Abstract
Lymfocytproliferation som svar på antigeniska eller mitogen stimulering är en lätt kvantifierbara fenomen användbar för testning immunmodulerande (dvs., immunundertryckande eller immunstimulerande) kemiska föreningar och biologiska läkemedel. En av de tidigaste stegen under mitogenes är utvidgningen cell eller blastogen transformation, varefter cellvolymökningar före division. Det är vanligtvis påvisas i de första timmarna av T-lymfocyter stimulering. Här beskriver vi en snabb metod för att kvantifiera blastogenes i T-lymfocyter isolerade från musmjältar och humana perifera mononukleära blodceller (PBMC) med användning av en automatiserad cellräknare. Olika vanligen använda spridningsanalyser för det mesta är arbetskrävande och endast återspegla den totala populationen effekt snarare än enskilda cellulära effekter inom en population. Däremot ger den presenterade automatiserad celltalsräknare analys snabba, direkta och exakta mätningar av celldiameter som kan varaanvändas för att bedöma effektiviteten av olika mitogener och immunmodulerande läkemedel in vitro.
Introduction
T-lymfocyter är de primära celler som ansvarar för adaptiv immunitet hos däggdjur. Det är känt att de svarar på specifika antigena peptider som presenteras av MHC-molekyler på ytan av antigenpresenterande celler. Vid aktivering av en besläktad T-cellreceptor (TCR), förstorar cellen i en process som benämns blastogen transformation, eller blastogenes. Denna process är detekterbar i den första ~ 6 timmar efter stimulans anbringas en. Under blastogenes, volymerna enskilda T-celler ökar 2 till 4 gånger 2-6. Lymfocyter börjar föröka sig i en process som kallas klonal expansion, vars syfte är att generera så många kloner av antigen-specifika TCR-bärande celler som möjligt. Avkomman celler utövar då deras immunologiska funktion genom att differentiera i cytotoxiska (CD8 +) eller hjälpare (CD4 +) effektor-T-lymfocyter. Således, naiva T-lymfocyter i humant eller mus blod finns i G 0 (vila) fas av cellcykel och stöd minimal metabolisk aktivitet. Vid exponering för antigener eller mitogener, T-celler återinträda i cellcykeln, med en åtföljande stimulering av transkription och proteinsyntes 7-10. Mitogener, såsom forbol 12-myristat 13-acetat (PMA) och jonomycin stimulera lymfocyterna genom aktivering av proteinkinas C (PKC) och Ca2 + -beroende signaleringsvägar 1. Aktiveringen av T-celler med PMA / jonomycin kringgår TCR signaleringssteg.
In vitro proliferationsanalyser används allmänt för att utvärdera lymfocytfunktion och svar på stimuli. Spridning avläsningar vanligtvis tas en till tre dagar efter starten av T-cellstimulering och återspeglar den kollektiva tillstånd av hundratals eller tusentals celler. Potensen av olika mitogener och immunmodulerande läkemedel in vitro kan utvärderas genom att helt enkelt mäta förökningshastigheter i närvaro av dessa föreningar. Några av dessa enssays och deras begränsningar diskuteras nedan.
För direkt cellantal räkning, är det förfarande tidskrävande, med en hög sannolikhet för operatörsfel.
För DNA-syntes, den 3H-tymidininkorporering analys mäter DNA-syntes, men dess huvudsakliga begränsningen är dess farligheten. En icke-radioaktiv alternativ är BrdU, men utbudet av linjär respons för celltillväxt är begränsad, och antikroppsbehandling krävs, vilket ökar antalet steg i förfarandet 11,12.
För metabolisk aktivitet, tetrazoliumsalter (MTT, MTS, XTT, och WST-1) och resazurin färgämnesbaserade kolorimetriska analyser rapporterar den allmänna metaboliska tillstånd att dela cellpopulationer. Emellertid är MTT inte är löslig i odlingsmediet, vilket kräver ytterligare tvättsteg, vilket sålunda införliva fel i mätningen; XTT behöver ytterligare komponenter för att minska effektivt; MTS-, WST-1, och resazurin baserade mätningar påverkaed av odlingsmediet pH och dess komponenter serum, albumin eller fenolrött 13-16. Dessa analyser mäter inte det faktiska antalet viabla celler utan snarare uppskatta de kombinerade enzymaktiviteterna. Därför spridningen hastigheten kan inte bestämmas noggrant genom metaboliska analyser på grund av den icke-linjärt samband mellan antalet celler och färgämne minskning 12,17.
För mätning av ATP-koncentration, T-cellsaktivering-inducerade ökningar i ATP korrelerar med proliferation. Men en av de första stegen i T-cellsaktivering förhöjning av intracellulär ATP; många steg är bakom själva spridningen 17,18.
För färgämnesspädningsanalys, fläckar CFSE fluorescerande färgämne celler genom kovalent bindning till intracellulära proteiner. Färgämnet visar en proliferation beroende minskning av fluorescensintensitet, vilket kan spåra antalet celldelningar. Men på grund av kovalent proteinmärkning, funktioner dessaproteiner kan äventyras. Färgämnet är toxisk för cellerna vid högre koncentrationer. Vid lägre färgämneskoncentrationer, emellertid den initiala fluorescensintensiteten reduceras, vilket minskar det antal celldelningar som kan spåras. Dessutom, efter märkning med CFSE, det finns en spridning oberoende ~ 50% förlust av initial fluorescens under den första 24 till 48 h period, vilket begränsar det dynamiska området för denna analys 19,20.
De flesta av dessa analyser återspegla det kollektiva tillståndet för ett stort antal celler och kräver behandling av cellerna med fluorescerande färgämnen. Nekrotiska och apoptotiska celler kan också bidra till dessa mätningar, såvida de inte tas bort från analysen genom färgning med kemikalier eller antikroppar.
