Summary
Restenos efter kardiovaskulära förfaranden (bypassoperation, angioplastik eller stenting) är ett signifikant problem som minskar hållbarheten hos dessa förfaranden. En ideell terapi skulle inhibera proliferation av glattmuskelcell (VSMC) och samtidigt främja regenerering av endotelet. Vi beskriver en modell för samtidig utvärdering av VSMC proliferation och endotelfunktion in vivo.
Abstract
Arteriell återuppbyggnad, oavsett angioplastik eller bypass-kirurgi, involverar iatrogena trauma som orsakar endotelavbrott och proliferation av vaskulär glattmuskelcell. Vanliga murinmodeller studerar små kärl som carotid och femorala artärer. Här beskrivs ett in vivo- system där både VSMC-proliferation och endotelbarriärfunktion kan utvärderas samtidigt i ett stort kärl. Vi studerade infrarenal aorta respons mot skada hos C57BL / 6 möss. Aortan skadades från den vänstra renala venen till aorta-bifurcationen med 30 transmurala krossar om 5 sekunder lång varaktighet med en bomullstipsapplikator. Morfologiska förändringar bedömdes med konventionell histologi. Aorta-väggtjockleken mättes från luminalytan till adventitia. EdU-integration och motfärgning med DAPI och alfa-aktin användes för att demonstrera VSMC-proliferation. Aktivering av ERK1 / 2, en känd moderator av intimal hyperplasi-bildning, avskräcktesMinas genom Western Blot-analys. Effekten av inflammation bestämdes genom immunhistokemi för B-celler, T-celler och makrofager . En ansiktssektioner av endotelet visualiserades med scanningelektronmikroskopi (SEM). Endotelbarriärfunktionen bestämdes med Evans Blue-färgning. Transmural skada resulterade i aortaväggsförtjockning. Denna skada inducerade VSMC proliferation, mest framträdande vid 3 dagar efter skada, och tidig aktivering av ERK1 / 2 och minskat p27 kip1 uttryck. Skada resulterade inte i ökad infektion av B-celler, T-celler eller makrofager i kärlväggen. Skada orsakade partiell endotelcell-denudation och förlust av cellcellskontakt. Skada resulterade i en signifikant förlust av endotelbarriärfunktionen, som återvände till baslinjen efter sju dagar. Den murina transmurala trubbiga aorta skademodellen ger ett effektivt system för att samtidigt studera både VSMC-proliferation och endotelbarriärfunktion i ett stort kärl.
Introduction
restenos Följande kardiovaskulära förfaranden (bypassoperation, angioplastik eller stentning) är ett signifikant problem som minskar hållbarheten hos dessa förfaranden. Alla revaskulariseringsprocedurer plågas av restenos. Nuvarande strategier för att förhindra restenos (läkemedelseluerende stenter och läkemedelsbelagda ballonger) inhiberar både vaskulär glattmuskelcell (VSMC) och endotelcellerproliferation (EC). Följaktligen förhindrar dessa ingrepp VSMC-medierad restenos, men förhindrar också regenerering av endotelet. Utan ett intakt endotel behövs patienter på potenta antiplatelet medel för att minska risken för in situ trombos med risk för blödningskomplikationer. En ideell terapi skulle inhibera VSMC-proliferation samtidigt som man främjar regenerering av endotelet. Det finns således ett behov av att samtidigt studera VSMC-proliferation och endotelbarriärfunktion i n vivo .
För närvarande är det svårtAl musmodeller av restenos 1 . Dessa modeller inkluderar karotidligering och femoral artär ledningsskada 2 . Aorta modeller inkluderar stent placering 3 , ballong skada 4 och aorta allograft 5 . Samtliga nuvarande modeller är begränsade. Carotidligering genererar en flödesmedierad neointimal lesion och har inte endotelskada. Dessutom har både karotid- och femorala artärer många gånger färre cellskikt än humana kärl, vilket begränsar deras translationsvärde. Mus aorta som är ca 1,3 mm i diameter, är det enda kärlet som approximerar en kliniskt relevant (kranskärl) mänsklig artär (3).
