Abstract
Lymfocyt proliferatie in respons op antigene of mitogene stimulatie is een goed meetbaar fenomeen bruikbaar voor het testen immuunmodulerende (bijv immunosuppressieve of immunostimulerende) chemische verbindingen en biologische middelen. Een van de eerste stappen in mitogenese is vergroting cel of blastogenic transformatie, waarna het celvolume toeneemt vóór deling. Het is gewoonlijk detecteerbaar in de eerste paar uren van T-lymfocyt stimulatie. We beschrijven hier een snelle methode om blastogenese in T-lymfocyten geïsoleerd uit milten van muizen en humane perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) te kwantificeren met behulp van een geautomatiseerde celteller. Verschillende gebruikelijke proliferatie assays voor het grootste deel zijn bewerkelijk en geven alleen de totale populatie effect dan individuele cellulaire effecten binnen een populatie. In tegenstelling, de gepresenteerde geautomatiseerde celtelinrichting assay biedt snelle, directe en nauwkeurige metingen van celdiameters die kunnen wordengebruikt voor het beoordelen van de effectiviteit van verschillende mitogenen en immunomodulerende geneesmiddelen in vitro.
Introduction
T-lymfocyten zijn de primaire cellen die verantwoordelijk zijn voor adaptieve immuniteit in zoogdieren. Het is bekend dat ze reageren met specifieke antigene peptiden door MHC moleculen gepresenteerd op het oppervlak van antigeen presenterende cellen. Na activering van een verwante T-celreceptor (TCR), de cel vergroot in een proces genoemd blastogenic transformatie of blastogenese. Dit proces is detecteerbaar in de eerste ~ 6 uur na de stimulus wordt toegepast 1. Tijdens blastogenesereactie, de omvang van de individuele T-cellen te verhogen 2- tot 4-voudig 2-6. Lymfocyten beginnen te prolifereren in een proces genaamd klonale expansie, waarvan het doel is om zoveel mogelijk van de klonen antigeenspecifieke TCR-dragende cellen mogelijk te genereren. Het nageslacht cellen vervolgens oefenen hun immunologische functie door differentiëren in cytotoxische (CD8 +) of helper (CD4 +) effector T lymfocyten. Dus naïeve T lymfocyten in humane of muizen bloed in de G 0 (rust) fase van de celcyclus en ondersteuning minimale metabolische activiteit. Bij blootstelling aan antigenen of mitogenen, T-cellen opnieuw invoeren van de celcyclus, met een gelijktijdige stimulatie van transcriptie en eiwitsynthese 7-10. Mitogenen, zoals forbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) en ionomycine de lymfocyten te stimuleren door de activering van proteïnekinase C (PKC) en Ca2 + afhankelijke signaleringsroutes 1. De activering van T-cellen met PMA / ionomycine omzeilt het TCR signalering stappen.
In vitro proliferatie assays worden algemeen gebruikt voor de evaluatie lymfocytfunctie en de reactie op stimuli. Proliferatie metingen worden meestal één tot drie dagen na het begin van de T-cel stimulatie genomen en weerspiegelen de collectieve status van honderden of duizenden cellen. De potentie van verschillende mitogenen en immunomodulerende geneesmiddelen in vitro kan worden beoordeeld door simpelweg het meten proliferatiesnelheden in aanwezigheid van deze verbindingen. Waarvan enkele eenssays en hun beperkingen worden hieronder besproken.
Direct aantal cellen tellen, de procedure is tijdrovend, met een grote kans op bedieningsfouten.
Voor DNA-synthese, de 3H-thymidine meet DNA synthese, maar de belangrijkste beperking is de radiotoxiciteit. Een niet-radioactieve alternatief BrdU, maar de lineaire meetbereik voor de celgroei beperkt en behandeling antilichaam nodig, waardoor het aantal stappen in de procedure 11,12 verhoogt.
Voor metabolische activiteit, tetrazoliumzouten (MTT, MTS, XTT, en WST-1) en resazurin kleurstof gebaseerde colorimetrische onderzoeken rapporteren de algemene metabolische toestand van delende celpopulaties. Echter MTT niet oplosbaar is in het kweekmedium, die extra wasstappen, waardoor waarin fouten in de meting; XTT moet extra componenten doeltreffend te verminderen; MTS-, WST-1- en-resazurin metingen zijn invloeded door het kweekmedium pH en zijn componenten serum albumine of fenolrood 13-16. Deze testen meten niet het werkelijke aantal levensvatbare cellen maar schat de gecombineerde enzymactiviteiten. Daarom is de proliferatiesnelheid niet nauwkeurig bepaald door metabolische assays vanwege de niet-lineaire correlatie tussen het aantal cellen en de kleurstof reductie 12,17.
Voor het meten van ATP concentratie, T-cel-activatie geïnduceerde toenamen in ATP correleren met proliferatie. Echter, verhoging van intracellulair ATP is een van de eerste stappen van T-celactivering; vele stappen achter de werkelijke proliferatie 17,18.
Kleurstof verdunningstest, CFSE fluorescerende kleurstof kleurt cellen door het covalent binden aan intracellulaire eiwitten. De kleurstof vertoont een proliferatie-afhankelijke afname in fluorescentie-intensiteit, die het aantal celdelingen kan volgen. Vanwege covalente eiwitmarkerend, de functies van dezeeiwitten kunnen worden aangetast. De kleurstof is giftig voor de cellen bij hogere concentraties. Bij lagere concentraties kleurstof echter de initiële fluorescentie intensiteit verlaagd, het verminderen van het aantal celdelingen die kunnen worden gevolgd. Bovendien, na merken met CFSE, bestaat er een veelvoud onafhankelijk ~ 50% verlies van de initiële fluorescentie gedurende de eerste 24 tot 48 uur periode, waarin het dynamische bereik van de assay beperkt 19,20.
De meeste van deze testen geven de collectieve status van grote aantallen cellen en vereisen de behandeling van de cellen met fluorescerende kleurstoffen. Necrotische en apoptotische cellen kunnen ook bijdragen aan deze metingen, tenzij uit de analyse verwijderd door kleuring met chemicaliën of antilichamen.
