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Immunology and Infection

इम्यूनोमॉड्यूलेटरी औषध पहचान के लिए टी lymphocytes में माइटोजन प्रेरित Blastogenesis की रैपिड मात्रा

Published: December 27, 2016 doi: 10.3791/55212
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Neuroscience, Cell Biology and Physiology, Boonshoft School of Medicine, Wright State University, 2Department of Pharmacology and Toxicology, Boonshoft School of Medicine, Wright State University

Abstract

जवाब में लिम्फोसाइट प्रसार प्रतिजनी करने के लिए या mitogenic उत्तेजना एक आसानी से मात्रात्मक घटना परीक्षण इम्यूनोमॉड्यूलेटरी (यानी, प्रतिरक्षा को दबाने या immunostimulatory) रासायनिक यौगिकों और बायोलॉजिक्स के लिए उपयोगी है। mitogenesis के दौरान जल्द से जल्द कदम से एक सेल वृद्धि या blastogenic परिवर्तन, विभाजन से पहले सेल की मात्रा बढ़ जाती है जिस है। यह आमतौर पर टी लिम्फोसाइट उत्तेजना के पहले कई घंटों में detectable है। यहाँ, हम माउस spleens और मानव परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) से अलग टी lymphocytes में blastogenesis यों के लिए एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर एक तेजी से विधि का वर्णन है। अधिकांश भाग के लिए विभिन्न आमतौर पर इस्तेमाल प्रसार assays श्रमसाध्य हैं और केवल एक आबादी के भीतर कुल जनसंख्या प्रभाव के बजाय व्यक्तिगत सेलुलर प्रभाव दर्शाते हैं। इसके विपरीत, प्रस्तुत स्वचालित सेल काउंटर परख सेल व्यास है कि हो सकता है की, तेजी से प्रत्यक्ष, और सटीक मापन प्रदान करता हैविभिन्न mitogens और इन विट्रो में इम्यूनोमॉड्यूलेटरी दवाओं के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया।

Introduction

टी lymphocytes स्तनधारियों में अनुकूली प्रतिरक्षा के लिए जिम्मेदार प्राथमिक कोशिकाओं रहे हैं। यह ज्ञात है कि वे प्रतिजन पेश कोशिकाओं की सतह पर MHC अणुओं द्वारा प्रस्तुत विशिष्ट प्रतिजनी पेप्टाइड का जवाब। एक आत्मीय टी सेल रिसेप्टर (TCR) के सक्रियण पर, सेल मायनों में इजाफा करने में एक प्रक्रिया blastogenic परिवर्तन, या blastogenesis करार दिया। बाद प्रोत्साहन 1 लागू किया जाता है इस प्रक्रिया को पहली ~ 6 घंटे में detectable है। Blastogenesis के दौरान अलग-अलग टी कोशिकाओं की मात्रा को बढ़ाने के लिए 2- 4 गुना 2-6। लिम्फोसाइटों एक प्रक्रिया क्लोनल विस्तार बुलाया में पैदा करने के लिए शुरू, जिस उद्देश्य के लिए संभव के रूप में विशिष्ट प्रतिजन TCR असर कोशिकाओं के रूप में कई क्लोन पैदा करने के लिए है। संतान कोशिकाओं तो साइटोटोक्सिक (सीडी 8 +) या सहायक (CD4 +) प्रेरक टी lymphocytes में फर्क द्वारा उनकी immunologic समारोह डालती है। इस प्रकार, मानव या माउस रक्त में भोले टी lymphocytes सेल के जी 0 (आराम) चरण में हैंचक्र और समर्थन के लिए कम से कम चयापचय क्रिया। एंटीजन या mitogens के लिए जोखिम पर, टी कोशिकाओं प्रतिलेखन और प्रोटीन संश्लेषण 7-10 के एक सहवर्ती उत्तेजना के साथ, कोशिका चक्र फिर से दर्ज। ऐसे phorbol 12 myristate 13-एसीटेट (पीएमए) और ionomycin प्रोटीन काइनेज सी (पीकेसी) और सीए 2 निर्भर संकेत दे रास्ते 1 के सक्रियण के माध्यम लिम्फोसाइट को प्रोत्साहित के रूप में mitogens। पीएमए / ionomycin के साथ टी कोशिकाओं की सक्रियता TCR संकेत कदम नजरअंदाज।

इन विट्रो प्रसार में assays व्यापक रूप से लिम्फोसाइट समारोह और उत्तेजनाओं के जवाब के मूल्यांकन के प्रयोजन के लिए उपयोग किया जाता है। प्रसार रीडिंग आम तौर पर एक से तीन दिन टी सेल उत्तेजना की शुरुआत के बाद लिया गया है और सैकड़ों या कोशिकाओं के हजारों की सामूहिक स्थिति को प्रतिबिंबित कर रहे हैं। विभिन्न mitogens और इन विट्रो में इम्यूनोमॉड्यूलेटरी दवाओं की शक्ति बस इन यौगिकों की उपस्थिति में प्रसार दर को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। इनमें से एक में से कुछssays और अपनी सीमाओं से नीचे चर्चा कर रहे हैं।

प्रत्यक्ष सेल संख्या की गणना के लिए, प्रक्रिया ऑपरेटर त्रुटियों की एक उच्च संभावना के साथ, समय लगता है।

डीएनए संश्लेषण के लिए, 3H-thymidine निगमन परख डीएनए संश्लेषण के उपाय है, लेकिन इसकी प्रमुख सीमा अपने radiotoxicity है। एक गैर रेडियोधर्मी विकल्प BrdU है, लेकिन सेल के विकास के लिए रेखीय प्रतिक्रिया की सीमा सीमित है, और एंटीबॉडी उपचार की आवश्यकता है, जो प्रक्रिया 11,12 में कदम की संख्या बढ़ जाती है।

चयापचय क्रिया, tetrazolium लवण (MTT, एमटीएस, XTT, और WST-1) और resazurin के लिए डाई आधारित वर्णमिति assays सेल आबादी को विभाजित करने की सामान्य चयापचय राज्य की रिपोर्ट। हालांकि, MTT नहीं संस्कृति के माध्यम में घुलनशील, अतिरिक्त धोने कदम की आवश्यकता होती है, इस प्रकार की माप में त्रुटियों को शामिल है; XTT कुशलता से कम करने के लिए अतिरिक्त घटकों की जरूरत है; MTS-, WST-1-, और resazurin आधारित माप प्रभावित कर रहे हैंसंस्कृति के माध्यम से पीएच और उसके घटकों सीरम, एल्बुमिन या फिनोल लाल 13-16 से एड। ये assays व्यवहार्य कोशिकाओं की वास्तविक संख्या को मापने के लिए नहीं है बल्कि संयुक्त एंजाइम गतिविधियों का अनुमान है। इसलिए, प्रसार दर सही सेल नंबर और डाई कमी 12,17 के बीच गैर रैखिक संबंध की वजह से चयापचय assays के द्वारा निर्धारित नहीं किया जा सकता है।

