Summary
Anestesi-inducerad utveckling av neurotoxicitet (AIDN) har fokuserat på gnagare, vilka inte är brett tillämpliga på människor. Icke-mänskliga primatmodeller är mer relevanta, men är kostnadseffektiva och svåra att använda för experiment. Grisen är däremot en kliniskt relevant, praktisk djurmodell som är idealisk för studier av anestetisk neurotoxicitet.
Abstract
Narkos kan inte undvikas i många fall när kirurgi krävs, särskilt hos barn. Nyligen undersökningar hos djur har väckt farhågor om att anestesiexponering kan leda till neuronal apoptos, känd som anestesiinducerad utvecklingsneurotoxicitet (AIDN). Vidare har vissa kliniska studier på barn föreslagit att exponering för anestesi kan leda till underskott i neurodevelopment senare i livet. Ändå har en ideal djurmodell för preklinisk studie ännu inte utvecklats. Den neonatala piglet representerar en värdefull modell för preklinisk studie, eftersom de delar ett slående antal utvecklingslikheter med människor.
Grisarnas anatomi och fysiologi möjliggör genomförande av rigorösa humana perioperativa tillstånd i både överlevnads- och icke-överlevnadsförfaranden. Femoral arteriell kateterisering möjliggör noggrann övervakning, vilket möjliggör snabb korrigering av eventuella avvikelser hos piglets vitala tecken och kemikalier. jagN Dessutom finns det flera utvecklingslikheter mellan grisar och mänskliga nyfödda. De tekniker som krävs för att använda grisar för experiment ska kräva erfarenhet att behärska. En pediatrisk anestesiolog är en kritisk medlem av undersökningsgruppen. Vi beskriver i allmänhet den lämpliga användningen av en pigletmodell för neurodevelopmental studie.
Introduction
Varje år får miljontals barn i allmänhet allmänbedövning, många av dem under 4 år 1 . Anestetisk inducerad utvecklingsneurotoxicitet (AIDN) har blivit ett fokus för pediatrisk anestesiforskning, eftersom det har blivit nödvändigt att förstå effekterna av anestesi på omogna hjärnor. Tidigare forskning har visat att vanliga anestetika, såsom isofluran, kan orsaka ökad neuronal apoptos i hjärnan hos unga djur. Studier hos barn har givit ojämn resultat 2 . Att förstå patogenesen av AIDN, identifiera potentiella terapeutiska mål för förebyggande eller förbättring, och beskriva de säkraste anestetiska regimer som är tillgängliga har blivit brådskande mål för barnsbedövningsgemenskapen. Det primära syftet med denna studie var att utveckla en optimal djurmodell och metod för att kvantifiera effekterna av anestetika på den utvecklande hjärnan och att stimulera noggrantUtformad undersökning av säkerheten hos för närvarande utbredda anestetika.
I en nyligen systematisk översyn av den nuvarande kroppen av preklinisk litteratur om AIDN noterade författarna betydande metodologisk heterogenitet i över 900 studier 3 . Många ansåg att detta var ett krav på en kliniskt relevant, väl utformad preklinisk modell, som ännu inte finns trots flera års forskning om ämnet. De flesta gnagaremodellerna behöver, utan behov, ett tillvägagångssätt som inte tillåter noggrann fysiologisk övervakning, blodprovtagning eller mekanisk ventilation. Eftersom hjärnan är utsökt känslig för fysiologiska störningar är det svårt att förlita sig på resultaten från sådana modeller. Ett primärt mål för utvecklingen av denna modell var att utforma det på ett sådant sätt att alla fysiologiska variabler såsom blodgasparametrar, kroppstemperatur, respiratoriska parametrar etc. övervakas och korrigeras vid behov.
4 . Den translatoriska pigletmodellen ger den kliniska relevans som eftersträvas i dessa recensioner och redaktioner, eftersom den är utformad för att tillgodose detta behov av relevanta prekliniska data som kan informera framtida kliniska studier.
Isofluran, en GABA-typ A (GABA A ) -receptoragonist och svag NMDA-receptorantagonist, är den som är en vanligt inhalerad anestetik i klinisk praxis världen över. Narkosläkemedel som isofluran har ansetts vara säkra så länge de inte inducerar hypotoni eller hypoxi. Men mer subtila effekter kan förekomma. När hjärnan utsätts för allmänbedövning, är balansen i GABA aGonism och NMDA-antagonism störs, vilket resulterar i förändringar i cellulär arkitektur, anslutning och funktion. Dessutom, medan GABA i allmänhet är en hämmande neurotransmittor, är det känt att vara excitatorisk i omogna hjärnor 5 . Exakt när GABAs övergång från exciterande till hämmande uppträder är inte väl förstådd och är sannolikt arthängande.
När en obalans mellan excitatorisk och hämmande ingrepp i hjärnan uppträder under den så kallade "brain growth spurt", kan den resulterande excitotoxiska dysreguleringen av kritiska molekylvägar leda till onormal neurodevelopment, såsom apoptotisk neurodegenerering. Förutom ökad apoptos kan oxidativ stress och inflammation också induceras, medan neuronal cellproliferation, neuronal migration och axonal arborisering blir undertryckta eller dysreglerade 6 . Nettoresultatet är neurokognitiva störningar som kan kvarstå i adulDöd 2 .
För att direkt mäta de neurotoxiska effekterna av isofluran på unga däggdjur används neonatala smågrisar. Smågrisar delar mer CNS-likheter med människor än något annat däggdjur, och som sådan gör deras neurodevelopmentala och neuroanatomiska likheter dem till ett idealiskt djur för en kliniskt relevant däggdjursmodell av AIDN. Både människor och smågrisar har gyrencefaliska hjärnor, som delar likheter i karaktären och fördelningen av hjärnan gyri, grå materia och vit materia. Hippocampusgrisen, basalganglierna och hjärnstammen är också topografiskt lik den hos människor 7 . Utvecklingsvis är smågrisar ett av få få-mänskliga däggdjur som genomgår perinatal hjärntillväxt och myelinering 8 . I utero, både mänskliga och piglet hjärnor genomgår betydande tillväxt under sen trimesterns graviditet. I samband med födseln är människa och grishjärnor 27% respektive 25% av vuxna hjärnor. Magnetic resonance imaging har visat att en en vecka gammal piglet hjärna är ungefär lika med en månad gammal mänsklig hjärna när det gäller neuron mognad och dendritisk arborization 9 . Dessutom delar grisetten och människans hjärna många likheter med avseende på neuroprojektionsmönster. Exempelvis är uttrycket och mRNA-sekvensen hos reelin 10 , den topografiska fördelningen av 5-HT-neuroner 11 och nervrörsläckningen 12 alla parallella med det som ses hos människor. Vidare finns omfattande homologi mellan genomerna av grisar och människor 13 .