Lymfocyt blastogenesereactie kan worden beoordeeld door verschillende methoden, zoals optische microscopie of flowcytometrie 4,21,22. We beschrijven hier een snelle methode voor het meten van T-cel-afmetingen met eenn geautomatiseerde celgetalmeter met real-time mobiele beelden die zijn opgeslagen en kunnen opnieuw geanalyseerd later verzamelt. Naast omvangmetingen, dit apparaat biedt precieze aantal cellen en het percentage levensvatbare cellen, zoals bepaald door trypan blauwe kleuring exclusie. De inrichting die in dit protocol is commercieel verkrijgbaar, en de fabrikant getest de precisie van het instrument met drie verschillende instrumenten en verschillende concentratie en levensvatbaarheid controles. De resultaten van deze onderzoeken werd een variatiecoëfficiënt dat was algemeen beneden 6%. Zoals vermeld in het protocol, wordt het apparaat geijkt op een regelmatige basis met 6 urn en 8 urn diameter polystyreen korrels. De voordelen van een celteller te maken tussen rustende T-cellen en T lymfoblasten gebaseerd op celdiameter is het gebruiksgemak en de geautomatiseerde aard van de analyse. De software kan een cirkel rond elke cel en het berekenen van de celdiameter. Bovendien, de imleeftijden zijn toegankelijk voor de operator, die de nauwkeurigheid van het instrument het identificeren van de cellen en correct een cirkel omheen kan controleren. In termen van beperkingen, kan het instrument niet per se onderscheid tussen puin en cellen; Daarom is het belangrijk dat de gebruiker beschouwt elk beeld als het wordt verwerkt. Er is een mogelijkheid voor het opnemen van luchtbellen, waarbij het aantal bruikbare gebied voor analyse zal afnemen; Dit is echter zeldzaam wanneer de periodieke spoeling onderhoud wordt uitgevoerd.
In deze studie, groepen milt T-lymfocyten werden gestimuleerd met ionomycine en toenemende concentraties PMA voor 12-48 uur. PMA concentratie van slechts 2 ng / ml induceerde zowel een robuuste respons blastogenic en significante proliferatie. Metingen van de effecten van verschillende geneesmiddelen, zoals immunosuppressiva cyclosporine A (CsA), FK506 (tacrolimus) en rapamycine (sirolimus), alsmede ionkanaal blokkers TRAM-34 en FTY720 (fingolimod), op blastogenesereactie aangetoond goed overeen met gerapporteerde effecten op de proliferatie. De blastogenic van humane PBMCs met PMA / ionomycine en muizen T-cel stimulatie met anti-CD3 en anti-CD28-antilichaam beklede magnetische korrels werden ook gemeten.
De celgetalmeter assay kwantificeert zowel blastogenese en de proliferatiesnelheid (celdichtheid) gelijktijdig maar afzonderlijk, anders dan de bovengenoemde methoden die kijken naar een combinatie van deze effecten. De gepresenteerde protocol geeft een snelle en robuuste techniek voor het evalueren van de sterkte van mitogene en immuunmodulerende middelen.
Protocol
Alle experimenten worden uitgevoerd in overeenstemming met protocollen door de Wright State University Lab Animal Care en gebruik Comite en Institutional Review Board goedgekeurd uitgevoerd.
OPMERKING: Menselijke PBMC's worden geïsoleerd door Ficoll dichtheidsgradiënt centrifugatie methode 5.
1. Spleen Harvest
- Huis volwassen vrouwelijke ICR-muizen in standaard laboratoriumomstandigheden met voedsel, water en beddengoed specifiek voor de soort vereisten.
OPMERKING: dieren hadden een gemiddelde leeftijd van 2,9 maanden en een gemiddeld gewicht van 30,4 g op het tijdstip van de euthanasie. - Op de datum van isolatie (DOI), euthanaseren van de dieren individueel zonder andere soortgenoten aanwezige dieren. Alles in het werk om een minimale belasting ervoor te zorgen dat de muis. Euthanaseren het gebruik van CO 2 met secundaire breken van de nek tot de dood te verzekeren.
- Plaats het dier nog in de overdracht kooi, in de CO 2 kamer en start de gasstroom bij 5 l / min. Deze stroomsnelheid verdringt zuurstof bij de aanbevolen 10-30% per min.
- Nadat het dier bewusteloos is, verhoging van de CO 2 debiet tot 15 l / min. Controleer het dier ademstilstand en laten in de kamer gedurende nog 2 min.
- Solliciteer cervicale dislocatie met afleiding kracht om de dood te verzekeren.
- Oogst de milt van het dier met behulp van aseptische techniek binnen 10 minuten van de dood.
- Steriliseren twee reeksen schaar en forceps voor het verwijderen van de milt in een autoclaaf oven voor gebruik. Steriliseer de dissectie oppervlak door toepassing 70% ethanol.
- Toepassen 70% ethanol om de muis buik. Met behulp van een set van de schaar en pincet, maak een snede in de vacht en de huid van de linker kant van de buik, en trek uit elkaar en schil de rug van de huid om het buikvlies te onthullen. Eenmaal blootgesteld, gelden 4% chloorhexidine-oplossing voor het openen van het buikvlies.
- Met behulp van de tweede set van scissors en pincet, maak een 2 tot 3 cm gesneden langs de centrale buik. Open het buikvlies en verwijder de milt door het wegsnijden van viscerale bijlagen en overtollig vet. Plaats de milt in Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS).
2. Voorbereiding van de Raw Splenocyten
OPMERKING: Voer alle stappen onder een laminaire stroming bioveiligheid kast met behulp van aseptische techniek.
- Week de geoogste milten in 10 ml gedeïoniseerd steriel H 2 O 5 min in een 10 cm kweekschaal tot het oppervlak erytrocyten te lyseren.
OPMERKING: Deze stap kan worden overgeslagen als de milt tijdens isolement werd beschadigd. - Om de splenocyten los, verpletteren de milt tussen twee gesteriliseerde glasplaatjes (matte kant van de milt) over een nieuwe 10 cm cultuur schotel. Mengen met 10 ml RPMI-1640 aangevuld met 10% foetaal runderserum, 2 mM L-glutamine, 50 IU / ml penicilline en 50 ug / ml streptomycine (hierna genoemd eens compleet RPMI).