Lymfocyt blastogenes kan utvärderas genom en mängd olika metoder, såsom optisk mikroskopi eller flödescytometri 4,21,22. Här beskriver vi en snabb metod för att mäta T-cellstorlekar med användning av enn automatiserad cellräknare, som samlar cellbilder i realtid som lagras och kan analyseras på nytt vid ett senare tillfälle. I tillägg till storleksmätningar, ger denna anordning exakta cellantal och den procentuella andelen livsdugliga celler, såsom bestämts genom trypanblå fläck utslagning. Den anordning som används i detta protokoll är kommersiellt tillgängliga, och tillverkaren testade precisionen hos instrumentet med tre olika instrument och flera kontroller koncentration och lönsamhet. Resultaten av dessa studier visade en variationskoefficient som var i allmänhet under 6%. Som nämnts i protokollet, är enheten kalibreras regelbundet med 6 pm och 8 pm polystyren diameter pärlor. Fördelarna med användning av en cellräknare för att skilja mellan vilande T-celler och T-lymfoblaster baserade på celldiametern är lättheten att använda och den automatiserade typen av analys. Programvaran är kapabel att dra en cirkel runt varje cell och beräkningen av celldiametern. Dessutom imåldrar är synliga för operatören, som kan kontrollera riktigheten av instrumentet för att identifiera cellerna och korrekt rita en cirkel runt dem. I termer av begränsningar, kan instrumentet inte i sig skilja mellan skräp och celler; därför är det viktigt att operatören betraktar varje bild som den håller på att bearbetas. Det finns en potential för att införliva luftbubblor, vilket kommer att minska antalet användbara fält för analys; emellertid är detta sällsynt om det vanliga spolnings underhåll utförs.
I denna studie erhöll grupper av mjält-T-lymfocyter stimulerades med ionomycin och ökande koncentrationer av PMA under 12-48 h. PMA så låga koncentrationer som 2 ng / ml inducerade både en robust blastogen respons och betydande spridning. Mätningar av effekterna av flera läkemedel, såsom immunsuppressiva cyklosporin A (CsA), FK506 (takrolimus), och rapamycin (sirolimus), liksom jon kanalblockerare TRAM-34 och FTY720 (fingolimod), på blastogenes visade god överensstämmelse med rapporterade effekter på proliferation. Den blastogen svaret hos humana PBMC till PMA / jonomycin och murin T-cellsstimulering med anti-CD3 och anti-CD28-antikropp-belagda magnetiska pärlor mättes också.
Cellräknare analysen kvantifierar både blastogenes och proliferationshastigheten (celldensitet) samtidigt men separat, till skillnad från de ovan nämnda metoderna, som ser på en kombination av dessa effekter. De presenterade protokoll ger en snabb och robust teknik för att utvärdera styrkan av mitogena och immunmodulerande medel.
Protocol
Alla experiment utförs i enlighet med protokoll som godkänts av Wright State University Lab Animal Care and Use Committee och Institutional Review Board.
OBS: Mänskliga PBMC isoleras genom Ficoll-densitetsgradientcentrifugering metod 5.
1. Spleen Harvest
- Hus vuxna kvinnliga ICR möss i standardlaboratorieförhållanden med mat, vatten och sängkläder som är specifika för arten.
NOT: Djur hade en medelålder av 2,9 månader och en genomsnittlig vikt av 30,4 g vid tidpunkten för eutanasi. - På dagen för isolering (DOI), avliva djuren individuellt utan andra conspecific djur som finns. Göra allt för att säkerställa minimal stress musen. Avliva med användning av CO2 med sekundär halsdislokation för att säkerställa döden.
- Placera djuret, fortfarande inuti överförings bur, in i CO 2 kammare och start gasflödet vid 5 L / min. Denna flödeshastighet förflyttar syre vid den rekommenderade 10-30% per minut.
- Efter det att djuret är medvetslöst, öka CO 2 flödeshastigheten till 15 l / min. Kontrollera djuret för upphörande av andning och lämna i kammaren för ytterligare två minuter.
- Applicera halsdislokation med distraktion kraft för att säkerställa döden.
- Skörda mjälten från djur med användning av aseptisk teknik inom 10 minuter av död.
- Sterilisera två uppsättningar av sax och pincett för avlägsnande av mjälten i en autoklav ugn före användning. Sterilisera dissektion ytan genom att applicera 70% etanol.
- Applicera 70% etanol till musen buken. Genom att använda en uppsättning av sax och pincett, gör ett snitt i pälsen och huden från den vänstra sidan av buken, sedan dra isär och dra tillbaka huden för att avslöja bukhinnan. När utsatta, applicera 4% klorhexidin lösning innan du öppnar bukhinnan.
- Med användning av den andra uppsättningen av scissors och pincett, gör en 2- till 3-cm snitt längs den centrala delen av buken. Öppna bukhinnan och ta bort mjälten genom att skära bort viscerala bilagor och överflödigt fett. Placera mjälten i Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS).
2. Framställning av Raw Splenocyter
OBS: Utför alla steg under ett laminärt flöde biosäkerhet skåp med aseptisk teknik.
- Blöt de skördade mjältarna i 10 ml avjoniserat sterilt H2O under 5 min i en 10 cm odlingsskål för att lysera de ytnära erytrocyter.
OBS: Detta steg kan uteslutas om mjälten skadades under isolering. - För att frigöra splenocyterna, krossa mjälten mellan två steriliserade glasskivor (frostat sidan mot mjälten) över en ny 10 cm odlingsskål. Blanda med 10 ml RPMI-1640 kompletterat med 10% fetalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, 50 lU / ml penicillin och 50 | ig / ml streptomycin (nedan hänvisade till ens fullständigt RPMI).
- Filtrera celler genom en steril 40 | im nyloncellfilter in i ett nytt 10 cm odlingsskål för att avlägsna bindväv och skräp.