Relevansen av en djurmodell måste förstås i samband med mänsklig patologi, särskilt i relation till mänsklig spädbarns hjärnmognad och patobiologi. De flesta av de befintliga toxicitetsstudierna för anestesi använder en gnagaremodell, med några som utnyttjar icke-mänskligPrimatmodeller. Dock kan gnagare och primater inte vara de perfekta djuren för att undersöka AIDN.
Även om de används i stor utsträckning är gnagarehjärnor väldigt annorlunda än hos människor i hela utvecklingen. Mest speciellt har gnagare lissencephalic (eller släta) hjärnor. Gnagarehjärnan saknar gyri och sulci som är karakteristiska för mer neurologiskt komplexa organismer. Gnagarehjärnan genomgår också en postnatal hjärntillväxtspurt 14 , olik till människor och smågrisar. Det har observerats att det finns variationer i sårbarhet hos olika hjärnregioner till inhalationsanestetik 15 . Därför bör det vara viktigt att djurmodellen för att studera AIDN har en hjärna som är neurodevelopmentally och neuroanatomically lik den hos en människa, för att bäst modellera de anestesiinducerade hjärnförändringar som sannolikt kommer att ses hos barn. Som tidigare beskrivits har piggar en hjärna som jagS mycket bättre lämpad för denna roll. Vidare är de vanliga formerna för neurokognitiv testning av gnagare, såsom rumslig inlärning och minne utvärderad i Morris-vattenlabben, inte direkt relevanta eller jämförbara med de neurokognitiva bedömningarna hos unga barn 16 . En av fördelarna med att använda grisar för utvecklingsnervetenskap är att de är extremt mottagliga för neurokognitiv testning, även i en tidig ålder. Många neurokognitiva tester som anses vara användbara för andra däggdjursarter har framgångsrikt använts och validerats hos grisar. Även om det fortfarande är ett utvecklande fält innehåller neurokognitiv bedömning hos grisar mer komplexa tester som bättre efterliknar mänskliga underskott, såsom ett lutande strålmotortest 17 , 18 och spatialt medvetenhetstest 19 . Motorprovning med den lutande strålen, som en del av traumatisk hjärnskadestudie hos grisar, visar hög tillförlitlighet vid bedömningenAv motorfunktionen. Spegeltestet visar minne om omgivningen plus erkännande och användning av en reflekterad bild för att söka matbelöning.
Å andra sidan kan icke-mänskliga primater vara en lämpligare modell för studier på barnsbedövning, men det finns ett antal otillåtna faktorer, inklusive kostnad och svårighetsgrad att använda. Dessutom är de extremt känsliga för tidiga uppfödningsförhållanden, särskilt stress och materiell separation 20 . Faktorer som är viktiga för studien av AIDN, såsom allosteriska modulatorer, receptor-ligandaffiniteter, posttranslationella modifieringar, receptorunderenhetskompositioner och alternativa splitsningsvarianter är okända i fallet med primater. Detta beror på att gener som är relevanta för sådana begrepp inte har klonats. Däremot har de klonats hos grisar. Som sådant har endast begränsat arbete gjorts i icke-mänskliga primater 21 , 22
Grönmodellen bygger på fördelarna med gnagare och icke-mänskliga primatmodeller: det är kostnadseffektivt, lätt att använda i förhållande till icke-mänskliga primatstudier, och är neuroanatomiskt och neurofysiologiskt lik den pediatriska mänskliga hjärnan. Användningen av grisar inom neurovetenskaplig forskning har ökat under de senaste åren, inklusive ett antal studier som har undersökt barns neuroinflammatoriska tillstånd. Effekter av respiratorisk virusinfektion på hippocampus och rumslig inlärning 23 , vilket minskar hjärncellsdöd efter stroke 24 , neurogenes efter traumatisk hjärnskada 25 och enzymaktivitet under anfall 26 är några av de studier som har använt neonatala grisar. Denna väsentliga och växande litteraturlitteratur ger styrka till lämpligheten och hållbarheten hos den kliniskt relevanta och höggradigt reproducerbara pigletmodellen för undersökning av anestetSia-inducerad neurotoxicitet.
Protocol
Friska, inhemska grisar ( Sus Scrofa) erhålls från en gård godkänd av Ohio State University Institutionella Animal Care and Use Committee (IACUC). Alla djurförsök utförs i enlighet med The Ohio State University IACUC policy, efter protokoll godkännande.
1. Djur och djurhantering
- Använd manliga grisar i detta experiment för att eliminera de potentiella störande effekterna av kön. OBS! Om experimentella mål inkluderar utvärdering av experimentet med djur på djur under den maximala hjärntillväxten, använd inte smågrisar som är äldre än 14 dagar.
- Planera grisarna att komma fram till vivarium minst 24 timmar före experiment för att tillåta acklimatisering till miljön.
OBS! Utbildade veterinärtekniker som övervakas av licensierade veterinärer tillhandahåller rutinmässig djurvård.- Håll grisarna i individuella temperaturstyrda burar och ge en näringNally komplett, kommersiell grismjölk ersättare ad libitum. Leverera djuren med en filt och en leksak. Kontrollera kontinuerligt temperaturen i djurhöljena.
- För denna preliminära genomförbarhetsstudie användes 18 grisar för isofluranarm och 22 grisar för kontrollarmen. Utför provstorleksberäkningar baserat på studiedesign när det är möjligt. Randomera de tillgängliga grisarna till antingen kontroll- eller exponeringsgruppen för lämplig exponeringstid. Utifrån erfarenhet, även med flera undersökare, förväntar sig att kunna utföra högst 2 experiment per dag (2 djur totalt).
2. Kontrollera djur
- Utför inte försöksintervention på kontrolldjur.
