Summary

Production de deletion rapide dans les champignons via<em> Agrobacterium</em> Transformation médiatisée des constructions de suppression OSCAR

Published: June 12, 2017
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Summary

Les mutants de délétion de gène générés par recombinaison homologue sont l'étalon-or pour les études de fonction de gène. Le procédé OSCAR (One Step Construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids) pour la génération rapide de constructions de suppression est décrit. La transformation fongique médiée par Agrobacterium suit. Enfin, une méthode de confirmation basée sur la PCR des délétions de gènes dans les transformants fongiques est présentée.

Abstract

La suppression précise des gènes d'intérêt, tout en laissant le reste du génome inchangé, constitue le produit idéal pour déterminer la fonction du gène particulier dans l'organisme vivant. Dans ce protocole, on décrit la méthode OSCAR de construction de plasmide de deletion précise et rapide. OSCAR s'appuie sur le système de clonage dans lequel une seule réaction de recombinase est réalisée contenant les flancs 5 'et 3' amplifiés par PCR du gène intéressant et deux plasmides, pA-Hyg OSCAR (le vecteur marqueur) et pOSCAR (l'assemblage vecteur). La confirmation du vecteur de suppression correctement assemblé s'effectue par une cartographie de la digestion par restriction suivie d'un séquençage. Agrobacterium tumefaciens est ensuite utilisé pour méditer l'introduction de la construction de deletion dans les spores fongiques (appelées ATMT). Enfin, un essai de PCR est décrit pour déterminer si la construction de deletion est intégrée par une recombinaison homologue ou non homologue, indiquant la suppression du gène ouIntégration ectopique, respectivement. Cette approche a été utilisée avec succès pour la suppression de nombreux gènes dans Verticillium dahliae et dans Fusarium verticillioides parmi d'autres espèces.

Introduction

La dissection génétique est une méthodologie puissante pour déterminer l'importance fonctionnelle de l'individu ou des combinaisons de gènes. Une approche standard pour comprendre le rôle des gènes spécifiques est la production de mutants géniques uniques inchangés dans tout autre gène. L'approche la plus puissante et la moins potentiellement confuse est la suppression complète et précise d'un cadre de lecture ouvert du gène d'intérêt (GOF ORF) sans endommager d'autres fonctions génétiques.

Parce que les approches de ligature standard pour la production de plasmides de suppression nécessitent des étapes multiples, le rationnel pour OSCAR 1 était de produire une approche in vitro plus rapide. La figure 1 représente le processus d'assemblage dans l'approche OSCAR. La méthode décrite ici a l'avantage de combiner la construction rapide de vecteurs individuels de délétion de gène dans une seule réaction multipartite en combinaison avec un transfo médié ultérieur Agrobacterium tumefaciens(ATMT). OSCAR est très rapide et se compare bien avec d'autres stratégies telles que l'utilisation de l'assemblage de Gibson dans la levure 2 . La méthode OSCAR a été utilisée avec succès avec plusieurs espèces de champignons d'Ascomycota. Ces espèces comprennent : Fusarium verticillioides (non publié), Verticillium dahliae 3 , Setosphaeria turcica 4 , Metarhizium robertsii 5 , Fusarium oxysporum f. Sp. Vasinfectum 6 , Pestalotiopsis microspora 7 , Colletotrichum higginsianum 8 et Dothistroma septosporum 9 et Sarocladium zeae (non publié) .

Ce protocole fournit des instructions étape par étape pour la méthode, y compris la conception de l'amorce, l'amplification par PCR du flanc, la réaction OSCAR BP, la confirmation de la structure de la construction de la suppression, la transformationIon d' Agrobacterium avec la construction suivie d'un transfert à base de ATM de la construction de deletion dans les cellules fongiques et finalement différenciant les mutants de deletion des champignons de ceux avec des constructions de suppression ectopiquement intégrées.