Trots den translatoriska potentialen hos murina aorta-modeller av sjukdom har nuvarande modeller begränsningar. Dessa modeller kräver avancerade mikrokirurgiska färdigheter och specialiserad utrustning som angioplastikballonger och stenter. Här presenterar viEn ny reproducerbar teknik för att samtidigt inducera VSMC-proliferation och störa endotelbarriärfunktionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikutlåtande: Protokollen för djurhantering godkändes av Institutionen för djurhälsa och användningskommitté (IACUC) vid University of Maryland (protokoll nummer 0416009) och genomfördes enligt AAALAC-internationella standarder.
1. Kirurgisk procedur
- Anestetisk teknik
- Sterilisera alla instrument som används vid överlevnadskirurgi med ångsterilisering vid 121 ° C under 30 minuter.
- Inducerar anestesi via en induktionstank med 100% O2 och 2,5% isofluran levererad via precisionsförångare. Efterinduktion, avbryt isofluran och spola kammaren med O2. Behandla anestesi med 1,5-2% isofluran via ansiktsmask och 1 L / min O 2 vid inandning.
- Bifoga både induktionskammaren och ansiktsmasken till en kolavskiljare för avfallsgasadsorption för att skydda personalen. Se till att ett adekvat narkosplan är klartVid att det inte finns något svar på skadliga stimuli (tånstift).
- Skapa ett operativt fält som består av ett kirurgiskt fack med isotermisk kudde för att ge termiskt stöd under operationen. En ytterligare isotermisk kudde kommer att ge termiskt stöd till djur i deras återhämtningsbur.
- Djurberedning
- Utför följande undersökning på 10-12 veckor gamla manliga C57BL / 6-möss.
- Ta bort håret på den ventrala bukytan från djuret från sternum till inguinalområdet med ett depilator eller en elektrisk klipper med ett nummer 40 blad.
- Vid depilatory agent, applicera denna förening till operationsområdet i 2-3 minuter och ta sedan bort det med bomull. Vi använder en kommersiellt tillgänglig förening av kalciumhydroxid och natriumhydroxid.
- Förbered området över axeln med 70% alkohol och injicera subkutant carprofen (5 mg / kg) med en 25 gauge eller mindre borrnål. DettaBehandling kommer att ge postoperativ analgesi för djuret.
- Överför djuret till det kirurgiska fältet och placera i dorsal recumbency.
- Förbered den kirurgiska platsen genom att skura 8-12% providone-jod med en ren bomullsapplikator eller bomullsgas. Skölj sedan huden två gånger med 70% alkohol.
- Placera okulärt smörjmedel i båda ögonen för att minska incidensen av hornhinnedisktion. Täck den kirurgiska platsen med en steril drapera.
- Operativ teknik
- Gör ett median abdominalt laparotomi snitt ca 2-2,5 cm i längd med en skalpell börjar omedelbart caudal xiphoid processen och sträcker sig mot bäckenet.
- Mobilisera tunn tarm och tolvfingertarm och reflektera lateralt till höger. Rulla upp en remsa av steril bomull gauzed och blötläggs med steril saltlösning för injektion för att möjliggöra förpackning av vätskan för att förbättra exponeringen.
- Med tunntarmen mobiliserad till höger omBuken, exponera retroperitoneum och exponera buken aorta från vänster renal ven till aorta bifurcation ( Figur 1 ).
- Med en steril bomullstipsapplikator, leverera 30 på varandra följande krossar, var femte sekund i varaktighet.
- Ta bort packningen och låt vätskan återvända till sin ursprungliga position.
- Stäng fascia med en löpande 4-0 absorberbar monofilament sutur (polydioxanon). Huden är stängd med en löpande 6-0 icke-absorberbar monofilament sutur (nylon).
- Återhämtning och efterbehandling
- Efter förfarandet placera djuret i en återvinningsbur med rent strö på en isotermisk dyna för att fortsätta termiskt stöd tills djuret kan ambulera normalt. Lämna inte djuret obevakat tills det visar förmågan att bibehålla sternal recumbency.
- Övervaka djuret varje timme för de första 4 timmarna efter operationen. När djuret är ambulerande returnerar jag normalt T till det tilldelade köksrummet. Djuret kommer inte att vara inrymt i ett annat djur, tills det helt återhämtade sig.
- Övervaka djuret två gånger dagligen under de första 72 timmarna efter operationen och minst 3 gånger i veckan därefter. Övervakning innefattar att väga djuret tre gånger i veckan.