- Inducera djup allmänbedövning via ansiktsmask för perfusion och vävnadssamlingsproceduren. Specifikt, efter 24-timmars acclimationperioden bedövar grisarna med 5% isofluran eller 8% sevofluran i 100% syre <Em> via ansiktsmask. Använd inte desfluran för induktion.
OBS: Tiden mellan induktion av anestesi och institutionen för kall PBS-perfusion bör vara så kort som möjligt. Erfaren teknikare kan slutföra denna process på under 5 min.- Bekräfta adekvat djup av anestesi genom brist på dewclaw-pinch reflex med hjälp av en kirurgisk klämma.
- För att undvika hypoxiska / ischemiska förolämpningar i hjärnan, övervaka piggen med hjälp av en pulsoxymeter för att säkerställa upprätthållandet av adekvat syre-, ventilation och hjärtutmatning tills perfusion av kall fosfatbuffrad saltlösning (PBS) börjar.
OBS! För att ge ytterligare skydd mot vävnadsskador, packa djuret (inklusive huvudet) i is efter induktion av anestesi.
- Utför en transkardiell perfusion.
OBS! Eftersom paraformaldehyd används, bör perfusionsförfarandet utföras under en avluftningsdosa eller på en downdraft-bord.- Gör en craniocaudal jagNcision längs sternumets längd med en skalpell. Snittets djup ska vara tillräckligt för att exponera brystbenet.
- Gör försiktigt en mittlinjesternotomi med ett par skarpa tunga saxar, för att undvika skador på hjärtat, lungorna eller membranet. Vid behov placera ett finger placerat mellan den bakre delen av båren och det intratoraciska innehållet för att undvika skador. Manövrera ett finger i mediastinum genom att göra ett litet snitt i fingret i membranet.
- Efter att du har trätt in i bröstkorget, behåll behållaren öppen med hjälp av en självhållande retraktor.
- Inse perikardiet med hjälp av pincett och ett sax, exponera det slående hjärtat. Var försiktig så att du inte skadar hjärtat.
- Identifiera vänster ventrikel och placera försiktigt en kanyl (t.ex. en 14 G angiokateter) genom ventrikelens apex. Ta bort nålen och lämna katetern på plats.
OBS! Var försiktig så att du inte punkterar den bakre väggen på ventrikeln.Pulsatil blodåterkomst från kateter indikerar att den är ordentligt placerad. Blod kan enkelt provas från djuret vid denna tidpunkt. - Efter att ha identifierat det högra atriumet utför en atriotomi genom att göra ett stort snitt i atriumet med sax för att tillåta exsanguination och escape av perfusat.
OBS! Isofluran via inandning bör fortsätt tills hjärtdöd är bekräftad. Hjärtdöd bekräftas av direkt observerad brist på hjärtutgång.
- Perfuse piglet med ett perfusat som består av kallt (4 ° C) fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande heparin i en koncentration av 5 enheter per ml. Perfuse vid 300 ml per minut i 5 minuter eller tills lösningen är klar.
- Var försiktig så att perfusionskanylen inte försvinner under perfusion. Använd en kommersiellt tillgänglig peristaltisk pump för detta och alla andra perfusioner.
- Utför en hemicraniektomi till reFlytta en halvklot i hjärnan för frisk vävnadsanalys.
OBS: Detta protokoll möjliggör återhämtning av en halvklot av färsk hjärnvävnad. Den andra halvklotet är fast. Om ingen frisk vävnad krävs, gå vidare till steg 2.6.- Under denna procedur fortsätt cirkulationen av iskall PBS med en hastighet av 50 ml per timme för att säkerställa att hjärnan förblir kall.
- Gör ett longitudinellt snitt i hårbotten längs sagittal suturen tills foramen magnum använder en skalpell. Under processen, använd ett fast tryck för att skapa en poäng i skallen. Reflektera hårbotten för att avslöja hela kraniet.
- Använd rongeurs och börja på foramen magnum, ta bort skallen på ena sidan genom att införa rongeursna mellan skallen och dura materen med försiktighet att inte skada den underliggande hjärnvävnaden. Ta bort ben i stycken, med hjälp av rongeursna för att pry det bort från hjärnparenchymen.
- När kraniet har tagits bort, incise och ta bort duRa mater som använder pincett och sax, igen med försiktighet att inte skada den underliggande hjärnvävnaden.
- Placera ett skalpblad mellan de två halvkärmen för att noggrant dela upp corpus callosum.
- Använd ett plant verktyg, såsom den breda handtaget änden av pincett, försiktigt tillbaka frontloben, gradvis avskilja kranialnerven, arbeta främre mot bakre. Vid den mest bakre sidan av halvklotet, använd en skalpell för att skära ryggmärgen. Ta bort halvklotet och blocket.
OBS: Ofixerad hjärnvävnad är bräcklig. Var försiktig när du tar bort halvklotet för att förhindra störningar av den återstående halvklotets blodtillförsel. - Sektion den borttagna halvklotet. Om det indikeras, blinka omedelbart i 2-metylbutan avkyld till -160 ° C i ett flytande kvävebad för att undvika vävnadsbrytning och förvaras omedelbart vid -80 ° C för senare analys.
ANMÄRKNING: Vi rekommenderar snitthjärnan koronalt i steg om 2 mm med en matris, men specifik detaiSektionerna kommer att bero på specifika experimentella mål.
- Byt perfusatet till 4% paraformaldehyd (PFA). Fortsätt PFA-perfusionen vid 300 ml per minut under minst 5 minuter.
VARNING! PFA är giftigt, undvik kontakt med hud, ögon eller slemhinnor. Inandning inte PFA-rök. - Förvänta piglets kropp att styva på grund av bildandet av aldehydbindningar som skapas i muskler. Efter att perfusion av PFA är fullständig, ta bort den återstående halvklotet på samma sätt som det som beskrivs i steg 2.5.5.
OBS: Korrekt perfuserad hjärna kommer att vara blek och fullständigt exsanguinated.- Placera kvarvarande halvklotet i en liten behållare med färsk 4% PFA vid 4 ° C. Håll halvklotet i PFA i 24-48 h för att slutföra fixeringsprocessen.