एटीपी एकाग्रता को मापने के लिए, एटीपी में टी सेल सक्रियण प्रेरित बढ़ जाती प्रसार के साथ सहसंबंधी। हालांकि, intracellular एटीपी की ऊंचाई टी सेल सक्रियण के प्रारंभिक चरणों में से एक है; कई कदम पीछे वास्तविक प्रसार 17,18 है।

डाई कमजोर पड़ने परख के लिए, CFSE फ्लोरोसेंट डाई covalently intracellular प्रोटीन के बंधन से कोशिकाओं दाग। डाई फ्लोरोसेंट तीव्रता में एक प्रसार पर निर्भर कमी है, जो कोशिका विभाजन की संख्या को ट्रैक कर सकते हैं पता चलता है। हालांकि, क्योंकि सहसंयोजक प्रोटीन लेबलिंग की, इन के कार्योंप्रोटीन से समझौता किया जा सकता है। डाई उच्च सांद्रता में कोशिकाओं को विषैला होता है। कम डाई सांद्रता में, हालांकि, प्रारंभिक प्रतिदीप्ति तीव्रता कम हो जाता है, कोशिका विभाजन की संख्या लगाया जा सकता है कम। इसके अतिरिक्त, CFSE के साथ लेबलिंग के बाद, वहाँ पहले 24 से 48 घंटा अवधि है, जो इस परख 19,20 के गतिशील रेंज की सीमा के दौरान प्रारंभिक प्रतिदीप्ति के प्रसार-स्वतंत्र ~ 50% नुकसान हुआ है।

इन परीक्षणों की सबसे कोशिकाओं की बड़ी संख्या के सामूहिक स्थिति को प्रतिबिंबित और फ्लोरोसेंट रंगों के साथ कोशिकाओं के इलाज की आवश्यकता होती है। परिगलित और apoptotic कोशिकाओं को भी जब तक वे रसायन या एंटीबॉडी के साथ धुंधला द्वारा विश्लेषण से हटा रहे हैं, इन मापों के लिए योगदान कर सकता है।

लिम्फोसाइट blastogenesis जैसे ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के रूप में तरीकों की एक किस्म के द्वारा मूल्यांकन या 4,21,22 प्रवाह cytometry जा सकता है। यहाँ, हम एक का उपयोग कर टी सेल आकार के माप के लिए एक तेजी से विधि का वर्णनn सेल काउंटर, जो कि जमा हो जाती है और बाद में फिर से विश्लेषण किया जा सकता वास्तविक समय सेल छवियों को इकट्ठा स्वचालित। आकार माप के अलावा, इस उपकरण के रूप में trypan नीले दाग बहिष्कार द्वारा निर्धारित, सटीक सेल नंबर और व्यवहार्य कोशिकाओं का प्रतिशत प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त उपकरण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, और निर्माता तीन विभिन्न उपकरणों और कई एकाग्रता और व्यवहार्यता नियंत्रण का उपयोग कर साधन की परिशुद्धता परीक्षण किया। इन अध्ययनों के परिणामों विचरण का एक गुणांक है कि आम तौर पर 6% से नीचे था प्रदर्शन किया। प्रोटोकॉल में उल्लेख किया, डिवाइस 6 माइक्रोन और 8 मीटर व्यास polystyrene मोतियों के साथ एक नियमित आधार पर calibrated है। आराम टी कोशिकाओं और टी lymphoblasts सेल व्यास के आधार पर के बीच अंतर करने के लिए एक सेल काउंटर का उपयोग करने के फायदे उपयोग की आसानी और विश्लेषण के स्वचालित स्वभाव है। सॉफ्टवेयर प्रत्येक कोशिका के चारों ओर एक वृत्त चित्र और सेल व्यास की गणना करने में सक्षम है। इसके अतिरिक्त, आईएमउम्र के ऑपरेटर, जो कोशिकाओं की पहचान करने और उन्हें सही ढंग से चारों ओर एक वृत्त चित्र में साधन की सटीकता की पुष्टि कर सकते हैं करने के लिए दिखाई दे रहे हैं। सीमाओं के संदर्भ में, साधन मलबे और कोशिकाओं के बीच अंतर नहीं प्रतिशत से कर सकते हैं; इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि ऑपरेटर हर छवि विचारों के रूप में यह कार्रवाई की जा रही है। वहाँ हवा के बुलबुले, जो विश्लेषण के लिए प्रयोग करने योग्य क्षेत्रों की संख्या में कमी होगी शामिल करने के लिए एक संभावित है; हालांकि, इस दुर्लभ यदि नियमित निस्तब्धता रखरखाव किया जाता है।

इस अध्ययन में, प्लीहा टी लिम्फोसाइटों के समूहों ionomycin और 12-48 घंटे के लिए बढ़ रही है पीएमए की सांद्रता के साथ प्रेरित किया गया। पीएमए सांद्रता 2 एनजी / एमएल प्रेरित दोनों एक मजबूत blastogenic प्रतिक्रिया और महत्वपूर्ण प्रसार के रूप में के रूप में कम। ऐसे immunosuppressants Cyclosporine ए (सीएसए), FK506 (tacrolimus), और rapamycin (सिरोलिमस), साथ ही आयन चैनल ब्लॉकर्स ट्राम 34 और FTY720 के रूप में कई दवाओं के प्रभाव का माप (fingoliरक्षा मंत्रालय), blastogenesis पर प्रसार पर सूचना प्रभाव के साथ अच्छे समझौते का प्रदर्शन किया। विरोधी CD3 और विरोधी CD28 एंटीबॉडी लेपित चुंबकीय मोतियों के साथ पीएमए / ionomycin और murine टी सेल उत्तेजना के लिए मानव PBMCs के blastogenic प्रतिक्रिया भी मापा गया।

सेल काउंटर परख दोनों blastogenesis और प्रसार दर (सेल घनत्व) एक साथ लेकिन अलग से quantifies, उपरोक्त विधियों, जो इन प्रभावों का एक संयोजन को देखने के विपरीत है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल mitogenic और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी एजेंटों की शक्ति के मूल्यांकन के लिए एक तेजी से और मजबूत तकनीक प्रदान करता है।

Protocol

सभी प्रयोगों राइट राज्य विश्वविद्यालय की प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग समिति और संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार किया जाता है।

