Summary
Kondrogenes från stamceller kräver finjustering av odlingsbetingelser. Här presenterar vi en magnetisk metod för kondense celler, för att ett väsentligt steg initiera kondrogenes. Dessutom visar vi att dynamisk mognad i en bioreaktor applicerar mekanisk stimulering till de cellulära konstruktionerna och förbättrar brosk extracellulär matrisproduktion.
Abstract
Brosk engineering fortfarande en utmaning på grund av de svårigheter i att skapa en funktionell implantat in vitro som liknar den naturliga vävnaden. Ett tillvägagångssätt har nyligen undersökt för utvecklingen av autologa ersättare innebär differentieringen av stamceller till kondrocyter. För att initiera denna kondrogenes, en komprimeringsgrad av stamcellema erfordras; följaktligen visade vi genomförbarheten av magnetiskt kondenserande celler, både inom tjocka byggnadsställningar och byggnadsställning fria, med användning av miniatyriserade magnetiska fältkällor som cell attractors. Denna magnetiska tillvägagångssätt användes också för att styra ballast fusion och för att bygga upp byggnadsställning-fri, organiserad, tredimensionell (3D) vävnader flera millimeter i storlek. Förutom att ha en förbättrad storlek, vävnaden bildad av magnetiskt driven fusion presenterade en signifikant ökning i uttrycket av kollagen II, och en liknande trend observerades för aggrekan uttryck. Som det nativa brosket utsattes för krafter thatt påverkade dess 3D-struktur, var dynamisk mognad också utföras. En bioreaktor som ger mekanisk stimuli användes för att odla de magnetiskt sådda ställningar under en 21-dagars period. Bioreaktor mognad i hög grad förbättrad kondrogenes in i de cellularized byggnadsställningar; den extracellulära matrisen som erhållits under dessa betingelser var rikt på kollagen II och aggrekan. Detta arbete beskrivs den innovativa potential magnetisk kondensation av märkta stamceller och dynamisk mognad i en bioreaktor för förbättrad kondrogen differentiering, både ställningsfria och inom polysackarid-ställningar.
Introduction
Magnetiska nanopartiklar används redan i kliniken som kontrastmedel för magnetisk resonansavbildning (MRI), och deras terapeutiska tillämpningar hålla expanderar. Till exempel, har det nyligen visats att märkta celler kan manipuleras in vivo med användning av ett externt magnetfält och kan styras och / eller bibehålls vid en definierad implantationsstället 1, 2, 3. I regenerativ medicin, kan de användas för att konstruera organiserade vävnader in vitro 4, inkluderande vaskulär vävnad 5, 6, 7, ben 8, och brosk 9.
Ledbrosk är nedsänkt i en avaskulär miljö, vilket gör reparationer av de extracellulära matriskomponenter mycket begränsade när skador uppstår. Av denna anledning research är för närvarande inriktad på konstruktion av hyalinbrosk ersättare som kan implanteras vid skadestället. För att framställa ett autologt ersätta, har vissa forskargrupper undersöka användningen av autologa kondrocyter som en cellkälla 10, 11, medan andra betonar förmågan hos mesenkymala stamceller (MSC) för att differentiera till kondrocyter 12, 13. I tidigare studier rekapituleras här, valde vi MSC, eftersom deras benmärgs sampling är ganska enkel och kräver inte att offra friska kondrocyter, som riskerar att förlora sin fenotyp 14.