- Lyserar de återstående erytrocyter genom tillsats av 20 ml lyseringsbuffert bestående av 155 mM NH4CI, 10 mM NaHCOs 3, och 0,1 mM EDTA vid pH 7,4 och ~ 300 mOsm / L.
OBS: Osmolaliteten mäts med en fryspunkt eller en ångtrycksosmometer.- Överföra celler från 10-cm platta till ett 50 ml koniskt rör och centrifugera vid 250 xg under 10 min (4 ° C).
- Avlägsna supernatanten, tillsätt 20 ml lyseringsbuffert, och återsuspendera de pelleterade cellerna genom pipettering.
- Inkubera vid rumstemperatur i lyseringsbuffert i 10 min med försiktig skakning.
- Centrifugera i 10 min vid 250 xg (4 ° C) för att pelletera cellerna. Häll av lyseringsbuffert.
- Återsuspendera cellerna i 10 ml komplett RPMI och centrifugera igen (250 xg, 10 min, 4 ° C). Skivaard supernatanten.
- Återsuspendera splenocyterna i 2 ml komplett RPMI värmdes till 37 ° C för överföring till kolumnen nylonull fibern.
3. Rening av T-lymfocyter
- Tvätta nylon ull kolonnerna två gånger med 5 ml komplett RPMI. Inkubera vid 37 ° C i en 5% CO 2 cellodling inkubator under 1 timme.
OBS: Det är viktigt att hålla nylon ull blöt under hela experimentet och att använda komplett RPMI värms till 37 ° C för alla nylon ull isoleringssteg. - Lägg isolerade splenocyter till kolonnen och inkubera i 1 h för att låta de B-celler, fibroblaster, och accessoriska celler att vidhäfta till nylonull.
- Tillsätt 2 ml av RPMI innehållande splenocyterna in i kolonnen och passera igenom tills toppen av nylonull nås.
- Tillsätt 2 ml av komplett RPMI värmdes till 37 ° C på toppen av nylonull och passera mediet genom ullentills vätskenivån når den övre ytan.
- Tillsätt 3 ml varm fullständigt RPMI till kolonnen för att helt täcka nylonull.
- Inkubera den laddade kolonnen ostörd i en 37 ° C, 5% CO 2 cellodling inkubator under 1 timme.
- Eluera cellerna genom tvättning av kolonnen två gånger med 5 ml komplett RPMI. Utföra en ytterligare tvätt av de eluerade cellerna genom centrifugering.
- Fyll kolonnen till de bästa 2 gånger med fullständigt RPMI och låt lösningen i kolonnen för att strömma genom in i ett 50 ml sterilt koniskt rör.
OBS: Undvik att trycka eller stöta kolonnen, vilket kan rubba de B-celler, hjälpceller och fibroblaster som ansluter sig till nylon ull. - Samla genomströmning fraktionen och centrifugering vid 250 xg under 10 min (4 ° C) för att pelletera cellerna. Tvätta en gång med 10 ml komplett RPMI. Pellets cellerna igen (250 xg, 10 min, 4 ° C) och återsuspendera i 2 ml komplett RPMI.
- Mäta c ell densitet med användning av en hemocytometer och späd i fullständigt RPMI till 0,5 x 10 6 celler / ml.
- Utsäde 1 eller 2 ml alikvoter av celler i varje brunn i en 24- eller 6-brunnars cellodlingsplatta, respektive, och odla cellerna vid 37 ° C med 5% CO2.
OBS: 1 mM 1,4-ditiotreitol (DTT) kan tillsättas till varje brunn i detta skede för att förbättra T-cellöverlevnad. - Valfritt: Bekräfta effektivitet isolering protokollet genom flödescytometri. Detta protokoll ger normalt ~ 80% T-lymfocyter 23.
OBS: nylonull-renade celler innehåller ungefär 50% CD4 + och 23% CD8 + -celler. Att rena CD4 + och CD8 + subpopulationer ytterligare, kan utföras en enda immunomagnetisk utarmningssteg med användning av åtta-antikroppar och magnetiska kulor 24. Alternativt kan renare CD4 + och CD8 + T-cellpopulationer isoleras genom positivt eller negativt urval med specifika antikroppar.
- Fyll kolonnen till de bästa 2 gånger med fullständigt RPMI och låt lösningen i kolonnen för att strömma genom in i ett 50 ml sterilt koniskt rör.
- Aktivera T-lymfocyter inom 24 timmar av isolering genom tillsats av PMA och jonomycin kalciumsalt eller magnetiska kulor belagda med anti-CD3 och anti-CD28-antikroppar 23,25,26. Lägg experimentella läkemedel (t.ex. CsA, FK506, rapamycin, TRAM-34, och FTY720) vid tidpunkten för aktivering.
OBS: Här, PMA koncentrationer varierade från 2 till 250 ng / ml och jonomycin koncentrationen hölls vid 250 nM. Om möjligt bör spädningar framställas från stock alikvoter av varje läkemedel så att volymen till varje brunn av celler är ≥1 il för att säkerställa reproducerbarhet. Den anti-CD3 / anti-CD28-belagda magnetiska pärlor tillsätts vid ett 1: 1 bead-till-cell-förhållande. En ökning av antalet kulor per cell (dvs pärla-till-cell-förhållande) kommer att öka intensiteten av stimulering 25,26. Pärlorna tvättas och återsuspenderas i komplett RPMI före deras tillsats till cellerna. Observera att trypanblå fläckar pärlorna. - Kultur cellerna i 12-72 timmar vid 37 ° C med 5% CO2 före analys med den automatiska cellräknare.
5. Automatiserad Cell Counter datainsamling
- Innan du kör provet, se till att cellerna blandades försiktigt med en serologisk pipett för att undvika klumpar. Detta är särskilt viktigt för aktiverade lymfocyter på grund av deras ökade vidhäftningsförmågan.
