Summary
Condrogenesi da cellule staminali richiede la messa a punto delle condizioni di coltura. Qui vi presentiamo un approccio magnetico per condensare le cellule, un passo essenziale per iniziare condrogenesi. Inoltre, mostriamo che la maturazione dinamico in un bioreattore applica stimolazione meccanica ai costrutti cellulari e aumenta la produzione di matrice extracellulare cartilaginea.
Abstract
Ingegneria cartilagine rimane una sfida a causa delle difficoltà nel creare un impianto funzionale in vitro simile al tessuto nativo. Un approccio recentemente esplorato per lo sviluppo delle sostituzioni autologhe comporta la differenziazione delle cellule staminali in condrociti. Per avviare questo condrogenesi, un grado di compattazione delle cellule staminali è richiesta; quindi, abbiamo dimostrato la fattibilità di cellule magneticamente condensazione, sia all'interno scaffold spessi e privo di scaffold, utilizzando miniaturizzati sorgenti di campo magnetico come attrattori cellulari. Questo approccio magnetico è stato utilizzato anche per guidare fusione aggregato e costruire privo di impalcatura, organizzato, tridimensionale (3D) i tessuti diversi millimetri di dimensione. Oltre ad avere una dimensione maggiore, il tessuto formato da fusione magnetica guidato presentato un significativo aumento dell'espressione di collagene II, ed una tendenza simile è stato osservato per l'espressione aggrecan. Come la cartilagine nativa è stato sottoposto a forze tcappello influenzato la sua struttura 3D, la maturazione dinamica è stata effettuata anche. Un bioreattore che fornisce stimoli meccanici stato usato per cultura scaffold magneticamente seminate su un periodo di 21 giorni. Bioreattore maturazione in gran parte migliorato chondrogenesis nelle impalcature cellularized; la matrice extracellulare ottenuto in queste condizioni era ricca di collagene II e aggrecano. Questo lavoro illustra il potenziale innovativo di condensazione magnetica delle cellule staminali etichettati e maturazione dinamica in un bioreattore per una migliore differenziazione condrogenica, sia-impalcatura libero e all'interno polisaccaridi ponteggi.
Introduction
nanoparticelle magnetiche sono già utilizzati in clinica, come agenti di contrasto per la risonanza magnetica (MRI), e le loro applicazioni terapeutiche tenere in espansione. Ad esempio, è stato recentemente dimostrato che le cellule marcate possono essere manipolati in vivo usando un campo magnetico esterno e possono essere orientati e / o mantenuti in un sito definito di impianto 1, 2, 3. In medicina rigenerativa, possono essere utilizzati per ingegnerizzare tessuti organizzati in vitro 4, tra tessuto vascolare 5, 6, 7, 8 osso, cartilagine e 9.
La cartilagine articolare è immersa in un ambiente avascolare, le riparazioni dei componenti della matrice extracellulare molto limitati quando si verificano danni. Per questo motivo, research è attualmente focalizzata sulla progettazione di sostituzioni cartilagine ialina che possono essere impiantati nel sito del difetto. Per produrre una sostituzione autologo, alcuni gruppi di ricerca stanno studiando l'utilizzo di condrociti autologhi come fonte cella 10, 11, mentre altri sottolineano la capacità delle cellule staminali mesenchimali (MSC) a differenziarsi in condrociti 12, 13. In studi precedenti ricapitolato qui, abbiamo scelto MSC, come il loro campionamento del midollo osseo è abbastanza semplice e non richiede il sacrificio di condrociti sani, che rischiano di perdere il loro fenotipo 14.
