Abstract
התפשטות לימפוציטים בתגובה אנטיגני או גירוי mitogenic היא תופעה לכימות בקלות שימושי המערכת החיסונית בדיקות (כלומר, אימונוסופרסיבי או immunostimulatory) תרכובות כימיות התרופות הביולוגיות. אחד הצעדים המוקדמים במהלך mitogenesis הוא הגדלת תא או שינוי blastogenic, ואז עולה נפח תא לפני החלוקה. זה בדרך כלל לגילוי בשעות המספר הראשונה של גירוי T-לימפוציטים. כאן אנו מתארים שיטה מהירה לכמת blastogenesis בלימפוציטים T המבודדים טחול עכבר ותאי הדם היקפיים mononuclear אדם (PBMCs) באמצעות דלפק תא אוטומטי. מבחני התפשטות שונים הנפוץ על פי רוב הם מייגע ורק לשקף את השפעת האוכלוסייה הכללית ולא תופעות הסלולר הפרט בתוך אוכלוסיה. לעומת זאת, assay נגד תא האוטומטי הציגה מספקת מדידות מהירות, ישירות, ומדויקות של קטרי תא שיכול להיותהמשמש להערכה האפקטיבית של mitogens השונה ותרופות אימונו במבחנה.
Introduction
לימפוציטים מסוג T הם תאים ראשוניים אחראי חסינות אדפטיבית ביונקים. זה ידוע כי הם מגיבים פפטידים ספציפיים אנטיגני שהציגו מולקולות MHC על פני השטח של תאי מציגי אנטיגן. עם הפעלת קולטן T-cell מאותו מקור (TCR), התא מגדיל ב תהליך שמכונה טרנספורמציה blastogenic, או blastogenesis. תהליך זה ניתן לגלות כבר בתוך השעה הראשונה ~ 6 לאחר הגירוי מוחל 1. במהלך blastogenesis, היקפי תאי T פרט להגדיל 2 עד פי 4 2-6. לימפוציטים מתחילים להתרבות בתהליך הנקרא שיבוטים, שמטרתו היא ליצור שיבוטים כמה שיותר תאי TCR נושאות אנטיגן ספציפי ככל האפשר. התאים הצאצאים ואז להפעיל פונקציה אימונולוגית שלהם תוך הבחנה לתוך ציטוטוקסיות (CD8 +) או עוזר לימפוציטים מסוג T מפעיל (CD4 +). לפיכך, לימפוציטים מסוג T נאיבי בדם אנושי או עכבר נמצא בשלב G 0 (מנוחה) של התאמחזור ופעילות מטבולית תמיכה מינימלית. בחשיפה אנטיגנים או mitogens, תאי T להזין מחדש את מחזור התא, עם גירוי בו זמני של סינתזת שעתוק וחלבוני 7-10. Mitogens, כגון phorbol 12-myristate 13-תצטט (PMA) ו ionomycin לעורר את לימפוציטים דרך ההפעלה של C פרוטאין קינאז (PKC) ו Ca 2 + איתות תלויה מסלולי 1. הפעלת תאי T עם PMA / ionomycin עוקפת את צעדי איתות TCR.
בהתרבות במבחנת מבחנים נמצאים בשימוש נרחב לצורך הערכת תפקוד לימפוציטים בתגובה לגירויים. קריאות הפצה נלקחות בדרך כלל אחד עד שלושה ימים לאחר תחילת גירוי תאי T ומשקפות את המדינה הקולקטיבית של מאה או אלף תאים. עוצמתה של mitogens השונה ותרופות אימונו במבחנה ניתן להעריך פשוט על ידי מדידת שיעורי התפשטות בנוכחות תרכובות אלו. חלק של אלהssays והמגבלות שלהם הם דנו בהמשך.
בדבר ספירת מספר סלולארי ישירה, ההליך הוא גוזל זמן בהסתברות גבוהה של טעויות מפעיל.
עבור סינתזה של DNA, assay ההתאגדות thymidine-3H מודד סינתזה של DNA, אך המגבלה העיקרית שלה היא radiotoxicity שלה. חלופה לא רדיואקטיבי הוא BrdU, אבל בטווח של התגובה ליניארי עבור צמיחת תאים מוגבל, וטיפול נוגדן נדרש, אשר מגדילה את מספר השלבים בהליך 11,12.
עבור פעילות מטבולית, מלחים tetrazolium (MTT, MTS, XTT, ו WST-1) ו resazurin מבחני colorimetric מבוסס הצבע ולדווח על המצב המטבולי הכללי של חלוקת אוכלוסיות תאים. עם זאת, MTT אינו מסיס במדיום התרבות, המחייב שלבים לשטוף נוספים, ובכך שילוב שגיאות במדידה; XTT צריך מרכיבים נוספים כדי להפחית ביעילות; MTS-, WST-1-, ומדידות מבוססי resazurin הם משפיעיםאד על ידי ה- pH בינוני תרבות ואדום 13-16 בסרום, אלבומין או פנול מרכיביו. מבחנים אלה לא מודדים את המספר האמיתי של תאי קיימא אלא לאמידה של פעילויות אנזים בשילוב. לפיכך, שיעור ההתפשטות לא ניתן לקבוע במדויק על ידי מבחני מטבולית בגלל המתאם שאינו ליניארי בין מספר תא לצבוע הפחתת 12,17.
למדידת ריכוז ה- ATP, עליות תאי T-induced ההפעלה ATP לתאם עם התפשטות. עם זאת, העלאת רמת ה- ATP התאי היא אחד הצעדים הראשונים של הפעלת תא T; שלבים רבים מאחורי הוא ההתפשטות בפועל 17,18.
עבור assay דילול צבע, צבע פלואורסצנטי CFSE מכתים תאים באמצעות קשירת קוולנטית חלבונים תאיים. לצבוע מראה ירידה תלוית התפשטות העוצמת פלורסנט, אשר יכול לעקוב אחר מספר חלוקות תא. עם זאת, בשל תיוג חלבון קוולנטיים, התפקידים אלהאפשר להתפשר חלבונים. צבען הוא רעיל לתאים בריכוזים גבוהים. בריכוזים לצבוע נמוכים, לעומת זאת, את עוצמת הקרינה הראשונית מצטמצמת, ומקטינה את מספר חלוקות תא שניתן לעקוב אחריהם. בנוסף, לאחר תיוג עם CFSE, יש אובדן 50% ~ עצמאית-התפשטות קרינה ראשונית במהלך התקופה 24 עד 48 השעות הראשונות, אשר מגבילה את הטווח הדינמי של assay זה 19,20.