- Administrera karpofen (5 mg / kg) subkutant två gånger dagligen under de första 72 timmarna efter operationen.
2. Anskaffning av vävnad
- Metod för eutanasi
- Euthanize djuren på förutbestämda tidpunkter.
- Inducerar anestesi via en induktionstank med 100% O2 och 2,5% isofluran levererad via precisionsförångare.
- För att studera endotelets integritet, administrera Evans Blue färgämne till djuret.
OBS: Evans Blue är ett negativt laddat azofärgämne med hög bindningsaffinitet för albumin och kan bara fläcka blodkärl i frånvaro av ett intakt endotelS = "xref"> 6. - För endoteliell integritetsstudier perfekterar djuren med 5 ml 0,3% Evans Blue-färgämne följt av 5 ml PBS vid fysiologiskt tryck i 5 min vid tidpunkten för eutanasi. Djuren upprätthålls i ett kirurgiskt plan av anestesi under perfusionsförfarandet.
- För att studera endotelets integritet, administrera Evans Blue färgämne till djuret.
- Efter att ha uppnått ett djupt narkosplan, öppna bröstet med en sternotomi. Gör en laceration i rätt atrium för att tillåta dränering av blod från djuret och åtkomst till vänster ventrikel nås med en 21 G nål och injicera fosfatbuffrad saltlösning (PBS) tills avloppet från det högra atriumet är klart.
- Efter perfusion med PBS, gå in i buken genom ett mittlinje snitt.
- Återigen mobilisera tunntarmen till högra sidan av buken och exponera infrarenalortan, dissekera skarpt aortan från angränsande vävnader och ta bort det från vänster renalven till aortisk bifurcation.
- Förvara den utskurna aortan i en 4% paraformaldEhydlösning tills vävnadsbehandling sker.
- För endotelintegritetstudier, öppna aortan i längdriktningen och peka den på ett vaxark som exponerar hela luminalytan 6 . Utför en kvalitativ bedömning av endotelintegritet med graden av färgning med Evans Blue Dye 6 .
- För andra histologiska analyser, dela aortan på tvären och bädda in den i optimala skärtemperaturföreningar (OCT) som dikteras av den histologiska metoden som ska användas 7 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transversella sektioner aorta inbäddade i OCT var snittade och färgade med hematoxylin och eosin motsatt färgad med Verhoeff-Van Gieson (VVG) -färg för att identifiera inre och yttre elastiska lamina 7 . Krossskada inducerad aortagväggförtjockning jämfört med aortorna hos djur som behandlats med ett skamförfarande (laparotomi och småarmarmobilisering ensam). Väggtjocklek, som bedömdes av avståndet från adventitia till lumen, var störst tre dagar efter skada (42,2 ± 1,7 μm vs. 22,1 ± 1,1 μm för laparotomi ensam) ( Figur 2A-B ). Skada resulterade i att cellerna hade ett mer rundat utseende och en oregelbunden kontur av luminalytan ( Figur 2C ).
Ökad väggförtjockning av den skadade aortan förmedlas åtminstone delvis av ökad proliferation av medial vaskulär slät musCle celler. För att bevisa att väggförtjockning beror på ökad proliferation i motsats till cellhypertrofi, använde vi en EdU-proliferationsanalys. I denna analys administreras thymidinanalogen 5-etynyl-2'-deoxyuridin (EdU) intravenöst till musen 24 h före eutanasi. EdU införlivas i DNA under syntesen. EdU detekteras med en klickreaktion (kopparkatalyserad azidalkyncyloaddition med användning av grönt fluorescerande färgämne) 8 . Sham-möss utsatta endast för laparotomi hade ingen observerad fluorescens i något lager av aortan. Conversley, möss utsatta för aorta skada demonstrerade fluorescens i både media och intima av aorta ( Figur 3 ).