Un primo passo essenziale per iniziare la differenziazione condrogenica delle cellule staminali è il loro condensazione. Aggregati cellulari sono comunemente formate utilizzando centrifugazione o cultura Micromass 15; Tuttavia, questi metodi di condensazione Neither presentare il potenziale per creare raggruppamenti cellulari all'interno scaffold spessa né la possibilità di controllare la fusione degli aggregati. In questo documento, si descrive un approccio innovativo alla condensazione cellule staminali utilizzando marcatura magnetica MSC e l'attrazione magnetica. Questa tecnica è stata dimostrata per formare costrutti 3D-free scaffold attraverso la fusione di aggregati tra loro per ottenere un millimetro scala tessuto cartilagineo 9. semina magnetico di scaffold spessi e grandi ha anche permesso la possibilità di aumentare la dimensione della ingegneria tessutale, realizzazione di una forma più facilmente utile per l'impianto, e diversificare il potenziale per applicazioni cliniche di riparazione della cartilagine. Qui, si dettaglio il protocollo per la semina magnetico di MSC nella scaffold porosi costituiti da polisaccaridi naturali, pullulano, e destrano, scaffold precedentemente utilizzato per confinare cellule staminali 16, 17. differenziazione condrogenico era finally eseguita in un bioreattore per garantire continue dei nutrienti e diffusione del gas nel nucleo matrice degli scaffold seminati con un'alta densità di cellule. Oltre a fornire le sostanze nutrienti, fattori di crescita condrogeniche e gas alle cellule, il bioreattore offerto stimolazione meccanica. Nel complesso, la tecnologia magnetica utilizzata per confinare le cellule staminali, in combinazione con la maturazione dinamica in un bioreattore, può notevolmente migliorare la differenziazione condrogenico.
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Protocol
1. la costruzione dei dispositivi magnetici
NOTA: I dispositivi utilizzati per semina delle cellule variano a seconda dell'applicazione (Figura 1). A formare aggregati, il numero delle cellule è limitato a 2,5 × 10 5 / aggregato, così le punte magnetiche devono essere molto sottili (750 micron di diametro). Seminare i ponteggi 1,8 centimetri 2/7 mm di spessore, i magneti devono essere più grandi (3 mm di diametro) e garantiranno migrazione cellulare attraverso i pori del ponteggio.
- Costruzione di un dispositivo a micro-magneti per la formazione di aggregati (Figura 1A)
- Rendere microfori con un trapano 0,8 mm mediante piastre di alluminio (3 cm di diametro e spessore 6 mm).
- Inserire una punta magnetica (750 micron di diametro) in ogni foro della piastra.
- Posizionare questo disco sopra un magnete al neodimio permanente, che garantisce la magnetizzazione di saturazione.
- Costruzione di un dispositivo per ponteggio semina (
- Tagliare polistirolo rigido in 2.4 cm 2 piazze.
- Inserire 9 piccoli magneti (3 mm di diametro, 6 mm di lunghezza) equidistanti su una superficie di 1,6 cm 2.
- Posizionare il dispositivo nel corso di un magnete al neodimio permanente.
2. Stem Cell Labeling
NOTA: Le cellule staminali sono state marcate con 0,1 mM nanoparticelle magnetiche per 30 min (2,6 ± 0,2 pg ferro / cella) a formare aggregati, mentre erano etichettati con 0,2 mM nanoparticelle magnetiche per 30 min (5 ± 0,4 pg ferro / cella) per seminare impalcature. Queste concentrazioni di nanoparticelle e tempi di incubazione sono stati utilizzati in precedenza e pubblicato per MSC e altre cellule 18, 19, ed è stato determinato che le nanoparticelle influenzato né vitalità cellulare né capacità di differenziazione MSC. La massa ferro incorporata dalle cellule staminali è stato misurato mediante single-cell magnetophoresis 19, 20.
- Cellule di coltura umane staminali mesenchimali (MSC) nella massima terreno di crescita delle cellule staminali mesenchimali (MSCGM) a 37 ° C e 5% di CO 2 fino vicino alla confluenza (~ 90%).
- Preparare la soluzione di etichettatura magnetico miscelando 0,1 o 0,2 mM maghemite citrato rivestite con ossido di ferro (γFe 2 O 3; nucleo: 8 nm di diametro) in terreno 5A di McCoy privo di siero modificata a Roswell Park Memorial Institute (RMPI) senza glutammina e contenente 5 mM citrato di sodio.
