Summary

Hurtig sletningsproduktion i svampe via<em> Agrobacterium</em> Medieret transformation af OSCAR-sletningskonstruktioner

Published: June 12, 2017
doi:

Summary

Gendeletionsmutanter frembragt ved homolog rekombination er guldstandarden for genfunktionsstudier. OSCAR (One Step Construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids) fremgangsmåden til hurtig generering af deletionskonstruktioner er beskrevet. Agrobacterium- medieret svamptransformation følger. Endelig præsenteres en PCR-baseret bekræftelsesmetode for gendeletioner i svamptransformanter.

Abstract

Præcis sletning af gen (er) af interesse, medens resten af ​​genomet uændret giver det ideelle produkt til at bestemme det pågældende gens funktion i den levende organisme. I denne protokol beskrives OSCAR-metoden for præcis og hurtig deletionsplasmidkonstruktion. OSCAR er afhængig af kloningsystemet, hvori en enkelt rekombinase-reaktion udføres, der indeholder de oprensede PCR-amplificerede 5'- og 3'-flanker af genet af interesse og to plasmider, pA-Hyg OSCAR (markørvektoren) og pOSCAR vektor). Bekræftelse af den korrekt monterede deletionsvektor udføres ved hjælp af restriktionsfordøjelsesmapping efterfulgt af sekventering. Agrobacterium tumefaciens anvendes derefter til at mediere introduktion af deletionskonstruktionen i svampesporer (benævnt ATMT). Endelig beskrives et PCR-assay for at bestemme, om deletionskonstruktionen integreres ved homolog eller ikke-homolog rekombination, indikerende gendeletion ellerEktopisk integration, henholdsvis. Denne fremgangsmåde er blevet anvendt til sletning af talrige gener i Verticillium dahliae og i Fusarium verticillioides blandt andre arter.

Introduction

Genetisk dissektion er en kraftfuld metode til bestemmelse af den funktionelle betydning af individet eller kombinationer af gener. En standard tilgang til at forstå rollen af ​​specifikke gener er produktion af enkeltgenmutanter uændret i ethvert andet gen. Den mest kraftfulde og mindst potentielt konfronterende tilgang er fuldstændig og præcis deletion af et gen af ​​interesse er åben læseramme (GOI ORF) uden skade på nogen anden genfunktion.

Fordi standardiseringsmetoder til sletning af plasmidgenerering kræver flere trin, var det rationelle for OSCAR 1 at producere en hurtigere in vitro- tilgang. Figur 1 viser samleprocessen i OSCAR-tilgangen. Fremgangsmåden beskrevet her har den fordel at kombinere hurtig konstruktion af individuelle gendeletionsvektorer i en enkelt multipartreaktion i kombination med efterfølgende Agrobacterium tumefaciens- medieret transfoRmation (ATMT). OSCAR er meget hurtig og sammenligner sig godt med andre strategier, såsom anvendelse af Gibson-samling i gær 2 . OSCAR-metoden er blevet anvendt succesfuldt med flere Ascomycota-svamparter. Disse arter omfatter: Fusarium verticillioides (upubliceret), Verticillium dahliae 3 , Setosphaeria turcica 4 , Metarhizium robertsii 5 , Fusarium oxysporum f. sp. Vasinfectum 6 , Pestalotiopsis microspora 7 , Colletotrichum higginsianum 8 og Dothistroma septosporum 9 og Sarocladium zeae (upubliseret) .

Denne protokol tilvejebringer trin-for-trin instruktion til fremgangsmåden inklusiv primer design, flank PCR amplifikation, OSCAR BP reaktion, deletion konstruktion struktur bekræftelse, transformatIon af Agrobacterium med konstruktionen efterfulgt af ATMT-baseret overførsel af deletionskonstruktionen i svampecellerne og endelig differentiering af svampe deletionsmutanter fra dem med ektopisk integrerede deletionskonstruktioner.