Aortaväggsförtjockning efter krossskada aktiverar cellsignalvägar inblandade i restenos hos människor. Det mitogenaktiverade proteinkinaset (MAP Kinase) ERK1 / 2 är en av de primära mediatorerna för intimal hyperplasiatbildningSom svar på stimulering från en mitogen fosforyleras ERK1 / 2 och aktiveras 9 , 10 . Data från vårt laboratorium har också visat att den cyklinberoende kinashämmaren p27 kip1 minskas som svar på mitogena stimuli i kärlväggen 12 . Möss euthaniserades vid 1, 3, 7 dagar och 1 månad efter aortisk krossskada. Infrarenal aorta isolerades och proteinuttryck av ERK1 / 2, fosfor-ERK1 / 2 (den aktiverade formen av ERK1 / 2) och den cyklinberoende kinashämmaren p27- kip1 bestämdes genom Western blot-analys ( Figur 4A ). Ingen förändring observerades i totalt ERK1 / 2 proteinuttryck över tiden. Emellertid var tre dagar efter skada fosfor-ERK1 / 2 (Pi-ERK1 / 2) -uttrycket över 200% större än baseline Pi-ERK1 / 2-uttryck. P27 kip1- uttrycket minskade vid tidiga tidpunkter och nådde en nadir på ca 20% av baslinjen sju dagar avTer skada. Både Pi-ERK1 / 2 och p27 kip1- uttryck approximerade baslinjenivåer en månad efter skada ( Figur 4B ). Sålunda är den observerade förtjockningen av aortaväggen åtminstone delvis beroende på ökad medial proliferation.
Aortic injury-modellen möjliggör samtidig utvärdering av både medial glatt muskelspridning och endotelbarriärfunktion. Scanningelektronmikroskopi (SEM) användes för att karakterisera effekten av krossskada på endotelets morfologi. Aortas luminala yta är kantad av ett sammanfogat endotel som förhindrar vidhäftning av blodfödda celler och molekyler ( Figur 5A , Skala bar = 100 μm). I motsats härmed resulterar krossskada i störning av endotelceller och partiell denudation av endotelet ( Figur 5B , Skala bar = 100 | im). Såsom ses vid högre förstoring resulterar avbrott i endotelet i adhesiPå partiklar som är konsekventa i storlek och form med blodplättar. Adhesion av dessa partiklar förekommer genom hela skadezonen och är inte begränsad till områden med brutal denudation observerad vid lägre förstoring ( Figur 5C , Skala bar = 50 | im). Morfologin hos den vidhäftande partikeln observeras bäst vid högre förstoring. Dessa partiklar överensstämmer med blodplättar och fibrin ( Figur 5D , Skala bar = 10 | im).
Förutom endotelmorfologin kan barriärfunktionen hos endotelet bedömas med denna modell av kärlsjukdom. Azo-färgämnet Evans Blue kan inte permeera det normala, intakta endotelet i den murina aortan. Skada på barriärfunktionen hos endotelet möjliggör färgning av basalmembranet med Evans Blue. Möss behandlade till en laparotomi ensam (sham) upprätthöll barriärfunktionen hos endotelet och dessa aortor var vita. Krossskada resulterade i aDiffus förlust av endotelbarriärfunktionen och dessa aortor färgade mörkblå. Intensiteten av färgning med Evans Blue minskade tre dagar efter krossskada, och full barriärfunktion återställdes veckan efter skada ( Figur 6A ). Endotelbarriärfunktionen kan kvantifieras ytterligare genom att väga proverna och homogenisera i 10-faldig volym 50% triklorättiksyra-lösning. Spädning av supernatanten i 4-faldig etanol möjliggör bestämning av fluorescensintensitet (excitation 620 nm och emission 680 nm) såsom beskrivits av Aoki et al . 11 . Mängden Evans Blue som eluerades från infrarenal aorta var över tre gånger högre i aorta omedelbart efter skada jämfört med aorta som endast utsattes för laparotomi (Skadad - Dag 0). Aortan fortsatte att fläcka med Evans Blue vid en och tre dagar efter skada, men mindre intenst än vid tidpunkten för skada, vilket föreslog en gradvis återhämtning av endotelbarriärfunktionen. En vecka bakomSkada den skadade aortan hade motsvarande färgning som en aorta behandlad med laparotomi ensam ( Figur 6B ).