नोट: मानव PBMCs Ficoll घनत्व ढाल centrifugation विधि 5 से अलग कर रहे हैं।

1. प्लीहा हार्वेस्ट

  1. हाउस वयस्क भोजन, पानी, और बिस्तर आवश्यकताओं प्रजातियों के लिए विशिष्ट साथ मानक प्रयोगशाला परिस्थितियों में महिला आईसीआर चूहों।
    नोट: पशु 2.9 महीने की औसत आयु और इच्छामृत्यु के समय में 30.4 जी का एक मतलब वजन था।
  2. अलगाव (DOI) की तिथि पर, व्यक्तिगत रूप से अन्य सजातीय वर्तमान जानवरों के बिना जानवरों euthanize। माउस के लिए कम से कम तनाव सुनिश्चित करने के लिए सभी प्रयास करें। सीओ 2 का उपयोग माध्यमिक ग्रीवा अव्यवस्था के साथ मौत को सुनिश्चित करने के euthanize।
    1. पशु हस्तांतरण पिंजरे के अंदर की जगह, फिर भी, सीओ 2 चैम्बर और स्टेशन में5 एल / मिनट में गैस का प्रवाह RT। इस प्रवाह की दर प्रति मिनट की सिफारिश की 10-30% से कम ऑक्सीजन विस्थापित।
    2. पशु के बाद बेहोश है, 15 एल / मिनट के लिए सीओ 2 प्रवाह की दर में वृद्धि। साँस लेने की समाप्ति के लिए पशु की जाँच करें और एक अतिरिक्त 2 मिनट के लिए चैम्बर में छोड़ दें।
    3. व्याकुलता बल के साथ ग्रीवा अव्यवस्था लागू मौत सुनिश्चित करने के लिए।
  3. पशु मौत के 10 मिनट के भीतर सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करने से तिल्ली हार्वेस्ट।
    1. एक आटोक्लेव ओवन का प्रयोग करने से पहले में तिल्ली को हटाने के लिए कैंची और संदंश के दो सेट जीवाणुरहित। 70% इथेनॉल लगाने से विच्छेदन सतह जीवाणुरहित।
    2. माउस पेट के लिए 70% इथेनॉल लागू करें। कैंची और संदंश के एक सेट का उपयोग करना है, तो अलग खींच और त्वचा पेरिटोनियम प्रकट करने के लिए वापस छील, फर और पेट के बाईं ओर से त्वचा में कटौती कर सकते हैं। एक बार अवगत कराया, पेरिटोनियम खोलने से पहले 4% chlorhexidine समाधान लागू होते हैं।
    3. विज्ञान के दूसरे सेट का उपयोगssors और संदंश, केंद्रीय पेट के साथ एक 2- 3 सेमी काट कर। पेरिटोनियम खोलें और दूर आंत संलग्नक और अतिरिक्त चर्बी काटने से तिल्ली को हटा दें। Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा (DPBS) में तिल्ली रखें।

2. कच्चे Splenocytes की तैयारी

नोट: एक लामिना का प्रवाह जैव सुरक्षा सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करते हुए कैबिनेट के तहत सभी चरणों का प्रदर्शन।

  1. एक 10 सेमी संस्कृति डिश में 5 मिनट के लिए विआयनीकृत बाँझ एच 2 ओ के 10 मिलीलीटर में काटा spleens सोख सतह एरिथ्रोसाइट्स lyse करने के लिए।
    नोट: यदि तिल्ली अलगाव के दौरान क्षतिग्रस्त हो गया था यह कदम छोड़ा जा सकता है।
  2. splenocytes को रिहा करने के लिए, एक ताजा 10 सेमी संस्कृति पकवान पर (तिल्ली का सामना करना पड़ पाले पक्ष) दो निष्फल ग्लास स्लाइड्स के बीच spleens कुचलने। 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 मिमी एल glutamine, 50 आइयू / एमएल पेनिसिलिन के साथ पूरक RPMI 1640 के 10 मिलीलीटर, और 50 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन (एक करने के लिए भेजा नीचे के साथ मिक्सपूरा RPMI)।
  3. संयोजी ऊतक और मलबे को हटाने के लिए एक नया 10 सेमी संस्कृति डिश में एक बाँझ 40 माइक्रोन नायलॉन सेल झरनी के माध्यम से कोशिकाओं फ़िल्टर।
  4. Lyse 7.4 पीएच में 155 मिमी एनएच 4 सीएल, 10 मिमी 3 NaHCO, और 0.1 मिमी EDTA से बना आरबीसी lysis बफर के 20 मिलीग्राम और 300 mOsm / एल जोड़कर शेष एरिथ्रोसाइट्स।
    नोट: परासरणीयता एक हिमांक या वाष्प दबाव osmometer से मापा जाता है।
    1. कोशिकाओं को 10 मिनट (4 डिग्री सेल्सियस) के लिए 250 XG पर एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र के लिए 10 सेमी की थाली से स्थानांतरण।
    2. सतह पर तैरनेवाला निकालें, आरबीसी lysis बफर के 20 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और pipetting द्वारा pelleted कोशिकाओं को फिर से निलंबित।
    3. कोमल कमाल के साथ 10 मिनट के लिए lysis बफर में कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    4. 250 XG (4 डिग्री सेल्सियस) पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र गोली कोशिकाओं। lysis बफर डालो।
    5. फिर पूरा RPMI और सेंट्रीफ्यूज के 10 मिलीलीटर (250 XG, 10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) में कोशिकाओं को फिर से निलंबित। डिस्कसतह पर तैरनेवाला अर्द।
  5. पूरा RPMI के 2 मिलीलीटर में splenocytes पुनः निलंबित नायलॉन ऊन फाइबर स्तंभ के हस्तांतरण के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक गरम।

