Summary
células progenitoras endoteliales (CPE) participan de manera crucial en la neovascularización de los tejidos isquémicos. Este método describe el aislamiento de EPCs humanos de sangre periférica, así como la identificación de su potencial migratorio contra muestras de suero de pacientes de cirugía cardíaca.
Abstract
células progenitoras endoteliales (EPC) son reclutados de la médula ósea en condiciones patológicas como la hipoxia y son de crucial participan en la neovascularización de los tejidos isquémicos. El origen, clasificación y caracterización de las CPE son complejos; no obstante, se han establecido dos prominentes subtipos de las CPE: la llamada "temprana" CPE (en lo sucesivo también como principios-EPC) y CPE-finales de derivación (tarde-EPC). Se pueden clasificar por propiedades biológicas, así como por su aspecto durante el cultivo in vitro. Mientras que las CPE "primeros" aparecen en menos de una semana después del cultivo de células mononucleares derivadas de la sangre periférica en los medios de comunicación a la CE específica, las CPE tarde en la excrecencia se pueden encontrar después de 2-3 semanas. CPE tarde en la excrecencia han sido reconocidos como involucrados directamente en la neovascularización, principalmente a través de su capacidad para diferenciarse en células endoteliales maduras, mientras que "temprano" CPE expresan diversos factores angiogénicos como endógenocarga ous para promover la angiogénesis de una manera paracrina. Durante el infarto de isquemia / reperfusión (I / R), varios factores controlan el homing de CPE a las regiones de formación de vasos sanguíneos.
Macrófagos, factor inhibidor de la migración (MIF) es una citoquina pro-inflamatoria y la expresión ubicua de quimioquinas similar y recientemente fue descrita para funcionar como regulador clave de la migración de las CPE a concentraciones fisiológicas 1. Curiosamente, MIF se almacena en piscinas intracelulares y rápidamente puede ser liberada en el torrente sanguíneo después de varios estímulos (por ejemplo, infarto de miocardio).
Este protocolo describe un método para el aislamiento fiable y la cultura de principios del CPE a partir de sangre periférica humana de adultos basado en la selección CD34-positivo con el cultivo posterior en medio que contiene factores de crecimiento endoteliales en placas recubiertas de fibronectina para el uso en los ensayos de migración in vitro frente a muestras de suero de los pacientes quirúrgicos cardíacos. Además, elinfluencia migratoria del MIF sobre la quimiotaxis de las CPE en comparación con otras citocinas que estimulan la angiogénesis conocidos se demuestra.
Introduction
Células progenitoras endoteliales (CPE) están circulando en la sangre humana y tienen la capacidad de diferenciarse en células endoteliales 2. Participan en la vasculogénesis y son capaces de reducir al mínimo el daño causado por la inflamación y las lesiones por isquemia / reperfusión (I / R) de varias maneras 3, 4. Por ejemplo, EPCs muestran niveles elevados de las enzimas antioxidantes intracelulares como catalasa, glutatión peroxidasa o superóxido dismutasa de manganeso (MnSOD) 5. La elevada resistencia contra el estrés oxidativo permite CPE funcionar en microambientes con especies elevadas de oxígeno reactivo (ROS) después de la lesión isquémica 6. Estudios anteriores también indicaron que el número de CPE puede ser correlacionada con la reparación vascular y que un número reducido de circulación EPCs predice la ocurrencia de eventos cardiovasculares 7,class = "xref"> 8. Sin embargo, una definición clara de un EPC no se ha encontrado todavía. Hasta ahora, no hay ningún marcador de superficie celular específico o fenotipo consistente para EPCs y estas células son muy raros en la sangre periférica 9. Un EPC humano debe considerarse como una célula de circulación con la capacidad de contribuir a la reconstrucción del endotelio lesionado y nuevas estructuras vasculares.
Una forma de aislar y caracterizar las CPE es a través de la adhesión a la fibronectina. De este modo, la capacidad de estas células se utiliza para mostrar una adhesión superior a la fibronectina platos recubiertos comparación con el tipo 1 de colágeno, por ejemplo 3, 10, 11. Sin embargo, otros encontraron que placas células mononucleares en los platos recubiertos de fibronectina sin ninguna etapa de purificación anterior o además conduce a colonias incluyendo las células progenitoras mieloides, monocitos, y linfocitos T 12, 13, 14. Por otra parte, en este caso, las plaquetas pueden contaminar la fracción de células mononucleares (MNC) y de ese modo la transferencia de las proteínas de membrana de plasma de las células adherentes 15.
Además de la caracterización por medio de ensayos de adhesión in vitro, una combinación de diferentes marcadores de superficie celular se utiliza para describir un tipo de célula considerada como un EPC. En este caso, después de la adhesión a fibronectina mediada, las células se analizaron preocupantes sus atributos similares a las endoteliales. En este proceso, los dos marcadores asociados a las células endoteliales, lipoproteína acetilada-baja densidad (acLDL) y vascular del receptor del factor de crecimiento endotelial 2 (VEGFR-2, KDR), juegan un papel. Las células endoteliales y macrófagos se ha demostrado que abordará de manera específica acLDL en un proceso llamado "vía celular del tesoro" 16. Otra proteína marcador es KDR como el principal receptor de VEGF en endotelial17 células. Sin embargo, como EPCs en general se cultivan en medio suplementado con factores de crecimiento endotelial y suero de ternera fetal, es posible que los macrófagos, que también podría haber sido aislado por error, exhiben un perfil de marcador endotelial-similares. Como se indica anteriormente, si se cultivan en un medio endotelial acondicionado, los macrófagos expresan proteínas "-endoteliales específica" 18.
