Summary
Gene-deletjonsmutanter generert ved homolog rekombination er gullstandarden for genfunksjonsstudier. OSCAR (One Step Construction av Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids) metode for rask generering av deletjonskonstruksjoner er beskrevet. Agrobacterium- mediert sopptransformasjon følger. Endelig presenteres en PCR-basert bekreftelsesmetode for genutslettelser i sopptransformanter.
Abstract
Presis deletion av gen (er) av interesse, mens resten av genomet uendret gir det ideelle produktet for å bestemme det spesielle gens funksjon i den levende organismen. I denne protokollen beskrives OSCAR-metoden for nøyaktig og rask deletjonsplasmidkonstruksjon. OSCAR er avhengig av kloningsystemet der en enkelt rekombinase-reaksjon utføres inneholdende de rensede PCR-amplifiserte 5'- og 3'-flankene av genet av interesse og to plasmider, pA-Hyg OSCAR (markørvektoren) og pOSCAR (forsamlingen vektor). Bekreftelse av den korrekt monterte deletjonsvektoren utføres ved hjelp av restriksjonsfordøyelseskartlegging etterfulgt av sekvensering. Agrobacterium tumefaciens brukes da til å mediere innføring av deletionskonstruksjonen i soppsporer (referert til som ATMT). Endelig beskrives en PCR-analyse for å bestemme om deletjonskonstruksjonen integreres ved homolog eller ikke-homolog rekombination, som indikerer gen-deletjon ellerEktopisk integrasjon, henholdsvis. Denne tilnærmingen har blitt vellykket brukt for sletting av mange gener i Verticillium dahliae og i Fusarium verticillioides blant andre arter.
Introduction
Genetisk disseksjon er en kraftig metode for å bestemme funksjonell betydning av individ eller kombinasjoner av gener. En standard tilnærming for å forstå rollen av spesifikke gener er produksjon av enkeltgenmutanter uendret i noe annet gen. Den mest kraftige og minst potensielt forvirrende tilnærmingen er fullstendig og nøyaktig sletting av et gen av interesse er åpen leseramme (GOI ORF) uten skade på noen annen genfunksjon.
Fordi standardiseringsmetoder for sletting av plasmidgenerering krever flere trinn, var det rasjonelle for OSCAR 1 å produsere en raskere in vitro- tilnærming. Figur 1 viser monteringsprosessen i OSCAR-tilnærmingen. Fremgangsmåten beskrevet her har fordelen av å kombinere rask konstruksjon av individuelle gen-deletjonsvektorer i en enkelt multipartreaksjon i kombinasjon med etterfølgende Agrobacterium tumefaciens- mediert transfoRmation (ATMT). OSCAR er veldig rask og sammenligner seg godt med andre strategier som bruk av Gibson-montering i gjær 2 . OSCAR-metoden har blitt brukt med flere Ascomycota-sopparter. Disse artene inkluderer : Fusarium verticillioides (upublisert), Verticillium dahliae 3 , Setosphaeria turcica 4 , Metarhizium robertsii 5 , Fusarium oxysporum f. sp. Vasinfectum 6 , Pestalotiopsis microspora 7 , Colletotrichum higginsianum 8 og Dothistroma septosporum 9 og Sarocladium zeae (upublisert) .
Denne protokollen gir trinnvis instruksjon for metoden, inkludert primerdesign, flank-PCR-amplifikasjon, OSCAR BP-reaksjonen, deletjonskonstruksstrukturbekreftelse, transformatIon av Agrobacterium med konstruksjonen fulgt av ATMT-basert overføring av deletjonskonstruksjonen i soppcellene og endelig differensiering av soppdeletjonsmutanter fra de med ektopisk integrerte deletjonskonstruksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Primer Design for PCR Amplification of Gene Flanks
- Last ned til en tekstbehandlingsfil den genomiske regionen av genet av interesse (GOI), inkludert den åpne leserammen (ORF) og minst 2 kb flankerer genet på hver side fra FungiDB eller annen genomisk dataressurs.
- Fremhev ORF beregnet for sletting og etikett start og stopp kodoner.
- Identifiser og merk av tilstøtende ORFer i den nedlastede sekvensen.