- Filter de cellen door een steriele 40 um nylon cel zeef in een nieuwe 10 cm cultuur schotel op het bindweefsel en vuil te verwijderen.
- Lyse de resterende erythrocyten door toevoeging van 20 ml RBC lysisbuffer bestaande uit 155 mM NH4CI, 10 mM NaHCO 3 en 0,1 mM EDTA bij pH 7,4 en ~ 300 mOsm / L.
OPMERKING: osmolaliteit gemeten met een vriespunt of dampdrukosmometer.- Breng de cellen van de 10-cm plaat een 50 ml conische buis en centrifugeer bij 250 xg gedurende 10 min (4 ° C).
- Verwijder het supernatant, voeg 20 ml RBC lysis buffer en resuspendeer de gepelleteerde cellen door pipetteren.
- Incubeer bij kamertemperatuur in lysisbuffer gedurende 10 minuten onder voorzichtig schommelen.
- Centrifugeer gedurende 10 min bij 250 xg (4 ° C) om de cellen te pelleteren. Giet het lysisbuffer.
- Resuspendeer cellen in 10 ml compleet RPMI en centrifugeer weer (250 x g, 10 min, 4 ° C). SchijfArd de bovenstaande vloeistof.
- Resuspendeer de splenocyten in 2 ml compleet RPMI verwarmd tot 37 ° C voor overdracht naar de kolom nylon wol vezels.
3. Zuivering van T lymfocyten
- Was de nylonwol kolommen tweemaal met 5 ml compleet RPMI. Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO 2 celkweek incubator gedurende 1 uur.
Opmerking: Het is noodzakelijk om de nylon wol nat gedurende de duur van het experiment te houden en te gebruiken volledig RPMI verwarmd tot 37 ° C voor nylon wol isolatiestappen. - Voeg geïsoleerde splenocyten aan de kolom en incubeer gedurende 1 uur om de B-cellen, fibroblasten en hulpcellen te houden aan de nylon wol.
- Voeg 2 ml RPMI dat de splenocyten in de kolom en passeren tot de bovenkant van de nylon wol wordt bereikt.
- Voeg 2 ml compleet RPMI verwarmd tot 37 ° C boven de nylon wol en passeren het medium door de woltotdat het vloeistofniveau bereikt het bovenoppervlak.
- Voeg 3 ml warm compleet RPMI de kolom volledig te bedekken de nylon wol.
- Incubeer de gevulde kolom ongestoord in een 37 ° C, 5% CO 2 celkweek incubator gedurende 1 uur.
- Elueer de cellen door wassen van de kolom tweemaal met 5 ml compleet RPMI. Voer een aanvullend wassen van de geëlueerde cellen door centrifugatie.
- Vul de kolom boven 2 maal met compleet RPMI en laat de oplossing in de kolom te laten stromen in een 50 ml steriele conische buis.
LET OP: Vermijd te tikken of stoten de kolom, die de B-cellen, accessoire cellen en fibroblasten die vastzit aan de nylon wol kunnen verjagen. - Verzamel de doorstroomfractie en centrifugeren bij 250 g gedurende 10 minuten (4 ° C) om de cellen te pelleteren. Was eenmaal met 10 ml compleet RPMI. Pellet de cellen opnieuw (250 x g, 10 min, 4 ° C) en resuspendeer in 2 ml compleet RPMI.
- Meet de c ell dichtheid met behulp van een hemocytometer en verdund in volledige RPMI tot 0,5 x 10 6 cellen / ml.
- Seed 1 of 2 ml aliquots van de cellen in elk putje van een 24- of 6-well celcultuur plaat, respectievelijk, en de cellen te kweken bij 37 ° C met 5% CO2.
Opmerking: 1 mM 1,4-dithiothreitol (DTT) kunnen aan elk putje worden toegevoegd in dit stadium T-celoverleving verbeteren. - Optioneel: Bevestig de efficiëntie van de isolatie protocol met flowcytometrie. Dit protocol levert normaal ~ 80% T-lymfocyten 23.
LET OP: Nylon-wol gezuiverde cellen bevatten ongeveer 50% CD4 + en 23% CD8 + cellen. Het verder zuiveren van de CD4 + en CD8 + subpopulaties, kan een immunomagnetische depletie stap worden uitgevoerd met behulp van acht antilichamen en magnetische korrels 24. Alternatief kan zuiverder CD4 + en CD8 + T-celpopulaties worden geïsoleerd door positieve of negatieve selectie met specifieke antilichamen.
- Vul de kolom boven 2 maal met compleet RPMI en laat de oplossing in de kolom te laten stromen in een 50 ml steriele conische buis.
- Activeren van T-lymfocyten binnen 24 uur van isolatie door de toevoeging van PMA en ionomycine calciumzout of magnetische bolletjes gecoat met anti-CD3 en anti-CD28 antilichamen 23,25,26. Voeg experimentele geneesmiddelen (bijvoorbeeld CsA, FK506, rapamycine, tram 34 en FTY720) op het moment van activering.
OPMERKING: Hier PMA varieerden 2-250 ng / ml en de concentratie ionomycine werd bij 250 nM gehouden. Indien mogelijk moet verdunningen worden bereid uit voorraad hoeveelheden van elk geneesmiddel, zodat het volume toegevoegd aan elk putje van cellen ≥1 pl reproduceerbaarheid te garanderen. Het anti-CD3 / anti-CD28-beklede magnetische parels worden toegevoegd in een 1: 1 korrel tot cel verhouding. Verhoging van het aantal korrels per cel (dat wil zeggen, de korrel tot cel verhouding) zal de intensiteit van de stimulatie 25,26 verhogen. De korrels worden gewassen en opnieuw gesuspendeerd in volledig RPMI voordat de toevoeging aan de cellen. Merk op dat trypanblauw kleurt de kralen. - Kweken van de cellen gedurende 12-72 uur bij 37 ° C met 5% CO 2 voor het analyseren van de geautomatiseerde celteller.