Ett tidigt steg viktigt att inleda kondrogena differentieringen av stamceller är deras kondens. Cellaggregat är vanligen bildas med användning av antingen centrifugering eller mikromasskultur 15; emellertid dessa kondensationsmetoder neither presentera potential att skapa cellkluster inom tjocka byggnadsställningar eller potentialen att styra fusion av aggregat. I detta dokument beskriver vi en innovativ strategi för kondense stamceller med hjälp av MSC magnetisk märkning och magnetisk attraktion. Denna teknik har visat sig bilda byggnadsställningar fria 3D konstruktioner via fusion av aggregat med varandra för att erhålla en millimeterskala broskvävnad 9. Magnetisk sådd av tjocka och stora ställningar har också tillåtit möjligheten att öka storleken på den manipulerade vävnaden, designa en form lättare användbar för implantation, och diversifiera möjligheterna för kliniska tillämpningar i broskreparation. Här, vi detalj protokollet för den magnetiska sådd av MSC in i porösa ställningar sammansatta av naturliga polysackarider, pullulan och dextran, ställningar tidigare använts för att begränsa stamceller 16, 17. Kondrogen differentiering var Finally fördes i en bioreaktor för att säkerställa kontinuerlig näringsämne och gas diffusion in i matriskärnan av de byggnadsställningar som ympats med en hög täthet av celler. Förutom att ge näring, kondrogena tillväxtfaktorer och gas till cellerna, bioreaktorn erbjuds mekanisk stimulering. Övergripande, den magnetiska teknik som används för att begränsa stamceller, i kombination med dynamisk mognad i en bioreaktor, markant kan förbättra kondrogen differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Konstruktion av magnetiska anordningar
OBS: De anordningar som används för cellsådd varierar beroende på tillämpning (fig 1). Att bilda aggregat, är antalet celler begränsade till 2,5 x 10 5 / aggregat, så de magnetiska tips måste vara mycket tunna (750 um i diameter). Att ympa 1,8 cm 2/7 mm tjocka ställningar, måste magneterna vara större (3 mm i diameter) och kommer att säkerställa cellmigrering genom porerna i ställningen.
- Konstruktion av en anordning med mikromagneter för aggregatbildning (Figur 1A)
- Gör mikrohål med en 0,8-mm borr genom aluminiumplattor (3 cm i diameter och 6 mm tjocka).
- Infoga en magnetisk spets (750 | j, m i diameter) i varje hål av plattan.
- Placera denna skiva över en permanent neodymium magnet, som säkerställer magnetisering till mättnad.
- Konstruktion av en anordning för byggnadsställning sådd (
- Skära hårt polystyren in i 2,4 cm 2 rutor.
- Infoga 9 små magneter (3 mm i diameter, 6 mm long) på lika avstånd över en ytarea av 1,6 cm 2.
- Placera enheten över en permanent neodymmagnet.
2. Stamcells Märkning
OBS: Stem celler märktes med 0,1 mM magnetiska nanopartiklar för 30 min (2,6 ± 0,2 pg järn / cell) för att bilda aggregat, medan de märktes med 0,2 mM magnetiska nanopartiklar för 30 min (5 ± 0,4 pg järn / cell) till utsäde ställningar. Dessa nanopartikelkoncentrationer och inkubationstider har använts tidigare och publicerats för MSC och andra celler 18, 19, och det har fastställts att nanopartiklar påverkade varken cellviabiliteten eller MSC-differentiering kapacitet. Järnmassan införlivas genom stamcellema mättes via singel-cell magnetophoresis 19, 20.
- Kultur humana mesenkymala stamceller (MSC) i fullständigt mesenkymal stamcell tillväxtmedium (MSCGM) vid 37 ° C och 5% CO 2 tills nära till sammanflytning (~ 90%).
- Förbereda den magnetiska märkningslösningen genom blandning av 0,1 eller 0,2 mM maghemit citrat belagda järnoxid (γFe 2 O 3; kärna: 8 nm diameter) i serumfritt McCoys 5A-medium modifierad vid Roswell Park Memorial Institute (RMPI) utan glutamin och innehållande 5 mM natriumcitrat.
- Kassera mediet, skölja cellerna med serumfritt RPMI-medium utan glutamin, och tillsätt 10 ml av järnoxid nanopartikel lösning per 150 cm 2 odlingsflaska, den minsta volym som erfordras för att täcka alla celler.
- Inkubera i 30 min vid 37 ° C och 5% CO 2 och sedan kassera nanopartikellösningen. Skölja i 5 min med serumfritt RPMI-medium utan glutamin till internalisera nanoparticles fortfarande fäst till plasmamembranet.
- Kassera RPMI-medium och tillsätt 25 ml av komplett MSCGM medium per kolv. Inkubera över natten vid 37 ° C och 5% CO2.
3. Magnetisk Cell Seeding
- Färsk förbereda den kondrogena mediet med användning av Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) med hög glukos med L-glutamin genom tillsats 50 | iM L-askorbinsyra 2-fosfat, 0,1 uM dexametason, 1 mM natriumpyruvat, 0,35 mM L-prolin, 1% universell kultur kosttillskott som innehåller insulin, humant transferrin och selensyra (ITS-Premix), och 10 ng / ml transformerande tillväxtfaktor-beta 3 (TGF-β3).