- Efter 24-48 timmar flyttar du den fixerade hjärnan till en lösning av PBS som innehåller 0,1% natriumazid, eftersom det är viktigt att förhindra överfixering. Överfixering kan resultera i masEpitopkonungen eller stark icke-specifik bakgrundsfärgning. Tillsatsen av natriumazid förhindrar bakteriell tillväxt.
OBS: Vävnaden kan förvaras i upp till en månad vid 4 ° C.
3. Isofluran (Experimentella) Djur
OBS: Narkos eller ingrepp kan användas, men vi rekommenderar inte desfluran för inhalationsinduktion.
- Induktion och underhåll av anestesi:
- Utför anestesi med en klinisk anestesi-arbetsstation utrustad med en pediatrisk ventilator och övervakningsanordningar.
- Efter 24 h acklimatiseringsperioden bedövar grisarna med 8% sevofluran i 100% O 2 via ansiktsmask.
- Kontinuerligt övervaka pulsokximetri, icke-invasivt blodtryck, elektrokardiografi och temperatur under induktionsperioden och hela tiden under studieproceduren.
- Efter induktion, titrera sevofluran eller isofluRane till en koncentration som möjliggör adekvat djup av anestesi samtidigt som man säkerställer fortsatt spontan andning (vanligtvis i en koncentration av 3-4%).
- Placera en 24 G perifer intravenös kateter i den marginala öronvenen ( Figur 1 ).
- Placera grisen i dorsalt liggande läge för tracheal intubation ( Figur 2 , panelen A). Använd ett Miller # 1 eller # 1.5 blad för att underlätta instrumentation av hypofarynx och intubation av luftröret. OBS! En erfaren operatör och assistent behövs under laryngoskopi.
- Ha en assistent förskjutning av djurets tunga med hjälp av en torr gasbindning för att underlätta exponering av struphuvudet och visualisering av vokalbandet ( Figur 2 B ).
OBS: Grisen epiglottis är morfologiskt lik den för människor ( Figur 2 C ). Grisens vokalkorDs kan vara svåra att visualisera eftersom de är flera millimeter djupa i laryngeal inloppet ( Figur 2 D ). - Förskjuta epiglottis: Placera spetsen på laryngoskopbladet under epiglottis och lyft bladet uppåt för att exponera struphuvudet.
- Före placeringen av röret i luftröret, spraya vokalband med 0,5 ml 2% lidokain för att förhindra laryngospasm under passage av endotrakealtubet, eftersom grisar är särskilt benägna att laryngospasm.
- Ha en assistent förskjutning av djurets tunga med hjälp av en torr gasbindning för att underlätta exponering av struphuvudet och visualisering av vokalbandet ( Figur 2 B ).
- Placera och säkra ett 3,0 mm manschettrör.
- Se till att bilaterala andningsljud och långvarig koldioxid används vid kardiovaskulering med stetoskop och EtCO 2- övervakning.
- Uppblåsa piglets lungor till ett kontinuerligt luftvägstryck på 20 cm H2O. Uppblåsa sedan manschetten hos endotrachealröret till det minimala trycket som krävs för att förhindra luftläckage vid ett tryck av 20 cm H
- Normoxi och normokarbia bibehålls under anestesi.
- Börja administrera 2% isofluran i 50% syre / 50% luft. Titrera syre för att upprätthålla PaO 2 på 90-100 mmHg. Fortsätt i 3 timmar (eller önskad experimentell varaktighet).
- Applicera oftalmisk salva på ögonen för att förhindra torrhet under anestesiets tid.
- Börja femoral arteriell kateterisering efter initiering av 2% isofluran.
- Administrera förekomst av bredspektrum antibiotika (cefazolin, 25 mg / kg) via perifer intravenös linje för att förhindra kirurgisk infektion.
- Sterilisera båda ljumskorna med tonad klorhexidin för att säkerställa korrekt sterilt fält och placera ett lämpligt sterilt draperi ( Figur 3 B ). Personalen som deltar i överlevnadsoperation bör åtminstone ha ett kirurgiskt lock, mask, sterila handskar och ögonskydd.
- Palpate femoralpuls vid inguinal crease med hjälp av index och mittfingrar.
- Gör en ytlig, 1,5 cm, craniocaudal snitt genom att använda en skalpell ( Figur 3 C ).
- Dissect mellan de två huvuden av gracilis muskeln med hjälp av ett trubbigt instrument, såsom kirurgisk hemostat eller trubbig-tippad sax ( Figur 3 D ).
OBS! Det femorala neurovaskulära buntet är vanligtvis mellan och bara djupt till dessa två muskler. ( Figur 4 A ). - Använd kärlklingor eller silkeband, isolera artären vid proximal och distal ände. Använd slingan för att dra arteriet upp till nivån på huden distalt ( Figur 4 B ).
- MedanPlacera dragkraft på den proximala bindningen som är tillräcklig för att avbryta blodflödet, gör en liten arteriotomi med ett par tenotomysaxar.
- Var försiktig så att du inte tränger över artären. En liten arteriotomi är tillräcklig. Alternativt, använd en nål-och-tråd metod för att komma åt artären ( Figur 4 C ).
- Gentag dragkraft på proximal slips kommer att förhindra överdriven blodförlust vid något tillfälle under denna del av proceduren. Om du använder nål- och trådanslutningen, passera ledningswiren (medföljer med satsen eller fås separat) genom nålen och in i artären upp till 5 cm.
- Var försiktig så att du inte förflyttar tråden längre eftersom det kan orsaka ventrikulär ektopi. Dra ut tråden omedelbart 1-2 cm om detta inträffar.
- Ta bort nålen från kärlet och var försiktig med att lämna styrtråden i kärlet. Förbi katetern försiktigt över tråden och in i kärlet ( Figur 4
- Använd en 3-fransk, 8 centimeter kateter för femoral artärkateterisering. Förvänta mild motstånd när kateterns spets först kommer in i kärlets ytliga vägg.
- Om du använder arteriotomimetoden, flytta kateter eller polyetenrör direkt in i kärlet. Blodretur bör observeras omedelbart.
- Anslut kateteret omedelbart till en tryckgivare. Spola katetern med normal saltlösning för att bibehålla kateterpatensen.
- Placera suturer för att fästa katetern på plats. Täck snittet med sterilt gasbind för att förhindra kontaminering. Använda ett perkutant tillvägagångssätt vid lårkärlkateterisering.
OBS: Se till att ultraljudet utförs av en erfaren tekniker.