- Bruk 2 kb 5 'enden av GOI ORF og primerdesignverktøyet (se Materialeliste) for å designe PCR-primerpar O1 og O2 for å generere et minimumsstørrelsesprodukt på 1 kb. Pass på å ikke påvirke tilstøtende ORFer.
- Lim inn 2 kb 5 'flanken i "Sequence Entry" -vinduet. Klikk på "Vis tilpassede parametere" -boksen. Skriv inn følgende tilpassede designparametere: primer TM 58 (min), 60 (opt) og 62 (maks); Primer GC 40 (min), 50 (opt) og 60 (maks); Primerstørrelse 22 (min), 24 (opt) og 26(Maks); Amplicon Størrelse 1250 (min), 1500 (opt) og 2000 (maks).
- Velg resultatet som plasserer den bakre primeren (O2) nærmest ORF. Ta et skjermbilde av analysene og kopier og lim inn primer-sekvensene i tekstbehandlingsdokumentet.
- Gjenta prosessen for 3'-flank for å generere primere O3 og O4, denne gangen velg resultatet som plasserer den fremre primeren (O3) nærmest målet ORF.
- Legg til passende bindesteder til 5'-ender av primere 1 til 4 (se tabell 1 ).
- Også design og bestill ORF-spesifikke primere som skal brukes til sletting av bekreftelse i avsnitt 4 nedenfor. Parametrene skal være de samme som i trinn 1.4.1, unntatt bruk Amplicon Størrelse 500 (min), 750 (opt) og 1000 (maks) justering for lengden av ORF om nødvendig. Til slutt, for å bekrefte homologe rekombinanter, genererer 5'-ut og 3'-ut primere like utenfor flankene i kromosomet. Disse "ut" primere vil bli brukt sammen medHygR (210) og hygF (850), henholdsvis ( Fig. 2 ).
- Bestill primere.
2. Produksjon av OSCAR Constructs
- Bruk en høykvalitets Taq, utfør to reaksjoner, en hver for 5'- og 3'-flankene, ved å bruke primere (100 μM) O1 og O2 i en reaksjon og primere O3 og O4 i den andre. Reaksjonsblanding inneholder følgende: 29,5 μL sterilt destillert vann (SDW), 5 μl 10x LA PCR buffer, 8 μl 2,5 mM dNTP-blanding, 5 μl 25 mM MgCl2, 1 μl mal (50 ng / μl), 0,5 μl hi- Fidelity Taq , 0,5 μL Primer O1 og 0,5 μL Primer O2 for 5'-flank (eller 0,5 μL Primer O3 og 0,5 μL Primer O4 for 3'-flank) Bruk reaksjonsbetingelser er som følger: 94 ° C i 1 min, deretter 30 sykluser av 94 ° C i 30 s, 60 ° C i 30 s, 72 ° C i 2 minutter, deretter sluttrinnene 72 ° C i 5 minutter og deretter holdes ubestemt ved 10 ° C.
- Kjør 0,8%Agarose 1x TAE (40 mM Tris acetat pH 8,3, 1 mM EDTA) gelelektroforese for ca. 125 Vh i et standard minigelapparat for å bestemme produktstørrelse og relativ konsentrasjon. Legg flekken på gelen med ikke-etidiumflekk i henhold til produsentens instruksjoner. Visualiser på en UV-belyser.
- Hvis 5 'og 3' flankprodukter er i omtrent jevn konsentrasjon, kombinere dem og bruk et affinitetskolonne kit (eller PEG-utfelling 90 μL kombinert PCR-produkter, 240 μl TE buffer pH 7,5, 160 μl 30% polyetylenglykol PEG8000 30 mM MgCl 2 ) å rense PCR-produktene i henhold til produsentens protokoll. Hvis de ikke er like lik konsentrasjon kombinere alt lavt konsentrasjonsprodukt med en estimert like mengde produkt fra høyere utbyttereaksjon.
- Bruk et spektrofotometer til å måle renset DNA-konsentrasjon.