En general, hay dos categorías de EPCs dentro de más subtipos, que se pueden encontrar en la sangre o ser cultivados in vitro. EPC-finales de derivación (late-EPC) aparecen después de 2-3 semanas de cultivo. Estas células se integran más rápido en una monocapa de células endoteliales de la vena umbilical humana y pueden formar tubos capilares 19. Además, los llamados "principios del EPCs" circular en la sangre durante aproximadamente una semana y actuar de una manera más pasiva a través de moléculas angiogénicas, tales como la entrega de crecimiento endotelial vascularfactor de (VEGF), o CXCL8 19. Los pacientes con enfermedad arterial coronaria (CAD) mostraron cantidades significativamente menores de principios de los CPE en comparación con un grupo control sin 20 CAD. Curiosamente, el mismo grupo mostró una mayor cantidad de finales de los EPCs comparación con un grupo control. Otro estudio mostró que los principios del CPE CPE proteger diferenciadas de la apoptosis en condiciones oxidantes, de una manera paracrina 6. Por lo tanto, los primeros EPCs pueden proporcionar efectos protectores relevantes a través de la migración de las otras células de una manera automática o paracrina dentro de la sangre periférica.
Este protocolo describe un método para purificar principios de los EPCs aislando primero el PBMC-fracción a partir de sangre periférica humana y, posteriormente, el aislamiento de células CD34 + de las PBMC-fracción para borrar esta suspensión de células a partir de células no deseadas. CD34 es un marcador, que se utiliza para el aislamiento de células madre hematopoyéticas humanas 9 las células CD34 + se cultivan en superficies de cultivo de tejidos recubiertas de fibronectina. Después de tres días, se cambia el medio, perdiendo de ese modo todas las células no adherentes. Finalmente, EPCs aislados se tiñeron para verificar la absorción de acLDL y la presencia de KDR como de células endoteliales-marcador mediante el uso de células activadas por fluorescencia (FACS). Como un marcador adicional, se analizaron las plaquetas molécula de adhesión celular endotelial (PECAM-1, CD31), que también se produce en las células endoteliales.
Restauración de tejido miocárdico dañado o infartado por el reclutamiento mejorada de EPCs pertenece a las estrategias de tratamiento intensamente investigados en las enfermedades cardiovasculares. Sin embargo, la traducción de los resultados experimentales en la práctica clínica es todavía difícil, dada la compleja interacción celular en el cuerpo humano durante diversas condiciones fisiopatológicas. Por otra parte, el infarto de I / R lesiones desencadenar una excesiva secreción de diversas citoquinas, hormonas de crecimiento y fac res, que controlan el homing de CPE a las regiones de formación de vasos sanguíneos 13. Como ya se ha mostrado, CXCL8, factor derivado de células estromales 1α (SDF-1α, CXCL12), VEGF y el factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF) se incrementó significativamente en muestras de suero después de una lesión miocárdica E / R1. Entre estos factores, MIF es una citoquina pleiotrópica quimiocina similar con características predominantemente pro-inflamatorias. En contraste con su nombre histórico, MIF tiene funciones pro-migratorias, actuando como un verdadero quimiocina en diversos tipos de células 1, 21, 22. Procesos de reclutamiento celular mediada por MIF se han relacionado con la receptores de quimioquinas CXCR2 y CXCR4, que se une a MIF y activa de una manera no afines 21. Es de destacar que las CPE expresan ambos receptores en su superficie, que, además, se convierten hasta reguladas en condiciones de hipoxiaculo = "xref"> 23, 24. Por otra parte, la acumulación de evidencia sugiere que el FOMIN tiene un efecto general cardioprotector durante la Primera R lesión / del corazón 22, 25, 26. En este contexto, se ha demostrado, además, que el FOMIN puede apoyar la neovascularización durante el estrés hipóxico que es de especial relevancia, al considerar los mecanismos de recuperación limitadas del miocardio lesionado 27. Anteriores estudios y experimentos in vitro en modelos de ratón en pre-clínicos proporcionados primera evidencia sobre el papel de MIF en las CPE reclutamiento 4. Es de destacar que FOMIN también es una proteína de carga prominente de CPE que puede ser puesto en libertad durante el reclutamiento CPE dentro de los sitios isquémicos 28. Sin embargo, los estudios en el ámbito clínico, en particular, en comparación con otros (angiogénicos citoquinas séricas) siendo difícil de alcanzar.
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Protocol
La sangre para el aislamiento de las CPE se obtuvo de voluntarios sanos después de consentimiento informado de acuerdo con el comité de ética local. Las muestras de suero utilizadas en los ensayos de migración fueron obtenidas de pacientes sometidos a cirugía cardiaca convencional con el uso de circulación extracorpórea (CEC). Los criterios de exclusión fueron las operaciones de emergencia, embarazo conocido o sospechado, patient`s edad inferior a 18 años, y la imposibilidad de obtener el consentimiento informado. Las muestras de suero se extrajeron además de mediciones de rutina clínicos (inmediatamente antes de la cirugía e inmediatamente después de la reperfusión de miocardio / apertura de pinzamiento aórtico) y posteriormente se almacena a -80 ° C hasta el análisis final. La junta de revisión institucional (Comité de Ética de la Universidad RWTH Aachen) aprobó este estudio. Los pacientes mostraron una edad media de 68,6 años y un peso promedio de 81,7 kg. enfermedades pre-existentes incluyen: hipertensión (65%), la enfermedad pulmonar crónica (19%), arteriopatía cardiaco extra (16%), disfunción cerebral (6%), angina inestable (3%), infarto de miocardio reciente (28% dentro de 90 d), enfermedad renal crónica (14%), enfermedad hepática (2%) y diabetes (34%).