- Placera suturer för att fästa katetern på plats. Täck snittet med sterilt gasbind för att förhindra kontaminering. Använda ett perkutant tillvägagångssätt vid lårkärlkateterisering.
- Aktivt värm piglet med en uppvärmningsanordning med tvångluft och övervaka kontinuerligtRektal temperatur ( figur 3 A ).
- Infusera dextrosinnehållande, isotonisk vätska (5% dextros i Ringers laktat eller normal saltlösning) vid underhållshastighet (4 gånger piglets vikt i kg, ml / h).
- Övervaka vitala tecken på störningar (hypotoni, arytmi, hypo / hypertermi, hypoxi)
OBS! Normala vitala teckenområden och motsvarande föreslagen hantering vid abnormaliteter sammanfattas i Tabell 1 . - Med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt blodanalyssystem mäter arteriella blodgaser (arteriellt pH, pCO2, pO2), elektrolyter (bikarbonat, basöverflöde / underskott, natrium, kalium, joniserad kalcium), hemoglobin och glukos åtminstone timme under experimentell period. Rita arteriellt blodprov från femoralartärkatetern.
OBS! Normala syrabas och elektrolytvärden tillsammans med rekommendationer för korrigering om abnormiteter ses aÅterges i tabell 1 .
- Slå försiktigt fast den proximala vaskulära siden för att permanent infoga lårbenen för att förhindra blödning. Alternativt, använd en vaskulär klämma.
- Kontrollera fullständig hemostas innan du stänger snittet. Bevatt snittet med 10-20 ml steril saltlösning för att förhindra infektion.
- Infiltrera såret med användning av 0,5-1 ml / kg 0,25% bupivakain med 1: 200 000 epinefrin för smärtkontroll. Belägg snittet med ett sterilt, kirurgiskt hudhäftande material.
OBS: Ingen dressing krävs.
- Värm upp det privata hemburet aktivt med ett uppvärmningsljus.
- Övervaka djuret noga efter anestesi av utbildad veterinär eller forskare. Ge grisens mjölkbyte.
- Injicera smågrisar med buprenorfin subkutant i en lämplig dos, var tredje timme efter behov för att säkerställa smärskontroll, efter skönsmässig bedömning av djurvårdspersonal som har erfarenhet av att kontrollera postoperativt obehag hos djur.
- Övervaka grisarna varje timme under de första 6 timmarna efter operationen och var 4: e timme därefter. Utför djuruppoffring och vävnadsupphandling på identiskt sätt för att kontrollera djur, som beskrivits ovan.
Representative Results
Fyrti grisar studerades (18 isofluran, 22 kontroll). Studieförfaranden tolererades väl av alla djur. Alla grisar som studerades var manliga. Det fanns ingen signifikant skillnad mellan grupperna med avseende på ålder eller vikt ( tabell 2, figur 5 ). Genomsnittliga laboratorievärden under experiment i isoflurangruppen ges i tabell 3 . Dessa värden visar att försöksprotokollet har intern konsistens och reproducerbarhet, eftersom vi hade flera tekniker som utför operationen under två år. Oavsett av dessa siffror är de många justeringar och korrigeringar som vi var tvungna att utföra under operationerna för att upprätthålla fysiologisk hemostas. CO 2 retention, lågkropp kroppstemperatur och hypoglykemi är några av de många confounders som vi avvärjde genom omfattande övervakning och anpassning efter behov.
T "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 1:. Placering av den perifera intravenösa linjen. En 24 G intravenös kateter placeras i den marginala öronvenen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Händelse av händelser i pigmentintubation. ( A ) Smågrisar placeras i lateralt liggande läge för intubation. Standardmonitorer är placerade. ( B ) En assistent förskjutit tungan från munhålan medan laryngoskopi utför laryngoskopi. ( C ) Epiglottisen är morfologiskt lik den hos en människa. I denna grafik, spetsen av thE-bladet ligger i vallecula. ( D ) Laryngealanatomi hos svin är tydligt annorlunda än hos människor; Röstbandet är flera millimeter djupt till laryngeinloppet. I den här grafiken har spetsen på bladet förskjutit epiglottisen och utsatt struphuvudet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Femoral Artery Approach. ( A ) Djurtemperaturen upprätthålls med användning av en uppvärmningsanordning med tvungen luft. Övervakning används under hela proceduren. Ett brett sterilt fält framställs med tonad klorhexidin och djuret är täckt med en fenestrated steril drapera. ( B ) Palpation vid det inguinala vecket avslöjar femoralpuls. ( C ) En crAniocaudal hudskärning, som är ungefär vinkelrätt mot inguinskenet och ca 1,5 cm lång, utförs över den femorala puls. ( D ) En trubbig dissektion uppnås för att exponera det femorala neurovaskulära buntet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Femoral arterikannulation. ( A ) Från den laterala till mediala innehåller den neurovaskulära bunten lårbenen, artären och venen. ( B ) Lårbensartären isoleras med användning av kärlslingor och / eller sutur. Hållbar spänning på proximal slips förhindrar överdriven blodförlust medan arteriet punkteras (se vitning av kärlet). ( C ) En nål används för att punktera lårbenet aRytm, undvikande av perforering av den bakre väggen av artären. När blodet återvänder, avanceras en guidewire in i artären genom nålen. ( D ) Nålen avlägsnas och katetern förflyttas över styrtråden in i Femoral artär. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Jämförelse av medelvikt och ålder av kontroll och isofluranbehandlade piggar. Felstängerna representerar +/- 1 standardavvikelse, med standardavvikelsevärdet noterat ovanför varje felfält.
Tabell 1: Sammanfattning av normala grisar Vital Signs, ArteriAlblodgas och serumelektrolytvärden med föreslagna korrigeringsmetoder. Vänligen klicka här för att se en större version av denna tabell.
Tabell 2: Sammanfattning av genomsnittlig vikt och ålder av kontroll jämfört med isofluranbehandlade smågrisar. Ett unpaired two-tailed T-test utfördes, vilket inte visade någon signifikant skillnad mellan de två grupperna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna tabell.
Tabell 3: Genomsnittliga vitala tecken och laboratorievärden av isofluranbehandlade djur. Under tiden av thE-operationer, avvikelser från vitala tecken och laboratorievärden från normala områden korrigeras omedelbart. Vänligen klicka här för att se en större version av denna tabell.