רוב המבחנים אלה משקפים את המצב הקולקטיבי של מספר הגדול של תאים ודורשים לטיפול בתאים עם צבעי ניאון. תאי נימקי אפופטוטיים עשויים גם לתרום מדידות אלה, אלא אם כן הם מוסרים מן הניתוח על ידי צביעה עם כימיקלים או נוגדנים.
Blastogenesis לימפוציטים יכול להיות מוערך על ידי מגוון שיטות, כגון מיקרוסקופיה אופטית או cytometry זרימה 4,21,22. כאן אנו מתארים שיטה מהירה למדידת גדלים תאי T באמצעותn אוטומטית דלפק תא, אשר אוסף תמונות תא בזמן אמת מאוחסן וניתן מחדש נתחו במועד מאוחר יותר. בנוסף מדידות גודל, המכשיר הזה מספק מספרים סלולריים מדויקים באחוז תאי קיימא, כפי שנקבע על ידי הרחקת כתם הכחולה trypan. המכשיר בשימוש בפרוטוקול זה זמין מסחרי, ואת היצרנית נבדקת הדיוק של המכשיר באמצעות שלושה כלים שונים ובקרות ריכוז כדאיים כמה. תוצאות המחקרים הללו הפגינו מקדם שונה כי היה בדרך כלל מתחת ל -6%. כפי שצוין בפרוטוקול, המכשיר הוא מכויל על בסיס קבוע עם 6 מיקרומטר ו -8 מיקרומטר בקוטר חרוזי פוליסטירן. היתרונות של שימוש מונה תא להבדיל בין תאי T מנוחת lymphoblasts T מבוססים על קוטר תא הוא קלות שימוש ואת האופי האוטומטי של הניתוח. התוכנה מסוגלת של ציור עיגול סביב כל תא וחישוב קוטר התא. בנוסף, imגילים גלויים למפעיל, אשר יכול לאמת את הדיוק של המכשיר בזיהוי התא ונכון ציור עיגול סביבם. במונחים של מגבלות, המכשיר לא יכול כשלעצמו להבדיל בין פסולת ותאים; ולכן, חשוב כי המפעיל רואה בכל תמונה כפי שהיא מעובדת. קיים פוטנציאל לשילוב בועות אוויר, אשר יקטין את מספר תחומים אפשריים לניתוח; עם זאת, זה נדיר אם החזקת השטיפה הרגילה מבוצעת.
במחקר זה, קבוצות של לימפוציטים מסוג T הטחול היו מגורה עם ionomycin והגדלת ריכוזי PMA עבור 12-48 שעות. ריכוזי PMA נמוכים כמו 2 ng / ml הוא מושרה תגובה blastogenic חזקה ושגשוגם משמעותי. מדידות של תופעות של מספר תרופות, כגון ציקלוספורין A immunosuppressants (CsA), FK506 (tacrolimus), ו rapamycin (sirolimus), כמו גם טראם-34 חוסמי תעלות יונים FTY720 (fingolimod), על blastogenesis הפגין הסכם טוב עם אפקטים דיווחו על התפשטות. תגובת blastogenic של PBMCs אדם PMA / ionomycin ו murine גירוי תאי T עם אנטי CD3 ואנטי-CD28 מצופה נוגדנים חרוזים מגנטיים נמדדה גם.
את assay דלפק התא מכמת הוא blastogenesis ואת קצב ההתפשטות (צפיפות תאים) בו זמנית, אך בנפרד, להבדיל מהשיטות הנ"ל, אשר להסתכל שילוב של השפעות אלו. הפרוטוקול המובא מספק טכניקה מהירה וחזקה על מנת לאמוד את עוצמת סוכני mitogenic ואת המערכת החיסונית.
Protocol
כל הניסויים מבוצעים בהתאם הפרוטוקולים שאושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מעבדה באוניברסיטת רייט סטייט ועדת שימוש סקירה מוסדיים המנהלים.
הערה: PBMCs אדם מבודדים בשיטת צנטריפוגה צפיפות שיפוע Ficoll 5.
1. טחול קציר
- בוגרי בית עכברי ICR נקבה בתנאי מעבדה רגיל, מזון, מים, ודרישות מצעים ספציפיות למין.
היו בעלי חיים בגיל ממוצע של 2.9 חודשים ומשקל ממוצע של 30.4 גרם בזמן של המתת חסד: הערה. - במועד הבידוד (DOI), להרדים את החיות בנפרד ללא חיות conspecific אחרות נוכחיות. הפוך את כל המאמצים על מנת להבטיח מתח מינימלי על העכבר. להרדים באמצעות CO 2 עם נקע בצוואר הרחם משנית להבטיח מוות.
- מניח את החיה, עדיין בתוך כלוב ההעברה, החדרת CO 2 ו STAרט את זרימת הגז ב 5 ליטר / דקה. קצב זרימה זה מחליף חמצן על דקות 10-30% לכל המומלצים.
- אחרי החיה היא מחוסר הכרה, להגביר את קצב זרימת CO 2 כדי 15 L / min. בדוק את החיה להפסקת הנשימה ולהשאיר בתא במשך 2 דקות נוספות.
- החל נקע בצוואר הרחם בעוצמה הסחת דעת כדי להבטיח מוות.
- קציר את הטחול מן החיה באמצעות הטכניקה aseptic בתוך 10 דקות של מוות.
- לעקר שני סטים של מספרי מלקחיים להסרת הטחול ב חיטוי בתנור לפני השימוש. לעקר את השטח לנתיחה על ידי יישום 70% אתנול.
- החל 70% אתנול אל בטן העכבר. באמצעות סט אחד של מספרי מלקחיים, לעשות חתך בתוך הפרווה והעור מהאגף השמאלי של הבטן, ואז לפרק לקלף בחזרה את העור לחשוף הצפק. לאחר שנחשף, להחיל 4% פתרון כלורהקסידין לפני פתיחת הצפק.
- באמצעות הסט השני של scissors מלקחיים, לעשות חתך 2 עד 3 סנטימטר לאורך הבטן המרכזית. פתח את הצפק ולהסיר את הטחול על ידי חיתוך משם מצורפים קרבי שומן עודף. מניח את הטחול מלוח פוספט שנאגר של Dulbecco (DPBS).
2. הכנת גלם Splenocytes
הערה: בצע את כל השלבים תחת ארון בטיחות ביולוגי זרימה למינרית באמצעות טכניקה מזוהמת.
- משרים את טחול שנקטפו 10 מ"ל של H סטרילי ללא יונים 2 O למשך 5 דקות בצלחת תרבות 10 ס"מ עד lyse אריתרוציטים השטח.