- Lösgöra de magnetiska celler med användning av 8 ml 0,05% trypsin-EDTA per 150-cm 2 odlingskolv och centrifugera de dissocierade cellerna vid 260 x g under 5 min. Aspirera mediet och räkna de återsuspenderade cellerna.
- Placera en glasbottnad cellodling petriskål (35 mm) ovanpå båda magnetiska anordningar.
- till magnetically bilda aggregat, tillsätt 3 ml kondrogen medium till petriskål och försiktigt deponera den minsta volymen möjligt (inte mer än 8 | il) innehållande 2,5 x 10 5 märkta celler per aggregat (upp till 16 aggregat kan deponeras). Lämna petriskål under 20-30 min utan att flytta den, så att den kan bilda sfäroider, och sedan placera den kompletta anordningen, inklusive petriskål innehållande de 16 aggregat, i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2.
- Formen styraggregat att följa samma protokoll och ersätta det fullständiga mediet med kondrogen medium utan TGF-β3.
- För att generera 3D-aggregat-konstruktionen, placera 2 aggregat i kontakt på dag 8 för att bilda 8 dubletter och initiera fusionen. På dag 11, slå samman 2 dubbletter att bilda 4 fyrlingar. Slutligen säkring 4 fyrlingar på dag 15 för att erhålla den slutliga strukturen.
- På samma gång, bilda aggregat genom centrifugering 2,5 x 10 5-märkt stamceller vid 26015; g under 5 min i 15-ml rör med 1,5 ml kondrogen medium med eller utan TGF-β3 (för prov och kontroll, respektive).
- Att magnetiskt utsädes byggnadsställningar, placera varje torkade byggnadsställning i en petriskål. Använda polysackarid porösa ställningar gjorda av pullulan / dextran 21. För varje byggnadsställning, späd 2 x 10 6 märkta stamceller i 350 mikroliter av kondrogen medium utan TGF-β3 och försiktigt pipettera cellerna på ställningen.
- Inkubera i 5 min vid 37 ° C för att medge fullständig cellpenetration inom ställningen och sedan försiktigt lägga 3 mL kondrogen medium med eller utan TGF-β3 (för prov eller kontroll, respektive) till petriskålen.
- Inkubera cellularized ställningen på dess magnetanordning vid 37 ° C och 5% CO 2 för 4 dagar för att tillåta cellmigration genom ställnings porer och inneslutning.
- På samma gång, utsäde byggnadsställningar med 2 x 10 6
4. Differentiering till kondrocyter
OBS: Efter 4 dagars inkubation, ta bort magneterna och fortsätta den kondrogena mognad antingen i en petriskål (statiska betingelser) eller i en bioreaktor (dynamiska förhållanden). Negativa kontrollprover är mognat i statiska förhållanden med kondrogen medium utan TGF-β3.
- I statiska förhållanden, hålla cellularized byggnadsställningar eller aggregat i samma petriskål. Ändra kondrogena mediet två gånger i veckan i 21 dagar.
- I dynamiska förhållanden, förbereda bioreaktorn.
- Skära silikonslang vid lämplig längd enligt tillverkarens protokoll.
- Autoklavera alla material: 500-ml kultur kammare, slangar, två-vägs rotator, och burar.
- Placera bioreaktor delar till en steril Microbiologisk säkerhetsstationen. Anslut slangen till 2-vägs rotatorer och kulturkammaren enligt tillverkarens anvisningar.
- Noggrant överföra cellularized byggnadsställningar i steriliserade burar med användning av en steril spatel. Placera 2 ställningar per bur. När burarna är redo, sätter dem i nålar av locket för att hålla dem från att röra sig under ytterligare rotation. Fylla odlingskammaren med kondrogen medium och stänga den med locket innehållande burarna.
- Slå på den peristaltiska pumpen för att fylla slangen med kondrogena medium och för att eliminera luftbubblor.
- Placera och säkra den fyllda kammaren in motorn i bioreaktorn och slå på datorn, som styr de rotationer både hos armen och av kammaren.
- Applicera en rotationshastighet av 5 varv per minut (rpm) på både armen och kammaren. Justera den peristaltiska pumpen med en flödeshastighet av 10 varv per minut under kontinuerlig matning av de cellularized byggnadsställningar.
OBS: Före RNA-extraktion, smälta ställningar med en enzymatisk lösning.