- Eliminare il mezzo, lavare le cellule con mezzo RPMI privo di siero senza glutammina, e aggiungere 10 ml di soluzione di ferro ossido di nanoparticelle a 150 cm 2 pallone di coltura, il volume minimo richiesto per coprire tutte le celle.
- Incubare per 30 minuti a 37 ° C e 5% di CO 2 e quindi eliminare la soluzione di nanoparticelle. Sciacquare per 5 minuti con mezzo RPMI privo di siero senza glutammina per internalizzare il nanoparticles ancora attaccato alla membrana plasmatica.
- Eliminare il medium RPMI e aggiungere 25 ml di completo media MSCGM per bombola. Incubare per una notte a 37 ° C e 5% CO 2.
3. semina delle cellule magnetiche
- Appena preparare il mezzo condrogenica usando Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose con L-glutammina aggiungendo 50 mM di acido L-ascorbico 2-fosfato, 0,1 pM desametasone, 1 mM sodio piruvato, 0,35 mM L-prolina, 1% cultura universale supplemento contenente insulina, transferrina umana e acido selenioso (ITS-Premix), e 10 ng / mL di crescita trasformante fattore-beta 3 (TGF-β3).
- Staccare le cellule magnetiche utilizzando 8 ml di 0,05% tripsina-EDTA a 150 cm-2 pallone di coltura e centrifugare le cellule dissociate a 260 xg per 5 min. Aspirare il terreno e contare le cellule risospese.
- Posizionare una coltura cellulare con fondo piatto Petri (35 mm) al di sopra di entrambi i dispositivi magnetici.
- per magnetically formare aggregati, aggiungere 3 ml di terreno condrogenica alla piastra di Petri e delicatamente depositare il minor volume possibile (non più di 8 mL) contenente 2,5 x 10 5 cellule marcate per aggregato (fino a 16 aggregati può essere depositato). Lasciare la piastra di Petri per 20-30 min senza spostarlo, permettendo di formare sferoidi, e quindi inserire il dispositivo completo, compresa la piastra di Petri contenente 16 aggregati, in incubatore a 37 ° C e 5% CO 2.
- aggregati controllo forma seguendo lo stesso protocollo e sostituire il mezzo completo con il mezzo condrogenica senza TGF-β3.
- Per generare l'aggregato costrutto 3D, mettere 2 aggregati in contatto il giorno 8 per formare 8 doppiette ed avviare la fusione. Il giorno 11, unire 2 doppiette per formare 4 quartine. Infine, fondere le 4 quadruplets il giorno 15 per ottenere la struttura finale.
- Allo stesso tempo, formare aggregati centrifugando 2,5 × 10 5 cellule staminali etichettati a 26015; g per 5 min a 15 mL provette con 1,5 mL di terreno condrogenica con o senza TGF-β3 (per il campione e controllo, rispettivamente).
- Per magneticamente ponteggi seme, inserire ogni scaffold essiccato in una capsula di Petri. Utilizzare polisaccaridi scaffold porosi fatti di pullulano / destrano 21. Per ogni scaffold, diluire 2 x 10 6 cellule staminali marcate in 350 ml di mezzo condrogenica senza TGF-β3 e accuratamente pipetta le cellule sul ponteggio.
- Incubare per 5 min a 37 ° C per consentire la penetrazione cellulare completo entro l'impalcatura e poi delicatamente aggiungere 3 mL di terreno condrogenica con o senza TGF-β3 (rispettivamente campione o controllo,) alla piastra di Petri.
- Incubare il ponteggio cellularized sul suo dispositivo magnetico a 37 ° C e 5% di CO 2 per 4 giorni per consentire la migrazione cellulare attraverso i pori scaffold e confinamento.