Figur 1: Skada är skapad genom att helt enkelt krossa Aorta från vänster njervärde till Aortic Bifurcation. Figur anpassad med tillstånd från Yu et al ., PLoS One 2015 12 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Crush Skada inducerar Aortic Wall Thickening. ( A ) Krossskada inducerade morfologiska förändringar i aortan. Representativa 5 | im tvärsnitt färgades med VVG vid O,1, 3 och 7 dagar efter skada. Skalstänger = 100 μm. ( B ) Väggtjockleken var störst 3 dagar efter skada, 42,2 ± 1,7 μm, och var signifikant större än aortan av skamdjur utsatta för laparotomi ensam, 22,1 ± 1,1 μm. Statistisk signifikans bestämdes med studentens två-svans t-test. * Betecknar p <0,05, n = 3. ( C ) Krossskada inducerade ett rundat utseende av mediala VSMC (färgade i grönt för a-slät muskelaktin) och förändrade cellorientering. Kärnor motverkades med DAPI (Blue). Skalstänger = 10 μm. Data presenteras som medel och standardavvikelser. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Crush Skada inducerar Cell ProlifeRation i Aortic Wall. Möss utsattes för antingen laparotomi ensam (skam) eller laparotomi med aortisk krossskada. Thymidinanalog 5-etynyl-2'-deoxyuridin (EdU) administrerades 24 h före eutanasi. EdU införlivas i DNA under syntesen. EdU detekteras med en klickreaktion (kopparkatalyserad azidalkyncyloaddition med användning av grönt fluorescerande färgämne). Det fanns ingen detekterbar EdU (grön) i skurdjurens aorta vägg. I de djur som utsattes för krossskada, färgade EdU framträdande i aortas media och i något mindre grad i intima. Vaskulära glattmuskelceller identifierades genom färgning med a-slät muskelaktinantikropp (röd). Detta resultat tyder på att den observerade väggförtjockningen observerad i figur 2 beror på en ökning av cellproliferation. Skalstänger = 10 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figure.
Figur 4: Den mitogenaktiverade proteinkinasen (MAP Kinase) -banan är aktiverad som svar på krossskada. ( A ) MAP-kinasen ERK1 / 2 fosforyleras när den aktiveras och är associerad med intimal hyperplasi och restenos. Möss euthaniserades vid 1, 3, 7 dagar och 1 månad efter aortisk krossskada. Western blot-analys användes för att bedöma proteinuttryck av totalt ERK1 / 2, fosf-ERK1 / 2 och den cyklinberoende kinashämmaren p27 kip1 . Proteinuttryck normaliserades till ett skamdjur behandlat med laparotomi ensam. ( B ) Ingen förändring observerades i totalt ERK1 / 2 proteinuttryck över tiden. Emellertid var tre dagar efter skada fosfor-ERK1 / 2 (Pi-ERK1 / 2) -uttrycket över 200% större än baseline Pi-ERK1 / 2-uttryck. P27 kip1 uttryck minskade vid tidiga tidpunkter anD nådde en nadir på cirka 20% av baslinjen sju dagar efter skada. Både Pi-ERK1 / 2 och p27 kip1- uttrycket approximerade baslinjenivåer en månad efter skada. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5. Crush Skada stör Aortic endotelceller. ( A ) Scanningelektronmikroskopi (SEM) användes för att karakterisera effekten av krossskada på endotelets morfologi. Den normala aortas luminala yta är kantad av ett sammanfogat endotel som förhindrar vidhäftning av blodfödda celler och molekyler. ( B ) Crush skada resulterar i störning av endotelceller och partiell denudation av endotelet. ( C ) Som sedd vid högre magnificaSönderdelning av endotelet resulterar i vidhäftning av partiklar som är konsekventa i storlek och form med blodplättar. Adhesion av dessa partiklar förekommer genom hela skadezonen och är inte begränsad till områden med brutal denudation observerad vid lägre förstoring. ( D ) Vid högre förstoring är dessa partiklar förenliga med blodplättar och fibrin. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Blunt Aortic Injury Tillåter kvantifiering av Endotel Barrier Function. ( A ) Skada på endotelens barriärfunktion medger färgning av basalmembranet med Evans Blue-färgämne. Möss behandlade till en laparotomi ensam (sham) upprätthöll barriärfunktionen hos endotelet och thEse aortor var vita. Krossskada resulterade i en diffus förlust av endotelbarriärfunktionen och dessa aortor färgades mörkblå. Intensiteten av färgning med Evans Blue minskade tre dagar efter krossskada, och fullständig barriärfunktion återställdes vecka efter skada. ( B ) Bindning av Evans Blue till infrarenal aorta kvantifierades genom att eluera Evans Blue från provet och kvantifiering med fluorescensintensitet. Data presenteras som medel och standardavvikelser. Den mest Evans Blue eluerades från aortan omedelbart efter krossskada. På skadan skedde aortan trefaldigt mer Evans Blue än aortan som utsattes för laparotomi ensam. Eftersom aorta fick återhämta sig, var det mindre bindande vid en och tre dagar efter skada. En vecka efter skada binder aortan samma mängd Evans Blue som aorta som utsätts för laparotomi ensam. Statistisk signifikans bestämdes med studentens två-svans t-test. * DeAnteckningar p <0,05, n = 3, NS betecknar inte signifikant. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har karaktäriserat effekterna av en murin aorta skademodell som resulterar i medial hyperplasi och endotelbarriär dysfunktion. Delvis EC-avlägsnande längs aorta intima åtföljde förlusten av cellcellskontakt och förbättring av cellutsprång. På motsvarande sätt försämrades endotelbarriärfunktionen, som stimulerade de mitogenkänsliga signaleringsvägarna, vilket ledde till proliferation av VSMC och förtjockning av kärlväggen. Styrkan i denna modell är att det är tekniskt lättare att lära sig och utföra än andra aorta-modeller av sjukdom och möjliggör samtidig utvärdering av både det proliferativa svaret på skada och endotelfunktion. Det kritiska steget i detta protokoll är den faktiska krossskadorna. Variabilitet i omfattningen av crush skada kan resultera i varierande grader av skada och därmed varierande mängder jämn smältmuskelcell proliferation. Ett steg som minskar denna variation i vårt laboratorium är att ha en sCientist, blindad för behandling eller experimentellt tillstånd, utför alla krossskador.
En begränsning av denna modell är dess generaliserbarhet för kliniskt relevanta mänskliga sjukdomsprocesser. Trots det tidiga robusta proliferativa svaret hos VSMCs i denna modell, modellerar den inte de sena händelserna hos restenos, dvs ingen neointima utvecklad. Minskade inflammatoriska mediatorer som cytokiner kan reglera denna process. Detta resultat kan bero på den snabba återhämtningen av endotelet från en partiell skada. I likhet med en tidigare rapporterad kärlkrossmodell i kaniner 13 var infiltrering av immunceller mindre. I den aktuella undersökningen utvärderade vi profilen av inflammatoriska cytokiner av skamdjur och aorta skada djur med profiler array. Det fanns emellertid ingen signifikant skillnad i cytokinprofilen som skulle förklara skillnaden i det proliferativa svaret mellan skam och skadade djur (datainte visad). Skadan som beskrivs i föreliggande rapport är temporärt begränsad. Medan andra modeller av aorta-skada och intimal hyperplasi, såsom aorta-angioplastikmodellen, fullständigt avslöjar endotelet, förnekar den nuvarande modellen endast delvis aortan. Fullständig denudation av endotelet kräver betydligt längre tid att återhämta sig och dessa djur upplever effekterna av skada under en längre tid.
Denna modell ger ett snabbt svar på VSMCs och ECs till skada som möjliggör kvantifiering av morfologiska och biokemiska förändringar på en vecka. Det är effektivare än andra modeller som tar 14-28 dagar innan effekten av intervention är uppenbar. Denna modell använder den murina aortan som är det enda murina kärlet som approximerar ett kliniskt relevant humankärl. Den väsentliga fördelen med denna teknik jämfört med andra aortamodeller är att denna modell är relativt lätt att lära sig och kräver inte dyrt eller svårt att erhålla ekvivalentUipment 2 , 3 , 4 , 5 . Sammanfattningsvis ger den murina aorta-crush-skademodellen en tekniskt enkel, billig, effektiv in vivo- plattform för att samtidigt utvärdera responsen av VSMCs och ECs till vaskulär skada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Detta arbete finansierades av Department of Veterans Affairs Career Development Award (1IK2BX001553-01) (TSM) och Vascular Cures EJ Wylie Scholarship (TSM).