- Förbereda en ml av enzymatisk lösning genom tillsats av 100 mikroliter av pullulanas (40 U / ml) och 50 mikroliter av dextranas (60 mg / ml) till 850 ml serumfritt DMEM-medium.
- Skölj ställningar två gånger med serumfritt DMEM-medium, kassera mediet, och tillsätt 800 mikroliter av den enzymatiska lösning per byggnadsställning. Inkubera under 15-30 minuter vid 37 ° C under försiktig skakning.
- När ställningen är fullständigt upplöst, överföra lösningen innehållande cellerna till en 1,5-ml rör, centrifugera vid 300 x g under 10 min, försiktigt aspirera mediet, skölj två gånger med steril 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS), centrifugera vid 300 x g under 10 min och återsuspendera cellerna i RNA-isoleringslösningen.
- Att extrahera RNA från aggregaten, placera sfäroiderna i RNA-isoleringslösning ochfullständigt krossa dem med användning av en homogenisator innan du utför RNA-extraktion.
- Isolera RNA genom användning av ett kit för total RNA-extraktion enligt tillverkarens instruktioner.
- Syntetisera komplementärt DNA från 400 ng av totalt RNA med användning av omvänt transkriptas enligt tillverkarens instruktioner, med användning av 250-ng slumpmässiga primrar, 1 mikroliter dNTP-blandning (10 mM vardera), och 40 U / ml RNas-inhibitor; den slutliga volymen av reaktionen är 20 | il. Vid slutet av reaktionen, tillsätt 80 | il destillerat vatten för att erhålla en slutlig volym av 100 ul.
- För kvantitativ polymeraskedjereaktion (PCR), använda en PCR-blandning innehållande ett fluorescerande reagens för att kvantifiera den relativa expressionen av generna av intresse, såsom aggrekan (AGC) och kollagen II (Col II), med 10 × utspätt cDNA. Normalisera nivåer av genexpression med referensgenen ribosomalt protein, Large, P0 (RPLP0). Utföra beräkningarna med 2 - ΔΔCT formeln, Där ΔΔCT = ACt av differentierad skick - betyda ACt av kontroll tillstånd, och varje ACt representerar CT av genen av intresse - CT för referensgenen (RPLP0).
- Bestämma statistiska mätningar som medelvärdena ± standardfelet av medelvärdet (SEM). Utföra analysen med n ≥ 2 oberoende experiment. Använda t-test för att analysera de statistiska skillnaderna mellan centrifuge pellets och magnetiska fusioner (* p <0,05). Avgöra betydelsen med en Kruskal-Wallis test (envägs ANOVA icke-parametrisk) för att analysera statistiska skillnader mellan differentierade ställningar och med styr scaffold (* p <0,05).
6. Histologisk analys
- Skölja cellularized byggnadsställningar eller aggregat med steril 1 x PBS, fixera dem i 10% formalinlösning under 1 h vid rumstemperatur, och skölj med 1 x PBS.
- Ta bort PBS, bädda proverna i optimal Cutting temperaturförening (OCT), och frysa dem i ett isopentan badet nedsänkt i flytande kväve. Lagra provet vid -20 ° C. Skära proven med en kryostat för att erhålla 8-um kryosnitt för aggregat eller 12-im för de cellularized byggnadsställningar.
- Färga kryosnitt med 0,5% toluidinblått lösning för två minuter, skölj i kranvatten, dehydrera med 100% etanol, förtydliga användning av toluen, och montera objektglasen med ett monteringsmedium för Ijusmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Först, kan aggregaten vara individuellt bildas med användning av mikro-magneter genom avsättning 2,5 x 10 5 märkta stamceller (Figur 2A). Dessa enskilda aggregat (~ 0,8 mm i storlek) kan sedan fuseras till större strukturer tack vare sekventiell, magnetiskt inducerade fusion. Till exempel, på dag 8 av kondrogen mognad, var aggregat placeras i kontakt i par för att bilda dubbletter; fyrlingar samlades på dag 11 genom sammanslagning 2 dubbletter; och slutligen, på dag 15, de 4 quadruplets smältes till bildande av en 3D-konstruktion innehållande 16 av de initialt bildade aggregat, med totalt 4 x 10 6 celler (~ 4 mm i storlek) (Figur 2B). För det andra har samma magnetiska attraktionsteknik använts för att bilda cellaggregat inom byggnadsställningar. Ställningar såddes över magnetanordningen och visade tätt kondense celler inuti porerna i byggnadsställningen, vid exakta mikromagnet platser (figur 2C). Däremot när cellerna såddes i en byggnadsställning utan magnetisk attraktion (passiv sådd), befanns de vara jämnt fördelade. Cellularized ställningar infördes sedan i burar (Figur 3A) anslutna till bioreaktorn kammaren för att utföra den kondrogena processen under dynamiska mognadsbetingelser (Figur 3B). Sådan bioreaktor förbättrar närings och gasbörser och ger mekanisk stimulering genom transduktion. Rotationshastigheten hos både armen och kammaren justerades till 5 varv per minut, såsom rekommenderas av konstruktören för mjuk 3D vävnadsregenerering. En peristaltisk pump som ger en kontinuerlig tillförsel av mediet var inställd på 10 varv per minut.