- Allo stesso tempo, seminare ponteggi con 2 × 10 6
4. differenziazione in condrociti
NOTA: Dopo 4 giorni di incubazione, rimuovere i magneti e continuare la maturazione condrogenica sia in una capsula di Petri (condizioni statiche) o in un bioreattore (condizioni dinamiche). campioni di controllo negativi sono maturati in condizioni statiche di media condrogenica senza TGF-β3.
- In condizioni statiche, mantenere i ponteggi cellularized o aggregati della stessa piastra di Petri. Cambiare il medio condrogenica due volte a settimana per 21 giorni.
- In condizioni dinamiche, preparare il bioreattore.
- Tagliare tubi in silicone alla lunghezza appropriata secondo il protocollo del produttore.
- Autoclavare tutti materiali: 500 mL camera cultura, tubi, piastre rotanti 2 vie, e gabbie.
- Posizionare le parti in un bioreattore microbio sterilistazione di sicurezza logico. Collegare il tubo per le 2 vie rotatori e alla camera di cultura seguendo le istruzioni del produttore.
- Trasferire accuratamente i ponteggi cellularized in gabbie sterilizzati utilizzando una spatola sterile. Mettere 2 ponteggi per gabbia. Quando le gabbie sono pronte, inserirle nelle aghi del coperchio per impedire loro di muoversi durante un'ulteriore rotazione. Riempire la camera di coltura con terreno condrogenica e chiuderlo con il coperchio contenente le gabbie.
- Accendere la pompa peristaltica per riempire il tubo con il mezzo condrogenica e per eliminare le bolle d'aria.
- Posizionare e fissare la camera riempita nel motore del bioreattore e accendere il computer, che controlla le rotazioni sia del braccio e della camera.
- Applicare una velocità di rotazione di 5 rotazioni al minuto (rpm) sia sul braccio e la camera. Regolare la pompa peristaltica ad una portata di 10 rpm per l'alimentazione continua dei ponteggi cellularized.
NOTA: Prima di estrazione di RNA, digerire i ponteggi con una soluzione enzimatica.
- Preparare 1 mL di soluzione enzimatica aggiungendo 100 ml di pullulanasi (40 U / ml) e 50 ml di destranasi (60 mg / ml) a 850 ml di terreno DMEM privo di siero.
- Lavare i ponteggi due volte con DMEM privo di siero, scartare il mezzo, e aggiungere 800 microlitri della soluzione enzimatica per ponteggio. Incubare per 15-30 minuti a 37 ° C sotto leggera agitazione.
- Quando l'impalcatura è completamente sciolto, trasferire la soluzione contenente le cellule ad una provetta da 1,5 mL, centrifugare a 300 xg per 10 min, aspirare accuratamente il mezzo, lavare due volte con sterile 1 × salina tamponata con fosfato (PBS), centrifugare a 300 g per 10 min, e risospendere le cellule in soluzione isolamento dell'RNA.
- Per estrarre l'RNA dagli aggregati, posizionare i sferoidi nella soluzione di isolamento di RNA ecompletamente schiacciare usando un omogeneizzatore prima di eseguire l'estrazione di RNA.
- Isolare l'RNA utilizzando un kit per l'estrazione di RNA totale secondo le istruzioni del produttore.
- Sintetizzare il DNA complementare da 400 ng di RNA totale utilizzando la trascrittasi inversa secondo le istruzioni del produttore, utilizzando 250 ng di primer casuali, 1 ml di miscela di dNTP (10 mM ciascuno), e 40 U / ml RNasi inibitore; il volume finale della reazione è di 20 microlitri. Al termine della reazione, aggiungere 80 ml di acqua distillata per ottenere un volume finale di 100 microlitri.