1. Recubrimiento de T75 Frasco:
- Preparar la solución 5 ml de fibronectina (fibronectina humana 1 mg diluidos en 15 ml de agua ultrapura) por matraz T75.
- Añadir la solución a un matraz T75 y esperar hasta que se evapore el agua. Para evitar interrupciones innecesarias durante el proceso de aislamiento debido a la evaporación, lleve a cabo este proceso con antelación (por ejemplo, durante la noche) y a temperatura ambiente. Esta solución da 4,44 g de fibronectina / cm 2.
- Preparar el crecimiento de células endoteliales medio MV2 suplementando el medio basal MV2 con los suplementos de factores de crecimiento proporcionadas por el fabricante.
2. Aislamiento de células progenitoras endoteliales (EPC) de 60 ml de sangre:
NOTA: A medida que el CD34-positivo cóctel de selección de unand las perlas magnéticas están disponibles comercialmente en un kit de selección combinado, no hay concentraciones proporcionadas por el fabricante. Sin embargo, alrededor de 100 l de anticuerpo son suficientes para el procesamiento de hasta 5 x 10 8 células. Las perlas magnéticas se diluyen en agua, revestido con dextrano y sobre 5.000x menor en comparación con otras perlas disponibles en el mercado. Para más información, consulte las instrucciones del fabricante.
- Mezclar la sangre (con o sin anticoagulantes) 1: 1 con Ca 2 + Mg 2 + libre de PBS.
- Añadir 15 ml de solución de gradiente de densidad por un tubo de 50 ml. Para más información, consulte las instrucciones del fabricante.
- capa lentamente la sangre diluida en la parte superior de la solución de gradiente de densidad.
- Centrifugar las muestras a 2.500 xg durante 30 min con una aceleración lenta y sin frenado.
- Recoger con cuidado la capa leucocitaria de cada tubo (Figura 1) con una pipeta de plástico estéril y ponerlo en otro tubo.Evitar la colección de la solución de gradiente de densidad. El rendimiento esperado de PBMC es de aproximadamente 3-4 x 10 6 células / ml de sangre.
Figura 1: La centrifugación por gradiente de densidad de la capa de solución de Ficoll Bbuffy. Se muestra el resultado de la centrifugación en gradiente de densidad a 2.500 xg durante 30 min en la solución de gradiente de densidad. Se representan los eritrocitos y granulocitos (rojo), la fracción de células mononucleares (capa blanca), plasma (amarillo), y la solución de gradiente de densidad (blanquecino). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Diluir la fracción de células mononucleares de sangre periférica con al menos 3 volúmenes de PBS y mezclar. Centrifugar a temperatura ambiente durante 15 min a 200 x g.
- Repita el paso 2.6 en dos ocasiones. </ Li>
- Aspirar el sedimento celular sobrenadante y resuspender en 5 ml de medio MV2.
- Añadir 100 ml de anticuerpo CD34 humano (suficiente para el procesamiento de hasta 5 x 10 8 células) por capa leucocitaria utilizado y girar durante 15 minutos a 37 ° C con 5% de CO2.
- Añadir 50 l de perlas magnéticas recubiertas de dextrano por capa leucocitaria utilizado y girar durante 10 minutos a 37 ° C con 5% de CO 2.
- Después de la incubación, la transferencia de la suspensión a tubos FACS con un máximo de 3 ml en cada tubo. Cantidades más altas no serán permisible con el imán.
- Introduzca el tubo (s) FACS dentro del imán (s) y esperar 5 minutos.
- Desechar el sobrenadante sin tirar de los tubos de FACS fuera del imán.
- Resuspender las células en cada tubo de FACS con 3 ml de medio MV2 fuera del imán.
- Repita los pasos 2.12 a 2.14 veces.
- Tire de los tubos de FACS de los imanes y resuspender las células en 3 ml de medio MV2.
- Transferir la suspensión celular en pre-recubierto T75 flasks y añadir 17 ml de medio MV2 por matraz.
NOTA: El medio debe ser cambiado después de 3 días. Después de una semana, las células muestran estructuras de tipo huso (Figura 2) y están listos para usar. Para un mirador del aislamiento véase la Figura 3.
Figura 2: Imagen microscópica de las CPE aisladas. Se muestra una imagen representativa de aislados de principios del CPE en un matraz T75 antes de la separación. Aparente es la estructura de tipo huso de la CPE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Diagrama de flujo que muestra el procedimiento de aislamiento de EPC. Representado es un esquema, espectáculoing los pasos individuales del protocolo de aislamiento EPC. Para un protocolo más detallado, véase la Sección 2 de la sección del protocolo.
3. Ensayo de Migración
- Retire el medio de EPC en el matraz T75.
- Se lava con 5 ml de PBS agitando con cuidado.
- Retirar PBS y añadir 5 solución de desprendimiento celular comercial ml. Espere hasta que se separan las células (marque con un microscopio). Acelerar el desprendimiento tocando con cuidado el fondo del matraz.
- Cuando se separan las células, añadir rápidamente 5 ml de medio completo MV2 y transferir la suspensión celular a otro tubo.
- Se centrifuga a 2.000 g durante 5 min.
- Resuspender las células en 5 a 10 ml de PBS y centrifugar de nuevo a 2000 xg durante 5 min.
- Repita el paso 3.6.
- Resuspender el sedimento celular en medio muerto de hambre MV2 (50.000 células en se necesitan 75 l por pocillo transmigración).
NOTA: ¿Qué sistema de migración que se necesita depende del tipo de células y ensayo. Hay diff diámetros de poro Erent y tamaños de placas (número de pozos). Para EPCs un tamaño de poro de 5 micras en el sistema 96 también es óptima. - Preparar la placa de la migración mediante la adición de 235 l de la muestra de suero (suero diluido 1: 5 en MV2 medio muerto de hambre) en la cámara inferior (Figura 4).