הערה: שלב זה יכול להיות מושמט אם הטחול נפגע במהלך בידוד. - כדי לשחרר את splenocytes, לרסק את הטחול בין שתי שקופיות זכוכית מעוקרות (בצד חלבי מול הטחול) על צלחת תרבות טריה 10 סנטימטרים. מערבבים עם 10 מ"ל של RPMI-1640 בתוספת 10% בסרום שור עוברית, 2 מ"מ L- גלוטמין, 50 IU / פניצילין מ"ל, ו -50 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין (להלן התייחסs להשלים RPMI).
- סנן את התאים דרך מסננת תא ניילון סטרילי 40 מיקרומטר לתוך צלחת תרבות 10 ס"מ חדש להסרת הרקמה ופסולת החיבור.
- Lyse אריתרוציטים הנותרים על ידי הוספת 20 מ"ל של חיץ תמוגה RBC מורכב 155 מ"מ NH 4 Cl, 10 מ"מ NaHCO 3, ו 0.1 מ"מ EDTA ב- pH 7.4 ו ~ 300 mOsm / L.
הערה: osmolality נמדדת על ידי נקודת קיפאון או osmometer לחץ אדים.- העברת התאים מהצלחת של 10 ס"מ לצינור צנטריפוגות חרוטי 50 מ"ל ב 250 XG במשך 10 דקות (4 ° C).
- הסר את supernatant, להוסיף 20 מ"ל של חיץ תמוגה RBC, מחדש להשעות את התאים pelleted ידי pipetting.
- דגירה בטמפרטורת חדר במאגר תמוגה למשך 10 דקות עם נדנדה עדינה.
- צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 250 XG (4 מעלות צלזיוס) עד גלולת התאים. יוצקים את חיץ תמוגה.
- Re להשעות תאים 10 מ"ל של RPMI להשלים צנטריפוגות שוב (250 XG, 10 דק ', 4 ° C). דיסקARD supernatant.
- Re- להשעות את splenocytes ב 2 מיליליטר של RPMI להשלים חמם עד 37 מעלות צלזיוס למשך העברה לעמודת סיבי צמר ניילון.
טיהור 3. T לימפוציטים
- שטפו את עמודות צמר ניילון פעמיים עם 5 מ"ל של RPMI להשלים. לדגור על 37 מעלות צלזיוס חממת תרבית תאים 5% CO 2 עבור שעה 1.
הערה: זה הכרחי כדי לשמור על צמר ניילון רטוב למשך הניסוי להשתמש RPMI להשלים חימם עד 37 מעלות צלזיוס במשך כל צמר ניילון צעדים בידוד. - להוסיף splenocytes מבודד לעמודה דגירה במשך שעה 1 כדי לאפשר תאי B, פיברובלסטים, ותאי אביזר לדבוק צמר ניילון.
- הוסף 2 מ"ל של RPMI המכיל את splenocytes לתוך הטור ועוברים עד שהחלק העליון של צמר ניילון הוא הגיע.
- הוסף 2 מ"ל של RPMI להשלים חימם עד 37 ° C על גבי צמר ניילון ולהעביר המדיום בצמרעד רמת הנוזל מגיעה המשטח העליון.
- הוסף 3 מ"ל של חם RPMI להשלים לעמודה לכיסוי צמר ניילון לחלוטין.
- דגירת העמודה הטעונה באין מפריעה בתוך חממת תרבית תאי 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור שעה 1.
- Elute את התאים על ידי שטיפת טור פעמיים עם 5 מ"ל של RPMI להשלים. בצע לשטוף נוסף של תאי eluted על ידי צנטריפוגה.
- מלא את עמודת 2 הפעמים העליונות עם RPMI מלא ולאפשר הפתרון בעמודה לזרום לתוך צינור חרוטים 50 מיליליטר סטרילי.
הערה: הימנע קשה או הקפצת הטור, אשר יכול לסלק את תאי B, תאי אבזר, ו פיברובלסטים דבקים צמר הניילון. - אסוף את שבריר ספין זרימת הדרך ב 250 XG במשך 10 דקות (4 מעלות צלזיוס) עד גלולת התאים. שטפי פעם עם 10 מ"ל של RPMI להשלים. גלולה התאים שוב (250 XG, 10 דק ', 4 ° C) מחדש להשעות ב 2 מ"ל של RPMI להשלים.
- מדוד את ג ell צפיפות באמצעות hemocytometer ו לדלל ב RPMI להשלים 0.5 x 10 6 תאים / מ"ל.
- זרע 1 או 2 מ"ל aliquots של תאים לתוך הבאר כל צלחת תרבית תאים 24 או 6 היטב, בהתאמה, והתרבות התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
הערה: 1 מ"מ 1,4-dithiothreitol (DTT) ניתן להוסיף כל טוב בשלב זה כדי לשפר הישרדות תאי T. - אופציונלי: לאשר את היעילות של פרוטוקול בידוד על ידי cytometry הזרימה. פרוטוקול זה בדרך כלל מניב ~ 80% T לימפוציטים 23.
הערה: ניילון מטוהרים צמר התאים מכילים כ 50% CD4 + ו- 23% CD8 + תאים. כדי לטהר את CD4 + ו- CD8 + תת-אוכלוסיות נוספות, צעד דלדול immunomagnetic יחיד יכול להתבצע באמצעות שמונה נוגדנים חרוזים מגנטיים 24. לחלופין, טהור CD4 + ו- CD8 + אוכלוסיות תא T יכולים להיות מבודדים על ידי סלקציה חיובית או שלילית עם נוגדנים ספציפיים.
- מלא את עמודת 2 הפעמים העליונות עם RPMI מלא ולאפשר הפתרון בעמודה לזרום לתוך צינור חרוטים 50 מיליליטר סטרילי.
- הפעל לימפוציטים מסוג T תוך 24 שעות של בידוד באמצעות תוספת של PMA ו ionomycin מלח סידן או חרוזים מגנטיים מצופה נוגדנים אנטי CD3 ואנטי-CD28 23,25,26. להוסיף תרופות ניסיוניות (למשל, CSA, FK506, rapamycin, טראם-34, ו FTY720) בעת ההפעלה.