- För kulturer som aktiveras med anti-CD3 / CD28 pärlor, efter pipettering, överföra provet till ett 1,5 ml eller 2 ml centrifugrör. Separera pärlorna genom att hålla röret på en magnet för 1-2 min. Använda supernatanten innehållande cellerna för analys.
OBS: Analysera både vilande och aktiverade celler inom en timme att ta hänsyn till en på förhand aktivering av vilande celler genom serum närvarande i odlingsmediet. Efter 12 timmar av PMA / jonomycin stimulering, kunde påvisas en liten ökning av cellstorleken (Figur 2
- För kulturer som aktiveras med anti-CD3 / CD28 pärlor, efter pipettering, överföra provet till ett 1,5 ml eller 2 ml centrifugrör. Separera pärlorna genom att hålla röret på en magnet för 1-2 min. Använda supernatanten innehållande cellerna för analys.
- Överföring 1 ml av cellsuspensionen i en provkopp och köra det genom automatiserad celltalsräknare enligt instruktionerna i bruksanvisningen.
OBS: För vart och ett av försöken, bör användas minst 1 ml (max 2 ml) av cellkultur. Den automatiserade cellräknaren använder en spruta för att blanda trypanblått med cellsuspensionen och passerar den cell trypanblått blandningen över ett fält som avbildas och analyseras av programvaran. Programvaran upptäcker trypan blåfärgade celler, ritar en cirkel runt varje cell, och bestämmer diametern. 100 bilder samlas in från varje prov, och cellviabiliteten och storlekar bestäms. Tröskeln till cellräknare som används här detekteringen har en undre gräns av 5 um. - Överför data från varje försök till ett kalkylprogram för vidare analys.
- Kalibrera enheten på regelbunden basis med användning av en 1ml prov av 6 pm och 8 pm polystyren diameter pärlor.
OBS: Den faktiska pärlstorlekar mäts av tillverkaren för varje parti ska användas, inte den nominella storleken. 6 och 8 ^ m pärlor är bekvämt eftersom dessa diametrar är nära de förväntade diametrarna hos vilande och aktiverade T-celler (se figur 1).
6. Data och statistisk analys
- Analysera data med hjälp av lämpliga statistiska och grafiska program.
OBS: kalkylblad för varje körning innehåller antalet celler med varje diameter (intervall: 5 | j, m till 70 | j, m). Cellerna ovanför en 17 um diameter bort från analysen för att utesluta dammpartiklar och små bubblor, som kan läsas som levande celler av instrumentet. - Utför hypotesprövning med hjälp av Welchs t-test för datauppsättningar med olika varians; Resultaten anses statistiskt signifikanta om p <0,001. Den formel som används var
var
och 
är medelvärden, 
och 
är urvalsvarianser, och 
och 
är urvalsstorlekar för varje datauppsättning. Antalet frihetsgrader är konservativt uppskattas med hjälp av den mindre av de två provstorlekar för varje jämförelse. Stapeldiagram presenteras som medelvärde ± SEM.
och 
är medelvärden, 
och 
är urvalsvarianser, och 
och 
är urvalsstorlekar för varje datauppsättning. Antalet frihetsgrader är konservativt uppskattas med hjälp av den mindre av de två provstorlekar för varje jämförelse. Stapeldiagram presenteras som medelvärde ± SEM. 7. mjälten T-lymfocyt proliferationsanalys
- Mäta T-cellsproliferation med användning av en MTS- eller MTT-kolorimetrisk plattläsare proliferationsanalys.
OBS: Analysen är basend på MTS tetrazoliumförening (Owens reagens) reduktion till löslig formazanprodukt, sannolikt av NADPH eller NADH produceras i metaboliskt aktiva celler av dehydrogenasenzymer. - Räkna renade T-celler med en hemocytometer och återsuspendera dem i fullständigt RPMI-1640 vid en slutlig densitet av 1 x 10 6 celler / ml.
OBS: 1 mM DTT kan tillsättas till cellerna i detta skede. - Aktivera cellerna med PMA och jonomycin tillsammans med testläkemedel, om så erfordras, och blanda försiktigt (liknande steg 4).
- Plattan 100 | il av cellerna i varje brunn i en 96-brunnars cellodlingsbehandlade plattan och inkubera vid 37 ° C med 5% CO2 under 48 timmar. Tillsätt 100 | il av RPMI-1640-media utan celler i en brunn för att erhålla en avläsning av bakgrunds absorbans.
- Tillsätt 20 | il av MTS-baserade reagens till varje brunn och inkubera vid 37 ° C med 5% CO2 under 4 h.
- Ta absorbansmätningar vid 490 nm med en plattläsare. absorbance mätningar motsvarar antalet metaboliskt aktiva cellerna i varje brunn.
OBS: Subtrahera bakgrundsnivåerna om det behövs. Bakgrunds absorptionsvärden beror på vilken typ av odlingsmedium, serum, yttre pH, och varaktigheten av MTS reagens exponering för ljus. MTS-baserade reagens är ljuskänslig, och exponering för ljus under flera timmar kan resultera i högre bakgrunds absorbansvärden.