Figura 4: Ensayo de migración en una cámara de Boyden modificada. Se muestra el diseño general de una cámara de Boyden modificada. Los insertos de cultivo celular (= cámara superior) se indican en azul oscuro y se insertan en la cámara inferior. La parte inferior (pero no las paredes) de estos insertos representa el sistema de filtro que incluye los poros. (A) muestra la configuración en el punto de tiempo cero. (B) Después de un punto de tiempo elegido, las células se migran a través del filtro hacia un estímulo.fig4large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Añadir el inserto poco antes de la adición de la solución de células.
- Añadir 75 l de la solución de células (= 50.000 células) en la cámara superior.
- Que el EPCs migrar durante 3 horas a 37 ° C y CO 2 al 5% (tiempo de migración depende del tipo de célula y del sistema).
- Para evitar artefactos de auto-fluorescencia de suero, cuantificar células migraron al tomar fotografías del bien bajo un microscopio y contar las células usando el software semiautomatizado "ImageJ".
- Retire la cámara superior (que contiene todas las células no migradas).
- Añadir 70 l solución de paraformaldehído al 3,6%, incluyendo Hoechst colorante (diluido 1: 1000). La placa se puede almacenar a 37 ° C y 5% de CO 2 durante la noche.
- Se centrifuga la placa en breve para obtener todas las células en el mismo plano focal a 2.000 xg durante 1-2 minutos.
- Tomar 5 imágenes por well (Figuras 5 y 6) con un aumento de 100X.
Figura 5: Esquema que muestra la posición de las fotos tomadas. El esquema representa la posición de las cinco imágenes tomadas, que son necesarios para la determinación de células migradas, en relación con el pozo. Las imágenes se tomaron para contar las células y calcular un valor medio para cada bien. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Imagen microscópica para la cuantificación de la célula. Se muestra una imagen representativa, que fue tomada para la cuantificación de células. Las células se tiñeron y USI fijosng de colorante Hoechst en el 3,6% de paraformaldehído. Los puntos representan fijaron y tiñeron las células progenitoras endoteliales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Contar las células migradas usando el software semiautomatizado "ImageJ" por el Instituto Nacional de Salud.
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Representative Results
Caracterización de las células progenitoras endoteliales aisladas
En primer lugar, la absorción de acLDL se verificó, así como la expresión de KDR y CD31 en la superficie de la población de células aislada. Como muestra la Figura 7a, el 85,1% de los aislados CPE mostró una absorción de acLDL y expresa CD31. Las figuras 7b y 7c muestran, además, una distribución homogénea de los dos marcadores, aunque parece que hay una población más pequeña, negativos para ambos marcadores. En un segundo paso, se realizó un análisis FACS de acLDL en combinación con KDR. La figura 8a muestra que más del 80% de las células aisladas mostró una absorción de acLDL y la expresión de KDR en su superficie. Las figuras 8b y 8c muestran la homogeneidad de estos marcadores.
Para verificar la importance de platos recubiertos de fibronectina durante el tiempo de cultivo, una comparación de los tres marcadores entre las células aisladas después de dos días de cultivo en una superficie recubiertos de fibronectina con las CPE aisladas después de siete días de cultivo en los platos recubiertos de fibronectina (como se indica en el protocolo) se llevó a cabo, tanto en lo anterior CD34 + -selección. Como se muestra en la Figura 9a, sólo el 46,4% de las células de dos días en cultivo mostró una absorción de acLDL, así como una expresión de CD31 en su superficie, en comparación con el 85% de las células después de siete días de cultivo en la fibronectina. Por otra parte, los histogramas (figuras 9b y 9c) muestran menos intensidad de ambos marcadores después de dos días de cultivo en comparación con los siete días (figuras 7b y 7c). Lo mismo es cierto para una combinación de los marcadores acLDL y KDR. Después de dos días de cultivo en fibronectina, sólo el 68,0% de todas las células mostró una absorción de acLDL, así como una expresión de KDR en su superficie (Figuras 10a-10c). Después de siete días de cultivo en fibronectina, 83,6% de las células mostró una absorción de acLDL y la expresión de KDR en su superficie (Figuras 8a-8c).
En un paso siguiente, se evaluó la importancia de la CD34 + -Selección durante el aislamiento de EPCs. Por lo tanto, las células seleccionadas de acuerdo con el presente protocolo, incluyendo centrifugación en gradiente de densidad y siete días de cultivo en fibronectina, pero que se perdieron el CD34 + fueron aislados -selección. Como se muestra en la Figura 10a, más del 18% de todas las células aisladas hacer ni CD31 expresa ni muestran una absorción de acLDL, en comparación con menos de 8% después de CD34 + -Selección, que muestran una expresión CD31 y una absorción de acLDL (Figura 7a) . Además, Figuras 11b y 11c muestran que las células aisladas son muy homogénea en cuanto a los dos marcadores en comparación con la relativa
Los niveles séricos de citocinas durante la cirugía cardíaca
Para identificar la influencia de la cirugía cardiaca después de infarto de I / R en las concentraciones circulantes de los niveles séricos de MIF, CXCL12, CXCL8 y VEGF, las muestras de suero se extrajeron antes y dentro de la cirugía para el posterior análisis por ELISA disponible comercialmente (Figura 12) . Los niveles séricos de MIF mostraron un aumento intraoperatoria significativa en comparación con los valores basales (100,3 ng / ml vs. 127,4 ng / ml, p = 0,027). Del mismo modo, los niveles de CXCL12 mostraron un aumento significativo en el suero durante la cirugía (0,101 ng / ml vs. 0.198 ng / ml, p = 0,011). Similar a MIF y CXCL12, CXCL8 aumentó significativamente durante la cirugía (0,15 ng / ml vs 0.3 ng / ml, p = 0,022). en contrast, las concentraciones de VEGF no mostró cambios significativos durante el período de observación (0.154 ng / ml frente a 0,134 ng / ml, p = 0,583) 1.