Protocol

1. Primer Design for PCR Amplification of Gene Flanks Download til en tekstbehandlingsfil den genomiske region af genet af interesse (GOI), herunder den åbne læseramme (ORF) og mindst 2 kb flankerer genet på hver side fra FungiDB eller anden genomisk datafilde. Fremhæv ORF'en beregnet til sletning og etiket start og stop kodoner. Identificer og markér tilstødende ORF'er inden for den downloadede sekvens. Brug 2-kb 5'-enden af ​​GOI ORF og primerdesig…

Representative Results

OSCAR-metoden genererer i en enkelt reaktion et plasmid indeholdende flankerne af målgenet, der skal slettes omkring den selekterbare markørkassette. Produktionen af ​​sletningskonstruktioner under anvendelse af OSCAR er meget effektiv. Systemet kan imidlertid producere partielle konstruktioner indeholdende nogle, men ikke alle tre fragmenter (de to genflanker og den selekterbare markør). Generelt indeholder størstedelen af E. coli transformanter den korrekte OSCAR konst…

Discussion

One-Step Konstruktion af Agrobacterium- Recombination-ready-plasmids (OSCAR) har med succes været anvendt med et stadigt stigende antal Ascomycota svampe. Metoden bør også let kunne anvendes på Basidiomycota og arter fra andre svampepyla (med passende promotorer, der kører selekterbare markørgener), forudsat at Agrobacterium- medieret transformation og homolog rekombination er mulige. Yderligere markørvektorer er blevet dannet for at diversificere valg af anti-svampeforbindelse samt tillade frem…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne takker følgende grundskole- og gymnasieelever for deres arbejde med at generere OSCAR-mutanter i Fusarium verticillioiodes : Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie, Manny Hernandez , Ashli ​​Crepsac, Jeff Delong, Christian King, Gi Jeong, Maria Belding, Christy Burre, Daniel O'Meara, Lauren (Victoria) Cook, Jake Goodman, Sampriti De, Oge Okoye, Alyssa Beckstead, Garrett Hibbs, Nick Goldstein, Caroline Twum , Chris Benson, Louis Stokes, Hannah Itell, Jane Hulse, Jasim Mohammed, James Loggins, Kelli Russell, Gre'Nisha Jones, Kristin Sheaffer, Mariam Hammady, Ava Wilson, Katrina Bazemore, Toney Harper, Karlin McGhee, Mohmed Momin, Rima Momin , Thi Ngoc Le og Angel Pham.

Materials

FungiDB Database/ http://fungidb.org/fungidb/
IDT PrimerQuest IDT Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
Microsoft Word Sequence file manipulation
Low Na LB Spec 100 medium E. coli transformant selection, composition: 1% tryptone, 0.05% NaCl, 0.5% yeast extract, 1.5 % agar if for solid medium
Co-cultivation medium ATMT transformation induction (Reference 12)
Aspergillus minimal medium with Hygromycin Fungal transformant selection
PDA medium Acumedia 7149A Single spore slant tubes
PDA-Hyg-Kan medium Fungal ransformant isolation, PDA containing 150 μg/ml hygromycin B and 100 μg/ml Kanamycin;
Glass beads Genlantis C400100 Plate spreading
Nitrocellulose filters (47mm) Fisher 09-719-555 Co-culturing for ATMT
Various centifuge tubes multiple preps
Petri plates (various) Culturing of bacteria and Fungi
pA-Hyg OSCAR Addgene 29640 Selectable marker vector
pOSCAR Addgene 29639 Assembly vector
DH5a One Shot Competent E. coli cells Life Technologies  12297-016 BP reaction transformation
ccdB survival E. coli cells Life Technologies  A10460 Maintenance of pOSCAR
Wooden transfer sticks Colony streaking
Toothpicks Colony picking
Microcentrifuge Pelleting Bacteria etc
Preparative centrifuge Fungal spore collection
Dissecting microscope Single spore isolation
Automated Cell Counter Spore suspension calculation
Compound microscope Hemocytometer cell counting
QIAquick PCR Purification Kit  Qiagen 28104 PCR gene flank produict purification
TaKaRa LA Taq  Takara Bio USA RR002A Hi Fidelity taq polymerase for OSCAR flank generation
Hygromycin B InvivoGen ant-hg-5
Spectinomycin Sigma 22189-32-8
Cefotaxim  TCI America C2224
Moxalactam  Sigma-Aldrich 43963
GelRed  Phenix Research Products RGB-4103 Post staining agarose gels
Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Cat. No. 28104) 
(OneShot_ Mach1TM T1R or One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R from Invitrogen)  Thermo Fisher Scientific C862003
Gateway BP Clonase II Enzyme mix Thermo Fisher Scientific 11789020 Used to assemble deletion construct in pOSAR
PrimerQuest tool IDT  Used in step 1.4; available on http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index