Representative Results
Vi använde denna analys för att jämföra lymfocyter blast bildning under stimulering med PMA, en forbolester och jonomycin, en kalciumjonofor. Figur 1A visar fördelningen av diametrar vilande och farmakologiskt aktiverade mjält-T-celler frekvens. Behandling av celler med PMA / jonomycin för ~ 2 dagar resulterade i en betydande förändring i medianen av fördelningen mot större diameter (se t ex referens 4). Antalet celler med mindre diameter var därmed minskas. För att säkerställa att vår enhet rapporterade rätt diameter, utförde vi två kalibreringar med polystyrenpärlor av 6 pm och 8 pm diameter (se Material tabell). Figurerna 1B och 1C visar avläsningar från aktiverade T-celler överlagrade med en 8 pm standard och vilande T-celler överlagrade med en 6 pm standard. Figur1D visar styr pärla storlekar som rapporterats av tillverkaren avsatt mot mediandiameter mätt med vår automatiserad cellräknare. Det framgick att den 6 | im storlek var något överskattad i våra mätningar, förmodligen på grund av tröskelvärdesmätning av instrumentet som har en nedre gräns på 5 | j, m. Men standardavvikelsen för pärla diameter beräknas från mätningar cell disk var i överensstämmelse med standardavvikelsen rapporteras av tillverkaren. Vi drar slutsatsen från dessa experiment att denna enhet kan användas på ett tillförlitligt sätt att jämföra vila och mitogenstimulerade mus T-cellstorlekar och att anordningen kan mäta de faktiska celldiametrar.
Vi fortsatte sedan att testa beroende ökar medeldiameter på PMA koncentration och fann att vid en fast ionomycin koncentration av 250 nM, PMA effekten inte ändrats nämnvärt genom att höja dess koncentration from 2 till 250 ng / ml (Figur 2A). Använda MTS-baserad analys, mätt vi T-celltillväxt vid 50 och 250 ng / ml PMA och fann ingen märkbar skillnad (figur 2C), i överensstämmelse med data våra celldiameter. Den kalcineurin-hämmare cyklosporin A (300 nM) och FK506 (1 nM) undertryckte både blastogenes (figur 2B) och spridning (figur 2C). Inhibition inte fylla i båda fallen dock. Mätningar som utförs 12 timmar efter PMA / jonomycin Dessutom visade en ökning med 7,2% och 6,8% i diameter för 50 ng / ml och 250 ng / ml PMA, respektive (figur 2D). Storlek ökar vid dessa två koncentrationer var inte signifikant olika, vilket var fallet för 48 h stimulering (jämför med figur 2A).
data cell diameter som samlats in från vilande och aktiverade T-celler efter 48 timmar av PMA / jonomycin stimulering sammanfattas i
Vi testade även andra kemiska föreningar rapporterats vara immunsuppressiv: CSA, FK506, rapamycin, FTY720 och spårvagn-34. I figur 3, cellstorleksmätningar erhölls i vilande och aktiverade T-celler i frånvaro och närvaro av dessa läkemedel är visade. CsA och FK506, som riktar sig mot kalcineurin-beroende nukleär faktor av aktiverade T-celler (NFAT) 27,28, var den mest potenta, hämmar blastogen respons med nästan 72% (figur 3A och 3B). Intressant, medökade PMA koncentrationer styrkan av CsA och FK506 sjunkit något, även om det fanns ingen ökning ytterligare celldiameter i frånvaro av dessa läkemedel (Figur 2A och 2B). Rapamycin, ett immunsuppressivt som hämmar mammalian target of rapamycin (mTOR) 29,30, hade en måttlig men statistiskt signifikant effekt (Figur 3A, 3B och 3C). FTY720 är en sfingosin 1-fosfat-receptoragonist som hämmar lymfocyt avstigning i omlopp 31 och har nyligen visat sig hämma TRPM7, en katjon kanal starkt uttryckt i T-lymfocyter 32. Både FTY720 och rapamycin hade en jämförbar effekt på blastogenes, reducera den från medelvärdet av en ökning i diameter 52% till ca 34% (Figur 3A och 3B). TRAM-34 är en blockerare av kalciumaktiverade kaliumkanalen KCa3.1 33. Testad vid 700 nM, TRAM-34 var ineffektiv i murina T-celler, in enligt en nyligen human T-cellproliferation studien; dess potens kan bero på naturen och styrkan hos mitogen stimulering 34 (figur 3A och 3B). 700 nM TRAM-34 var effektiv i att blockera KCa3.1 kanaler i våra patch clamp elektrofysiologi experiment (data ej visade). Denna jämförelse gjordes mellan vila och drog exponerade celler i flera studier inom samma experiment på 48 timmar. När rapamycin och CsA användes tillsammans, blastogenes inhiberades fullständigt (Figur 3C).
Aktivering av murina T-celler med anti-CD3 / anti-CD28-belagda magnetiska pärlor för 72 h gav en ökning av den genomsnittliga diametern, som minskades till 5% i närvaro av CsA (figur 3D) 27%. Humana mononukleära celler vid PMA / jonomycin aktivering under 48 timmar ökade i diameter med 33%, och aktivering i närvaro av CsA minskade svaret till 23% ( inom-page = "1"> Tabell 1: Sammanfattning av medelcelldiameter och relativa ökningar i ytarea. Mätningarna utfördes 48 timmar efter aktivering med 250 ng / ml PMA och 250 nM jonomycin. 