5. Automated Cell Collection Tellergegevens
- Voordat u het monster, zorg ervoor dat de cellen voorzichtig worden gemengd met een serologische pipet om klonten te voorkomen. Dit is vooral belangrijk voor geactiveerde lymfocyten vanwege hun kleverigheid.
- Voor kweken die geactiveerd met anti-CD3 / CD28 beads na pipetteren, overbrengen van het monster naar een 1,5 ml of 2 ml centrifugebuis. Scheid de kralen door het houden van de buis op een magneet voor 1-2 minuten. Gebruik het supernatant dat de cellen voor analyse.
OPMERKING: Analyseer zowel rustende en geactiveerde cellen binnen 1 uur om eventuele pre-activering van rustende cellen door serum aanwezig in het kweekmedium. Na 12 uur PMA / ionomycine stimulatie, een kleine toename in celgrootte werd gedetecteerd (Figuur 2
- Voor kweken die geactiveerd met anti-CD3 / CD28 beads na pipetteren, overbrengen van het monster naar een 1,5 ml of 2 ml centrifugebuis. Scheid de kralen door het houden van de buis op een magneet voor 1-2 minuten. Gebruik het supernatant dat de cellen voor analyse.
- Breng 1 ml van de celsuspensie in een monsterhouder en voer het door de geautomatiseerde celteller volgens de instructies in de handleiding.
Opmerking: Voor elk van de proeven dient minimaal 1 ml (maximaal 2 ml) van de celkweek gebruikt worden. De geautomatiseerde celgetalmeter gebruikt een spuit trypan blauw mengen met de celsuspensie en geeft de mobiele trypan blue mengsel over een gebied dat wordt afgebeeld en geanalyseerd door de software. De software detecteert trypan blue-gekleurde cellen, tekent een cirkel rond elke cel, en bepaalt de diameter. 100 foto's worden verzameld uit elk monster, en de levensvatbaarheid van de cellen en maten worden bepaald. De drempelwaarde van de celtelinrichting hier gebruikt heeft een ondergrens van 5 urn. - Gegevensoverdracht van elke rit naar een spreadsheet voor verdere analyse.
- Kalibreer het apparaat regelmatig met een 1ml monster van 6 urn en 8 urn diameter polystyreen korrels.
OPMERKING: De feitelijke korrelgroottes gemeten door de fabrikant voor elke partij te gebruiken, niet de nominale maat. 6 en 8 urn kralen zijn handig omdat deze diameters dicht bij de verwachte diameters van rustende en geactiveerde T-cellen (zie figuur 1).
6. gegevens en statistische analyse
- Analyseer de gegevens met behulp van geschikte statistische en grafische software.
LET OP: De spreadsheet voor elke run bevat het aantal cellen met elk een diameter (bereik: 5 pm tot 70 pm). De cellen boven een 17 urn diameter verwijderd uit de analyse stofdeeltjes en kleine bellen, dat kan worden gelezen als levensvatbare cellen door het instrument te sluiten. - Voer hypothese te testen met behulp van Welch t-test voor data sets met ongelijke variantie; Resultaten worden als statistisch significant als p <0,001. De formule werd gebruikt,
waar
en 
zijn voorbeelden van middelen, 
en 
zijn steekproefvarianties, en 
en 
zijn steekproefomvang voor elke dataset. Het aantal vrijheidsgraden wordt conservatief geschat met behulp van de kleinste van de twee steekproefomvang voor elke vergelijking. Staafgrafieken worden weergegeven als het gemiddelde ± SEM.
en 
zijn voorbeelden van middelen, 
en 
zijn steekproefvarianties, en 
en 
zijn steekproefomvang voor elke dataset. Het aantal vrijheidsgraden wordt conservatief geschat met behulp van de kleinste van de twee steekproefomvang voor elke vergelijking. Staafgrafieken worden weergegeven als het gemiddelde ± SEM. 7. milt T-lymfocyt proliferatie assay
- Meet T-celproliferatie met een MTS- of MTT-gebaseerde colorimetrische plaatlezer proliferatietest.
OPMERKING: De test is basisd MTS tetrazolium verbinding (Owen's reagens) reductie oplosbare formazanproduct, waarschijnlijk door NADPH of NADH geproduceerd in metabolisch actieve cellen door dehydrogenase-enzymen. - Aantal gezuiverde T-cellen met een hemocytometer en resuspendeer ze in volledig RPMI-1640 in een uiteindelijke dichtheid van 1 x 10 6 cellen / ml.
Opmerking: 1 mM DTT kan worden toegevoegd aan de cellen in dit stadium. - Activeer de cellen met PMA en ionomycine met testgeneesmiddelen, indien nodig en meng voorzichtig (zoals in stap 4).
- Plaat 100 ul van de cellen in elke well van een 96-well celcultuur behandeld plaat en incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 48 uur. Voeg 100 ul RPMI-1640 medium zonder cellen in een putje van een lezing van de achtergrondabsorptie te verkrijgen.
- Voeg 20 pl MTS gebaseerde reagens aan elk putje en incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 4 uur.
- Neem absorptiemetingen bij 490 nm met behulp van een plaat lezer. De Absorbance metingen overeenkomen met het aantal metabolisch actieve cellen in elk putje.
OPMERKING: Trek achtergrond niveaus indien nodig. De achtergrondabsorptie zijn afhankelijk van het type kweekmedium, serum, externe pH en duur van MTS reagens blootstelling aan licht. MTS-gebaseerde reagentia zijn lichtgevoelig en blootstelling aan licht gedurende enkele uren kan resulteren in hogere absorptiewaarden achtergrond.