Capacidad de migración de las células progenitoras endoteliales
Para investigar el efecto directo de las muestras de suero patients' y la contenida en el mismo citocinas / quimiocinas / factores angiogénicos en la migración EPC, un ensayo de migración ex vivo usando muestras de suero, que se extrae antes y durante la cirugía, se realizó. EPCs fueron aislados de voluntarios sanos. Como se muestra en la Figura 13, la tasa de migración EPC aumentó significativamente hacia las muestras tomadas dentro de la cirugía en comparación con las muestras tomadas de la operación PRE (+ 35% en comparación con el valor basal, p = 0,047).
Dado que los estudios anteriores ya demostraron que I / R desencadena una secreción de sevSe realizaron va- citoquinas que modulan la quimiotaxis de leucocitos y la migración, ensayos de migración que utilicen estos cebos químicos potenciales, incluyendo MIF, CXCL12, CXCL8, y VEGF. Para obtener una mejor comprensión de la influencia de estas citoquinas en el reclutamiento EPC in vivo, en experimentos adicionales de migración in vitro, la aplicación de las concentraciones fisiológicamente medidos de las citoquinas anteriores a la cámara inferior de la migración se realizaron dispositivos, también.
Como las concentraciones séricas de MIF entre 100 y 130 ng / ml se habían medido (Figura 12), una concentración de 100 ng / ml se utilizó de MIF recombinante, lo que condujo a un aumento> 6 veces en la migración EPC en comparación con el medio de control ( la Figura 14). Por el contrario, las concentraciones séricas de CXCL12, CXCL8, y VEGF estaban en el rango de 150 a 300 pg / mL. Es de destacar que estas concentraciones no mediar ningún efecto sobre la migración in vitro EPC(Figura 14). Por tanto, es concebible que entre estos cuatro citoquinas, MIF exhibe la relación más fuerte influencia sobre la migración EPC 1 in vivo.
Figura 7: Análisis FACS de las CPE aisladas en el Día 7. (a) Se muestra la captación de acLDL y CD31 expresión en la superficie celular de las CPE aisladas después de CD34 + selección y periodo de cultivo de 7 días en platos recubiertos de fibronectina. Arriba a la izquierda: Las células muestran la captación de acLDL, pero no expresan CD31. Arriba a la derecha: Las células muestran la captación de acLDL y expresan CD31. Abajo a la izquierda: Las células no muestran ninguna absorción de acLDL y no expresan CD31. Abajo a la derecha: Las células no muestran ninguna absorción de acLDL, sino que expresan CD31. (B) Se muestra el histograma de acLDL conjugado con PE después de la absorción por las CPE aisladas. (C) Se muestra el histograma de FITC-conjanticuerpo CD31 ugated tras la unión a CD31 de la superficie celular de las CPE aisladas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Análisis FACS de las CPE aisladas en el Día 7. (a) Se muestra la captación de acLDL y KDR expresión en la superficie celular de las CPE aisladas después de CD34 + selección y periodo de cultivo de 7 días en platos recubiertos de fibronectina. Parte superior izquierda: células muestran absorción de acLDL, pero no expresan KDR. Arriba a la derecha: Las células muestran la captación de acLDL y expresan KDR. Abajo a la izquierda: Las células no muestran ninguna absorción de acLDL y no expresan KDR. Abajo a la derecha: Las células no muestran ninguna absorción de acLDL, sino que expresan KDR. (B) Se muestra el histograma de acLDL conjugado con PE después de la absorción por las CPE aisladas. (C) Se muestra lahistograma de anticuerpo KDR conjugado con FITC después de la unión a KDR superficie celular de EPCs aisladas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: Análisis FACS de las CPE aisladas en el Día 2. (a) Se muestra la captación de acLDL y CD31 expresión en la superficie celular de las CPE aisladas después de CD34 + selección y período de cultivo de 2 días sobre los platos recubiertos de fibronectina. Parte superior izquierda: células muestran absorción de acLDL, pero no expresan CD31. Arriba a la derecha: Las células muestran la captación de acLDL y expresan CD31. Abajo a la izquierda: Las células no muestran ninguna absorción de acLDL y no expresan CD31. Abajo a la derecha: Las células no muestran ninguna absorción de acLDL, sino que expresan CD31. (B) Se muestra el histograma de acLDL conjugado con PE después de la absorción por las CPE aisladas. (
Figura 10: Análisis FACS de las CPE aisladas en el Día 2. (a) Se muestra la captación de acLDL y KDR expresión en la superficie celular de las CPE aisladas después de CD34 + selección y período de cultivo de 2 días sobre los platos recubiertos de fibronectina. Parte superior izquierda: células muestran absorción de acLDL, pero no expresan KDR. Arriba a la derecha: Las células muestran la captación de acLDL y expresan KDR. Abajo a la izquierda: Las células no muestran ninguna absorción de acLDL y no expresan KDR. Abajo a la derecha: Las células no muestran ninguna absorción de acLDL, sino que expresan KDR. (B) Se muestra el histograma de acLDL conjugado con PE después de la absorciónpor EPCs aisladas. (C) Se muestra el histograma de anticuerpo KDR conjugado con FITC después de la unión a KDR superficie celular de EPCs aisladas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 11: Análisis FACS de las CPE aisladas en el Día 7. (a) Se muestra la captación de acLDL y CD31 expresión en la superficie celular de las CPE aisladas, sin previa