Protocol

1. Conception d'amorce pour l'amplification par PCR des flancs de gènes Téléchargez dans un fichier de traitement de texte la région génomique du gène d'intérêt (GOI), y compris le cadre de lecture ouvert (ORF) et au moins 2 kb flanquant le gène de chaque côté de FungiDB ou d'autres ressources de données génomiques. Mettez en surbrillance l'ORF destiné à la suppression et à l'amorçage des étiquettes et à l'arrêt des codons. Identifiez et mett…

Representative Results

La méthode OSCAR, dans une seule réaction, génère un plasmide contenant les flancs du gène cible à supprimer entourant la cassette de marque sélectionnable. La production de constructions de suppression utilisant OSCAR est très efficace. Cependant, le système peut produire des constructions partielles contenant certains mais pas les trois fragments (les deux flancs de gènes et le marqueur sélectionnable). Généralement, la majorité des transformants de E. coli conti…

Discussion

La construction en une étape des plasmides prêts à l'emploi d'Agrobacterium-Recombination (OSCAR) a été utilisée avec succès avec un nombre toujours croissant de champignons d'Ascomycota. La méthode devrait également être facilement applicable aux Basidiomycota et aux espèces d'autres phylas fongiques (avec des promoteurs appropriés conduisant des gènes marqueurs sélectionnables), en supposant que la transformation médiée par Agrobacterium et la recombinaison ho…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient les étudiants de premier cycle et de lycée suivants pour leur travail de génération de mutants OSCAR dans les verticillioiodes de Fusarium : Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie, Manny Hernandez Ashli ​​Crepsac, Jeff Delong, Christian King, Gi Jeong, Maria Belding, Christy Burre, Daniel O'Meara, Lauren (Victoria) Cook, Jake Goodman, Sampriti De, Oge Okoye, Alyssa Beckstead, Garrett Hibbs, Nick Goldstein, Caroline Twum Chris Benson, Louis Stokes, Hannah Itell, Jane Hulse, Jasim Mohammed, James Loggins, Kelli Russell, Gre'Nisha Jones, Kristin Sheaffer, Mariam Hammady, Ava Wilson, Katrina Bazemore, Toney Harper, Karlin McGhee, Mohmed Momin, Rima Momin , Thi Ngoc Le et Angel Pham.

Materials

FungiDB Database/ http://fungidb.org/fungidb/
IDT PrimerQuest IDT Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
Microsoft Word Sequence file manipulation
Low Na LB Spec 100 medium E. coli transformant selection, composition: 1% tryptone, 0.05% NaCl, 0.5% yeast extract, 1.5 % agar if for solid medium
Co-cultivation medium ATMT transformation induction (Reference 12)
Aspergillus minimal medium with Hygromycin Fungal transformant selection
PDA medium Acumedia 7149A Single spore slant tubes
PDA-Hyg-Kan medium Fungal ransformant isolation, PDA containing 150 μg/ml hygromycin B and 100 μg/ml Kanamycin;
Glass beads Genlantis C400100 Plate spreading
Nitrocellulose filters (47mm) Fisher 09-719-555 Co-culturing for ATMT
Various centifuge tubes multiple preps
Petri plates (various) Culturing of bacteria and Fungi
pA-Hyg OSCAR Addgene 29640 Selectable marker vector
pOSCAR Addgene 29639 Assembly vector
DH5a One Shot Competent E. coli cells Life Technologies  12297-016 BP reaction transformation
ccdB survival E. coli cells Life Technologies  A10460 Maintenance of pOSCAR
Wooden transfer sticks Colony streaking
Toothpicks Colony picking
Microcentrifuge Pelleting Bacteria etc
Preparative centrifuge Fungal spore collection
Dissecting microscope Single spore isolation
Automated Cell Counter Spore suspension calculation
Compound microscope Hemocytometer cell counting
QIAquick PCR Purification Kit  Qiagen 28104 PCR gene flank produict purification
TaKaRa LA Taq  Takara Bio USA RR002A Hi Fidelity taq polymerase for OSCAR flank generation
Hygromycin B InvivoGen ant-hg-5
Spectinomycin Sigma 22189-32-8
Cefotaxim  TCI America C2224
Moxalactam  Sigma-Aldrich 43963
GelRed  Phenix Research Products RGB-4103 Post staining agarose gels
Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Cat. No. 28104) 
(OneShot_ Mach1TM T1R or One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R from Invitrogen)  Thermo Fisher Scientific C862003
Gateway BP Clonase II Enzyme mix Thermo Fisher Scientific 11789020 Used to assemble deletion construct in pOSAR
PrimerQuest tool IDT  Used in step 1.4; available on http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index

References

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Gold, S. E., Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Glenn, A. E. Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs. J. Vis. Exp. (124), e55239, doi:10.3791/55239 (2017).

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