- Utfør BP-reaksjon ved å blande følgende: 1 μL 60 ng / μl pOSCAR, 2 μL 60 ng /ΜL pA-Hyg-OSCAR, 1 μl 60 ng / μL kombinerte flanker, 1 μl klonase. Inkuber i 16 timer ved 25 ° C. Avslutt reaksjonen ved å tilsette 0,5 μl proteinase K og inkuber i 10 minutter ved 37 ° C.
- Overfør høy kompetanse E. Coli- celler. Både kommersielt tilgjengelige kompetente celler og hjemmelagde DH5a CaCl 2 kompetente celler ble brukt vellykket som mottakere som beskrevet av produsentens instruksjoner. Plate på lav natrium (0,5 g / l NaCl) LB inneholdende 100 μg / ml spektinomycin (Spec).
- Identifiser riktig konstruksjon ved å utføre DNA minipreps 10 av kolonier generert ovenfor. Utfør dobbel fordøyelse med Hin dIII og Kpn I som følger: pipett 5 μL DNA, 2 U av hvert enzym, 2 μl passende 10 x buffer med SDW til et totalt volum på 20 μL. Dette frigir innsatsen (ca. 4,5 kb med 1,5 kb genflanker) fra vektoren ( ca. 7 kb) og kutter noen steder iFlanker som kan gi forutsigbare båndstørrelser.
- Sekvens 11 velger kloner som viser et passende båndmønster.
3. Agrobacterium tumefaciens Mediated Transformation (ATMT) av svampe
- Transform Agrobacterium tumefaciens stamme AGL1 med OSCAR deletion konstruksjon 12 .
- Transform sopp med AGL1 som inneholder GOI OSCAR deletjonsplasmidet. For å gjøre dette, utfør følgende trinn:
- Forbered en soppsporesuspensjon med sterilt vann ved 2 x 106 sporer / ml. Kvantifiser sporer på et hemocytometer eller en automatisert celleteller. Plasser 500 μL av dette i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Denne oppsettet er for 4 transformasjonsplater.
- Bruk en blå steril engangssling for å legge til en lett synlig gob (skal dekke ca. 20% av sløyfediameteren) av deletjonsplasmidet som inneholder AGL1 fra 2-3 dagers LB-Spec 100 medium (se MAterials Liste for sammensetning) som inneholder plater og blandes i sporesuspensjonen. Vortex til bakterielle celler er godt spredt ( ca. 5 min medium hastighet).
- Pipetter 100 μl av conidia-Agro suspensjonen på midten av et cellulosemembranfilter plassert på hver av fire 6 cm petriskål inneholdende samdyrkningsmedium 12 .
- Spred suspensjonen med sterile glassperler (ca. 4) for å dekke hele overflaten av membranfilteret. Alternativt spre suspensjonen ved hjelp av et tradisjonelt spreaderverktøy. La membranfilteret tørke i en hette i ca. 10 minutter, pakk med parafinfilm. Gjenta trinn 3.2.2 og 3.2.3 for å konfigurere flere transformasjoner.
- Inkuber platen i 2 dager ved romtemperatur, omvendt.
- Overfør membranfilteret på 6 cm Aspergillus seleksjonsmedium 12 plater inneholdende hygromycin B (Hyg) 150 μg / ml, 200 mM cefotaxim og 100 μg / mlMoxalactam. Inkuber ved romtemperatur i 5-7 dager før isolering av Hyg-resistente kolonier.
- Med sterile tannplukkere, overfør putative transformanter på 6 cm potet Dextrose Agar (PDA) plater som inneholder 150 μg / mL Hyg, 100 μg / mL kanamycin.
4. Deletion Mutant Identification by PCR
- Ekstraher DNA til PCR fra transformanter ved termolyse 13 .
- Når transformanter danner kolonier på PDA fra trinn 3.2.7, bruk en steril tannpirke for å overføre en liten mengde (2 mm x 2 mm) mycelium eller gjærceller fra kolonien til 100 ul lysisoppløsning (50 mM natriumfosfat, pH 7,4, 1 mM EDTA, 5% glycerol) i et mikrosentrifugerør.
- Inkuber blandingen ved 85-90 ° C i 20-30 minutter. Oppbevar råekstraktet som inneholder genomisk DNA ved -20 ° C til bruk i trinn 4.2.