För alla förhållanden av cellorganisation (fuserade aggregat och ympning inom byggnadsställningar) och vävnadsmognad (inom eller utan en bioreaktor), fram genuttryck analyserades på dag 25. Vävnaden som bildas genom magnetisk fusion visade en significant ökning av kollagen Il-uttryck jämfört med den erhållna pelleten genom centrifugering (Figur 4A), tillsammans med en ökad trend av aggrekan uttryck. För cellularized byggnadsställningar, erhöll vi en ökning av aggrekan och kollagen Il-uttryck-signifikant för kollagen II-när magnet ympning användes, jämfört med de ställningar såddes utan magnetiska krafter. Dessutom uttrycket av båda generna var mycket högre (signifikant för Col II) då magnetiska ympning kombinerades med dynamisk differentiering (Figur 4B).
Histologiska analyser utfördes också, till exempel med användning av en toluidinblå fläcken för att avslöja de glykosaminoglykaner (GAG). Den sekventiella magnetiska fusion av 16 aggregat uppvisade rikliga avsättning av GAG, vilket visats av den blå-lila färg (figur 5A). För ställningar, endast de magnetiskt seedade färgades med toluidinblått. GAG Content var högre när skeletten differentierades i en bioreaktor (figur 5B) snarare än statiskt (figur 5C). Sammantaget visar dessa resultat potential magnetisk aggregering och magnetisk sådd inom ställningar för att förbättra kondrogenes. Den visar också att de dynamiska mognadsförhållandena inom bioreaktorn är mycket mer gynnsamt för en effektiv differentiering.
Figur 1. Konstruktion av de magnetiska anordningarna. (A) Exempel på en magnetisk anordning för aggregatbildning: aluminiumplattan borrades (hål 0,8 pm-diameter) och tips infördes i varje hål och placerades sedan på permanent neodym magnet, vilket säker magnetisering till mättnad. (B) Magnetisk anordning för att ympa ställningen: hård polystyren (24 mm 2) med 9 manuellt gjorda hål varplaceras på en permanent neodym magnet, vilket säker magnetisering till mättnad. Små magneter (3 mm i diameter) infördes sedan i varje hål för att bilda anordningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Magnetisk märkning av stamceller och sådd. (A) Stem celler märktes med järnoxidnanopartiklar för 30 min vid 37 ° C. (B) Sfäroider bildades från märkta celler attraheras av ett nätverk av 16 mikromagneter. Aggregaten slogs samman till quadruplets på dag 11 genom sammansmältning av de dubletter bildade 3 dagar innan. De fyrlingar sedan smält på dag 15 för att konstruera den slutliga konstruerade vävnaden. (C) En byggnadsställning, placerades i en glasbottnad skål, ympades med eller medout magnetiska krafter. På dag 4, var fläckar av kompakterade stamceller observerades i den magnetiskt seeded scaffold, medan cellerna verkade likformigt fördelade i byggnadsställningen ympades utan en magnet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Dynamisk mognaden av cellularized byggnadsställningar. (A) Efter magnetisk eller passiv sådd, var cellularized byggnadsställningar tas i burar för att undvika störningar. (B) Burar, fixerade med användning av nålar av locket, placerades i kärlet bioreaktorns fylld med kondrogen medium. Bioreaktorn appliceras biaxiella rotation med en självständigt kontrollerad hastighet (1-12 rpm och 1-35 rpm under armen och kammaren, respektive). En peristaltisk pump anordnad kontinuerligt medium. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Uttryck av specifika kondrogena gener på dag 25. (A) Den magnetiskt inducerad fusion av MSC sfäroider visade en signifikant ökning av kollagen II jämfört med pelleten som bildas genom centrifugering. * Betecknar en statistisk skillnad med användning av t-test (p-värde <0,05). (B) Uttrycket av aggrekan och kollagen II var tydligt ökat i ställningar differentierade med en kombination av magnetisk sådd och dynamisk mognad i en bioreaktor. Genuttryck normaliserades till RPLP0 mRNA och uttrycks i godtyckliga enheter i förhållande till kontroll (~ 1 ± SEM). Resultaten presenteras som medelvärden ± SEM av två till fyra oberoende experiment. * deNOTES en statistisk skillnad med användning av Kruskal-Wallis test (envägs ANOVA icke-parametrisk test) (p-värde <0,05). (-): ympning utan magnet; (+): Ympning med magnetiska krafter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Histologisk färgning av glykosaminoglykaner på dag 25. Glykosaminoglykan (GAG) depositioner framgår av blå-lila färg. (A) En positiv toluidinblått fläck observerades i de åtta-um kryosnitt av den slutliga broskstruktur erhållen från den sekventiella fusion av 16 aggregat. De 12-im kryosnitt av byggnadsställningar magnetiskt sådda efter statiska (B) eller dynamiska (C) förhållanden visade tydligtatt GAG innehållet var högre i ställningar differentierade i en bioreaktor. Pilar indikerar aggregat av differentierade celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Först, eftersom de tekniker som presenteras här är beroende av internalisering av magnetiska nanopartiklar, är en viktig fråga resultatet av nanopartiklar när de lokalisera i cellerna. Det är sant att järn nanopartiklar kan utlösa potentiell toxicitet eller nedsatt differentiering kapacitet beroende på deras storlek, beläggning, och exponeringstiden 19, 22. Emellertid, har flera studier visat någon effekt på cellulär fysiologi när inkapslade järnnanopartiklar användes 23 i form av magnetoferritin, en biologisk magnetisk nanopartikel 24, eller användes med en enkel citrat beläggning och adekvata koncentrationer 18. Dessutom, när järnoxidnanopartiklar användes i liknande betingelser som de som beskrivs i detta dokument (med MSC och för kondrogenes), som nyligen visade vi att en snabb och nästan total nedbrytning av nanopartiCykler inträffar inom de endosomer i ca 10 dagar vid cellulär inkorporering och MSC sfäroid-bildning. Intressant nog var denna massiva försämring i samband med en effektiv lagring av fritt järn i ferritin protein och resulterade i en mycket begränsad effekt på den cellulära järn metabolism, Boding väl för framtida kliniska tillämpningar 25.
En annan kritisk punkt är kravet på cellpackning för att initiera kondrogenes. Vanligtvis är kondensationen av celler uppnås genom centrifugering; emellertid är denna metod begränsad av ett lågt antal celler (ej mer än 2,5 x 10 5 celler). Förbi detta nummer kan näringsämnen och gas inte diffundera till mitten av aggregaten, utlöser cell nekros. Här visas den magnetiska kondensation av märkta stamceller till aggregat som ett betydande metod för att bilda 3D-konstruktioner för broskvävnadsregenerering. Ett sådant magnetiskt förfarande har använts av andra författare tillbygga 3D-sfäroider: genom magnetisk levitation med en magnet placerad på toppen av plattan efter dissociation av cellerna 23 eller med järn stift för att lokalisera det magnetiska fältet 26. Däremot magnetisk levitation verkar inte vara lämpade för ytterligare stadier av aggregat fusion. Däremot med den magnetiska metoden som föreslås här, kan vi kontrollera alla fusionssteg för erhållande av en steg-för-steg-broskvävnad konstruktion. I korthet, startar denna flerstegsprocess med inneslutning av stamceller till aggregerade byggstenar och följs av fusion av dessa block i en större struktur. De kritiska stegen i denna byggnadsställning fritt stamcells aggregering förfarande är följande: för det första måste man bilda varje aggregat med en så liten volym av celler som möjligt och för det andra måste man styra fusions åtgärder för att undvika bildandet av en enda stor aggregat. Vävnaden erhålls här var rik på kollagen II och aggrecan. Det presenterade också advantages med att ha flexibla geometri och storlek och av att vara byggnadsställning fritt.