Representative Results
We gebruikten deze test om lymfocyten blast vorming vergelijken tijdens stimulatie met PMA, een forbolester en ionomycine, een calciumionofoor. Figuur 1A toont de frequentieverdeling van diameters van rustende en geactiveerde farmacologisch milt T-cellen. Behandeling van cellen met PMA / ionomycine gedurende ~ 2 dagen resulteerde in een significante verschuiving in de mediaan van de verdeling naar steeds grotere diameters (zie bijvoorbeeld referentie 4). Het aantal cellen met kleinere diameter is verlaagd. Om vast te stellen dat onze apparaat meldde de juiste diameters, voerden we twee kalibraties met polystyreen kralen van 6 urn en 8 urn diameters (zie Materials tabel). Figuren 1B en 1C tonen lezingen uit geactiveerde T-cellen bovenop met een 8 urn standaard en rustende T-cellen bovenop met een 6 um standaard. Figuur1D toont de controle kraal maten door de fabrikant gemeld uitgezet tegen de mediane diameters gemeten met onze geautomatiseerde cel tegen te gaan. Het bleek dat de 6 pm maten licht overschat in onze metingen, waarschijnlijk door de meting drempel van het instrument met een ondergrens van 5 urn. De standaarddeviatie van de kraal diameters berekend uit de celtelinrichting metingen was in overeenstemming met de standaarddeviatie door de fabrikant beschreven. We concluderen uit deze experimenten dat dit apparaat betrouwbaar kan worden om rust en mitogeen gestimuleerde muizen T-cel-afmetingen te vergelijken en dat de inrichting nauwkeurig kan meten de werkelijke cel diameters.
We gingen vervolgens naar de afhankelijkheid van de gemiddelde toename diameter op PMA concentratie te testen en vond dat, tegen een vaste ionomycine concentratie van 250 Nm, de PMA effect was niet significant veranderd door het opvoeren van de concentratie from 2-250 ng / ml (Figuur 2A). Met de MTS-gebaseerde test, maten we T- celproliferatie bij 50 en 250 ng / ml PMA en vond geen merkbaar verschil (figuur 2C), in overeenstemming met onze celdiameter data. De calcineurine remmers cyclosporine A (300 nm) en FK506 (1 nM) onderdrukt zowel blastogenesereactie (Figuur 2B) en proliferatie (figuur 2C). Remming was niet compleet in beide gevallen echter. Metingen uitgevoerd 12 uur na PMA / ionomycine Daarnaast toonde een 7,2% en 6,8% toename van diameter 50 ng / ml en 250 ng / ml PMA, respectievelijk (figuur 2D). Grootte toeneemt bij beide concentraties waren niet significant verschillend, zoals bij 48 uur stimulatie (vergelijk figuur 2A) was.
De celdiameter verzameld van rustende en geactiveerde T-cellen na 48 uur PMA / ionomycine stimulatie samengevat in
We testten ook andere chemische verbindingen gemeld immunosuppressieve te zijn: CsA, FK506, rapamycine, FTY720, en TRAM-34. In figuur 3, celgrootte meetresultaten van rustende en geactiveerde T-cellen in de afwezigheid en aanwezigheid van deze geneesmiddelen weergegeven. CsA en FK506, die de calcineurine-afhankelijke nucleaire factor van geactiveerde T-cellen (NFAT) 27,28 targeten, waren de meest potente, remmen de blastogenic reactie met bijna 72% (Figuur 3A en 3B). Interessant, metPMA verhoogde concentraties, de potentie van CsA en FK506 daalde licht, hoewel werd geen bijkomende toename celdiameter in afwezigheid van deze geneesmiddelen (Figuur 2A en 2B). Rapamycine, een immunosuppressivum dat zoogdieren doelwit van rapamycine (mTOR) 29,30 remt, had een matige maar statistisch significant effect (Figuur 3A, 3B en 3C). FTY720 is een sphingosine 1-fosfaat-receptor agonist die lymfocyt uitgang remt in omloop 31 en werd onlangs gevonden om TRPM7, een kation kanaal sterk tot expressie gebracht in T-lymfocyten 32 remmen. Zowel FTY720 en rapamycine was een vergelijkbaar effect op blastogenesereactie, af zal nemen van het gemiddelde van een stijging van 52% in diameter tot ongeveer 34% (Figuur 3A en 3B). TRAM-34 is een blocker van de calcium-geactiveerde kaliumkanaal KCa3.1 33. Getest bij 700 nm, TRAM-34 niet effectief was in muizen T-cellen, in Volgens een recente menselijke T-celproliferatie studie; de potentie kan afhangen van de aard en de sterkte van mitogene stimulatie 34 (figuur 3A en 3B). 700 nM TRAM-34 was effectief in het blokkeren KCa3.1 kanalen in onze patch clamp elektrofysiologie experimenten (gegevens niet getoond). Deze vergelijking werd gemaakt tussen rust en drug-blootgestelde cellen in meerdere studies binnen hetzelfde experiment op 48 uur. Wanneer rapamycine en CsA werden samen gebruikt, blastogenesereactie werd volledig geremd (figuur 3C).
Activatie van muizen T-cellen met anti-CD3 / anti-CD28-beklede magnetische korrels gedurende 72 uur leverde een 27% toename in de gemiddelde diameter, die in aanwezigheid van CsA (figuur 3D) werd verlaagd tot 5%. Menselijke mononucleaire cellen na PMA / ionomycine activatie gedurende 48 uur in diameter vergroot met 33%, en activering in aanwezigheid van CsA daalde de respons tot 23% ( binnen-page = "1"> Tabel 1: Samenvatting van de gemiddelde cel diameter en relatieve toename in oppervlak. Metingen werden uitgevoerd 48 uur na activering met 250 ng / ml PMA en ionomycine 250 nM. 