Figur 1: Frekvensfördelningar av murina mjält-T-cells diametrar. (A) Black kolumner indikerar vila och röda kolumner indikerar PMA / jonomycin-aktiverade (48 h) celler. (B) Fördelningen av aktiverade mjält-T-celler överlagrade på en 8 pm partikelstorlek kalibreringsstandard. (C) Fördelningen av vilande T-celler överlagrade på en 6 pm kalibreringsstandard. Antalet celler och pärlor användes är indikerade i lådor. (D) Median diameter mäts av cellräknare avsatt mot pärldiametern rapporteras av tillverkaren. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 2: Beroendet av murin T-cell-aktivering på PMA koncentrationen. (A) medeldiametrar av T-celler antingen obehandlade eller behandlade med 2, 50, och 250 ng / ml PMA till ett fast jonomycin koncentration (250 nM). (B) Cell motverka mätningar av vilande och aktiverade (2, 50, 250 ng / ml PMA) T-celler i frånvaro och närvaro av 300 nM CsA eller ett nM FK506. (C) MTS tillväxtanalys vid 50 och 250 ng / ml PMA med 250 nM jonomycin i frånvaro och närvaro av 300 nM CsA. Signifikanta skillnader (p <0,001) anges med asterisker. n är det totala antalet försök. Data är från celler isolerade från 3 möss. (D) Cell diametrar vilande och aktiverade T-celler (250 ng / ml PMA och 250 nM jonomycin) 12 h efter aktivering i frånvaro och närvaro av 300 nM CsA. pload / 55212 / 55212fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 3: Effekter av CsA, FK506, FTY720, rapamycin, och spårvagn-34 på cellstorleken. (A och C) medeldiametrar av vila och PMA / jonomycin-aktiverade murina T-celler i frånvaro och närvaro av droger. Koncentrationer visas i rutan. (B) data från en uttryckt som procent ökning jämfört med vilande T-celldiameter. Lymfocytaktivering utfördes med 250 ng / ml PMA och 250 nM ionomycin, och mätningarna gjordes efter 48 timmar. (D) Cell motverka mätningar av vila och anti-CD3 / CD28-aktiverade T-celler, 72 timmar efter aktivering i frånvaro och närvaro av 300 nM CsA.rge.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 4: blastogenes i humana PBMC vid mitogen stimulering. (A) Black kolumner indikerar vila och röda kolumner indikerar aktiverade PBMC. (B) medeldiametrar av vilande och aktiverade PBMC i frånvaro och närvaro av 300 nM CsA. Celler aktiverades med 250 ng / ml PMA och 250 nM ionomycin, och mätningarna togs efter 48 h av aktivering. Klicka här för att se en större version av denna siffra. kolumn1 Vilar aktiverad CsA 100 nM CsA 200 nM Medeldiameter 6,94 | im 9.78 | im 8,19 | im 7,92 | im Genomsnittlig diameterökning 40,92% 17,88% 14,09% Genomsnittlig Ytarea 151.37 μm² 300.61 μm² 210.56 μm² 197.22 μm² Genomsnittlig ökning av Surface Area 98,59% 39,00% 30,16%
Discussion
Här beskriver vi en teknik för snabb detektering och kvantifiering av T-cells blastogen transformation med användande av en automatiserad cellräknare. Under våra förhållanden (250 ng / ml PMA och 250 nM ionomycin stimulering), var cellytan ökade tvåfaldigt och volymen trefaldigt efter 48 timmar av aktivering. Analysen är tillräckligt känslig för att upptäcka sprängning under de första 12 h av aktivering, där cellvolymen ökade endast 1,25 gånger jämfört med vilande (figur 2D). Ett mer fysiologiskt relevant mekanismen för T-cellsaktivering med användning av anti-CD3 och anti-CD28 antikroppsbelagda magnetiska pärlor gav en signifikant blastogen respons, med en genomsnittlig 2,3-faldig ökning i volym (72 h efter aktivering, figur 3D). Humana mononukleära celler visade en 2,6-faldig förändring av volym vid PMA / ionomycin stimulering under 48 timmar (Figur 4). ICR-mus mjälten T-cellmedeldiameter och volym bestämdes vara6,9 pm och 1,9 x 10 -4 nl respektive. Humana PBMC (från en frisk donator) hade en medeldiameter av 7,7 pm och en genomsnittlig volym av 2,7 x 10 -4 nl. Användning av detta protokoll, testade vi också ökande koncentrationer av PMA på deras förmåga att aktivera T-celler. Dessa encelliga resultat överensstämde med proliferationsanalyser utförda på liknande PMA koncentrationer.
Flera föreningar rapporterade att påverka celltillväxt testades: FTY720 31,32; den immunsuppressiva cyklosporin A, FK506 och rapamycin 27,28; och spårvagn-34, en blockerare av kalciumaktiverade KCa3.1 kanaler 33,35. Vi fann att, vid de testade koncentrationerna, de mest potenta hämmare av blastogenes var CsA och FK506. Rapamycin hade en mindre men statistiskt signifikant undertryckande effekt på blastogenes. TRAM-34, å andra sidan, inte påverkar blastogenes.
CsA tryckte både blastogenes och proliferation, men inte fullständigt (figur 2B och 2C), vilket visar att automatisk cellräknare mätning är en bra korrelat av läkemedelseffektiviteten i T-cellproliferation. I närvaro av rapamycin tillsammans med CsA, blastogenes inhiberades fullständigt, vilket tyder på att NFAT- och mTOR-medierade reaktionsvägar i kombination fullt kan stå för utvidgningen T-cellen vid mitogen stimulering med PMA / jonomycin (figur 3C).
Det dynamiska området för vissa proliferationsanalyser är begränsad (se figur 2). Proliferationsanalyser, såsom den som vi har använt (figur 2C), rapporterar en signal som innehåller bidrag från apoptotiska och nekrotiska celler. Automatiserade ändra diameter mätningar inte har denna begränsning, eftersom mätningarna avser endast levande celler. Cellviabilitet bedöms genom uteslutning av trypanblått fläck från friska, livsdugliga celler. I storleksmätningar med användning av fram-ljusspridning i flödescytometri diskriminering dubb cell kan vara problematiskt 22. I de automatiserade mätningar cell disk, ingen dubb befolkningen hittade (Figur 1). Även mätningen var tillräckligt exakt för att skilja mellan effekterna av 100 och 200 nM cyklosporin (Tabell 1) och för att upptäcka blastogenes inom 12 timmar av mitogen stimulering (figur 2D).