הערה: כאן, ריכוזי PMA נע בין 2 250 מל / ng, ואת ריכוז ionomycin נשמר ב 250 ננומטר. צריכים להיות מוכנים דילולים במידת האפשר, מן aliquots מלאי של כל תרופה כך נפח מתווסף גם כל התאים הוא ≥1 μl כדי להבטיח שחזור. חרוזים מגנטיים אנטי CD3 / אנטי-מצופה-CD28 מתווספים יחס של 1: 1 חרוז אל התא. הגדלת מספר חרוזים לכל תא (כלומר, חרוז אל תא היחס) יהיה להגביר את עוצמת גירוי 25,26. החרוזים נשטפים מחדש תלויה RPMI להשלים לפני כן שלהם אל התאים. שים לב trypanכחול מכתים את החרוזים. - תרבות התאים עבור 12-72 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 לפני הניתוח עם דלפק התא האוטומטי.
אוסף 5. תא האוטומטי מונים נתונים
- לפני הפעלת המדגם, לוודא כי התאים מעורבבים בעדינות עם טפטפת סרולוגיות להימנע גושים. הדבר חשוב במיוחד עבור לימפוציטים הופעל בגלל הדביקות המוגברת שלהם.
- עבור תרבויות אשר מופעלים עם חרוזים אנטי CD3 / CD28, לאחר pipetting, להעביר את המדגם כדי צינור צנטריפוגות 1.5 מ"ל או 2 מ"ל. הפרד את החרוזים על ידי שמירה על הצינור על אבן שואבת 1-2 דקות. השתמש supernatant המכיל את התאים לניתוח.
הערה: לנתח שני תאים נחים והופעל בתוך 1 hr לתת דין וחשבון על כל הפעלה מראש של תאים נחים על ידי נסיוב נוכח המדיום לתרבות. לאחר 12 שעות של PMA / ionomycin גירוי, עלייה קטנה בגודל התא לא הורגש (איור 2
- עבור תרבויות אשר מופעלים עם חרוזים אנטי CD3 / CD28, לאחר pipetting, להעביר את המדגם כדי צינור צנטריפוגות 1.5 מ"ל או 2 מ"ל. הפרד את החרוזים על ידי שמירה על הצינור על אבן שואבת 1-2 דקות. השתמש supernatant המכיל את התאים לניתוח.
- העברת 1 מיליליטר של השעית התא לתוך כוס מדגמת ולהפעיל אותו באמצעות דלפק התא האוטומטי על פי ההוראות.
הערה: עבור כל הניסויים, מינימום של 1 מ"ל (מקסימום של 2 מ"ל) של תרבית תאים אמור לשמש. מונה התא האוטומטי בעזרת מזרק לערבב trypan כחול עם השעית התא ומעביר את התערובת הכחולה trypan התא מעל שדה כי הוא צלם ונותח על ידי התוכנה. התוכנה מזהה תאים כחול מוכתם trypan, מציירת עיגול סביב כל תא, וקובע את הקוטר. תמונות 100 נאספים מכל מדגם, כדאיות התא וגדלים נחושים. סף הגילוי של דלפק התא משמש כאן יש גבול תחתון של 5 מיקרומטר. - העברת נתונים מכל לרוץ גיליון אלקטרוני לניתוח נוסף.
- כייל את המכשיר על בסיס קבוע באמצעות 1מדגם מ"ל של 6 מיקרומטר ו -8 מיקרומטר בקוטר חרוזי פוליסטירן.
ההערה: הגדלים החרוזים בפועל נמדדו על ידי היצרן עבור כל אצווה אמורים לשמש, לא גודל הנומינלי. 6 ו -8 מיקרומטר חרוזים נוחים כי קטרים אלה קרובים בקטרים הצפויים של מנוחה ותאי T מופעלים (ראו איור 1).
6. נתונים וניתוח סטטיסטי
- לנתח את הנתונים באמצעות תוכנה סטטיסטית גרפים מתאימות.
הערה: גיליון אלקטרוני עבור כל מחזור מכיל את מספר התאים עם כל בקוטר (טווח: 5 מיקרומטר עד 70 מיקרומטר). התאים מעל בקוטר 17 מיקרומטר יוסרו מהניתוח להוציא חלקיקי אבק בועות קטנות, אשר ניתן לקרוא כמו תאי קיימא על ידי המכשיר. - בצע בדיקת שערות באמצעות מבחן t של וולש עבור ערכות נתונים עם שונות שוויוניות; תוצאות נחשבות משמעותיות מבחינה סטטיסטית אם p <0.001. הנוסחה המשמשת היה,
איפה
ו 
הם אמצעי מדגם, 
ו 
הם סטיות מדגמות, 
ו 
גודל מדגם הם עבור כל קבוצת נתונים. מספר דרגות החופש מוערך באופן שמרני באמצעות הנמוך מבין שני המדגמים עבור כל השוואה. גרפים ברים מוצגים כממוצע ± SEM.
ו 
הם אמצעי מדגם, 
ו 
הם סטיות מדגמות, 
ו 
גודל מדגם הם עבור כל קבוצת נתונים. מספר דרגות החופש מוערך באופן שמרני באמצעות הנמוך מבין שני המדגמים עבור כל השוואה. גרפים ברים מוצגים כממוצע ± SEM. Assay הפצת הטחול T-לימפוציטים 7.
- מדוד התפשטות תאי T באמצעות MTS- או assay התפשטות קוראת צלחת colorimetric מבוסס MTT.
הערה: assay הוא בסיסד על המתחם MTS tetrazolium (מגיב של אוון) הפחתה למוצר formazan מסיסים, ככל הנראה על ידי NADPH או NADH המיוצר בתאים פעילים מבחינה מטבולית על ידי אנזימים dehydrogenase. - ספירת תאי T מטוהרים עם hemocytometer מחדש להשעות אותם RPMI-1640 מלאים בצפיפות סופית של 1 x 10 6 תאים / מיליליטר.
הערה: 1 מ"מ DTT ניתן להוסיף את התאים בשלב זה. - הפעל את התאים עם PMA ו ionomycin יחד עם תרופות הבדיקה, אם נדרש, ומערבבים בעדינות (בדומה לשלב 4).
- פלייט 100 μl של תאים בכל טוב של צלחת מטופלים תרבית תאים 96-היטב לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 למשך 48 שעות. הוספת 100 μl של התקשורת RPMI-1640 ללא תאים לתוך אחד טוב כדי לקבל קריאה של ספיגת הרקע.
- הוסף 20 μl של מגיב מבוסס MTS זה היטב לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 למשך 4 שעות.
- קח מדידות ספיגות ב 490 ננומטר באמצעות קורא צלחת. אמדידות bsorbance מתאימות מספר תאים פעילים מבחינה מטבולית בכל טוב.
הערה: נפחית רמות הרקע במידת הצורך. הערכים הספיגים רקע תלויים בסוג של מדיום התרבות, סרום, pH החיצוני, ומשך החשיפה מגיבה MTS לאור. ריאגנטים מבוססים MTS הם רגישים לאור, ואת החשיפה לאור במשך כמה שעות זה עשויה לגרום לערכים ספיגים רקע גבוה.