3. टी lymphocytes की शुद्धि

  1. नायलॉन ऊन कॉलम पूरा RPMI के 5 मिलीलीटर के साथ दो बार धोएं। 1 घंटे के लिए एक 5% सीओ 2 के सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    नोट: यह नायलॉन ऊन प्रयोग की अवधि के लिए गीला रखने के लिए और पूरा RPMI सभी नायलॉन ऊन अलगाव चरणों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर गरम का उपयोग करने के लिए आवश्यक है।
  2. स्तंभ के लिए पृथक splenocytes जोड़ें और 1 घंटे के लिए सेते बी कोशिकाओं, fibroblasts, और गौण कोशिकाओं नायलॉन ऊन का पालन करने की अनुमति देते हैं।
    1. स्तंभ में splenocytes युक्त RPMI के 2 मिलीलीटर जोड़ें और जब तक नायलॉन ऊन के शीर्ष पर पहुंच गया है के माध्यम से गुजरती हैं।
    2. नायलॉन ऊन के शीर्ष पर करने के लिए गर्म 37 डिग्री सेल्सियस पूरा RPMI के 2 मिलीलीटर जोड़ें और ऊन के माध्यम से मध्यम पारितजब तक तरल स्तर ऊपर की सतह तक पहुँचता है।
    3. पूरी तरह से नायलॉन ऊन कवर करने के लिए स्तंभ के लिए गर्म पूरा RPMI के 3 मिलीलीटर जोड़ें।
    4. 1 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 के सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में undisturbed लोड स्तंभ सेते हैं।
  3. पूरा RPMI के 5 मिलीलीटर के साथ दो बार स्तंभ धोने से कोशिकाओं Elute। Centrifugation द्वारा eluted कोशिकाओं के एक अतिरिक्त धोने प्रदर्शन करना।
    1. पूरा RPMI के साथ शीर्ष 2 बार के लिए स्तंभ भरें और कॉलम में समाधान के लिए एक 50 मिलीलीटर बाँझ शंक्वाकार ट्यूब में के माध्यम से प्रवाह के लिए अनुमति देते हैं।
      नोट: दोहन या स्तंभ है, जो बी कोशिकाओं, सहायक कोशिकाओं, और fibroblasts नायलॉन ऊन का पालन करने को बेदखल कर सकते हैं bumping से बचें।
    2. गोली कोशिकाओं के लिए 10 मिनट (4 डिग्री सेल्सियस) के लिए 250 XG पर प्रवाह के माध्यम से अंश और स्पिन ले लीजिए। पूरा RPMI के 10 मिलीलीटर के साथ एक बार धो लें। कोशिकाओं को फिर से गोली (250 XG, 10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) और पूरा RPMI के 2 मिलीलीटर में फिर से निलंबित।
    3. उपाय ग पक्ष घनत्व एक hemocytometer का उपयोग और 0.5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल पूरा RPMI में पतला।
    4. बीज 1 या 24 या 6 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली, क्रमशः के प्रत्येक कुएं में कोशिकाओं के 2 मिलीलीटर aliquots, और संस्कृति के 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं।
      नोट: 1 मिमी 1,4-dithiothreitol (डीटीटी) टी सेल अस्तित्व में सुधार करने के लिए इस स्तर पर प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ा जा सकता है।
    5. वैकल्पिक: प्रवाह cytometry द्वारा अलगाव प्रोटोकॉल की दक्षता की पुष्टि करें। इस प्रोटोकॉल सामान्य रूप से पैदावार ~ 80% टी lymphocytes 23।
      नोट: नायलॉन ऊन शुद्ध कोशिकाओं लगभग 50% सीडी 4 + और 23% सीडी 8 + कोशिकाओं होते हैं। सीडी 4 + और सीडी 8 + उप-जनसंख्या आगे को शुद्ध करने के लिए, एक भी immunomagnetic कमी कदम आठ एंटीबॉडी और चुंबकीय मोती 24 का उपयोग किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, शुद्ध सीडी 4 + और सीडी 8 + टी सेल आबादी विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ सकारात्मक या नकारात्मक चयन द्वारा अलग किया जा सकता है।
_title "> 4। टी lymphocytes की सक्रियता और प्रयोगात्मक दवा एक्सपोजर

  1. पीएमए के अलावा के माध्यम से और कैल्शियम नमक या चुंबकीय मोती विरोधी CD3 और विरोधी CD28 एंटीबॉडी 23,25,26 के साथ लेपित ionomycin अलगाव के 24 घंटा के भीतर टी lymphocytes सक्रिय करें। सक्रियण के समय में प्रायोगिक दवाओं (जैसे, सीएसए, FK506, rapamycin, ट्राम-34, और FTY720) जोड़ें।
    नोट: यहाँ, पीएमए सांद्रता 2 से 250 एनजी / एमएल से अलग, और ionomycin एकाग्रता 250 एनएम पर रखा गया था। यदि संभव हो तो, dilutions प्रत्येक दवा का जायजा aliquots से तैयार किया जाना चाहिए ताकि मात्रा कोशिकाओं में से प्रत्येक में अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ा reproducibility सुनिश्चित करने के लिए ≥1 μl है। 1 मनका करने वाली कोशिका अनुपात: विरोधी CD3 / विरोधी CD28 लेपित चुंबकीय मोती एक 1 पर जोड़ रहे हैं। सेल (यानी, मनका करने वाली कोशिका अनुपात) प्रति मोतियों की संख्या बढ़ाने से उत्तेजना 25,26 की तीव्रता में वृद्धि होगी। मोती धो रहे हैं और कोशिकाओं को उनकी अलावा पहले पूरा RPMI में फिर से निलंबित कर दिया। ध्यान दें कि trypanनीले रंग के मोती दाग।
  2. संस्कृति 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 12-72 घंटे के लिए कोशिकाओं स्वचालित सेल काउंटर के साथ विश्लेषण करने से पहले।

5. स्वचालित सेल काउंटर डेटा संग्रह

  1. नमूना चलाने से पहले, सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को धीरे एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट झुरमुटों से बचने के लिए के साथ मिश्रित कर रहे हैं। यह उनकी वृद्धि की चिपचिपाहट की वजह से सक्रिय लिम्फोसाइटों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है।
    1. संस्कृतियों है कि, विरोधी CD3 / CD28 मोतियों के साथ सक्रिय कर रहे हैं pipetting के बाद के लिए, एक 1.5 मिलीलीटर या 2 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब नमूना हस्तांतरण। 1-2 मिनट के लिए एक चुंबक पर ट्यूब रखकर मोती अलग करें। विश्लेषण के लिए कोशिकाओं से युक्त सतह पर तैरनेवाला का प्रयोग करें।
      नोट: संस्कृति के माध्यम में मौजूद सीरम से आराम कर रहा कोशिकाओं के किसी भी पूर्व सक्रियण के लिए खाते में 1 घंटा के भीतर दोनों आराम कर रही है और सक्रिय कोशिकाओं का विश्लेषण। पीएमए के 12 घंटे के बाद / उत्तेजना ionomycin, सेल आकार में एक छोटे से वृद्धि detectable था (चित्रा 2
  2. एक नमूना कप में सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर स्थानांतरण और मैनुअल में दिए गए निर्देशों के अनुसार स्वचालित सेल काउंटर के माध्यम से इसे चलाते हैं।
    नोट: परीक्षण के प्रत्येक के लिए, सेल संस्कृति के 1 मिलीलीटर (2 मिलीलीटर की अधिकतम) की एक न्यूनतम इस्तेमाल किया जाना चाहिए। स्वचालित सेल काउंटर सेल निलंबन के साथ trypan नीले रंग मिश्रण करने के लिए एक सिरिंज का उपयोग करता है और एक क्षेत्र है कि imaged और सॉफ्टवेयर से विश्लेषण किया जाता है पर सेल trypan नीले रंग के मिश्रण से गुजरता है। सॉफ्टवेयर trypan नीले रंग से सना हुआ कोशिकाओं का पता लगाता है, प्रत्येक कोशिका के चारों ओर एक चक्र आ रही है, और व्यास निर्धारित करता है। 100 छवियों प्रत्येक नमूने से एकत्र कर रहे हैं, और सेल व्यवहार्यता और आकार निर्धारित कर रहे हैं। सेल काउंटर यहां इस्तेमाल का पता लगाने सीमा 5 माइक्रोन से कम एक सीमा होती है।
  3. आगे के विश्लेषण के लिए एक स्प्रेडशीट के लिए चलाने के प्रत्येक से स्थानांतरण डेटा।
  4. एक 1 का उपयोग कर एक नियमित आधार पर डिवाइस जांच6 माइक्रोन और 8 मीटर व्यास polystyrene मोतियों की मिलीलीटर नमूना।
    नोट: वास्तविक मनका आकार प्रत्येक बैच के लिए निर्माता द्वारा मापा इस्तेमाल किया जाना चाहिए, न कि नाममात्र का आकार। क्योंकि इन व्यास आराम की उम्मीद व्यास और सक्रिय टी कोशिकाओं के करीब हैं 6 और 8 माइक्रोन मोती सुविधाजनक हैं (चित्रा 1 देखें)।