Detta nya assay är särskilt användbar för små antal prover. Upp till 15 prover kan mätas i en timme. Dock har analysen sina begränsningar, varav de flesta kan mildras. Även om det på ett effektivt sätt kan lösa små (<1 pm) skillnad i celldiameter, maskinen modell vi använt har en självrisk på 5 pm upptäckt. Denna gräns kan leda till överskattningen av mycket små cellstorlekar, eftersom det effektivt utesluter alla celler med mindre diameter. Men nyare modeller av cellräknare har upptäckt tröskaåringar på ~ 2 pm, vilket bör lindra detta problem. Om det finns för mycket skräp i provet, instrumentet behandlar dem som livskraftiga celler. Dessutom kan luftbubblor ibland komma in i flödescellen och orsakar förvrängning av cellbilder tagna av maskinen. Distorsionen verkar inte påverka viabilitet, men det kan påverka de uppmätta diametrar. Därför är det rekommenderat att alla bilder kontrolleras av försöksledaren för luftbubblor innan uppgifterna från varje försök accepteras för analys. Eftersom programvaran drar endast cirklar runt cellerna, kan diametrar av icke-sfäriska celler vara sned mot den långa axeln, vilket gör analysen mindre lämpliga för icke-sfäriska celler.
Denna analys är snabb, tar ca 4 min per prov, jämfört med proliferationsanalyser, som kräver ett par timmar. Datainsamling är också ganska enkelt med hjälp av programvara som medföljer enheten. Programmet kan exportera mätdata till en spreadsheet för analys. Slutligen är det en single-cell, i motsats till en population, mätning; både blastogenes och proliferation mäts; och det skiljer mellan levande och döda celler samtidigt. Det kan användas för att utvärdera olika musstammar för deras förmåga att montera ett immunsvar. Analysen kan även användas med framgång för mätning av blastogenes i T-celler från humana givare (Figur 4), och den kan också användas i andra celltyper.
Cellvolymökningar är kända för att bidra till reglering av metabolism: cell svullnad stimulerar glutamin-inducerad glykogensyntes och lipogenes i hepatocyter 36,37. Neutrofiler visar migrationsrelaterade volymökningar på 35-60%, medan kemotaktiska medel inducerar 10-15% svullnad 38-40. Den aktuella analysen kan potentiellt användas för att studera dessa processer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | Lonza | BW12-702F | |
| 40 μm nylon cell strainers | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | |
| nylon wool fiber columns | Polysciences, Inc. | 21759-1 | |
| 50 ml conical tubes | The Lab Depot | TLD431697 | |
| 6-well cell culture treated plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
| 96-well cell culture treated plates | Thermo Fisher Scientific | 130188 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-100 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | MTS based assay |
| Cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024 | |
| FK506 | Cayman Chemical Company | 104987-11-3 | |
| Rapamycin | Santa Cruz Biotechnology | sc-3504 | |
| TRAM-34 | Sigma-Aldrich | T6700 | |
| FTY720 | Sigma-Aldrich | SML0700 | |
| Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 | Gibco | 11456D | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Acros Organics | 356150010 | |
| Ionomycin calcium salt | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| Penicillin-Streptomycin | MP Biomedicals | ICN1670049 | 100x stock |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | HyClone | SH30378.02 | 10x stock |
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Research Products International | 12/3/3483 | reducing agent |
| 8 µm micro particle size standard | Sigma-Aldrich | 84192-5ML-F | Actual 8.02 µm |
| 6 µm micro particle size standard | Sigma-Aldrich | 89756-5ML-F | Actual 6.084 µm |
| Single magnetic separation stand for 1.5 - 2 ml tube | V&P Scientific, Inc. | VP772F5 | |
| Cell culture incubator | Forma Scientific | 3110 | |
| Synergy H1 hybrid reader | Bio Tek | BTH1M | |
| Vi-CELL cell viability analyzer | Beckman Coulter | 731050 |
References
- Weiss, A., Samelson, L. E. T-lymphocyte activation. Fundamental Immunology. Paul, W. E. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. Fifth ed 321-364 (2003).
- Gergely, P., Ernberg, I., Klein, G., Steinitz, M. Blastogenic response of purified human T-lymphocyte populations to Epstein-Barr virus (EBV). Clin Exp Immunol. 30 (3), 347-353 (1977).
- Sanderson, R. J., Rulon, K., Groeneboer, E. G., Talmage, D. W. The response of murine splenic lymphocytes to concanavalin A and to co-stimulator. J Immunol. 124 (1), 207-214 (1980).
- Decoursey, T. E., Chandy, K. G., Gupta, S., Cahalan, M. D. Mitogen induction of ion channels in murine T lymphocytes. J Gen Physiol. 89 (3), 405-420 (1987).
- Nibbering, P. H., Zomerdijk, T. P., Tilburg, A. J., Furth, R. V. Mean cell volume of human blood leucocytes and resident and activated murine macrophages. J Immunol Methods. 129 (1), 143-145 (1990).
- Segel, G. B., Cokelet, G. R., Lichtman, M. A. The measurement of lymphocyte volume: importance of reference particle deformability and counting solution tonicity. Blood. 57 (5), 894-899 (1981).
- Cooper, H. L., Braverman, R. Protein synthesis in resting and growth-stimulated human peripheral lymphocytes. Evidence for regulation by a non-messenger RNA. Exp Cell Res. 127 (2), 351-359 (1980).
- Cooper, H. L., Braverman, R. Close correlation between initiator methionyl-tRNA level and rate of protein synthesis during human lymphocyte growth cycle. J Biol Chem. 256 (14), 7461-7467 (1981).
- Teague, T. K., et al. Activation changes the spectrum but not the diversity of genes expressed by T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12691-12696 (1999).
- Tzur, A., Kafri, R., Lebleu, V. S., Lahav, G., Kirschner, M. W. Cell growth and size homeostasis in proliferating animal cells. Science. 325 (5937), 167-171 (2009).