Den magnetiska tillvägagångssätt användes också för att styra stamceller inom tjocka och stora ställningar; ett annat alternativ för utformningen av olika former och storlekar. Det kritiska steget är att ympa ställningar med en lämplig volym av celler: varken för lite för att få en total homogen fördelning av celler, eller för mycket för att undvika cellförlust. Magnetiska krafter användes tidigare för att attrahera och kvarhålla celler i byggnadsställningar och för att förbättra cellsådd 27, 28. Här tillräckligt cell kondens i porerna i polysackarid ställningar ledde till framgångsrik kondrogenes. Den extracellulära matrisen produktionen markant förbättrad när de magnetiskt cellularized byggnadsställningar utsattes för transduktion / skjuvspänning stimuli som tillhandahålls av bioreaktorn tack vare sin bi-axiell rotation. Det har visat sig i andra studier som Multi-axiella belastningsförhållanden förbättrat kvaliteten på vävnader bildade från kondrocyter 29. Denna nya bioreaktor koncept presenterar en verklig vinst jämfört med existerande teknik, där endast tryckkrafter appliceras 30, 31, 32.
Sammanfattningsvis, för kondrogen differentiering, användning av magnetisk inneslutning av märkta stamceller att bilda och manipulera aggregat samt till utsäde byggnadsställningar tillåts för skapandet av millimeterstorlek brosk cellulära konstruktioner. Dessutom kombinerar magnetisk cellsådd med dynamisk differentiering ger ett värdefullt nytt verktyg för regenerativ medicin tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för QuinXell Technologies och CellD, särskilt Lothar Grannemann och Dominique Ghozlan för deras hjälp med bioreaktorn. Vi tackar Catherine Le Visage, som försett oss med pullulan / dextran polysackarid ställningar. Detta arbete stöddes av EU (ERC-2014-Cog projekt Matisse 648.779) och av AgenceNationalede la Recherche (ANR), Frankrike (MagStem projekt ANR-11 SVSE5).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iron oxide (maghemite) nanoparticules (γ-Fe2O3) | PHENIX - University Paris 6 | Made and given by C. Ménager | Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge |
| Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds | LIOAD - University Nantes | Made and given by C. Le Visage | Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10 M NaOH). Porosity: 185-205 µm; Thickness: 7 mm; Surface area: 1.8 cm2. |
| TisXell Regeneration System | QuinXell Technologies | QX900-002 | Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber |
| Cage for scaffolds: Histosette II M492 | VWR | 720-0909 | |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | Three independant batches have been used |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin (10,000 U/mL) / Streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| Sodium pyruvate solution 100 mM | Sigma | S8636 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20 °C |
| TGF-beta 3 protein 10 µg | Interchim | 30R-AT028 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare the 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C |
| Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus | Sigma | P2986 | |
| Dextranase from Chaetomium erraticum | Sigma | D0443 | |
| NucleoSpin RNA Extraction Kit | Macherey-Nagel | 740955.5 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| Random Primer - Hexamer | Promega | C1181 | 500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample |
| Recombinant RNAs in ribonuclease inhibitor | Promega | N2511 | 40 U/µL: put 1 µL per sample |
| PCR nucleotide dNTP mix (10 mM each) | Roche | 10842321 | |
| SyBr Green PCR Master Mix | Life Technologies | 4368708 | |
| Step One Plus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4381792 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| OCT solution | VWR | 361603E | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Toluidine blue O | VWR | 1.15930.0025 | |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Toluene | VWR | 1.08323.1000 | |
| Mounting medium Pertex | Histolab | 840 | |
| RPLP0 Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3' |
|
| Aggrecan Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5' | |
| Collagen II Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5' |
References
- Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A.
- Edmundson, M., Thanh, N. T., Song, B. Nanoparticles based stem cell tracking in regenerative medicine. Theranostics. 3 (8), 573-582 (2013).
- Di Corato, R., et al. High-resolution cellular MRI: gadolinium and iron oxide nanoparticles for in-depth dual-cell imaging of engineered tissue constructs. ACS Nano. 7 (9), 7500-7512 (2013).
- Xu, F., et al. Three-dimensional magnetic assembly of microscale hydrogels. Adv Mater. 23 (37), 4254-4260 (2011).
- Kito, T., et al. iPS cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for reparative angiogenesis. Sci Rep. 3, 1418 (2013).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Nanotechnology in vascular tissue engineering: from nanoscaffolding towards rapid vessel biofabrication. Trends Biotechnol. 26 (6), 338-344 (2008).
