. L. The inflammatory response in myocardial infarction. Cardiovasc Res. 53 (1), 31-47 (2002).
- Zernecke, A., Bernhagen, J., Weber, C. Macrophage migration inhibitory factor in cardiovascular disease. Circulation. 117 (12), 1594-1602 (2008).
- White, D. A., et al. Pro-inflammatory action of MIF in acute myocardial infarction via activation of peripheral blood mononuclear cells. PLoS One. 8 (10), e76206 (2013).