6. डेटा और सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. उचित सांख्यिकीय और रेखांकन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण।
    नोट: (: 5 माइक्रोन से 70 माइक्रोन रेंज) प्रत्येक रन के लिए स्प्रेडशीट प्रत्येक व्यास के साथ कोशिकाओं की संख्या में शामिल है। एक 17 मीटर व्यास ऊपर कोशिकाओं धूल कणों और छोटे बुलबुले, साधन के रूप में व्यवहार्य कोशिकाओं पढ़ा जा सकता है जो बाहर करने के लिए विश्लेषण से हटा रहे हैं।
  2. असमान विचरण के साथ डेटा सेट के लिए वेल्च की टी-परीक्षण का उपयोग का परीक्षण परिकल्पना प्रदर्शन; परिणाम सांख्यिकीय महत्वपूर्ण है, तो पी <0.001 माना जाता है। सूत्र का इस्तेमाल किया था,

    कहा पे 2 समीकरण तथा 3 समीकरण नमूना साधन हैं, 4 समीकरण तथा 5 समीकरण नमूना प्रसरण हैं, और समीकरण 6 तथा समीकरण 7 प्रत्येक डेटा सेट के लिए नमूना आकार रहे हैं। स्वतंत्रता के अंशों की संख्या परंपरागत ढंग से प्रत्येक तुलना के लिए दो नमूना आकार के छोटे का उपयोग कर अनुमान लगाया गया है। बार रेखांकन ± SEM के मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं।

7. प्लीहा टी-लिम्फोसाइट प्रसार परख

  1. टी सेल प्रसार को मापने के लिए एक MTS- या MTT आधारित वर्णमिति प्लेट पाठक प्रसार परख का उपयोग।
    ध्यान दें: परख का आधार हैएमटीएस tetrazolium यौगिक (ओवेन अभिकर्मक) घुलनशील formazan उत्पाद के लिए कमी, संभावना NADPH या NADH द्वारा डी पाचन सक्रिय कोशिकाओं में डिहाइड्रोजनेज एंजाइमों द्वारा उत्पादन किया।
  2. एक hemocytometer के साथ शुद्ध टी कोशिकाओं की गणना और 1 एक्स 10 6 सेल / मिलीलीटर की एक अंतिम घनत्व पर पूरा RPMI 1640 में उन्हें फिर से निलंबित।
    नोट: 1 मिमी डीटीटी इस स्तर पर कोशिकाओं को जोड़ा जा सकता है।
  3. पीएमए के साथ कोशिकाओं को सक्रिय और परीक्षण दवाओं के साथ-साथ ionomycin, यदि आवश्यक हो, और (4 कदम के लिए समान) मिश्रण धीरे।
  4. प्लेट एक 96 अच्छी तरह से सेल संस्कृति इलाज थाली के प्रत्येक कुएं में कोशिकाओं के 100 μl और 48 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। पृष्ठभूमि absorbance के एक पढ़ने प्राप्त करने के लिए एक अच्छी तरह से कोशिकाओं के बिना RPMI 1640 मीडिया के 100 μl जोड़ें।
  5. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए MTS-आधारित अभिकर्मक के 20 μl जोड़ें और 4 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  6. एक प्लेट रीडर का उपयोग कर 490 एनएम पर absorbance नाप लो। द एbsorbance माप अच्छी तरह से प्रत्येक में पाचन सक्रिय कोशिकाओं की संख्या के अनुरूप हैं।
    नोट: यदि जरूरत पृष्ठभूमि के स्तर को घटाना। पृष्ठभूमि absorbance के मूल्यों प्रकाश में संस्कृति के माध्यम से, सीरम, बाहरी पीएच, और एमटीएस अभिकर्मक जोखिम की अवधि के प्रकार पर निर्भर करते हैं। एमटीएस आधारित अभिकर्मकों प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं, और कई घंटे के लिए प्रकाश के संपर्क में उच्च पृष्ठभूमि absorbance के मूल्यों में हो सकता है।

Representative Results

हम पीएमए, एक phorbol एस्टर, और ionomycin, एक कैल्शियम ionophore के साथ उत्तेजना के दौरान लिम्फोसाइट विस्फोट गठन तुलना करने के लिए इस परख के लिए इस्तेमाल किया। चित्रा 1 ए औषधीय सक्रिय प्लीहा टी कोशिकाओं आराम का व्यास और की आवृत्ति वितरण से पता चलता। ~ 2 दिनों के लिए पीएमए / ionomycin के साथ कोशिकाओं के उपचार बड़ा व्यास (देखें, उदाहरण के संदर्भ 4 के लिए) की ओर वितरण का मंझला में एक महत्वपूर्ण बदलाव में हुई। छोटे व्यास के साथ कोशिकाओं की संख्या के हिसाब से कम हो गया था। आदेश में पता लगाना है कि हमारे डिवाइस सही व्यास सूचना में, हम 6 माइक्रोन की polystyrene मोती के साथ दो calibrations और 8 माइक्रोन व्यास (देखें सामग्री तालिका) का प्रदर्शन किया। आंकड़े 1 बी और एक 8 माइक्रोन मानक और आराम कर रही टी एक 6 माइक्रोन मानक के साथ आरोपित कोशिकाओं के साथ आरोपित सक्रिय टी कोशिकाओं से 1C शो रीडिंग। आकृति-1 डी नियंत्रण मनका आकार निर्माता द्वारा रिपोर्ट हमारी स्वचालित सेल काउंटर के साथ मापा मंझला व्यास के खिलाफ साजिश रची पता चलता है। ऐसा लगता है कि 6 माइक्रोन आकार थोड़ा 5 माइक्रोन की एक निचली सीमा होने के साधन के माप सीमा के कारण, हमारे माप में overestimated था शायद। हालांकि, गणना सेल काउंटर माप से मनका व्यास के मानक विचलन मानक विचलन निर्माता द्वारा सूचना के साथ समझौते में किया गया था। हम इन प्रयोगों है कि इस डिवाइस मज़बूती से इस्तेमाल किया जा सकता है आराम और माइटोजन उत्तेजित माउस टी सेल आकार की तुलना करने के लिए और डिवाइस सही वास्तविक सेल व्यास उपाय कर सकते हैं कि से समाप्त।