- Utfør 4 PCR-reaksjoner per transformant, en hver til dEtekter homolog rekombination av henholdsvis 5'- og 3'-flankene, en for den selekterbare markør (hygromycinfosfotransferase i dette tilfelle) og en for GOI ORF.
MERK: Vi bruker vanligvis billig, lavtrofast Taq for disse reaksjonene. Reaksjonsbetingelser er som beskrevet i trinn 2.1 ovenfor og inneholder SDW 20 μl, 10 x Taq buffer 2,5 μL, dNTPS (10 mM) 0,5 μl, hjemmelaget Taq 14 , 0,5 μl, Primer A (100 μM) 0,5 μl, Primer B (100 μM ) 0,5 μl, mal 0,5 μl. Lavere konsentrasjonsprimerbeholdere (10 μM) kan brukes like bra. - Kjør en agarosegel ( f.eks. 0,8%) av PCR-produktene. Slettingsmutanter vil produsere Hyg-båndet, men ikke et ORF-produkt. Ektopiske integrasjoner vil vise begge bandene. Vildtype vil produsere bare ORF-båndet.
- Permanent lagre slettingsmutanter (og en ektopisk transformant eller to for kontroller) for fremtidig bruk.
MERK: 15% glycerol brukes til sRev våre stammer langsiktig ved -80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
OSCAR-metoden, i en enkelt reaksjon, genererer et plasmid som inneholder flankene i målgenet som skal slettes rundt den selekterbare markørkassetten. Produksjonen av slettekonstruksjoner med OSCAR er svært effektiv. Systemet kan imidlertid produsere delvise konstruksjoner som inneholder noen, men ikke alle tre fragmentene (de to genflankene og den selekterbare markøren). Generelt inneholder de fleste E. coli transformanter den riktige OSCAR konstruksjonen. For eksempel viser Figur 2 OSCAR-deletionskonstruksjonen for Verticillium dahliae- genet VDAG_06812. I dette tilfellet mangler flankene til VDAG_06812 Hin dIII eller Kpnl-steder, og derfor bør en plasmidinnsats på 4,247 bp frigjøres. Fig. 3 viser Hin dIII- Kpn I restriktionsenzymdobbelt fordøyelsesbekreftelse av den riktige plasmidstrukturen bortsett fra banene 5 og 11 som representerer uregelmessig konstruksjonts. Figur 4 viser endelig bekreftelse på to forskjellige gen deletjoner av Southern blot. Figur 5 viser en endelig PCR-tilnærming som et alternativ til Southern blot.
Figur 1: OSCAR sletting konstruksjon reaksjon. OSCAR-sletningskonstruksjonsprosessen inkluderer separat PCR-amplifisering av 5'- og 3'-genflankene, etterfulgt av en BP-klonase-reaksjon med de kombinerte rensede flankprodukter og de binære og seleksjonsmarkørplasmider. B1r, B2r, B3, B4, P1r, P2r, P3, P4, R1, R2, L3 og L4 representerer lambda rekombinasjonssteder. Skriv ut med tillatelse fra referanse 1 .
Figur 2: OSCAR-sletningskonstruksjon for < Em > Verticillium dahliae gen VDAG_06812. Posisjoner av restriksjonsenzymgjenkjenning og primerglødesteder for å verifisere korrekt deletjonkonstruktstruktur er vist. Skriv ut med tillatelse fra referanse 1 .
Figur 3: Restriksjon fordøyelsesbekreftelse av deletion konstruksjon strukturen av VDAG_06812 med Kpn I og Hin dIII. Plasmider ble fordoblet og analysert ved gelelektroforese på en 0,8% agarosegel. Den korrekte konstruksjon genererer to bånd, på ca. 6,9 kb og 4,2 kb, som representerer den binære vektorkroken og HygR-markøren fusjonert til henholdsvis målgenflankene. Skriv ut med tillatelse fra referanse 1 .