Representative Results
השתמשנו assay זה להשוות את תהליך יצירת הפיצוץ לימפוציטים במהלך גירוי עם PMA, אסתר phorbol, ו ionomycin, ionophore סידן. איור 1 א מציג את התפלגות תדירות בקטרים של המנוחה ותאי הטחול T פרמקולוגית מופעל. טיפול של תאים עם PMA / ionomycin עבור ~ 2 ימים הביא שינוי משמעותי בהרכב החציון של ההתפלגות כלפי בקטרים גדולים יותר (ראה, למשל התייחסות 4). מספר התאים עם בקטרים קטנים הופחת בהתאם. על מנת לוודא כי המכשיר שלנו דיווח על בקטרים הנכונים, בצענו שני כיולים עם חרוזי פוליסטירן של 6 מיקרומטר ו -8 מיקרומטר בקטרים (ראה לוח חומרים). דמויות 1B ולהראות 1C קריאות מתאי מופעל T גבי עם 8 מיקרומטר סטנדרטיים נח תאי T גבי עם תקן 6 מיקרומטר. דמות1D מציג את גדלי חרוז בקרה חלו ידי היצרן זממו נגד בקטרים החציוני נמדדו עם דלפק התא האוטומטי שלנו. נראה שגודל 6 מיקרומטר היה להפריז מעט במדידות שלנו, ככל הנראה בשל סף המדידה של המכשיר שיש גבול תחתון של 5 מיקרומטר. עם זאת, סטיית ההתקן של הקטרים החרוזים שנמדדים מדידות תא הדלפק הייתה בהסכמה עם סטיית תקן דיווח על ידי היצרן. אנו מסיקים מניסויים אלה שמכשיר זה יכול לשמש באופן מהימן להשוות מנוחה וגדל T-cell עכבר מגורה mitogen ושהמכשיר יכול למדוד את קטרי תא בפועל במדויק.
אנחנו מכן המשכנו לבחון את התלות של עליית הקוטר הממוצעת על ריכוז PMA ומצאנו כי, בריכוז קבוע ionomycin של 250 ננומטר, השפעת PMA לא שונתה באופן משמעותי על ידי הרמת f ריכוזוROM 2 250 מל / ng (איור 2 א). באמצעות assay MTS המבוסס, מדדנו התפשטות תאי T ב -50 ו -250 ng / ml PMA ולא מצאנו הבדל ניכר (איור 2 ג), בהסכם עם נתוני קוטר תא שלנו. א 'ציקלוספורין תרופות מעכב calcineurin (300 ננומטר) FK506 (1 ננומטר) דיכא גם blastogenesis (תרשים 2B) ושגשוגם (איור 2 ג). עיכוב לא להשלים בשני המקרים, עם זאת. המדידות שבוצעו 12 שעות לאחר PMA / בנוסף ionomycin הראה גידול של 7.2% ו -6.8% בקוטר 50 ng / ml ו -250 ng / ml PMA, בהתאמה (איור 2 ד). גודל עליות בשני ריכוזים אלה לא היו שונים משמעותית, כפי שהיה נהוג במשך 48 שעות גירוי (להשוות איור 2 א).
נתוני קוטר התא שנאספו נח ותאי T מופעלים לאחר 48 שעות של גירוי PMA / ionomycin מסוכמים
גם בדקנו תרכובות כימיות אחרות דיווחו להיות אימונוסופרסיבי: CSA, FK506, rapamycin, FTY720, וחשמלית-34. באיור 3, מדידות גודל תא שהושגו מנוחה והופעלו תאי T בהעדר והנוכחות של תרופות אלו מוצגות. CSA ו FK506, אשר למקד את הפקטור הגרעיני תלוי calcineurin של תאי T מופעלים (NFAT) 27,28, היו החזק ביותר, עיכוב תגובת blastogenic בכמעט 72% (איור 3 א ו 3 ב). מעניין, עםריכוזים PMA גדל, את העוצמה של CSA ו FK506 ירד מעט, למרות לא היה גידול בקוטר תא נוסף בהעדר תרופות אלו (איור 2 א ו -2). Rapamycin, גידול חיסון מעכב יעד יונק of rapamycin (mTOR) 29,30, היה השפעה מתונה אך מובהקת סטטיסטית (איור 3 א, 3 ב ו -3 ג). FTY720 הוא אגוניסט קולטן 1-פוספט sphingosine המעכבת יציאה הלימפוציטים למחזור 31 ו נמצא לאחרונה לעכב TRPM7, ערוץ קטיון מבוטא בכמות גבוהה ב T לימפוציטים 32. שניהם FTY720 ו rapamycin היתה השפעה דומה על blastogenesis, צמצום זה מן הממוצע של גידול של 52% בקוטר של כ 34% (איור 3 א ו 3 ב). טראם-34 הוא חוסם של תעלות אשלגן המופעל סידן KCa3.1 33. נבדק ב 700 ננומטר, טראם-34 לא היה יעיל בתאי T בעכברים, אניn בהתאם מחקר התפשטות תאי T האנושיים אחרון; העוצמה שלה יכולה להיות תלויה באופי וכוח של גירוי mitogenic 34 (איור 3 א ו 3 ב). טראם-34 700 ננומטר היה יעיל בחסימת ערוצי KCa3.1 בניסויים electrophysiology מהדק תיקון שלנו (מידע לא מוצג). השוואה זו נעשתה בין מנוחה ותאים שנחשפו תרופה בניסוי מרובה באותו הניסוי ב 48 שעות. כאשר Rapamycin ו CSA שמש יחד, blastogenesis היה מופנם לחלוטין (איור 3 ג).