हम तो पीएमए एकाग्रता पर मतलब व्यास वृद्धि की निर्भरता का परीक्षण करने के लिए रवाना किया और पाया कि, 250 एनएम के एक एकाग्रता तय ionomycin में पीएमए प्रभाव काफी अपनी एकाग्रता च उठाने से नहीं बदला गया थाROM 2 से 250 एनजी / एमएल (2A चित्रा)। एमटीएस आधारित परख का उपयोग करना, हम 50 और 250 एनजी / एमएल पीएमए पर टी-सेल प्रसार मापा जाता है और हमारे सेल व्यास डेटा के साथ कोई सराहनीय अंतर (चित्रा -2), समझौते में पाया। Calcineurin अवरोध दवाओं Cyclosporine ए (300 एनएम) और FK506 (1 एनएम) दोनों blastogenesis (चित्रा 2 बी) और प्रसार (चित्रा -2) को दबा दिया। निषेध दोनों ही मामलों में पूरा नहीं किया गया था, लेकिन। माप 12 घंटा प्रदर्शन के बाद पीएमए / ionomycin इसके अलावा 50 एनजी / एमएल और 250 एनजी / एमएल पीएमए, क्रमशः (चित्रा 2 डी) के लिए व्यास में एक 7.2% और 6.8% वृद्धि देखी गई। इन दो सांद्रता में आकार बढ़ता है, काफी अलग नहीं थे के रूप में 48 घंटा उत्तेजना (2A चित्रा के लिए तुलना) के लिए मामला था।

सेल व्यास और पीएमए / ionomycin उत्तेजना के 48 घंटे के बाद आराम कर से एकत्र आंकड़ों सक्रिय टी कोशिकाओं में संक्षेप हैं 2 और 1.9 x 10 -4 NL, क्रमशः थे। मतलब सतह क्षेत्र और सक्रिय टी कोशिकाओं की मात्रा 300.6 माइक्रोन 2 और 5.9 x 10 -4 NL, क्रमशः थे। सभी सक्रिय कोशिकाओं के लिए समग्र औसत व्यास वृद्धि 40.92% (1 टेबल) था।

सीएसए, FK506, rapamycin, FTY720, और ट्राम-34: हम भी अन्य रासायनिक यौगिकों immunosuppressive होने की सूचना परीक्षण किया। चित्रा 3 में, सेल आकार माप अभाव में आराम कर में प्राप्त और सक्रिय टी कोशिकाओं और इन दवाओं की उपस्थिति दिखाई जाती हैं। सीएसए और FK506, जो calcineurin निर्भर सक्रिय टी कोशिकाओं (NFAT) 27,28 के परमाणु कारक लक्ष्य, सबसे शक्तिशाली थे लगभग 72% (चित्रा 3 ए और 3 बी) द्वारा blastogenic प्रतिक्रिया बाधा। दिलचस्प है, साथबढ़ी हुई पीएमए सांद्रता, सीएसए और FK506 की शक्ति से थोड़ा गिरा दिया, भले ही वहाँ इन दवाओं (चित्रा 2A और 2 बी) के अभाव में कोई अतिरिक्त सेल व्यास वृद्धि हुई थी। Rapamycin, एक immunosuppressant कि rapamycin (mTOR) 29,30 के स्तनधारी लक्ष्य को रोकता है, एक उदारवादी लेकिन सांख्यिकीय महत्वपूर्ण प्रभाव (चित्रा 3 ए, 3 बी और 3 सी) के लिए किया था। FTY720 एक sphingosine 1-फॉस्फेट रिसेप्टर agonist कि संचलन 31 में लिम्फोसाइट निकास को रोकता है और हाल ही में TRPM7, एक केशन चैनल अत्यधिक टी में व्यक्त 32 लिम्फोसाइटों को बाधित करने के लिए पाया गया है। दोनों FTY720 और rapamycin blastogenesis पर एक तुलनीय प्रभाव नहीं पड़ा, यह व्यास में एक 52% वृद्धि की औसत से लगभग 34% तक कम करने (चित्रा 3 ए और 3 बी)। ट्राम 34 कैल्शियम सक्रिय पोटेशियम चैनल KCa3.1 33 के एक अवरोधक है। 700 एनएम पर परीक्षण किया गया, ट्राम -34 murine टी कोशिकाओं में अप्रभावी था, मैंn हाल ही में एक मानव टी सेल प्रसार अध्ययन के अनुसार; अपनी शक्ति प्रकृति और mitogenic उत्तेजना 34 (चित्रा 3 ए और 3 बी) के बल पर निर्भर हो सकता है। 700 एनएम ट्राम 34 हमारे पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगों में KCa3.1 चैनलों को रोकने में प्रभावी था (डेटा) नहीं दिखाया। इस तुलना 48 घंटा में ही प्रयोग के भीतर कई परीक्षणों में आराम कर रही है और दवा उजागर कोशिकाओं के बीच बनाया गया था। जब rapamycin और सीएसए एक साथ इस्तेमाल किया गया, blastogenesis पूरी तरह से हिचकते था (चित्रा 3 सी)।

विरोधी CD3 / विरोधी CD28 लेपित 72 घंटे के लिए चुंबकीय मोतियों के साथ murine टी कोशिकाओं की सक्रियता औसत व्यास, जो सीएसए की उपस्थिति (चित्रा 3 डी) में 5% से कम हो गया था में एक 27% वृद्धि का उत्पादन किया। 48 घंटे के लिए पीएमए / ionomycin सक्रियण पर मानव कोशिकाओं mononuclear व्यास में 33% की वृद्धि हुई है, और सीएसए की उपस्थिति में सक्रियण 23% के जवाब में कमी आई है (

आकृति 1
चित्रा 1: murine प्लीहा टी-सेल व्यास की आवृत्ति वितरण। (ए) काले कॉलम आराम से संकेत मिलता है और लाल कॉलम पीएमए / ionomycin सक्रिय (48 घंटा) कोशिकाओं से संकेत मिलता है। (बी) के सक्रिय प्लीहा टी एक 8 माइक्रोन कण आकार अंशांकन मानक पर आरोपित कोशिकाओं का वितरण। (सी) टी कोशिकाओं एक 6 माइक्रोन अंशांकन मानक पर आरोपित आराम कर के वितरण। कोशिकाओं और मोतियों का इस्तेमाल किया संख्या बक्से में संकेत कर रहे हैं। (डी) माध्य व्यास सेल काउंटर से मापा मनका व्यास निर्माता द्वारा रिपोर्ट के खिलाफ साजिश रची। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