Acknowledgments
Vi tackar Hsia Ru-ching PhD, från Electron Microscopy Core Facility vid University of Maryland School of Medicine, för hennes tekniska support vid behandling av scanning elektroniska mikroskopi prover.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Pharmaceutical agents |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | Pharmaceutical agents |
| Carprofen | Zoetis | 26357 | Pharmaceutical agents |
| Precision vaporizer | Summit Medical | 10675 | Surgical supplies |
| Charcoal scavenger | Bickford Inc. | 80120 | Surgical supplies |
| Isothermal pad | Harvard Apparatus | 50-7053-R | Surgical supplies |
| Sterile cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-124 | Surgical supplies |
| 4-0 absorbable monofilament suture | Ethicon, Inc | J310 | Surgical supplies |
| 5-0 non-absorbable monofilament suture | Ethicon,Inc | 1666 | Surgical supplies |
| 21-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305165 | Surgical supplies |
| 25-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305125 | Surgical supplies |
| Dry sterilizer | Cellpoint | 7770 | Surgical supplies |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | Surgical instruments |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | Surgical instruments |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Surgical instruments |
| Vannas Spring Scissors 3 mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-00 | Surgical instruments |
| Needle driver | Fine Science Tools | 91201-13 | Surgical instruments |
| Scalpel handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Surgical instruments |
| Scalpel blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | Surgical instruments |
| PBS | Lonza | 17-516F | Reagents for tissue processing |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | Reagents for tissue processing |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagents for tissue processing |
| Modeling wax | Bego | 40001 | Reagents for tissue processing |
| OCT compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 | Reagents for tissue processing |
| Mayer's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | MHS16 | Reagents for immunohistological analysis |
| Eosin Y solution alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110316 | Reagents for immunohistological analysis |
| Elastin stain kit | Sigma-Aldrich | HT25A | Reagents for immunohistological analysis |
| Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4695 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-phospho-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4370 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-p27kip1 antibody | Cell Signaling Technology | 3698 | Reagents for immunohistological analysis |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | Reagents for immunohistological analysis |
References
- Carmeliet, P.
- Carmeliet, P., Moons, L., Collen, D. Mouse models of angiogenesis, arterial stenosis, atherosclerosis and hemostasis. Cardiovasc Res. 39 (1), 8-33 (1998).
- Baker, A. B., et al. Heparanase Alters Arterial Structure, Mechanics, and Repair Following Endovascular Stenting in Mice. Circ Res. 104 (3), 380-387 (2009).
- Petrov, L., Laurila, H., Hayry, P., Vamvakopoulos, J. E. A mouse model of aortic angioplasty for genomic studies of neointimal hyperplasia. J Vasc Res. 42 (4), 292-300 (2005).
- Li, J., et al. Vascular smooth muscle cells of recipient origin mediate intimal expansion after aortic allotransplantation in mice. Am J Path. 158 (6), 1943-1947 (2001).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062 (2013).
- Turbett, G. R., Sellner, L. N. The use of optimal cutting temperature compound can inhibit amplification by polymerase chain reaction. Diagn Mol Pathol. 6 (5), 298-303 (1997).
- Puchtler, H., Waldrop, F. S. On the mechanism of Verhoeff's elastica stain: a convenient stain for myelin sheaths. Histochem. 62 (3), 233-247 (1979).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Nelson, P. R., Yamamura, S., Mureebe, L., Itoh, H., Kent, K. C. Smooth muscle cell migration and proliferation are mediated by distinct phases of activation of the intracellular messenger mitogen-activated protein kinase. J Vasc Surg. 27 (1), 117-125 (1998).
- Rzucidlo, E. M. Signaling pathways regulating vascular smooth muscle cell differentiation. Vascular. 17, Suppl 1. S15-S20 (2009).
- Aoki, T., Sumii, T., Mori, T., Wang, X., Lo, E. H. Blood-brain barrier disruption and matrix metalloproteinase-9 expression during reperfusion injury: mechanical versus embolic focal ischemia in spontaneously hypertensive rats. Stroke. 33 (11), 2711-2717 (2002).
- Yu, D., et al. MARCKS Signaling Differentially Regulates Vascular Smooth Muscle and Endothelial Cell Proliferation through a KIS-, p27kip1- Dependent Mechanism. PLoS One. 10 (11), e0141397 (2015).
- Banai, S., et al. Rabbit ear model of injury-induced arterial smooth-muscle cell-proliferation - kinetics, reproducibility, and implications. Circ Res. 69 (3), 748-756 (1991).