הפעלה של תאים T בעכברים עם חרוזים מגנטיים אנטי CD3 / אנטי-מצופה-CD28 במשך 72 שעות המיוצר עלייה של 27% ב הקוטר הממוצע, אשר הופחת ל 5% בנוכחות של CSA (איור 3D). תאי mononuclear אדם באקטיבציה PMA / ionomycin במשך 48 שעות גדלו קוטר ב -33%, והפעלה בנוכחות של CSA ירד התגובה ל -23% (
איור 1: הפצות תדר של קטרי T-cell טחול Murine. (א) עמודות שחורות הצביע המנוחה ועמודות אדומות עולות PMA / ionomycin המופעל תאים (48 שעות). (ב) הפצות של תאי T הטחול מופעל על גבי תקן כיול גודל החלקיקים 8 מיקרומטר. (ג) הפצות של נח תאי T על גבי סטנדרט כיול 6 מיקרומטר. המספרים של תאים וחרוזים בשימוש מסומנים בקופסאות. (ד) חציון בקוטר נמדדת דלפק התא זמם נגד קוטר החרוז דיווח על ידי היצרן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
בתוך-page = "1"> 
איור 2: תלות של הפעלת תאי T בעכברים על ריכוז PMA. (א) בקטרים Mean של תאי T או מטופל או מטופלת עם 2, 50, ו 250 ng / ml PMA בכל ionomycin ריכוז קבוע (250 ננומטר). (ב) מדידות תא הדלפק של המנוחה והופעל (2, 50, 250 ng / ml PMA) תאי T בהעדר ונוכחות של CSA 300 ננומטר או 1 ננומטר FK506. (C) MTS assay התפשטות ב -50 ו -250 ng / ml PMA עם 250 ננומטר ionomycin בהעדר ונוכחות של 300 ננומטר CSA. הבדלים משמעותיים (p <0.001) מסומן עם כוכביות. n הוא המספר הכולל של ניסויים. הממצאים מתוך תאים מבודדים מן 3 עכברים. (ד) בקטרים תא של המנוחה ותאי T מופעל (250 ng / ml PMA ו -250 ionomycin ננומטר) 12 שעות לאחר הפעלת בהעדר ונוכחות של CSA 300 ננומטר. "Target =" pload / 55,212 / 55212fig2large.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: השפעות של CSA, FK506, FTY720, rapamycin, וחשמלית-34 על גודל התא. (A ו- C) בקטרים ממוצעים של מנוחת PMA / ionomycin המופעל תאים בעכברים T בהעדר והנוכחות של תרופות. ריכוזים מוצגים בתיבה. (ב) נתונים מתוך מבוטא הגידול האחוז לעומת קוטר תאי T מנוחה. הפעלת לימפוציטים בוצעה עם 250 ng / ml PMA ו -250 ננומטר ionomycin, ואת המדידות נלקחו לאחר 48 שעות. (ד) מדידות דלפק תא של מנוחה אנטי CD3 / תאי T המופעל CD28, 72 שעות לאחר הפעלת בהעדר ונוכחות של CSA 300 ננומטר.rge.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: Blastogenesis ב PBMCs אדם על גירוי mitogen. (א) עמודות שחורות הצביע המנוחה ועמודות אדומות עולות PBMCs מופעל. (ב) בקטרים Mean של מנוחה PBMCs מופעל בהעדר ונוכחות של CSA 300 ננומטר. תאים הופעלו עם 250 ng / ml PMA ו -250 ננומטר ionomycin, ואת המדידות נלקחו לאחר 48 שעות של הפעלה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| Column1 | מנוחה | מוּפעָל | CsA 100 ננומטר | CsA 200 ננומטר |
| קוטר ממוצע | 6.94 מיקרומטר | 9.78 מיקרומטר | 8.19 מיקרומטר | 7.92 מיקרומטר |
| עלייה ממוצעת קוטר | 40.92% | 17.88% | 14.09% | |
| שטח פנים ממוצע | 151.37 μm² | 300.61 μm² | 210.56 μm² | 197.22 μm² |
| עלייה ממוצעת שטח פנים | 98.59% | 39.00% | 30.16% |
טבלה 1: סיכום של קוטר התא הממוצע ועליות יחסיות שטח פנים. מדידות בוצעו 48 שעות לאחר הפעלת עם 250 ng / ml PMA ו -250 ננומטר ionomycin.
Discussion
כאן אנו מתארים טכניקת האיתור וכימות המהיר של טרנספורמציה T-cell blastogenic באמצעות דלפק תא אוטומטי. בתנאים שלנו (250 ng / ml PMA ו -250 ננומטר ionomycin גירוי), באזור תא השטח הוגדל כפולה ושלושה פי נפח לאחר 48 שעות של הפעלה. Assay הוא רגיש מספיק כדי לזהות פיצוץ במהלך ההפעלה 12 שעות של הראשון, כאשר נפח התא גדל רק 1.25 פי לעומת נח (2D איור). מנגנון רלוונטי יותר פיסיולוגי של הפעלת תאי T באמצעות אנטי CD3 ו חרוזים מגנטיים מצופה נוגדן אנטי CD28 היוצר תגובת blastogenic משמעותית, עם גידול פי 2.3 בממוצע בנפח (72 שעות לאחר הפעלה, איור 3D). תאים mononuclear אדם הראה שינוי 2.6 של פי נפח על PMA / ionomycin גירוי במשך 48 שעות (איור 4). הקוטר הממוצע של תאי T טחול עכבר ICR והנפח נקבעו6.9 מיקרומטר ו 1.9 x 10 -4 NL, בהתאמה. PBMCs אדם (מתורם בריא אחד) היה בקוטר ממוצע של 7.7 מיקרומטר ו היקף ממוצע של 2.7 x 10 -4 NL. שימוש בפרוטוקול זה, אנחנו גם נבדק ריכוז גדל והולך של PMA על יכולתם להפעיל תאי T. תוצאות חד-תאיים אלה עלו בקנה אחד עם מבחני התפשטות ביצע בריכוזים PMA דומה.
תרכובות דיווחו מספר להשפיע שגשוג התאים נבדקו: FTY720 31,32; א ציקלוספורין immunosuppressants, FK506, ו Rapamycin 27,28; וחשמלית-34, חוסם ערוצי KCa3.1 המופעל סידן 33,35. מצאנו כי, בריכוזים שנבדקו, המעכבים החזקים ביותר של blastogenesis היו CSA ו FK506. היה Rapamycin השפעה מדכאת קטנה אך משמעותית מבחינה סטטיסטית על blastogenesis. טראם-34, מצד שני, לא השפיע blastogenesis.
CsA דיכא גם blastogenesis ו- proliferation, אבל לא לגמרי (האיור 2B ו 2C), ההוכחה כי מדידה נגד תא אוטומטי הוא לתאם טוב של יעילות תרופה בהתרבות תאי T. בנוכחות rapamycin יחד עם CSA, blastogenesis היה מופנם לחלוטין, דבר המצביע על כך NFAT- ושבילים בתיווך mTOR בשילוב יכול להסביר באופן מלא להגדלת תאי T על גירוי mitogenic עם PMA / ionomycin (איור 3 ג).