= "1">-पृष्ठ के भीतर चित्र 2
चित्रा 2: पीएमए एकाग्रता पर murine टी सेल सक्रियण की निर्भरता। (ए) टी कोशिकाओं या तो इलाज या 2, 50 के साथ इलाज किया, और 250 एनजी / एमएल पीएमए एक निश्चित एकाग्रता ionomycin (250 एनएम) का मतलब व्यास। आराम का (बी) सेल काउंटर मापन और सक्रिय (2, 50, 250 एनजी / एमएल पीएमए) टी अभाव में कोशिकाओं और 300 एनएम सीएसए या 1 एनएम FK506 की उपस्थिति। पीएमए 50 और 250 एनजी पर (सी) एमटीएस प्रसार परख / एमएल अभाव में 250 एनएम ionomycin और 300 एनएम सीएसए की उपस्थिति के साथ। महत्वपूर्ण अंतर (पी <0.001) तारों के साथ संकेत कर रहे हैं। n परीक्षणों की कुल संख्या है। डेटा 3 चूहों से अलग कोशिकाओं से कर रहे हैं। (डी) आराम की सेल व्यास और सक्रिय टी कोशिकाओं (250 एनजी / एमएल पीएमए और 250 एनएम ionomycin) अभाव और 300 एनएम सीएसए की उपस्थिति में सक्रियता के बाद 12 घंटा। पलोड करें / 55212 / 55212fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: सीएसए के प्रभाव, FK506, FTY720, rapamycin, और सेल आकार पर ट्राम-34। (ए और सी) आराम और अभाव और दवाओं की उपस्थिति में पीएमए / ionomycin सक्रिय murine टी कोशिकाओं की औसत व्यास। सांद्रता बॉक्स में दिखाए जाते हैं। (बी) एक से डेटा आराम टी सेल व्यास प्रतिशत से अधिक वृद्धि के रूप में व्यक्त किया। लिम्फोसाइट सक्रियण 250 एनजी / एमएल पीएमए और 250 एनएम ionomycin के साथ प्रदर्शन किया गया था, और माप के 48 घंटे के बाद ले जाया गया। (डी) आराम और विरोधी CD3 के सेल काउंटर माप / CD28 सक्रिय टी कोशिकाओं, अभाव और 300 एनएम सीएसए की उपस्थिति में सक्रियता के बाद 72 घंटा।rge.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: माइटोजन उत्तेजना पर मानव PBMCs में Blastogenesis। (ए) काले कॉलम आराम से संकेत मिलता है और लाल कॉलम सक्रिय PBMCs संकेत मिलता है। (बी) के आराम का मतलब व्यास और अभाव में सक्रिय PBMCs और 300 एनएम सीएसए की उपस्थिति। प्रकोष्ठों 250 एनजी / एमएल पीएमए और 250 एनएम ionomycin के साथ सक्रिय रहे थे, और माप के सक्रियण के 48 घंटे के बाद ले जाया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

स्तंभ 1 आराम सक्रिय सीएसए 100 एनएम सीएसए 200 एनएम
औसत व्यास 6.94 माइक्रोन 9.78 माइक्रोन 8.19 माइक्रोन 7.92 माइक्रोन
व्यास में औसत वृद्धि 40.92% 17.88% 14.09%
औसत सतह क्षेत्र 151.37 μm² 300.61 μm² 210.56 μm² 197.22 μm²
सतह के क्षेत्र में औसत वृद्धि 98.59% 39.00% 30.16%

तालिका 1: औसत सेल व्यास और सतह के क्षेत्र में रिश्तेदार बढ़ जाती है का सारांश। माप 250 एनजी / एमएल पीएमए और 250 एनएम ionomycin के साथ सक्रियता के बाद 48 घंटा प्रदर्शन किया गया।

Discussion

यहाँ, हम तेजी से पता लगाने और टी-सेल blastogenic परिवर्तन की मात्रा का ठहराव के लिए एक तकनीक एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग का वर्णन है। हमारी शर्तों (250 एनजी / एमएल पीएमए और 250 एनएम उत्तेजना ionomycin) के तहत, कोशिका की सतह क्षेत्र की दो गुना और सक्रियण के 48 घंटे के बाद मात्रा तीन गुना वृद्धि की गई थी। परख पर्याप्त सक्रियण के पहले 12 घंटा, जहां सेल की मात्रा आराम कर (चित्रा 2 डी) की तुलना में केवल 1.25 गुना वृद्धि हुई दौरान नष्ट पता लगाने के लिए संवेदनशील है। विरोधी CD3 और विरोधी CD28 एंटीबॉडी लेपित चुंबकीय मोतियों का उपयोग टी सेल सक्रियण के एक अधिक physiologically प्रासंगिक तंत्र एक महत्वपूर्ण blastogenic प्रतिक्रिया, मात्रा में औसतन 2.3 गुना वृद्धि (सक्रियता के बाद 72 घंटा, चित्रा 3 डी) के साथ उत्पादन किया। मानव कोशिकाओं mononuclear 48 घंटा (चित्रा 4) के लिए पीएमए पर मात्रा में 2.6 गुना परिवर्तन / उत्तेजना ionomycin दिखाया। आईसीआर माउस प्लीहा टी सेल औसत व्यास और मात्रा होने के लिए निर्धारित किया गया है6.9 माइक्रोन और 1.9 x 10 -4 NL, क्रमशः। मानव PBMCs (एक स्वस्थ दाता से) 7.7 माइक्रोन के एक औसत व्यास और 2.7 x 10 -4 nl के एक औसत मात्रा था। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम भी टी कोशिकाओं को सक्रिय करने की क्षमता के लिए पीएमए की सांद्रता में वृद्धि का परीक्षण किया। ये एकल कोशिका परिणाम समान पीएमए सांद्रता पर प्रदर्शन प्रसार assays के साथ संगत कर रहे थे।

सेल प्रसार को प्रभावित करने के लिए सूचित कई यौगिकों का परीक्षण किया गया: FTY720 31,32; immunosuppressants Cyclosporine ए, FK506, और 27,28 rapamycin; और ट्राम-34, कैल्शियम सक्रिय KCa3.1 चैनलों 33,35 के एक अवरोधक। हमने पाया है कि परीक्षण किया सांद्रता में, blastogenesis के सबसे शक्तिशाली अवरोधकों सीएसए और FK506 थे। Rapamycin blastogenesis पर एक छोटी लेकिन महत्वपूर्ण सांख्यिकीय दमनकारी प्रभाव नहीं पड़ा। ट्राम 34, दूसरे हाथ पर, blastogenesis प्रभावित नहीं किया।

सीएसए दोनों blastogenesis और पी दबा दियाroliferation, लेकिन पूरी तरह से नहीं (चित्रा 2 बी और 2 सी), प्रदर्शन है कि स्वचालित सेल काउंटर माप टी सेल प्रसार में दवा क्षमता का अच्छा सहसंबंधी है। एक साथ सीएसए के साथ rapamycin की उपस्थिति में, blastogenesis पूरी तरह से हिचकते था, सुझाव है कि संयोजन में NFAT- और mTOR की मध्यस्थता रास्ते पूरी तरह से पीएमए / ionomycin (चित्रा 3 सी) के साथ mitogenic उत्तेजना पर टी सेल वृद्धि के लिए खाते सकता है।