References

  1. Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Andrews, D. L., Klosterman, S. J., Baeza-Montañez, L., Gold, S. E. One step construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids (OSCAR), an efficient and robust tool for ATMT based gene deletion construction in fungi. Fungal Genet Biol. 48 (7), 677-684 (2011).
  2. Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  3. Klosterman, S. J., et al. Comparative genomics yields insights into niche adaptation of plant vascular wilt pathogens. PLoS Pathog. 7 (7), (2011).
  4. Xue, C., Wu, D., Condon, B. J., Bi, Q., Wang, W., Turgeon, B. G. Efficient gene knockout in the maize pathogen Setosphaeria turcica using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Phytopathology. 103 (6), 641-647 (2013).
  5. Xu, C., et al. A high-throughput gene disruption methodology for the entomopathogenic fungus Metarhizium robertsii. PloS One. 9 (9), (2014).
  6. Crutcher, F. K., Liu, J., Puckhaber, L. S., Stipanovic, R. D., Bell, A. A., Nichols, R. L. FUBT, a putative MFS transporter, promotes secretion of fusaric acid in the cotton pathogen Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum. Microbiology. 161, 875-883 (2015).
  7. Yu, X., Wang, Y., Pan, J., Wei, D., Zhu, X. High frequency of homologous gene disruption by single-stranded DNA in the taxol-producing fungus Pestalotiopsis microspora. Ann Microbiol. 65 (4), 2151-2160 (2015).
  8. Korn, M., Schmidpeter, J., Dahl, M., Müller, S., Voll, L. M., Koch, C. A Genetic Screen for Pathogenicity Genes in the Hemibiotrophic Fungus Colletotrichum higginsianum Identifies the Plasma Membrane Proton Pump Pma2 Required for Host Penetration. PloS One. 10 (5), e0125960 (2015).
  9. Chettri, P. . Regulation of dothistromin toxin biosynthesis by the pine needle pathogen Dothistroma septosporum: a thesis presented in the partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy (PhD) in Genetics at Massey University, Manawatu, New Zealand . , (2014).
  10. Chen Zhou, ., Yujun Yang, ., Jong, A. Y. Mini-prep in ten minutes. Biotechniques. 8 (2), 172 (1990).
  11. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. P Natl Acad SciUSA. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  12. Khang, C. H., Park, S. Y., Rho, H. S., Lee, Y. H., Kang, S., Wang, K. a. n. Filamentous fungi (Magnaporthe grisea and Fusarium oxysporum). Agrobacterium Protocols. 2, 403-420 (2007).
  13. Zhang, Y. J., Zhang, S., Liu, X. Z., Wang Wen, H. A., M, A simple method of genomic DNA extraction suitable for analysis of bulk fungal strains. Lett Appl Microbiol. 51 (1), 114-118 (2010).
  14. Pluthero, F. G. Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 21 (20), 4850-4851 (1993).
  15. McCluskey, K. Boosting Research and Industry by Providing Extensive Resources for Fungal Research. Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 361-384 (2016).

Play Video

Cite This Article
Gold, S. E., Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Glenn, A. E. Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs. J. Vis. Exp. (124), e55239, doi:10.3791/55239 (2017).

View Video