- Per la reazione a catena della polimerasi (PCR) quantitativa, usare una miscela di PCR contenente un reagente fluorescente per quantificare l'espressione relativa dei geni di interesse, come aggrecan (AGC) e collagene II (Col II), con 10 × diluito cDNA. Normalizzare i livelli di espressione genica con la Ribosomale proteina del gene di riferimento, di grandi dimensioni, P0 (RPLP0). Eseguire i calcoli con il 2 - formula ΔΔCT, Dove ΔΔCT = ΔCT condizione differenziata - significa ΔCT di condizione di controllo, e ogni ΔCT rappresenta la TC del gene di interesse - CT del gene di riferimento (RPLP0).
- Determinare misurazioni statistiche come i valori medi ± l'errore standard della media (SEM). Eseguire l'analisi con n ≥ 2 esperimenti indipendenti. Utilizzare test t di analizzare le differenze statistiche tra pellets centrifugati e fusioni magnetici (* p <0,05). Determinare la significatività con un test di Kruskal-Wallis (ANOVA non parametrico) per analizzare le differenze statistiche tra scaffold differenziati e con lo scaffold controllo (* p <0,05).
6. analisi istologica
- Lavare i ponteggi cellularized o aggregati con sterile 1 × PBS, fissarli in formalina al 10% per 1 ora a temperatura ambiente, e risciacquare con 1 × PBS.
- Rimuovere la PBS, incorporare i campioni in cuttin ottimalecomposto g temperatura (OCT), e congelarli in un bagno isopentano immersi in azoto liquido. Conservare il campione a -20 ° C. Tagliare i campioni con un criostato avere criosezioni 8 micron per gli aggregati o 12 micron per i ponteggi cellularized.
- Macchiare le criosezioni con 0,5% toluidina soluzione blu per 2 min, risciacquo in acqua di rubinetto, disidratare con etanolo al 100%, chiarire con toluene, e montare i vetrini con un mezzo di montaggio per la microscopia ottica.
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Representative Results
In primo luogo, gli aggregati possono essere formati individualmente tramite microorganismi magneti depositando 2,5 x 10 5 cellule staminali marcate (Figura 2A). Questi singoli aggregati (~ 0,8 mm di dimensione) possono essere fusi in strutture più grandi grazie sequenziale, fusione indotta magneticamente. Per esempio, il giorno 8 di maturazione condrogenica, aggregati sono stati posti in contatto in coppia per formare doppietti; quartine sono state assemblate il giorno 11 con la fusione 2 doppietti; e, infine, il giorno 15, i 4 gruppi di quattro stati fusi per formare un costrutto 3D contenente 16 degli aggregati inizialmente formate, con un totale di 4 × 10 6 cellule (~ 4 mm di dimensione) (Figura 2B). In secondo luogo, la stessa tecnica attrazione magnetica è stata usata per formare aggregati cellulari all'interno impalcature. Ponteggi sono stati seminati sul dispositivo magnetico e mostrava densamente condensati cellule all'interno dei pori del ponteggio, in posizioni esatte micro-magnete (Figura 2C). Per contro, quando le cellule sono state seminate in un colpo scaffold attrazione magnetica (semina passivo), sono stati trovati per essere uniformemente distribuita. Ponteggi Cellularized sono stati poi inseriti in gabbie (Figura 3A) attaccate alla camera bioreattore per eseguire il processo di maturazione condrogenica in condizioni dinamiche (Figura 3B). Tale bioreattore migliora nutrienti e gas scambi e fornisce una stimolazione meccanica trasduzione. La velocità di rotazione sia il braccio e la camera è stato regolato a 5 rpm, come raccomandato dal costruttore per la rigenerazione dei tessuti molli 3D. Una pompa peristaltica che fornisce un flusso continuo di terreno è stato fissato a 10 rpm.