הטווח הדינמי של מבחני התפשטות כמה מוגבל (ראה איור 2). מבחני הפצת נשק, כמו זו השתמשנו (איור 2 ג), לדווח אות הכוללת תרומות תאים אפופטוטיים ו נמקי. מדידות שינוי בקוטר אוטומטיות אין מגבלה, כמו המדידות נוגעות תאי קיימא בלבד. כדאיות התא מוערך על ידי הרחקה של כתם כחול trypan מתאי בריא, בר קיימא. במדידות גודל, באמצעות קדימהפיזור אור בתזרים cytometry אפלית תא כפיל יכול להיות בעייתי 22. בשנת המדידות נגד תא האוטומטי, לא אוכלוסיית כפיל נמצאה (איור 1). כמו כן, המדידה הייתה מדויקת מספיק כדי להבחין בין ההשפעות של 100 ו -200 ננומטר ציקלוספורין (טבלת 1), וכדי לזהות blastogenesis בתוך 12 שעות של גירוי mitogenic (איור 2 ד).
assay חדש תכונה זו שימושית במיוחד עבור מספר קטן של דוגמאות. עד 15 דגימות יכולות להימדד 1 hr. עם זאת, assay יש מגבלות, שרובן ניתן למתן. למרות שזה יכול למעשה לפתור קטן (<1 מיקרומטר) ההבדל בקוטר התא, מודל המכונה השתמשנו שסף זיהוי ותחתון של 5 מיקרומטר. מגבלה זו יכולה לגרום יתר של גדלי תאים קטנים מאוד, שכן הוא יעיל כולל את כל תאים עם בקטרים קטנים. עם זאת, הדגמים החדשים של הדלפק תא יש דיש זיהויבנים של ~ 2 מיקרומטר, אשר אמור להקל על בעיה זו. אם יש יותר מדי פסולת במדגם, המכשיר מתייחס אליהם תאי קיימא כמו. בנוסף, בועות אוויר יכולות לקבל מדי פעם לתוך תא הזרימה ולגרום לעיוות של תמונות התא שנתפסו על ידי מכונה. העיוות אינה מופיעה כדי להשפיע על קביעת הכדאיות, אבל זה יכול להשפיע על בקטרים הנמדדים. לכן, מומלץ כי כל התמונות להיבדק על ידי הנסיין בועות אוויר לפני נתוני כל ניסוי מתקבלים לניתוח. מאז התוכנה רק שואבת במעגלים סביב התאים, בקטרים של תאים שאינם כדוריים עשויים להיות מוטים כלפי ציר הזמן, מה שהופך את assay פחות מתאים תאים שאינם כדוריים.
assay זה הוא מהיר, לוקח דקות 4 כ לדגימה, לעומת מבחני התפשטות, אשר דורשים מספר שעות. איסוף נתונים הוא גם די פשוט באמצעות התוכנה מצורפת להתקן. התוכנה יכולה לייצא נתוני מדידה על spreadsheet לניתוח. לבסוף, הוא תא בודד, בניגוד אוכלוסייה, מדידה; הן blastogenesis ושגשוגם נמדדים; והיא מבדילה בין תאי קיימא ומתים בעת ובעונה אחת. ניתן להשתמש בו כדי להעריך זני עכבר שונים על יכולת הר תגובה חיסונית. Assay יכול לשמש גם בהצלחה לשקילה blastogenesis בתאי T מתורמי אדם (איור 4), והוא יכול לשמש גם סוגי תאים אחרים.
נפח עליות ניידות ידועות לתרום בוויסות של חילוף חומרים: נפיחות תא יעודד את סינתזת הגליקוגן נגרמת גלוטמין ו lipogenesis ב hepatocytes 36,37. נויטרופילים להציג עליות נפח הקשורים הגירה של 35-60%, ואילו סוכני chemotactic לגרום 10-15% נפיחות 38-40. את assay הנוכחי יכול לשמש פוטנציאל ללמוד תהליכים אלה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | Lonza | BW12-702F | |
| 40 μm nylon cell strainers | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | |
| nylon wool fiber columns | Polysciences, Inc. | 21759-1 | |
| 50 ml conical tubes | The Lab Depot | TLD431697 | |
| 6-well cell culture treated plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
| 96-well cell culture treated plates | Thermo Fisher Scientific | 130188 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-100 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | MTS based assay |
| Cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024 | |
| FK506 | Cayman Chemical Company | 104987-11-3 | |
| Rapamycin | Santa Cruz Biotechnology | sc-3504 | |
| TRAM-34 | Sigma-Aldrich | T6700 | |
| FTY720 | Sigma-Aldrich | SML0700 | |
| Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 | Gibco | 11456D | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Acros Organics | 356150010 | |
| Ionomycin calcium salt | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| Penicillin-Streptomycin | MP Biomedicals | ICN1670049 | 100x stock |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | HyClone | SH30378.02 | 10x stock |
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Research Products International | 12/3/3483 | reducing agent |
| 8 µm micro particle size standard | Sigma-Aldrich | 84192-5ML-F | Actual 8.02 µm |
| 6 µm micro particle size standard | Sigma-Aldrich | 89756-5ML-F | Actual 6.084 µm |
| Single magnetic separation stand for 1.5 - 2 ml tube | V&P Scientific, Inc. | VP772F5 | |
| Cell culture incubator | Forma Scientific | 3110 | |
| Synergy H1 hybrid reader | Bio Tek | BTH1M | |
| Vi-CELL cell viability analyzer | Beckman Coulter | 731050 |
References
- Weiss, A., Samelson, L. E. T-lymphocyte activation. Fundamental Immunology. Paul, W. E. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. Fifth ed 321-364 (2003).
- Gergely, P., Ernberg, I., Klein, G., Steinitz, M. Blastogenic response of purified human T-lymphocyte populations to Epstein-Barr virus (EBV). Clin Exp Immunol. 30 (3), 347-353 (1977).
- Sanderson, R. J., Rulon, K., Groeneboer, E. G., Talmage, D. W. The response of murine splenic lymphocytes to concanavalin A and to co-stimulator. J Immunol. 124 (1), 207-214 (1980).
- Decoursey, T. E., Chandy, K. G., Gupta, S., Cahalan, M. D. Mitogen induction of ion channels in murine T lymphocytes. J Gen Physiol. 89 (3), 405-420 (1987).
- Nibbering, P. H., Zomerdijk, T. P., Tilburg, A. J., Furth, R. V. Mean cell volume of human blood leucocytes and resident and activated murine macrophages. J Immunol Methods. 129 (1), 143-145 (1990).
- Segel, G. B., Cokelet, G. R., Lichtman, M. A. The measurement of lymphocyte volume: importance of reference particle deformability and counting solution tonicity. Blood. 57 (5), 894-899 (1981).