कुछ प्रसार assays के गतिशील रेंज सीमित है (देखें चित्र 2)। ऐसा ही एक हम इस्तेमाल किया है (चित्रा 2 सी), एक संकेत है कि apoptotic और परिगलित कोशिकाओं से योगदान भी शामिल है रिपोर्ट के रूप में प्रसार assays। के रूप में माप केवल व्यवहार्य कोशिकाओं से संबंधित स्वचालित व्यास परिवर्तन माप है कि सीमा नहीं है। सेल व्यवहार्यता स्वस्थ, व्यवहार्य कोशिकाओं से trypan नीले रंग के दाग के बहिष्कार से मूल्यांकन किया है। आकार माप में, आगे का उपयोग करनक़ल सेल भेदभाव प्रवाह cytometry में प्रकाश तितर बितर समस्याग्रस्त 22 हो सकती है। स्वचालित सेल काउंटर माप में, कोई नक़ल आबादी (चित्रा 1) मिला था। इसके अलावा, माप पर्याप्त रूप से 100 और 200 एनएम Cyclosporine (1 टेबल) और mitogenic उत्तेजना के 12 घंटा (चित्रा 2 डी) के भीतर blastogenesis का पता लगाने के प्रभाव के बीच भेद करने के लिए सटीक था।

इस नए परख नमूनों की कम संख्या के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। अप करने के लिए 15 नमूने 1 घंटे में मापा जा सकता है। हालांकि, परख की अपनी सीमाएं हैं, जिनमें से अधिकांश कम किया जा सकता है। हालांकि इसे प्रभावी ढंग से सेल व्यास में छोटे (<1 माइक्रोन) के अंतर को हल कर सकते हैं, मशीन मॉडल हम इस्तेमाल 5 माइक्रोन की एक कम का पता लगाने सीमा है। इस सीमा, बहुत छोटे सेल आकार की overestimation पैदा कर सकता है, क्योंकि यह प्रभावी रूप से छोटे व्यास के साथ सभी कोशिकाओं को शामिल नहीं है। हालांकि, सेल काउंटर के नए मॉडल का पता लगाने ताड़ना है~ 2 माइक्रोन के बच्चों, जो इस समस्या को कम करना चाहिए। अगर वहाँ नमूने में बहुत ज्यादा मलबे है, साधन के रूप में उन्हें व्यवहार्य कोशिकाओं को मानते हैं। इसके अतिरिक्त, हवा के बुलबुले कभी कभी प्रवाह सेल में मिलता है और मशीन द्वारा कब्जा कर लिया सेल छवियों की विकृति पैदा कर सकता है। विरूपण व्यवहार्यता निर्धारण को प्रभावित करने के लिए प्रकट नहीं होता है, लेकिन यह मापा व्यास को प्रभावित कर सकते हैं। इसलिए, यह सिफारिश की है कि सभी छवियों हवा के बुलबुले के लिए प्रयोगकर्ता द्वारा जाँच की जा प्रत्येक परीक्षण से डेटा के विश्लेषण के लिए स्वीकार कर रहे हैं पहले। चूंकि यह सॉफ्टवेयर केवल कोशिकाओं के आसपास हलकों आ रही है, गैर गोलाकार कोशिकाओं के व्यास लंबे अक्ष की दिशा में टेढ़ी हो सकता है, गैर गोलाकार कोशिकाओं के लिए परख कम उपयुक्त बना रही है।

इस परख प्रसार assays, जो कुछ ही घंटे की आवश्यकता की तुलना में जल्दी है, नमूना के अनुसार लगभग 4 मिनट ले रही है। डेटा संग्रह भी सॉफ्टवेयर डिवाइस के साथ शामिल का उपयोग कर के बजाय सरल है। सॉफ्टवेयर एक सपा को माप डेटा निर्यात कर सकते हैंविश्लेषण के लिए readsheet। अंत में, यह एक एकल कोशिका, के रूप में आबादी, माप करने का विरोध किया है; दोनों blastogenesis और प्रसार मापा जाता है; और इसके साथ ही व्यवहार्य और मृत कोशिकाओं के बीच अलग। यह एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया माउंट करने के लिए उनकी क्षमता के लिए विभिन्न माउस उपभेदों का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। परख भी मानव दाताओं (चित्रा 4) से टी कोशिकाओं में blastogenesis की माप के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया जा सकता है, और यह भी अन्य प्रकार की कोशिकाओं में इस्तेमाल किया जा सकता है।

सेल की मात्रा बढ़ जाती है चयापचय के नियमन में योगदान करने के लिए जाना जाता है: सेल सूजन glutamine प्रेरित ग्लाइकोजन संश्लेषण और hepatocytes 36,37 में lipogenesis को उत्तेजित करता है। न्यूट्रोफिल, 35-60% के पलायन से जुड़े मात्रा बढ़ जाती है, जबकि प्रदर्शित कीमोटैक्टिक एजेंटों 10-15% प्रेरित 38-40 सूजन। वर्तमान परख संभावित इन प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI-1640  Lonza BW12-702F
40 μm nylon cell strainers  Thermo Fisher Scientific 22363547
nylon wool fiber columns Polysciences, Inc.  21759-1
50 ml conical tubes  The Lab Depot TLD431697
6-well cell culture treated plates USA Scientific CC7682-7506
96-well cell culture treated plates Thermo Fisher Scientific 130188
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher BioReagents BP231-100
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay  Promega G3582 MTS based assay
Cyclosporine A Sigma-Aldrich 30024
FK506 Cayman Chemical Company 104987-11-3
Rapamycin Santa Cruz Biotechnology sc-3504
TRAM-34 Sigma-Aldrich T6700
FTY720 Sigma-Aldrich SML0700
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 Gibco 11456D
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)  Acros Organics  356150010
Ionomycin calcium salt Sigma-Aldrich I0634
Penicillin-Streptomycin MP Biomedicals  ICN1670049 100x stock
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS)  HyClone SH30378.02 10x stock
1,4-dithiothreitol (DTT)  Research Products International 12/3/3483 reducing agent
8 µm micro particle size standard  Sigma-Aldrich 84192-5ML-F Actual  8.02 µm
6 µm micro particle size standard  Sigma-Aldrich 89756-5ML-F Actual 6.084 µm
Single magnetic separation stand for 1.5 - 2 ml tube V&P Scientific, Inc. VP772F5
Cell culture incubator Forma Scientific  3110
Synergy H1 hybrid reader  Bio Tek BTH1M
Vi-CELL cell viability analyzer  Beckman Coulter 731050

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Gibson, J. N., Beesetty, P.,… More

Gibson, J. N., Beesetty, P., Sulentic, C., Kozak, J. A. Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs. J. Vis. Exp. (118), e55212, doi:10.3791/55212 (2016).

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