Discussion
Kritiska protokollsteg / felsökning
När försöket börjar bör övervakning av icke-invasiva vitala tecken börja med induktion. Blodtryck, hjärtfrekvens, syremättnad och rektaltemperatur kan lätt erhållas och övervakas. Grisen bör vara under en luftvärmningsanordning för att upprätthålla tillräcklig kärnkroppstemperatur, eftersom dessa djur snabbt kan bli hypoterma under generell anestesi. Snabb placering av en perifer intravenös kateter möjliggör behandling av nödfall om de uppstår vid induktion. Det är viktigt att kontinuerligt övervaka piglet, noninvasivt eller invasivt, genom både isofluranförfarandet och offerproceduren. Grisen kan uppleva arteriell syre-desaturering mycket snabbt under flera steg under protokollet, speciellt under luftvägshantering och intubation. Vi använder 8% sevofluran för att framkalla anestesi för att replikera mänsklig pediatrisk praxis och att talaD induktion. 5% isofluran har emellertid använts framgångsrikt och är lämpligt. Med tanke på skillnaderna i anatomi och en predisposition för laryngospasm, kan piglet vara svårt att intubera. Om grisen börjar desaturera under induktion och / eller luftvägshantering, ska 100% syre och sevofluran omedelbart administreras via ansiktsskott för att återställa en säker syrgasmättnadsnivå och ett adekvat narkosnivå. Tänk på att medan narkosplanet måste vara tillräckligt djupt för att tillåta intubation, kan överdriven anestesi leda till apné. Kontinuerlig vaksamhet med avseende på djurs ventilation och syreförmåga krävs med titrering av inhalationsanestetik i enlighet därmed. Intubation kan sedan återupptas när oxidering har återställts och adekvat anestesi har uppnåtts. Positiv tryckventilation via ansiktsröret kan försökas, men är vanligtvis misslyckad. Om laryngospasm uppstår, appliceras lidokainlösningen direkt på voksenAl-kablarna indikeras för att tillåta tracheal intubation.
Nödläkemedel bör alltid finnas tillgängliga och ska administreras efter behov under de kritiska delarna av protokollet för att korrigera fysiologiska störningar. Medan en grundlig diskussion om bedövning och narkotikamissbruk i grisar ligger utanför detta manuskript, är Swindles "Svin i laboratoriet: Kirurgi, bedövning, bildbehandling och experimentella tekniker" en utmärkt resurs. 27
På liknande sätt kan piglet börja desaturera snabbt under offret, efter att bröstkaviteten öppnats under mittlinjens sternotomi. Operatören bör arbeta snabbt men säkert för att exponera hjärtat och sätta in angiokatemetern för att starta kallt PBS. En noggrann kall PBS-perfusion (och snabb fixering med PFA, om det anges) behövs för att förhindra ischemisk skada på hjärnan.
När grisen har intuberats resp respRatory-hastighet och koldioxidspårning i slutet tidvatten börjar ( Tabell 1 ). Stabilisera grisens sintring och ventilation genom att titrera ventilationsstödet medan tillräcklig anestesi upprätthålls. Vi använder mekanisk ventilation för att efterlikna det som används i människor så nära som möjligt. Hyperoxi bör undvikas för att minimera risken för oxidativ stress.
Isoflurangrisarna genomgår en femoral artärkanylering av två skäl: att kontinuerligt övervaka arteriellt blodtryck; Och att prova arteriellt blod för bedömning av syrabasstatus, blodgaser och elektrolyter under hela förfarandet. Kannulering av lårbensartären kan vara utmanande. Vänligen se videon för fullständiga detaljer. För överlevnadsförsök bör denna procedur utföras i en steril arbetsmiljö under sterila förhållanden. Efter kanylering av femoralartären, starta timmeövervakning av arteriell blodgas och serumelektrolyter, korrigera vid behov för attUpprätthålla homeostas ( tabell 1 ). Grisen bör få kontinuerlig dextroshaltig isotonisk vätska för att upprätthålla adekvat blodglukos. Under experimentet bör djuret kontinuerligt övervakas för normotermi, och uppvärmning av tvungen luft bör tillhandahållas vid behov. Det är lika viktigt att undvika hypotermi och hypertermi.
Medan detta protokoll tillhandahåller en halvklot av "fräsch" hjärna och en halvklot av fast neuralvävnad, kan detta enkelt anpassas för att rymma alternativa studier. Ytterligare prov kan också hämtas från piglet. CSF kan erhållas efter bedövning av piglet, med eller utan fluoroskopi-vägledning. Blod kan också uppsamlas från grislet vid olika stadier av protokollet, inklusive från lårkärlskatetern, såväl som direkt från vänster kammare via angiokateteret omedelbart före perfusion. Konvalescensperioden kan också förlängas eller sh Ortened, för undersökning av det kroniska respektive akuta svaret.
Begränsningar av tekniken
Detta protokoll och modell är tekniskt utmanande. En skicklig utredare och en fullt tillförd operationssats krävs, särskilt för överlevnadsförsök. Utredaren (och assistenten, för vissa delar av protokollet) måste vara bekväm med både de kirurgiska och anestetiska komponenterna i detta protokoll, vilket kan kräva träning och erfarenhet att behärska. Andra begränsningar inkluderar kostnaden för grisarna i förhållande till gnagaremodeller, även om pigletmodellen är mycket mindre kostnadseffektiv än icke-mänskliga primater. Medan kostnaden för grisar varierar beroende på region och gård från vilken djur erhålls, kan man förvänta sig att kostnaden per djur är mindre än $ 500, medan icke-mänskliga primater kan vara tusentals dollar per djur. Enligt vår erfarenhet är den genomsnittliga kostnaden per djur typiskt omkring 200 kronor.