- Mattix, B. M., et al. Janus magnetic cellular spheroids for vascular tissue engineering. Biomaterials. 35 (3), 949-960 (2014).
- Henstock, J., El Haj, A. Controlled mechanotransduction in therapeutic MSCs: can remotely controlled magnetic nanoparticles regenerate bones? Regen Med. 10 (4), 377-380 (2015).
- Fayol, D., et al. Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling. Adv Mater. 25 (18), 2611-2616 (2013).
- Bartlett, W., et al. Autologous chondrocyte implantation versus matrix-induced autologous chondrocyte implantation for osteochondral defects of the knee: a prospective, randomised study. J Bone Joint Surg Br. 87 (5), 640-645 (2005).
- Batty, L., Dance, S., Bajaj, S., Cole, B. J. Autologous chondrocyte implantation: an overview of technique and outcomes. ANZ J Surg. 81, 18-25 (2011).
- Song, L., Baksh, D., Tuan, R. S. Mesenchymal stem cell-based cartilage tissue engineering: cells, scaffold and biology. Cytotherapy. 6 (6), 596-601 (2004).
- Boeuf, S., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells: role of tissue source and inducing factors. Stem Cell Res Ther. 1 (4), 31 (2010).
- Kock, L., van Donkelaar, C. C., Ito, K. Tissue engineering of functional articular cartilage: the current status. Cell Tissue Res. 347 (3), 613-627 (2012).
- Schon, B. S., et al. Validation of a high-throughput microtissue fabrication process for 3D assembly of tissue engineered cartilage constructs. Cell Tissue Res. , (2012).
- Robert, D., et al. Magnetic micro-manipulations to probe the local physical properties of porous scaffolds and to confine stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1586-1595 (2010).
- Luciani, N., et al. Successful chondrogenesis within scaffolds, using magnetic stem cell confinement and bioreactor maturation. Acta Biomaterialia. 37, 101-110 (2016).
- Wilhelm, C., Gazeau, F. Universal cell labelling with anionic magnetic nanoparticles. Biomaterials. 29 (22), 3161-3174 (2008).
- Fayol, D., Luciani, N., Lartigue, L., Gazeau, F., Wilhelm, C. Managing magnetic nanoparticle aggregation and cellular uptake: a precondition for efficient stem-cell differentiation and MRI tracking. Adv Healthc Mater. 2 (2), 313-325 (2013).
- Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells. Eur Biophys J. 31 (2), 118-125 (2002).
- Autissier, A., Le Visage, C., Pouzet, C., Chaubet, F., Letourneur, D. Fabrication of porous polysaccharide-based scaffolds using a combined freeze-drying/cross-linking process. Acta Biomater. 6 (9), 3640-3648 (2010).
- Singh, N., Jenkins, G. J. S., Asadi, R., Doak, S. H. Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION). Nano Reviews. 1, (2010).
- Lee, J. H., Hur, W. Scaffold-free formation of a millimeter-scale multicellular spheroid with an internal cavity from magnetically levitated 3T3 cells that ingested iron oxide-containing microspheres. Biotechnol Bioeng. 111 (5), 1038-1047 (2014).
- Mattix, B., et al. Biological magnetic cellular spheroids as building blocks for tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10 (2), 623-629 (2014).
- Mazuel, F., et al. Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels. ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).
- Kim, J. A., et al. High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture. Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).
- Shimizu, K., Ito, A., Honda, H. Enhanced cell-seeding into 3D porous scaffolds by use of magnetite nanoparticles. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 77 (2), 265-272 (2006).
- Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine (Lond). 7 (9), 1425-1442 (2012).
- Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review. Eur Cell Mater. 13, 66-74 (2007).
- Takahashi, I., et al. Compressive force promotes sox9, type II collagen and aggrecan and inhibits IL-1beta expression resulting in chondrogenesis in mouse embryonic limb bud mesenchymal cells. J Cell Sci. 111 (14), 2067-2076 (1998).
- Campbell, J. J., Lee, D. A., Bader, D. L. Dynamic compressive strain influences chondrogenic gene expression in human mesenchymal stem cells. Biorheology. 43, 455-470 (2006).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Bioreactor cultivation conditions modulate the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage. J Orthop Res. 17 (1), 130-138 (1999).