Per tutte le condizioni di organizzazione cellulare (aggregati fusi e semina entro ponteggi) e la maturazione dei tessuti (dentro o fuori un bioreattore), l'espressione del gene è stato analizzato il giorno 25. Il tessuto formato da fusione magnetica ha mostrato un significativoaumento ficant in collagene II espressione rispetto al pellet ottenuto per centrifugazione (Figura 4A), unitamente ad una maggiore tendenza di espressione aggrecan. Per ponteggi cellularized, abbiamo ottenuto un aumento aggrecan e collagene II espressione significativa per il collagene II, quando è stato utilizzato semina magnetico, rispetto ai ponteggi seminate senza forze magnetiche. Inoltre, l'espressione di entrambi i geni era molto più alto (significativo per Col II) quando semina magnetico è stato combinato con differenziazione dinamica (Figura 4B).
analisi istologiche sono stati eseguiti, ad esempio con un colorante blu di toluidina per rivelare i glicosaminoglicani (GAG). La fusione magnetica sequenziale di 16 aggregati esposta abbondante deposizione di GAG, come si evince dal colore viola-blu (Figura 5A). Per i ponteggi, solo quelli magneticamente seminato sono state colorate con blu di toluidina. conten GAGt era superiore quando i ponteggi sono stati differenziati in un bioreattore (Figura 5B) piuttosto che staticamente (Figura 5C). Presi insieme, questi risultati dimostrano il potenziale di aggregazione magnetica e semina magnetico all'interno di impalcature per migliorare condrogenesi. Esso indica inoltre che le condizioni di maturazione dinamici all'interno del bioreattore sono molto più favorevoli per la differenziazione efficiente.
Figura 1. Costruzione dei dispositivi magnetici. (A) Esempio di un dispositivo magnetico per la formazione di aggregati: la piastra di alluminio è stato perforato (0,8 fori micron di diametro) e suggerimenti sono stati inseriti in ciascun foro e poi posto su un magnete al neodimio permanente, sufficiente magnetizzazione di saturazione. (B) Dispositivo magnetico per inizializzare il ponteggio: duro polistirene (24 mm 2) con 9 fori eseguiti manualmente eraposto su un magnete al neodimio permanente, sufficiente magnetizzazione di saturazione. Piccoli magneti (3 mm di diametro) sono stati inseriti in ciascun foro per formare il dispositivo. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. etichettatura magnetica delle cellule staminali e semina. (A) Le cellule staminali sono state marcate con nanoparticelle di ossido di ferro per 30 minuti a 37 ° C. (B) sferoidi sono formate da cellule marcate attratti da una rete di 16 micro-magneti. Gli aggregati sono state fuse in quartine il giorno 11 dalla fusione dei doppietti formate 3 giorni prima. Le quartine sono state poi fuse il giorno 15 per la costruzione della ingegneria tessutale finale. (C) Un ponteggio, collocato in un piatto di vetro a fondo, è stato seminato con oforze magnetiche fuori. Il giorno 4, macchie di cellule staminali compattati sono stati osservati nel patibolo magneticamente testa di serie, mentre le cellule apparivano uniformemente distribuiti in patibolo seminato senza un magnete. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. maturazione dinamica di ponteggi cellularized. (A) Dopo la semina magnetica o passiva, impalcature cellularized sono stati messi in gabbie per evitare interruzioni. (B) gabbie, fissi usando gli aghi del tappo, sono stati collocati nel recipiente del bioreattore riempito con il mezzo condrogenico. Il bioreattore applicato rotazione biassiale con una velocità controllata in modo indipendente (1-12 rpm e 1-35 rpm per il braccio e la camera, rispettivamente). Una pompa peristaltica disponibile continuamente medium. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Espressione dei geni specifici condrogeniche il giorno 25. (A) La fusione indotta magneticamente di sferoidi MSC ha mostrato un significativo aumento di collagene II rispetto al pellet formato per centrifugazione. * Indica una differenza statistica utilizzando il test t di Student (p <0,05). (B) L'espressione di aggrecano e collagene II erano chiaramente aumentati in ponteggi differenziate con una combinazione di semina magnetico e maturazione dinamica in un bioreattore. espressione genica è stata normalizzata per RPLP0 mRNA e espressa in unità arbitrarie rispetto ai controlli (~ 1 ± SEM). I risultati sono presentati come media ± SEM di due a quattro esperimenti indipendenti. * DenoTES una differenza statistica utilizzando il test di Kruskal-Wallis (ANOVA test non parametrico) (valore p <0,05). (-): semina senza magnete; (+): Semina con le forze magnetiche. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. istologica colorazione dei glicosaminoglicani il giorno 25. glicosaminoglicano (GAG) depositi sono evidenziati dalla colorazione blu-viola. (A) Una macchia blu toluidina positiva è stata osservata nei criosezioni 8 micron della struttura cartilaginea finale ottenuto dalla fusione sequenziale di 16 aggregati. I criosezioni 12 um di scaffold magneticamente seminate dopo statico (B) o condizioni dinamiche (C) mostrano chiaramentequel contenuto GAG era maggiore nei ponteggi differenziate in un bioreattore. Le frecce indicano aggregati di cellule differenziate. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In primo luogo, perché le tecniche qui presentate si basano su l'internalizzazione delle nanoparticelle magnetiche, una questione importante è il risultato delle nanoparticelle, una volta che localizzano all'interno delle cellule. È vero che le nanoparticelle di ferro possono scatenare tossicità potenziale o capacità di differenziazione ridotta seconda delle loro dimensioni, rivestimento, e il tempo di esposizione 19, 22. Tuttavia, numerosi studi hanno dimostrato alcun impatto sulla fisiologia cellulare quando nanoparticelle di ferro incapsulate sono stati utilizzati 23 nella forma di magnetoferritin, una nanoparticella magnetico biologico 24, o sono stati usati con un semplice rivestimento citrato e concentrazioni adeguate 18. Inoltre, quando nanoparticelle di ossido di ferro sono stati utilizzati in condizioni analoghe a quelle descritte nel presente documento (con MSC e per condrogenesi), abbiamo recentemente dimostrato che una rapida degradazione e quasi totale della nanopartiCicli avviene all'interno endosomi in circa 10 giorni sulla incorporazione cellulare e formazione sferoide MSC. È interessante notare che questo degrado massiccia è stata associata con l'archiviazione efficiente del ferro libero all'interno della proteina ferritina ed ha comportato un impatto molto limitato sul metabolismo del ferro cellulare, boding bene per le future applicazioni cliniche 25.
Un altro punto critico è il requisito di compattazione cella di avviare condrogenesi. Di solito, la condensazione di cellule è ottenuta per centrifugazione; Tuttavia, questo metodo è limitato da un basso numero di cellule (non più di 2,5 x 10 5 cellule). Passato questo numero, i nutrienti e il gas non possono diffondere al centro degli aggregati, innescando necrosi cellulare. Qui, la condensazione magnetico di cellule staminali marcate in aggregati appare come un metodo significativo per formare costrutti 3D per la rigenerazione del tessuto cartilagineo. tale procedura magnetico è stato utilizzato da altri autori acostruire sferoidi 3D: da levitazione magnetica con un magnete posto sulla parte superiore della piastra dopo la dissociazione di cellule 23 o con perni di ferro per localizzare il campo magnetico 26. Tuttavia, levitazione magnetica non sembra essere adatto per ulteriori fasi di fusione aggregato. Al contrario, con il metodo qui proposto magnetico, possiamo controllare tutte le fasi di fusione per ottenere una costruzione tessuto cartilagineo passo-passo. In breve, questo processo in più fasi inizia con confinamento delle cellule staminali in blocchi aggregato ed è seguita dalla fusione di questi blocchi in una struttura più grande. I passaggi critici di questa procedura di aggregazione delle cellule staminali privo di ponteggio sono i seguenti: in primo luogo, si deve formare ciascun aggregato con il minor volume di cellule possibile e secondo, bisogna controllare le fasi di fusione per evitare la formazione di un unico grande aggregato. Il tessuto ottenuto qui era ricco di collagene II e aggrecan. E 'anche presentato l'advantages di avere geometria e dimensione flessibile e di essere privo di ponteggio.