Jove_content "> Slutligen, eftersom det är syftet med pigletmodellen att efterlikna den mänskliga hjärnans hjärna, bör endast neonatala smågrisar användas. Centralnervsystemet är mest sårbart under perioden med snabb tillväxt och hos grisar sträcker sig denna period från Sex veckor före födseln till fem veckor efter födseln 8. Användning av äldre grisar som ligger längre bort från deras fosterdatum medför risk för att försämra piglets modellens kliniska relevans. Medan det finns en stor kontrovers med avseende på "jämvikt" hos piglets hjärnans utveckling till Det hos en mänsklig nyfödd, det finns slående likheter när tidig postnatal hjärnans utveckling mellan människor och grisar jämförs. Vid födseln är hjärnorna hos människor och gris 27% respektive 25% av vuxen vikt. 14 Baserat på Johnson-arbetet Och kollegor kan vi konstatera att en pigletvecka ungefär motsvarar en månad. 9 Dessa resultat baseras på wh Ole-hjärnvolymdata har validerats av Workman och kollegor. 28 Vi valde 7-14 dagar gamla grisar för att approximera en människa med 1-2 månaders ålder. Det kan dock vara klokt att använda yngre djur (1-5 dagar gamla) om det experimentella målet är att efterlikna zeniten hos piglets hjärnans tillväxtspurt. Detta är möjligt, eftersom smågrisar kan avvänjas vid födseln. Vår användning av pigletmodellen kommer att anpassas eftersom nya data blir tillgängliga med avseende på parallellerna mellan utveckling av mänsklig och gris postnatal hjärna.Teknikens betydelse med hänsyn till alternativa eller befintliga metoder
Grisen har slående likheter med mänskliga nyfödda, inklusive kritiska paralleller i hjärnans utveckling och patofysiologiska svar. Det är därför en kliniskt relevant däggdjursmodell och bevis-av-konceptstudien indikerar att piglet är en lämplig modell för studier av anestetisk neurotoxicitetRef "> 29 , 30. Det kan också lätt anpassas till andra typer av utvecklingsnervetenskaplig forskning. Modellen är utformad att undersöka, med vetenskaplig auktoritet, att AIDNs omfattning och mekanism minimerar oro för att confounders, såsom hypoxi eller hyperkarbi, är Orsakar neurologiska skador som kan tolkas felaktigt som anestesi-inducerad. För att åstadkomma detta behandlas grisarna med samma perioperativa kirurgiska och anestetiska tillstånd och övervakning som upplevs av barn.
Framtida riktningar och applikationer efter att ha mastrat tekniken
Förflyttning framåt är grisar också mycket mottagliga för neurokognitiv testning 17 . Detta attribut kommer att möjliggöra komplex, omfattande utvärdering av neurokognitivt resultat efter anestetisk exponering i framtida experiment. Det bör också betonas att barn i de kliniska miljöerna oftast genomgår anestesi förRa fysiologiskt stressande förfarande (kirurgi). Samspelet mellan anestesi och postkirurgisk inflammation samt den resulterande neuronala skadorna och / eller toxiciteten (ses hos gnagare och primater) förtjänar ytterligare undersökning och betydande överväganden. Den neonatala piglet ger en unik, kliniskt relevant baslinjemodell för effekterna av anestetika på den utvecklande hjärnan utan det störande inflytandet av kirurgi (efterliknande vanliga kliniska scenarier hos barn). Effekterna av olika typer av kirurgi eller andra konfronteringar (ischemi, hjärnskada, genetisk predisposition etc. ) kan nu testas på ett tillförlitligt sätt med hjälp av denna modell.
I laboratoriet planerar vi att använda flera elektrofysiologiska och elektrokemiska metoder för att ytterligare undersöka mekanismer för anestesi och AIDN i intakta neurala kretsar. Dessa tekniker inkluderar in vivo- mätning av neurotransmittoraktivitet, helcells-patch-clamp-inspelningar, neuroimaging ochNeurofysiologiska undersökningar i hjärnskivor. Med avseende på neurovetenskap i den omogna hjärnan är grisar mer relevanta för människor än murina modeller med väldigt få av nackdelarna hos icke-mänskliga primater. Med vidare utveckling kan grisar vara den perfekta modellen för human utvecklingsnervetenskaplig forskning.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Författarna skulle vilja erkänna bidrag från Ohio State University Laboratory Animal Resource Center (ULAR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liqui-Wean | Milk Specialities | 454836 | |
| Piglet Anesthesia Face-Cone Mask | VetEquip | 921428 | |
| Masterflex L/S Peristaltic Pump | Cole-Parmer | EW-77916-20 | Alternative peristaltic pumps can be used, as long as a constant and sufficient perfusion rate can be achieved |
| Masterflex L/S Pump Tubing, 25 ft | Cole-Parmer | EW-96410-24 | |
| 14 G angiocatheter | Becton-Dickson | 381164 | |
| 10x PBS | Thermo-Fisher Scientific | ||
| Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | P6148-5KG | Our lab makes this reagent from the powder as it is much more cost-effective. Prepared paraformaldehyde can also be purchased. |
| 2-methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631-4L | |
| Needle holder | Teleflex | 152720 | |
| Right angle clamp | Teleflex | 496217 | |
| Rongeurs | Teleflex | 028120 | |
| Tenotomy scissors | Teleflex | 423480 | |
| Stitch scissors | Teleflex | 423440 | |
| McPherson Tying Forceps | Teleflex | 425200 | |
| Adson Tissue Forceps | Teleflex | 181223 | |
| 3-0 nylon suture | Medline | ETH627H | |
| Integra SL Anesthesia Workstation | DRE Veterinary | 2350 | This anesthesia workstation is chosen to best mimic the clinical monitoring experienced by pediatric patients in the operating room. Any anesthesia machine can be used as long as it allows for sufficient physiologic monitoring and intervention. |
| Laryngoscope handle | Teleflex | 8710000 | |
| Miller 1 Laryngoscope blade | Teleflex | 2216100 | |
| Bair Hugger | 3M | 750 | |
| Bair Hugger Torso Blanket | 3M | 540 | |
| iStat Handheld | Abbott Point of Care | 300 | Alternative point of care arterial blood gas analysis devices may be used |
| iStat Cartridges | Abbott Point of Care | CG8+ | |
| Dermabond Advanced Topic Skin Adhesive | Ethicon | DNX6 | |
| LMA Laryngotracheal Atomization Device | Teleflex | MAD720 | A cotton-tipped applicator soaked in local anesthetic can also be used |
| Sheridan CF 3.0 Cuffed Endotracheal Tube | Teleflex | 5-10106 | This model ETT was selected because it has a Murphy's eye, which is important to prevent ETT occlusion during the experiment |
| Pediatric Intubation Stylet | Smiths Medical | 100/120/100 | |
| 24 G angiocatheter | Becton-Dickson | 381112 | |
| #10 Disposable Scalpel | Ted Pella, Inc | 549-9-10 | |
| Arterial Pressure Monitoring Kit (3 French, 8 cm catheter) |
Cook Medical | C-PMSY-300-FA | Simple polyethylene tubing with a luer-lock adapter can also be used |
| Intramedic PE90 Polyethylene tubing | Fisher Scientific | 14-170-12D | |
| Monoject Blunt Cannula | VWR International | 15141-144 |
References
- Buie, V. C., Owings, M. F., DeFrances, C. J., Golosinskiy, A. National hospital discharge survey: 2006 annual summary. Vital Health Stat 13. (168), 1-79 (2010).