- Messele, T., et al. Nonradioactive techniques for measurement of in vitro T-cell proliferation: alternatives to the [3H]thymidine incorporation assay. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (4), 687-692 (2000).
- Maghni, K., Nicolescu, O. M., Martin, J. G. Suitability of cell metabolic colorimetric assays for assessment of CD4+ T cell proliferation: comparison to 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) ELISA. J Immunol Methods. 223 (2), 185-194 (1999).
- Weichert, H., Blechschmidt, I., Schröder, S., Ambrosius, H. The MTT-assay as a rapid test for cell proliferation and cell killing: application to human peripheral blood lymphocytes (PBL). Allerg Immunol (Leipz). 37 (3-4), 139-144 (1991).
- Huang, K. T., Chen, Y. H., Walker, A. M. Inaccuracies in MTS assays: major distorting effects of medium, serum albumin, and fatty acids. Biotechniques. 37 (3), 406, 408 410-412 (2004).
- Rampersad, S. N. Multiple applications of Alamar Blue as an indicator of metabolic function and cellular health in cell viability bioassays. Sensors (Basel). 12 (9), 12347-12360 (2012).
- Quent, V. M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research. J Cell Mol Med. 14 (4), 1003-1013 (2010).
- Augustine, N. H., Pasi, B. M., Hill, H. R. Comparison of ATP production in whole blood and lymphocyte proliferation in response to phytohemagglutinin. J Clin Lab Anal. 21 (5), 265-270 (2007).
- Sottong, P. R., Rosebrock, J. A., Britz, J. A., Kramer, T. R. Measurement of T-lymphocyte responses in whole-blood cultures using newly synthesized DNA and ATP. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (2), 307-311 (2000).
- Wallace, P. K., Muirhead, K. A. Cell tracking 2007: a proliferation of probes and applications. Immunol Invest. 36 (5-6), 527-561 (2007).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Teague, T. K., Munn, L., Zygourakis, K., Mcintyre, B. W. Analysis of lymphocyte activation and proliferation by video microscopy and digital imaging. Cytometry. 14 (7), 772-782 (1993).
- Böhmer, R. M., Bandala-Sanchez, E., Harrison, L. C. Forward light scatter is a simple measure of T-cell activation and proliferation but is not universally suited for doublet discrimination. Cytometry A. 79 (8), 646-652 (2011).
- Lee, J., Sadelain, M., Brentjens, R. Retroviral transduction of murine primary T lymphocytes. Methods Mol Biol. 506, 83-96 (2009).
- Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail. J Immunol Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).
- Trickett, A., Kwan, Y. L. T cell stimulation and expansion using anti-CD3/CD28 beads. J Immunol Methods. 275 (1-2), 251-255 (2003).
- Pène, J., Rahmoun, M., Temmerman, S., Yssel, H. Use of anti-CD3/CD28 mAb coupled magnetic beads permitting subsequent phenotypic analysis of activated human T cells by indirect immunofluorescence. J Immunol Methods. 283 (1-2), 59-66 (2003).
- Sigal, N. H., Dumont, F. J. Cyclosporin A, FK-506, and rapamycin: pharmacologic probes of lymphocyte signal transduction. Annu Rev Immunol. 10 (1), 519-560 (1992).
- Fruman, D. A., Klee, C. B., Bierer, B. E., Burakoff, S. J. Calcineurin phosphatase activity in T lymphocytes is inhibited by FK 506 and cyclosporin A. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (9), 3686-3690 (1992).
- Pollizzi, K. N., Waickman, A. T., Patel, C. H., Sun, I. H., Powell, J. D. Cellular size as a means of tracking mTOR activity and cell fate of CD4+ T Cells upon antigen recognition. PLoS One. 10 (4), e0121710 (2015).
- Pollizzi, K. N., Powell, J. D. Regulation of T cells by mTOR: the known knowns and the known unknowns. Trends Immunol. 36 (1), 13-20 (2015).
- Mandala, S., et al. Alteration of lymphocyte trafficking by sphingosine-1-phosphate receptor agonists. Science. 296 (5566), 346-349 (2002).
- Qin, X., et al. Sphingosine and FTY720 are potent inhibitors of the transient receptor potential melastatin 7 (TRPM7) channels. Br J Pharmacol. 168 (6), 1294-1312 (2013).
- Wulff, H., Kolski-Andreaco, A., Sankaranarayanan, A., Sabatier, J. M., Shakkottai, V. Modulators of small- and intermediate-conductance calcium-activated potassium channels and their therapeutic indications. Curr Med Chem. 14 (13), 1437-1457 (2007).
- Petho, Z., et al. The anti-proliferative effect of cation channel blockers in T lymphocytes depends on the strength of mitogenic stimulation. Immunol Lett. 171, 60-69 (2016).
- Wulff, H., et al. Design of a potent and selective inhibitor of the intermediate-conductance Ca2+-activated K+ channel, IKCa1: a potential immunosuppressant. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (14), 8151-8156 (2000).
- Lang, F., et al. Functional significance of cell volume regulatory mechanisms. Physiol Rev. 78 (1), 247-306 (1998).
- Hue, L. Control of liver carbohydrate and fatty acid metabolism by cell volume. Biochem Soc Trans. 22 (2), 505-508 (1994).
- O'Flaherty, J. T., Kreutzer, D. L., Ward, P. A. Neutrophil aggregation and swelling induced by chemotactic agents. J Immunol. 119 (1), 232-239 (1977).
- Hsu, L. S., Becker, E. L. Volume changes induced in rabbit polymorphonuclear leukocytes by chemotactic factor and cytochalasin B. Am J Pathol. 81 (1), 1-14 (1975).
- Rosengren, S., Henson, P. M., Worthen, G. S. Migration-associated volume changes in neutrophils facilitate the migratory process in vitro. Am J Physiol. 267, 6 Pt 1 C1623-C1632 (1994).