L'approccio magnetico è stato utilizzato anche per guidare le cellule staminali all'interno scaffold spesse e grandi; Un'altra alternativa per la progettazione di varie forme e dimensioni. Il passo critico è dare dei ponteggi con un volume appropriato di cellule: né troppo poco per avere una distribuzione omogenea complessiva delle cellule, né troppo per evitare la perdita di cellule. Forze magnetiche sono stati utilizzati in precedenza per attrarre e mantenere le cellule all'interno di impalcature e per migliorare la semina delle cellule 27, 28. Qui, la condensazione delle cellule sufficiente all'interno dei pori dei ponteggi polisaccaridi ha portato a condrogenesi successo. La produzione matrice extracellulare è stata notevolmente migliorata quando i ponteggi magneticamente cellularized sono stati sottoposti alle / taglio stimoli di stress trasduzione forniti dai bioreattori grazie alla sua rotazione biassiale. E 'stato dimostrato in altri studi che MULcondizioni di carico ti-assiali migliorato la qualità dei tessuti formati da condrociti 29. Questo concetto bioreattore romanzo presenta un guadagno reale rispetto alle tecniche attuali, dove solo forze di compressione sono applicati 30, 31, 32.
In conclusione, per la differenziazione condrogenica, l'uso di confinamento magnetico di cellule staminali marcate per formare e manipolare aggregati nonché per seminare scaffold permesso la realizzazione di millimetro dimensioni cartilagine costrutti cellulari. Inoltre, combinando magnetico semina delle cellule con differenziazione dinamica fornisce un nuovo strumento prezioso per applicazioni di medicina rigenerativa.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori vorrebbero riconoscere QuinXell Technologies e CellD, in particolare Lothar Grannemann e Dominique Ghozlan per il loro aiuto con il bioreattore. Ringraziamo Catherine Le Visage, che ci ha fornito i pullulano / ponteggi polisaccaride destrano. Questo lavoro è stato sostenuto dall'Unione Europea (progetto ERC-2014-Cog Matisse 648.779) e dalla AgenceNationalede la Recherche (ANR), la Francia (progetto MagStem ANR-11 SVSE5).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iron oxide (maghemite) nanoparticules (γ-Fe2O3) | PHENIX - University Paris 6 | Made and given by C. Ménager | Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge |
| Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds | LIOAD - University Nantes | Made and given by C. Le Visage | Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10 M NaOH). Porosity: 185-205 µm; Thickness: 7 mm; Surface area: 1.8 cm2. |
| TisXell Regeneration System | QuinXell Technologies | QX900-002 | Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber |
| Cage for scaffolds: Histosette II M492 | VWR | 720-0909 | |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | Three independant batches have been used |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin (10,000 U/mL) / Streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| Sodium pyruvate solution 100 mM | Sigma | S8636 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20 °C |
| TGF-beta 3 protein 10 µg | Interchim | 30R-AT028 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare the 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C |
| Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus | Sigma | P2986 | |
| Dextranase from Chaetomium erraticum | Sigma | D0443 | |
| NucleoSpin RNA Extraction Kit | Macherey-Nagel | 740955.5 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| Random Primer - Hexamer | Promega | C1181 | 500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample |
| Recombinant RNAs in ribonuclease inhibitor | Promega | N2511 | 40 U/µL: put 1 µL per sample |
| PCR nucleotide dNTP mix (10 mM each) | Roche | 10842321 | |
| SyBr Green PCR Master Mix | Life Technologies | 4368708 | |
| Step One Plus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4381792 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| OCT solution | VWR | 361603E | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Toluidine blue O | VWR | 1.15930.0025 | |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Toluene | VWR | 1.08323.1000 | |
| Mounting medium Pertex | Histolab | 840 | |
| RPLP0 Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3' |
|
| Aggrecan Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5' | |
| Collagen II Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5' |
References
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