- Cooper, H. L., Braverman, R. Protein synthesis in resting and growth-stimulated human peripheral lymphocytes. Evidence for regulation by a non-messenger RNA. Exp Cell Res. 127 (2), 351-359 (1980).
- Cooper, H. L., Braverman, R. Close correlation between initiator methionyl-tRNA level and rate of protein synthesis during human lymphocyte growth cycle. J Biol Chem. 256 (14), 7461-7467 (1981).
- Teague, T. K., et al. Activation changes the spectrum but not the diversity of genes expressed by T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12691-12696 (1999).
- Tzur, A., Kafri, R., Lebleu, V. S., Lahav, G., Kirschner, M. W. Cell growth and size homeostasis in proliferating animal cells. Science. 325 (5937), 167-171 (2009).
- Messele, T., et al. Nonradioactive techniques for measurement of in vitro T-cell proliferation: alternatives to the [3H]thymidine incorporation assay. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (4), 687-692 (2000).
- Maghni, K., Nicolescu, O. M., Martin, J. G. Suitability of cell metabolic colorimetric assays for assessment of CD4+ T cell proliferation: comparison to 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) ELISA. J Immunol Methods. 223 (2), 185-194 (1999).
- Weichert, H., Blechschmidt, I., Schröder, S., Ambrosius, H. The MTT-assay as a rapid test for cell proliferation and cell killing: application to human peripheral blood lymphocytes (PBL). Allerg Immunol (Leipz). 37 (3-4), 139-144 (1991).
- Huang, K. T., Chen, Y. H., Walker, A. M. Inaccuracies in MTS assays: major distorting effects of medium, serum albumin, and fatty acids. Biotechniques. 37 (3), 406, 408 410-412 (2004).
- Rampersad, S. N. Multiple applications of Alamar Blue as an indicator of metabolic function and cellular health in cell viability bioassays. Sensors (Basel). 12 (9), 12347-12360 (2012).
- Quent, V. M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research. J Cell Mol Med. 14 (4), 1003-1013 (2010).
- Augustine, N. H., Pasi, B. M., Hill, H. R. Comparison of ATP production in whole blood and lymphocyte proliferation in response to phytohemagglutinin. J Clin Lab Anal. 21 (5), 265-270 (2007).
- Sottong, P. R., Rosebrock, J. A., Britz, J. A., Kramer, T. R. Measurement of T-lymphocyte responses in whole-blood cultures using newly synthesized DNA and ATP. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (2), 307-311 (2000).
- Wallace, P. K., Muirhead, K. A. Cell tracking 2007: a proliferation of probes and applications. Immunol Invest. 36 (5-6), 527-561 (2007).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Teague, T. K., Munn, L., Zygourakis, K., Mcintyre, B. W. Analysis of lymphocyte activation and proliferation by video microscopy and digital imaging. Cytometry. 14 (7), 772-782 (1993).
- Böhmer, R. M., Bandala-Sanchez, E., Harrison, L. C. Forward light scatter is a simple measure of T-cell activation and proliferation but is not universally suited for doublet discrimination. Cytometry A. 79 (8), 646-652 (2011).
- Lee, J., Sadelain, M., Brentjens, R. Retroviral transduction of murine primary T lymphocytes. Methods Mol Biol. 506, 83-96 (2009).
- Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail. J Immunol Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).
- Trickett, A., Kwan, Y. L. T cell stimulation and expansion using anti-CD3/CD28 beads. J Immunol Methods. 275 (1-2), 251-255 (2003).
- Pène, J., Rahmoun, M., Temmerman, S., Yssel, H. Use of anti-CD3/CD28 mAb coupled magnetic beads permitting subsequent phenotypic analysis of activated human T cells by indirect immunofluorescence. J Immunol Methods. 283 (1-2), 59-66 (2003).
- Sigal, N. H., Dumont, F. J. Cyclosporin A, FK-506, and rapamycin: pharmacologic probes of lymphocyte signal transduction. Annu Rev Immunol. 10 (1), 519-560 (1992).
- Fruman, D. A., Klee, C. B., Bierer, B. E., Burakoff, S. J. Calcineurin phosphatase activity in T lymphocytes is inhibited by FK 506 and cyclosporin A. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (9), 3686-3690 (1992).
- Pollizzi, K. N., Waickman, A. T., Patel, C. H., Sun, I. H., Powell, J. D. Cellular size as a means of tracking mTOR activity and cell fate of CD4+ T Cells upon antigen recognition. PLoS One. 10 (4), e0121710 (2015).
- Pollizzi, K. N., Powell, J. D. Regulation of T cells by mTOR: the known knowns and the known unknowns. Trends Immunol. 36 (1), 13-20 (2015).
- Mandala, S., et al. Alteration of lymphocyte trafficking by sphingosine-1-phosphate receptor agonists. Science. 296 (5566), 346-349 (2002).
- Qin, X., et al. Sphingosine and FTY720 are potent inhibitors of the transient receptor potential melastatin 7 (TRPM7) channels. Br J Pharmacol. 168 (6), 1294-1312 (2013).
- Wulff, H., Kolski-Andreaco, A., Sankaranarayanan, A., Sabatier, J. M., Shakkottai, V. Modulators of small- and intermediate-conductance calcium-activated potassium channels and their therapeutic indications. Curr Med Chem. 14 (13), 1437-1457 (2007).
- Petho, Z., et al. The anti-proliferative effect of cation channel blockers in T lymphocytes depends on the strength of mitogenic stimulation. Immunol Lett. 171, 60-69 (2016).
- Wulff, H., et al. Design of a potent and selective inhibitor of the intermediate-conductance Ca2+-activated K+ channel, IKCa1: a potential immunosuppressant. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (14), 8151-8156 (2000).
- Lang, F., et al. Functional significance of cell volume regulatory mechanisms. Physiol Rev. 78 (1), 247-306 (1998).
- Hue, L. Control of liver carbohydrate and fatty acid metabolism by cell volume. Biochem Soc Trans. 22 (2), 505-508 (1994).
- O'Flaherty, J. T., Kreutzer, D. L., Ward, P. A. Neutrophil aggregation and swelling induced by chemotactic agents. J Immunol. 119 (1), 232-239 (1977).
- Hsu, L. S., Becker, E. L. Volume changes induced in rabbit polymorphonuclear leukocytes by chemotactic factor and cytochalasin B. Am J Pathol. 81 (1), 1-14 (1975).
- Rosengren, S., Henson, P. M., Worthen, G. S. Migration-associated volume changes in neutrophils facilitate the migratory process in vitro. Am J Physiol. 267, 6 Pt 1 C1623-C1632 (1994).