CD34 + selección, pero incluyendo periodo de cultivo de 7 días en platos recubiertos de fibronectina. Arriba a la izquierda: Las células muestran la captación de acLDL, pero no expresan CD31. Arriba a la derecha: Las células muestran la captación de acLDL y expresan CD31. Abajo a la izquierda: Las células no muestran ninguna absorción de acLDL y no expresan CD31. Abajo a la derecha: Las células no muestran ninguna absorción de acLDL, sino que expresan CD31. (B) se muestra dees el histograma de acLDL conjugado con PE después de la absorción por EPCs aisladas. (C) Se muestra el histograma de anticuerpo CD31 conjugado con FITC después de la unión a CD31 de la superficie celular de EPCs aisladas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 12: Niveles de citoquinas en suero durante la cirugía cardíaca. La medición de las concentraciones séricas de CXCL8, VEGF, CXCL12, y MIF de los pacientes que se sometieron a cirugía cardíaca mediante ELISA. Se demuestran los valores medios de pre-operatoria en comparación con las concentraciones intraoperatorias ± SEM (*: p <0,05; vs pre-OP)
Figura 13: In Vitro La migración de las CPE Hacia el suero del paciente. Se muestra el aumento intra-operatoria en la migración de EPC voluntarios sanos hacia las muestras de suero de pacientes, que se sometieron a cirugía cardíaca. se añadieron 50.000 células por pocillo en medio de suero MV2 muerto de la cámara superior de un sistema Transwell. Las muestras de suero en la cámara inferior se diluyeron 1: 5 con el mismo medio. Las células migraron durante 3 horas a 37 ° C y 5% de CO 2 a través de una membrana de 5 micras. Las barras representan los valores medios ± SEM (*: p <0,05)
Figura 14: migración in vitro de CPE Hacia recombinante citoquinas. Se muestra la migración de EPCs hacia concentraciones representativas de CXCL8 recombinante, CXCL12, VEGF, y MIF en comparación con medio de suero de hambre (= línea de base). Sólo pudo MIFpara mediar un aumento de la migración EPC a concentraciones fisiológicamente medidos. Las citoquinas recombinantes se diluyeron en suero MV2 medio de hambre. Las células migraron durante 3 h a través de una membrana de 5 micras. Las barras representan los valores medios ± SEM (**: p <0,01 frente al suero medio muerto de hambre)
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Discussion
La primera parte de este estudio incluyó el aislamiento de las CPE humanos de la sangre periférica de voluntarios sanos para permitir una evaluación completa de la sangre de los pacientes sometidos a cirugía cardíaca. Por lo tanto, una centrifugación en gradiente de densidad se realizó para separar la fracción de PBMC a partir de plasma, granulocitos y eritrocitos. Para eliminar la mayor parte de las plaquetas contaminantes, esta fracción de células se sometió a corto y lavado lento los pasos 29, 30. A continuación, se aislaron células CD34 + a partir de la fracción restante para separar las células progenitoras de los linfocitos restantes, y monocitos. Finalmente, la suspensión de células se cultivó en placas recubiertas de fibronectina en un medio de crecimiento de células endoteliales comercialmente disponible para separar las células progenitoras endoteliales de otras células progenitoras () del linaje mieloide 3. De la nota, se discute que las plaquetas pueden mostrar un expreso de la superficie celular CD34ion, también. Aunque los estudios previos demostraron la unión de algunos anticuerpos anti-CD34 a las plaquetas, esto podría ser un artefacto debido a la agregación de las plaquetas con otras células (CD34-positivas) 31, 32. Sin embargo, la mayoría de las plaquetas pueden ser separados por las repetidas etapas de lavado lentos. Al lado de las plaquetas, sus precursores - megacariocitos - no expresan este antígeno de células progenitoras hematopoyéticas y pueden estar presentes en la sangre periférica, a pesar de que se encuentran principalmente en la médula ósea 33, 34. Por otra parte, también se describe que el marcador de superficie celular CD34, usado en este protocolo se expresa en niveles muy bajos en las células endoteliales maduras 35. Por lo tanto, es importante tener en cuenta con precaución una posible contaminación por plaquetas / megacariocitos o células endoteliales maduras, cuando el aislamiento de EPCs. Por lo tanto, el paso 2.6 es de especial relevancia durante el isolation de CPE para eliminar las plaquetas.
Para aclarar la importancia de cultivar las células aisladas en los platos recubiertos de fibronectina, las poblaciones de células después de dos días y siete días de cultivo en la fibronectina se compararon tanto con la selección anterior CD34-positivo. En el segundo día, menos de la mitad de las células aisladas mostró una absorción de acLDL y expresión simultánea de CD31 en su superficie. Por otra parte, una menos intensa expresión de ambos marcadores en los histogramas con respecto podía ser visto. Estos datos muestran que siete días de cultivo en fibronectina en el medio específico de la célula endotelial son necesarias para obtener EPCs que muestran patrones de expresión endoteliales característicos. En este paso, es de importancia para utilizar el derecho de concentración / cantidad de fibronectina. Wijelath y colegas demostraron previamente que la fibronectina promueve la expresión de los patrones de células endoteliales como, probablemente en combinación con VEGF 36.