Figuur 1: frequentieverdelingen milt van muizen T-cel diameters. (A) Zwarte kolommen geven rust en rode kolommen geven PMA / ionomycine-geactiveerde (48 uur) cellen. (B) Uitkeringen van geactiveerde milt T-cellen bovenop een 8 urn deeltjesgrootte kalibratie standaard. (C) Uitkeringen van rustende T-cellen bovenop een 6 micrometer kalibratiestandaard. Het aantal cellen en kralen gebruikt worden in de vakken. (D) Mediane diameter gemeten door de celgetalmeter uitgezet tegen de pareldiameter door de fabrikant beschreven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 
Figuur 2: Afhankelijkheid van muizen T-celactivering op PMA concentratie. (A) Gemiddelde diameters van T-cellen ofwel onbehandeld of behandeld met 2, 50 en 250 ng / ml PMA een vaste concentratie ionomycine (250 nM). (B) Celgetalmeter metingen van rustende en geactiveerde (2, 50, 250 ng / ml PMA) T cellen in de afwezigheid en aanwezigheid van 300 nM CsA of FK506 1 nM. (C) MTS proliferatie assay bij 50 en 250 ng / ml PMA met 250 nM ionomycine in afwezigheid en aanwezigheid van 300 nM CsA. Significante verschillen (p <0,001) zijn aangeduid met sterretjes. n het totale aantal pogingen. Gegevens zijn uit cellen geïsoleerd uit 3 muizen. (D) Cell diameters van rustende en geactiveerde T-cellen (250 ng / ml PMA en ionomycine 250 nM) 12 uur na activering in de afwezigheid en aanwezigheid van 300 nM CsA. Pbelasting / 55212 / 55212fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 
Figuur 3: Effecten van CsA, FK506, FTY720, rapamycine en TRAM-34 op celgrootte. (A en C) Gemiddelde diameters van rust en PMA / ionomycine-geactiveerde muriene T-cellen in de afwezigheid en aanwezigheid van geneesmiddelen. Concentraties worden weergegeven in het vak. (B) De gegevens van A uitgedrukt als de procentuele stijging ten opzichte van de rustende T-cel diameter. Lymfocytactivering werd uitgevoerd met 250 ng / ml PMA en ionomycine 250 nM, en de metingen werden genomen na 48 uur. (D) Celgetalmeter metingen van rust en anti-CD3 / CD28 geactiveerde T-cellen, 72 uur na activering in de afwezigheid en aanwezigheid van 300 nM CsA.rge.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 
Figuur 4: blastogenesereactie in menselijke PBMCs op mitogeen stimulatie. (A) Zwarte kolommen geven rust en rode kolommen geven geactiveerde PBMC. (B) Gemiddelde diameters van rustende en geactiveerde PBMC in de afwezigheid en aanwezigheid van 300 nM CsA. Cellen werden geactiveerd met 250 ng / ml PMA en ionomycine 250 nM, en de metingen werden genomen na 48 uur activering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. kolom1 Rusten geactiveerde 100 nM CsA 200 nM CsA gemiddelde Diameter 6.94 pm 9.78 pm 8.19 pm 7.92 pm Gemiddelde stijging van de Diameter 40,92% 17.88% 14.09% Gemiddelde oppervlakte 151,37 μm² 300,61 μm² 210,56 μm² 197,22 μm² Gemiddeld vergroting van de oppervlakte 98,59% 39.00% 30.16%
Discussion
We beschrijven een techniek voor de snelle detectie en kwantificering van T-cel blastogenic omzetting door middel van een geautomatiseerde celteller. Onder onze omstandigheden (250 ng / ml PMA en ionomycine 250 nM stimulatie), werd het celoppervlak verhoogd tweevoudige en drievoudige volume na 48 uur activering. De test is gevoelig genoeg is om stralen gedurende de eerste 12 h activatie waarbij het celvolume nam slechts 1,25-voudige van de rust (figuur 2D). Een fysiologisch relevant mechanisme van T-cel activatie met behulp van anti-CD3 en anti-CD28-antilichaam gecoate magnetische korrels een significante blastogenic respons, met gemiddeld 2,3-voudige toename in volume (72 uur na activatie Figuur 3D). Menselijke mononucleaire cellen vertoonde een 2,6-voudige verandering in volume bij PMA / ionomycine stimulatie gedurende 48 uur (Figuur 4). De ICR muis milt T-cellen een gemiddelde diameter en het volume werd bepaald te zijn6,9 micrometer en 1,9 x 10 -4 nl, respectievelijk. Menselijke PBMC's (van een gezonde donor) had een gemiddelde diameter van 7,7 urn en een gemiddeld volume van 2,7 x 10 -4 nl. Met dit protocol, testten we ook toenemende concentraties van PMA op hun vermogen om T cellen te activeren. Deze eencellige resultaten waren consistent met proliferatie assays uitgevoerd bij vergelijkbare concentraties PMA.
Verscheidene verbindingen gemeld aan celproliferatie beïnvloeden werden getest: FTY720 31,32; de immunosuppressiva cyclosporine A, FK506 en rapamycine 27,28; en TRAM-34, een blocker van calcium geactiveerde KCa3.1 kanalen 33,35. We vonden dat, bij de geteste concentraties, de meest potente remmers van blastogenese waren CsA en FK506. Rapamycine had een kleinere maar statistisch significant onderdrukkend effect op blastogenese. Tram 34, anderzijds, geen invloed blastogenese.
CsA onderdrukt zowel blastogenese en proliferation, maar niet volledig (figuur 2B en 2C), waaruit blijkt dat geautomatiseerde celgetalmeter meting een goede correlatie geneesmiddel efficiëntie in T-celproliferatie. In aanwezigheid van rapamycine met CsA, blastogenesereactie werd volledig geremd, wat suggereert dat NFAT- en mTOR-gemedieerde paden in combinatie volledig kan verklaren T-cel uitbreiding op mitogene stimulatie met PMA / ionomycine (figuur 3C).
Het dynamisch bereik van enkele proliferatieassays wordt beperkt (zie figuur 2). Proliferatie assays, zoals degene die we hebben gebruikt (figuur 2C), rapporteren een signaal dat bijdragen van apoptotische en necrotische cellen omvat. Geautomatiseerde verandering diameter metingen hebben geen die beperking, als de metingen betrekking hebben op enige levensvatbare cellen. Cellevensvatbaarheid wordt bepaald door de uitsluiting van trypan blauwe vlek van gezonde, levensvatbare cellen. In grootte metingen met behulp van forwardlichtverstrooiing in flowcytometrie doublet cel discriminatie kan problematisch 22 zijn. In de geautomatiseerde celtelinrichting metingen werd geen doublet populatie gevonden (figuur 1). Ook de meting was voldoende nauwkeurig onderscheid te maken tussen de effecten van 100 en 200 nM cyclosporine (Tabel 1) en blastogenesereactie detecteren binnen 12 h mitogene stimulatie (Figuur 2D).