- Hays, S. R., Deshpande, J. K. Newly postulated neurodevelopmental risks of pediatric anesthesia. Curr Neurol Neurosci Rep. 11, 205-210 (2011).
- Disma, N., Mondardini, M. C., Terrando, N., Absalom, A. R., Bilotta, F. A systematic review of methodology applied during preclinical anesthetic neurotoxicity studies: important issues and lessons relevant to the design of future clinical research. Paediatr Anaesth. 26, 6-36 (2016).
- Loepke, A. W., Vutskits, L. What lessons for clinical practice can be learned from systematic reviews of animal studies? The case of anesthetic neurotoxicity. Paediatr Anaesth. 26, 4-5 (2016).
- Cherubini, E., Rovira, C., Gaiarsa, J. L., Corradetti, R., Ben Ari, Y. GABA mediated excitation in immature rat CA3 hippocampal neurons. International journal of developmental neuroscience. 8, 481-490 (1990).
- Kaindl, A. M., et al. Brief alteration of NMDA or GABAA receptor-mediated neurotransmission has long term effects on the developing cerebral cortex. Mol Cell Proteomics. 7, 2293-2310 (2008).
- Glauser, E. M. Advantages of piglets as experimental animals in pediatric research. Exp Med Surg. 24, 181-190 (1966).
- Dickerson, J., Dobbing, J. Prenatal and postnatal growth and development of the central nervous system of the pig. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 166 (1005), 384-395 (1967).
- Conrad, M. S., Johnson, R. W. The domestic piglet: an important model for investigating the neurodevelopmental consequences of early life insults. Annu Rev Anim Biosci. 3, 245-264 (2015).
- Nielsen, K. B., et al. Reelin expression during embryonic development of the pig brain. BMC Neuroscience. 11, 75 (2010).
- Niblock, M. M., et al. Comparative anatomical assessment of the piglet as a model for the devleoping human medullary serotonergic system. Brain Res Brain Res Rev. 50 (1), Netherlands. 169-183 (2005).
- van Straaten, H. W., Peeters, M. C., Hekking, J. W., van der Lende, T. Neurulation in the pig embryo. Anat Embryol (Berl). 202 (2), 75-84 (2000).
- Goureau, A., et al. Conserved synteny and gene order difference between human chromosome 12 and pig chromosome 5. Cytogenetics and cell genetics. 94 (1-2), 49-54 (2001).
- Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Human Development. 3 (1), 79-83 (1979).
- Istaphanous, G. K., et al. Characterization and quantification of isoflurane-induced developmental apoptotic cell death in mouse cerebral cortex. Anesth Analg. 116 (4), 845-854 (2013).
- Loepke, A. W., et al. The effects of neonatal isoflurane exposure in mice on brain cell viability, adult behavior, learning, and memory. Anesth Analg. 108 (1), 90-104 (2009).
- Sullivan, S., et al. Improved behavior, motor, and cognition assessment in neonatal piglets. J Neurotrauma. 30 (20), 1770-1779 (2013).
- Gieling, E. T., Nordquist, R. E., van der Staay, F. J. Assessing learning and memory in pigs. Anim Cogn. 14 (12), 151-173 (2011).
- Broom, D. M., Sena, H., Moynihan, K. L. Pigs learn what a mirror image represents and use it to obtain information. Animal Behaviour. 78 (5), 1037-1041 (2009).
- Martin, L. J., Spicer, D. M., Lewis, M. H., Gluck, J. P., Cork, L. C. Social deprivation of infant rhesus monkeys alters the chemoarchitecture of the brain: I. Subcortical regions. The Journal of neuroscience. 11 (11), 3344-3358 (1991).
- Rizzi, S., Ori, C., Jevtovic-Todorovic, V. Timing versus duration: determinants of anesthesia-induced developmental apoptosis in the young mammalian brain. Annals of the New York Academy of Sciences. 1199, 43-51 (2010).
- Brambrink, A. M., et al. Isoflurane-induced neuroapoptosis in the neonatal rhesus macaque brain. Anesthesiology. 112 (4), 834-841 (2010).
- Elmore, M. R., et al. Respiratory viral infection in neonatal piglets causes marked microglia activation in the hippocampus and deficits in spatial learning. J Neurosci. 34 (6), 2120-2129 (2014).
- Alonso-Alconada, D., et al. Brain cell death is reduced with cooling by 3.5 degrees C to 5 degrees C but increased with cooling by 8.5 degrees C in a piglet asphyxia model. Stroke. 46 (1), 275-278 (2015).
- Costine, B. A., et al. The subventricular zone in the immature piglet brain: anatomy and exodus of neuroblasts into white matter after traumatic brain injury. Developmental neuroscience. 37 (2), Switzerland. 115-130 (2015).
- Holtzman, D., et al. In vivo phosphocreatine and ATP in piglet cerebral gray and white matter during seizures. Brain research. 783 (1), 19-27 (1998).
- Swindle, M. M. Swine in the Laboratory. , 2nd ed, CRC Press. (2007).
- Workman, A. D., Charvet, C. J., Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Modeling transformations of neurodevelopmental sequences across mammalian species. J Neurosci. 33 (17), 7368-7383 (2013).
- Lunney, J. K. Advances in swine biomedical model genomics. International journal of biological sciences. 3 (3), 179-184 (2007).
- Nemzek, J. A., Hugunin, K. M., Opp, M. R. Modeling sepsis in the laboratory: merging sound science with animal well-being. Comparative medicine. 58 (2), 120-128 (2008).