En la siguiente step del protocolo, se investigó la importancia de CD34 + -Selección de la suspensión celular, la comparación de las células aisladas después de 7 días de cultivo en placas recubiertas de fibronectina, con y sin CD34 + anterior -Selección. La cantidad de células que faltan los dos marcadores (captación acLDL y expresión CD31) fue mucho mayor después del aislamiento de células sin CD34 + anterior -Selección comparación con el aislamiento incluyendo este paso. CD34 Curiosamente, después de siete días de cultivo en la fibronectina, las células que faltan + -Selección mostró una población de células menos homogénea, como se indica por la expresión no homogénea de CD31 en comparación con las células, aislado con CD34 + -Selección. Estos datos muestran que CD34 + -Selección es necesario resolver EPCs de otros monocitos / macrófagos. Durante la creación de este protocolo, se encontró que CD34 + en un medio -selección MV2 a 37 ° C conduce a un aumento del número de células supervivientes, en comparación con te mucho menormperatures, que debe ser investigada con cautela en futuros estudios. Tenemos que reconocer que al aplicar este protocolo, la incubación del anticuerpo en un medio que contiene calcio a 37 ° C puede dar lugar a interacciones y la unión no específica. En el futuro, los sistemas de amortiguación que carecen de calcio a temperaturas más bajas deben ser probados y establecidos para evitar este posible factor de confusión.
Cabe destacar que, durante el análisis preliminar de los experimentos de migración celular con las muestras de suero, las mediciones se realizaron en primer lugar utilizando un lector de microplacas de fluorescencia y calceína-tinción de las células, como se describe previamente para diferentes tipos de células (por ejemplo, células endoteliales de la vena umbilical humana, HUVEC) 37. Los diferentes valores de extinción entre las cámaras se indica que no sólo las muestras de suero solo, sino también el medio ya tienen una notable influencia en la fluorescencia medida, que debe ser considerado cuidadosamente. Por lo tanto, we adaptado nuestro protocolo y cambió a un sistema de medición en el que las células se pueden observar a través de microscopía de luz y contados por un software semi-automatizado.
Mientras que EPCs representan aproximadamente el 0,1% de las células en la sangre periférica y es difícil de aislar estas células específicas 38, un número impresionante de estudios indicaron que EPCs puede proporcionar efectos beneficiosos y mejorar la vascularización del tejido después de eventos isquémicos en las extremidades y en el miocardio 39 , 40. Sin embargo, todavía es un desafío permanente para traducir estos resultados en la práctica clínica y evaluar su relevancia clínica. Las razones pueden deberse a la influencia significativa de los muchos factores perioperatorios sobre la secreción de diferentes quimioatrayentes, que se ha demostrado previamente 22, 41. Por lo tanto, en la segunda parte de este estudio, el papel de diferente cytokines sobre la migración de EPCs en el entorno de I miocardio / R se evaluaron. Por lo tanto, se midieron las concentraciones séricas de citocinas en pacientes de cirugía cardiaca. MIF, así como CXCL12 y CXCL8 mostraron un aumento intra-operatorio significativo. Cuando se traduce cuenta los resultados en los experimentos in vitro, presentan resultados demostraron que no es ni una ni CXCL12- efecto CXCL8 mediada por la migración de EPC a las concentraciones fisiológicas medidas in vitro. Usando el modelo de aislamiento EPC descrito y el ensayo de migración posterior, MIF fue identificado como un mediador predominante de la migración EPC 42. En este contexto, Kanzler et al. demostrado en un modelo experimental de ratón que MIF y VEGF proporcionan el efecto más fuerte sobre la migración EPC en condiciones de hipoxia 23. Curiosamente, las mediciones de VEGF muestran que no hay ningún cambio intra-operatoria significativa en las concentraciones en sangre de VEGF, que puede resultar de la unión of VEGF a la aplicación normalizada de la heparina intraoperatoria. Por lo tanto, el FOMIN puede jugar un papel predominante entre las quimiocinas angiogénicos en el reclutamiento de las CPE en pacientes sometidos a cirugía cardíaca y puede iniciar y contribuir al proceso de curación después de un infarto de I / R a través del tráfico de CPE en el sitio de la lesión 43, 44 Sin embargo, como MIF niveles aumentaron inmediatamente después de que el infarto / R, sigue siendo especulativa si el efecto mediado por el FOMIN sobre la contratación de las CPE puede influir en la remodelación cardiaca y la angiogénesis, que tienen importantes implicaciones en la prevención de la insuficiencia cardiaca después de un infarto de I / R 23. Sin embargo, antes de avanzar a dicho análisis, es importante para caracterizar mejor los diferentes subtipos de EPCs y para evaluar su papel funcional en la biología humana. A este respecto, el presente protocolo proporciona un método fiable sobre cómo aislar EPCs a partir de sangre periférica humana para permitir ict caracterización más completa y futuros estudios.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores no tienen reconocimientos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin | Biochrom AG | L7117 | Coating of T-75 flasks |
| Aqua ad iniectabilia | Fresenius Kabi | ||
| Endothelial cell growth medium MV2 | Promo Cell | C-22221 | |
| Endothelial cell growth medium MV2 SupplementMix | Promo Cell | C-39226 | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | Density centrifugation |
| EasySep human CD34 positive Selection Kit | Stemcell Technologies | 18056 | Isolation of CD34+ cells |
| EasySep magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | Detachment of cells |
| Corning HTS transwell 96 well permeable supports | Sigma-Aldrich | CLS3387-8EA | Migration system |
| Hoechst solution | ThermoFisher | 33342 | Staining of migrated cells |
| ImageJ | National institutes of health | xxx | Counting of migrated cells |
References
- Emontzpohl, C., et al. Key role of MIF in the migration of endothelial progenitor cells in patients during cardiac surgery. Int J Cardiol. 181C, 284-287 (2014).
- Smadja, D. M., et al. Interleukin 8 is differently expressed and modulated by PAR-1 activation in early and late endothelial progenitor cells. J Cell Mol Med. 13 (8B), 2534-2546 (2009).
- Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
- Simons, D., et al. Hypoxia-induced endothelial secretion of macrophage migration inhibitory factor and role in endothelial progenitor cell recruitment. J Cell Mol Med. 15 (3), 668-678 (2011).