Deze nieuwe test is bijzonder nuttig voor kleine aantallen monsters. Maximaal 15 monsters kunnen worden gemeten in 1 uur. De test heeft zijn beperkingen, waarvan de meeste worden verminderd. Hoewel het effectief kleine (<1 micrometer) verschil kan oplossen in cel diameter, de machine model gebruikten we een lagere detectiegrens van 5 micrometer. Deze limiet kan overschatting van zeer kleine celgroottes veroorzaken, omdat het effectief met kleinere diameters sluit alle cellen. Echter, de nieuwere modellen van de cel teller hebben detectie dorsenjarigen van ~ 2 micrometer, die dit probleem zou verminderen. Als er te veel puin in de steekproef, het instrument behandelt ze als levensvatbare cellen. Daarnaast kunnen luchtbellen af en toe in de stroom cel en verstoring van de cel beelden die door de machine veroorzaken. De vervorming lijkt niet de levensvatbaarheid bepaling beïnvloeden, maar de opstelling kan de gemeten diameters. Derhalve wordt aanbevolen dat alle beelden worden gecontroleerd door de experimentator luchtbellen voordat de gegevens van elk onderzoek voor analyse worden geaccepteerd. Aangezien de software alleen baseert cirkels rond de cellen kunnen diameters van niet-bolvormige cellen scheefgetrokken naar de lange as zijn, waardoor de test minder geschikt voor niet-bolvormige cellen.
Deze test is snel en duurt ongeveer 4 min per monster vergeleken met proliferatie assays, die enkele uren vereisen. Het verzamelen van gegevens is ook vrij eenvoudig met behulp van de software die bij het apparaat. De software kan meetgegevens exporteren naar een spreadsheet voor analyse. Tenslotte is een eencellige, in tegenstelling tot een populatie, meet; zowel blastogenesereactie en proliferatie worden gemeten; en het onderscheid tussen levensvatbare en dode cellen tegelijk. Het kan worden gebruikt om verschillende muizenstammen evalueren op hun vermogen om een immuunrespons. De test kan ook met succes worden gebruikt voor de meting van blastogenese in T-cellen van humane donoren (figuur 4), en het kan ook worden gebruikt in andere celtypen.
Celvolume verhogingen gekend dat de regulering van het metabolisme: cel zwelling stimuleert glutamine-geïnduceerde glycogeensynthese en lipogenese in hepatocyten 36,37. Neutrofielen tonen migratie geassocieerd volume stijgt van 35-60%, terwijl de chemotactische agenten induceren 10-15% zwelling 38-40. De huidige test kan eventueel worden gebruikt om deze processen te bestuderen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | Lonza | BW12-702F | |
| 40 μm nylon cell strainers | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | |
| nylon wool fiber columns | Polysciences, Inc. | 21759-1 | |
| 50 ml conical tubes | The Lab Depot | TLD431697 | |
| 6-well cell culture treated plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
| 96-well cell culture treated plates | Thermo Fisher Scientific | 130188 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-100 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | MTS based assay |
| Cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024 | |
| FK506 | Cayman Chemical Company | 104987-11-3 | |
| Rapamycin | Santa Cruz Biotechnology | sc-3504 | |
| TRAM-34 | Sigma-Aldrich | T6700 | |
| FTY720 | Sigma-Aldrich | SML0700 | |
| Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 | Gibco | 11456D | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Acros Organics | 356150010 | |
| Ionomycin calcium salt | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| Penicillin-Streptomycin | MP Biomedicals | ICN1670049 | 100x stock |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | HyClone | SH30378.02 | 10x stock |
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Research Products International | 12/3/3483 | reducing agent |
| 8 µm micro particle size standard | Sigma-Aldrich | 84192-5ML-F | Actual 8.02 µm |
| 6 µm micro particle size standard | Sigma-Aldrich | 89756-5ML-F | Actual 6.084 µm |
| Single magnetic separation stand for 1.5 - 2 ml tube | V&P Scientific, Inc. | VP772F5 | |
| Cell culture incubator | Forma Scientific | 3110 | |
| Synergy H1 hybrid reader | Bio Tek | BTH1M | |
| Vi-CELL cell viability analyzer | Beckman Coulter | 731050 |
References
- Weiss, A., Samelson, L. E. T-lymphocyte activation. Fundamental Immunology. Paul, W. E. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. Fifth ed 321-364 (2003).
- Gergely, P., Ernberg, I., Klein, G., Steinitz, M. Blastogenic response of purified human T-lymphocyte populations to Epstein-Barr virus (EBV). Clin Exp Immunol. 30 (3), 347-353 (1977).
- Sanderson, R. J., Rulon, K., Groeneboer, E. G., Talmage, D. W. The response of murine splenic lymphocytes to concanavalin A and to co-stimulator. J Immunol. 124 (1), 207-214 (1980).
- Decoursey, T. E., Chandy, K. G., Gupta, S., Cahalan, M. D. Mitogen induction of ion channels in murine T lymphocytes. J Gen Physiol. 89 (3), 405-420 (1987).
- Nibbering, P. H., Zomerdijk, T. P., Tilburg, A. J., Furth, R. V. Mean cell volume of human blood leucocytes and resident and activated murine macrophages. J Immunol Methods. 129 (1), 143-145 (1990).
- Segel, G. B., Cokelet, G. R., Lichtman, M. A. The measurement of lymphocyte volume: importance of reference particle deformability and counting solution tonicity. Blood. 57 (5), 894-899 (1981).
- Cooper, H. L., Braverman, R. Protein synthesis in resting and growth-stimulated human peripheral lymphocytes. Evidence for regulation by a non-messenger RNA. Exp Cell Res. 127 (2), 351-359 (1980).
- Cooper, H. L., Braverman, R. Close correlation between initiator methionyl-tRNA level and rate of protein synthesis during human lymphocyte growth cycle. J Biol Chem. 256 (14), 7461-7467 (1981).
- Teague, T. K., et al. Activation changes the spectrum but not the diversity of genes expressed by T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12691-12696 (1999).
- Tzur, A., Kafri, R., Lebleu, V. S., Lahav, G., Kirschner, M. W. Cell growth and size homeostasis in proliferating animal cells. Science. 325 (5937), 167-171 (2009).
- Messele, T., et al. Nonradioactive techniques for measurement of in vitro T-cell proliferation: alternatives to the [3H]thymidine incorporation assay. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (4), 687-692 (2000).
- Maghni, K., Nicolescu, O. M., Martin, J. G. Suitability of cell metabolic colorimetric assays for assessment of CD4+ T cell proliferation: comparison to 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) ELISA. J Immunol Methods. 223 (2), 185-194 (1999).
- Weichert, H., Blechschmidt, I., Schröder, S., Ambrosius, H. The MTT-assay as a rapid test for cell proliferation and cell killing: application to human peripheral blood lymphocytes (PBL). Allerg Immunol (Leipz). 37 (3-4), 139-144 (1991).
- Huang, K. T., Chen, Y. H., Walker, A. M. Inaccuracies in MTS assays: major distorting effects of medium, serum albumin, and fatty acids. Biotechniques. 37 (3), 406, 408 410-412 (2004).
- Rampersad, S. N. Multiple applications of Alamar Blue as an indicator of metabolic function and cellular health in cell viability bioassays. Sensors (Basel). 12 (9), 12347-12360 (2012).
- Quent, V. M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research. J Cell Mol Med. 14 (4), 1003-1013 (2010).
- Augustine, N. H., Pasi, B. M., Hill, H. R. Comparison of ATP production in whole blood and lymphocyte proliferation in response to phytohemagglutinin. J Clin Lab Anal. 21 (5), 265-270 (2007).
- Sottong, P. R., Rosebrock, J. A., Britz, J. A., Kramer, T. R. Measurement of T-lymphocyte responses in whole-blood cultures using newly synthesized DNA and ATP. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (2), 307-311 (2000).
- Wallace, P. K., Muirhead, K. A. Cell tracking 2007: a proliferation of probes and applications. Immunol Invest. 36 (5-6), 527-561 (2007).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Teague, T. K., Munn, L., Zygourakis, K., Mcintyre, B. W. Analysis of lymphocyte activation and proliferation by video microscopy and digital imaging. Cytometry. 14 (7), 772-782 (1993).
- Böhmer, R. M., Bandala-Sanchez, E., Harrison, L. C. Forward light scatter is a simple measure of T-cell activation and proliferation but is not universally suited for doublet discrimination. Cytometry A. 79 (8), 646-652 (2011).
- Lee, J., Sadelain, M., Brentjens, R. Retroviral transduction of murine primary T lymphocytes. Methods Mol Biol. 506, 83-96 (2009).
- Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail. J Immunol Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).
- Trickett, A., Kwan, Y. L. T cell stimulation and expansion using anti-CD3/CD28 beads. J Immunol Methods. 275 (1-2), 251-255 (2003).
- Pène, J., Rahmoun, M., Temmerman, S., Yssel, H. Use of anti-CD3/CD28 mAb coupled magnetic beads permitting subsequent phenotypic analysis of activated human T cells by indirect immunofluorescence. J Immunol Methods. 283 (1-2), 59-66 (2003).
- Sigal, N. H., Dumont, F. J. Cyclosporin A, FK-506, and rapamycin: pharmacologic probes of lymphocyte signal transduction. Annu Rev Immunol. 10 (1), 519-560 (1992).
- Fruman, D. A., Klee, C. B., Bierer, B. E., Burakoff, S. J. Calcineurin phosphatase activity in T lymphocytes is inhibited by FK 506 and cyclosporin A. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (9), 3686-3690 (1992).
- Pollizzi, K. N., Waickman, A. T., Patel, C. H., Sun, I. H., Powell, J. D. Cellular size as a means of tracking mTOR activity and cell fate of CD4+ T Cells upon antigen recognition. PLoS One. 10 (4), e0121710 (2015).
- Pollizzi, K. N., Powell, J. D. Regulation of T cells by mTOR: the known knowns and the known unknowns. Trends Immunol. 36 (1), 13-20 (2015).
- Mandala, S., et al. Alteration of lymphocyte trafficking by sphingosine-1-phosphate receptor agonists. Science. 296 (5566), 346-349 (2002).
- Qin, X., et al. Sphingosine and FTY720 are potent inhibitors of the transient receptor potential melastatin 7 (TRPM7) channels. Br J Pharmacol. 168 (6), 1294-1312 (2013).
- Wulff, H., Kolski-Andreaco, A., Sankaranarayanan, A., Sabatier, J. M., Shakkottai, V. Modulators of small- and intermediate-conductance calcium-activated potassium channels and their therapeutic indications. Curr Med Chem. 14 (13), 1437-1457 (2007).
- Petho, Z., et al. The anti-proliferative effect of cation channel blockers in T lymphocytes depends on the strength of mitogenic stimulation. Immunol Lett. 171, 60-69 (2016).
- Wulff, H., et al. Design of a potent and selective inhibitor of the intermediate-conductance Ca2+-activated K+ channel, IKCa1: a potential immunosuppressant. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (14), 8151-8156 (2000).
- Lang, F., et al. Functional significance of cell volume regulatory mechanisms. Physiol Rev. 78 (1), 247-306 (1998).
- Hue, L. Control of liver carbohydrate and fatty acid metabolism by cell volume. Biochem Soc Trans. 22 (2), 505-508 (1994).
- O'Flaherty, J. T., Kreutzer, D. L., Ward, P. A. Neutrophil aggregation and swelling induced by chemotactic agents. J Immunol. 119 (1), 232-239 (1977).
- Hsu, L. S., Becker, E. L. Volume changes induced in rabbit polymorphonuclear leukocytes by chemotactic factor and cytochalasin B. Am J Pathol. 81 (1), 1-14 (1975).
- Rosengren, S., Henson, P. M., Worthen, G. S. Migration-associated volume changes in neutrophils facilitate the migratory process in vitro. Am J Physiol. 267, 6 Pt 1 C1623-C1632 (1994).