- Dernbach, E., et al. Antioxidative stress-associated genes in circulating progenitor cells: evidence for enhanced resistance against oxidative stress. Blood. 104 (12), 3591-3597 (2004).
- Yang, Z., et al. Paracrine factors secreted by endothelial progenitor cells prevent oxidative stress-induced apoptosis of mature endothelial cells. Atherosclerosis. 211 (1), 103-109 (2010).
- Asahara, T., Kawamoto, A., Masuda, H. Concise review: Circulating endothelial progenitor cells for vascular medicine. Stem Cells. 29 (11), 1650-1655 (2011).
- Schmidt-Lucke, C., et al. Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events: proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair. Circulation. 111 (22), 2981-2987 (2005).
- Yoder, M. C. Human endothelial progenitor cells. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006692 (2012).
- Ito, H., et al. Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin. Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Rohde, E., et al. Blood monocytes mimic endothelial progenitor cells. Stem Cells. 24 (2), 357-367 (2006).
- Rohde, E., et al. Immune cells mimic the morphology of endothelial progenitor colonies in vitro. Stem Cells. 25 (7), 1746-1752 (2007).
- Prokopi, M., et al. Proteomic analysis reveals presence of platelet microparticles in endothelial progenitor cell cultures. Blood. 114 (3), 723-732 (2009).
- Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein. J Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).
- Koch, S., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by vascular endothelial growth factor receptors. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006502 (2012).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).
- Tagawa, S., et al. Determination of Early and Late Endothelial Progenitor Cells in Peripheral Circulation and Their Clinical Association with Coronary Artery Disease. Int J Vasc Med. , 2015 (2015).
- Bernhagen, J., et al. MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment. Nat Med. 13 (5), 587-596 (2007).
- Stoppe, C., et al. Interaction of MIF Family Proteins in Myocardial Ischemia/Reperfusion Damage and Their Influence on Clinical Outcome of Cardiac Surgery Patients. Antioxid Redox Signal. 23 (11), 865-879 (2015).
- Kanzler, I., et al. Differential roles of angiogenic chemokines in endothelial progenitor cell-induced angiogenesis. Basic Res Cardiol. 108 (1), 310 (2013).
- Walenta, K. L., Bettink, S., Bohm, M., Friedrich, E. B. Differential chemokine receptor expression regulates functional specialization of endothelial progenitor cell subpopulations. Basic Res Cardiol. 106 (2), 299-305 (2011).
- Rassaf, T., Weber, C., Bernhagen, J. Macrophage migration inhibitory factor in myocardial ischaemia/reperfusion injury. Cardiovasc Res. 102 (2), 321-328 (2014).
- Stoppe, C., et al. High postoperative blood levels of macrophage migration inhibitory factor are associated with less organ dysfunction in patients after cardiac surgery. Mol Med. 18, 843-850 (2012).
- Amin, M. A., et al. Migration inhibitory factor mediates angiogenesis via mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol kinase. Circ Res. 93 (4), 321-329 (2003).
- Kupatt, C., et al. Embryonic endothelial progenitor cells expressing a broad range of proangiogenic and remodeling factors enhance vascularization and tissue recovery in acute and chronic ischemia. FASEB J. 19 (11), 1576-1578 (2005).
- Colotta, F., et al. Expression of a monocyte chemotactic cytokine by human mononuclear phagocytes. J Immunol. 148 (3), 760-765 (1992).
- Casale, T. B., Kaliner, M. A rapid method for isolation of human mononuclear cells free of significant platelet contamination. J Immunol Methods. 55 (3), 347-353 (1982).
- Lewandowska, K., Kaplan, D., Husel, W. CD34 expression on platelets. Platelets. 14 (2), 83-87 (2003).
- Stellos, K., et al. Platelet-derived stromal cell-derived factor-1 regulates adhesion and promotes differentiation of human CD34+ cells to endothelial progenitor cells. Circulation. 117 (2), 206-215 (2008).
- Thornton, M. A., Poncz, M. In vitro expansion of megakaryocytes from peripheral blood hematopoietic progenitors. Methods Mol Med. 31, 337-345 (1999).
- Ivetic, N., et al. Producing megakaryocytes from a human peripheral blood source. Transfusion. 56 (5), 1066-1074 (2016).
- Friedrich, E. B., Walenta, K., Scharlau, J., Nickenig, G., Werner, N. CD34-/CD133+/VEGFR-2+ endothelial progenitor cell subpopulation with potent vasoregenerative capacities. Circ Res. 98 (3), e20-e25 (2006).
- Wijelath, E. S., et al. Novel vascular endothelial growth factor binding domains of fibronectin enhance vascular endothelial growth factor biological activity. Circ Res. 91 (1), 25-31 (2002).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Yao, E. H., et al. Effects of the antioxidative beta-blocker celiprolol on endothelial progenitor cells in hypertensive rats. Am J Hypertens. 21 (9), 1062-1068 (2008).
- Takahashi, T., et al. Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nat Med. 5 (4), 434-438 (1999).
- Kawamoto, A., et al. Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia. Circulation. 103 (5), 634-637 (2001).
- Kim, B. S., et al. Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients. J Cardiovasc Transl Res. 9 (3), 230-238 (2016).
- Frangogiannis, N. G., Smith, C. W., Entman, M. L. The inflammatory response in myocardial infarction. Cardiovasc Res. 53 (1), 31-47 (2002).
- Zernecke, A., Bernhagen, J., Weber, C. Macrophage migration inhibitory factor in cardiovascular disease. Circulation. 117 (12), 1594-1602 (2008).
- White, D. A., et al. Pro-inflammatory action of MIF in acute myocardial infarction via activation of peripheral blood mononuclear cells. PLoS One. 8 (10), e76206 (2013).