Figur 4: Southern blot hybridisering bekrefter sletting av VDAG_02161 og VDAG_09930 i V. dahliae ved bruk av OSCAR deletion konstruksjoner. Genomiske DNA ble spaltet med Bcl I. De ble deretter probet samtidig med VDAG_02161 og VDAG_09930 ORF prober. Hybridiseringsbånd er 2,757 bp og 1 426 bp for vildtype alleler av henholdsvis VDAG_02161 og VDAG_09930. Prøver er som følger: bane 1: Vildtype stamme VdLs.17; Bane 2: deletjonsmutantstamme 02161.1; Bane 3: deletjonsmutantstamme 02161.3; Bane 4: ektopisk transformantstamme Ect 02161.2; Bane 5: deletjonsmutantstamme 09930.3; Bane 6: deletjonsmutant stamme 09930.10; Bane 7: ektopisk transformantstamme Ect 09930.4. Skriv ut med tillatelse fra Referanse 1 .
Figur 5: Deletion mutant bekreftelse ved PCR. Analyse av sletting og ektopiske Fusarium verticillioides transformanter for genet FVEG_13253. Baner 1 topp og bunn, markør; Baner 2-6 top gel-transformant PCR 5'-ut fragment-amplifikasjon; Baner 7-11 topp gel ORF amplifisering; Baner 2-6 bunn gel Hyg-genforsterkning; Baner 7-11 bunn gel 3 'ut fragment amplifikasjon. Prøver er deletjonsstammer 11/31 (baner 2 og 7), 11/32 (baner 3 og 8), 11/33 (baner 4 og 9) og ektopiske transformanter 11/34 (baner 5 og 10) og 11 / 35 (baner 6 og 11).
| primer | Bruk | Sekvens |
| Primer O1- (attB2r) | Amplifisering av 5'flank,Primer fremover | 5'-GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGAA |
| Primer O2- (attB1r) | Amplifisering av 5'flank, primer revers | 5'-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGT |
| Primer O3- (attB4) | Forsterkning av 3'-flank, primer fremover | 5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGTT |
| Primer O4- (attB3) | Amplifisering av 3'-flank, primer revers | 5'-GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGT |
Tabell 1: Spesifikke OSCAR-primer-5'-utvidelser tilsatt til genspesifikke primersekvenser.
| primer | Bruk | Sekvens |
| OSC-F | 5'-CTAGAGGCGCGCCGATATCCT | |
| OSC-R | OSCAR revers sekvenseringsprimer, sekvenser antisense streng av 5 'flank | 5'-CGCCAATATATCCTGTCAAACACT |
| HygR (210) | Omvendt sekvenseringsprimer, sekvenser antisensjonsstreng av 5'-flanken | 5'-GCCGATGCAAAGTGCCGATAAACA |
| HygF (850) | Forward sequencing primer, sekvenser fornemmer streng av 3'-flanken | 5'-AGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCG |
| Ny Hyg Marker Forward | For å amplifisere hygromycinresistensgenet som en kontroll (sammen med New Hyg Marker Reverse Primer nedenfor) | 5'-GACAGGAACGAGGACATTATTA |
| Ny Hyg Marker Omvendt | For å amplifisere hygromycinresistensgenet som en kontroll (sammen med New Hyg Marker Forward-primer over) | 5'-GCTCTGATAGAGTTGGTCAAG |
Tabell 2: Primers for analyse av OSCAR deletion konstruksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett trinns konstruksjon av Agrobacterium -Rombinasjon-klar-plasmider (OSCAR) har blitt brukt med et stadig økende antall Ascomycota-sopp. Metoden bør også enkelt gjelde for basidiomycota og arter fra andre soppfyla (med passende promotorer som driver selekterbare markørgener), forutsatt at Agrobacterium- mediert transformasjon og homolog rekombination er mulig. Ytterligere markørvektorer er blitt generert for å diversifisere valg av anti-soppforbindelse, samt tillate produksjon av dobbelt- og høyere-ordensmutanter. Disse inkluderer resistens mot G418, nourseothricin, og nylig har herbicidene glufosinat ammonium og klorimuron etyl 4 .
Metoden ble utarbeidet for bruk med Verticillium dahliae hvor bildene presentert her hovedsakelig er avledet 1 . Mer nylig har OSCAR blitt brukt mye for slettingAv gener i mykotoxigenic sopp Fusarium verticillioides. Over 60 deletionskonstruksjoner er blitt gjort og deletjoner mutanter for mer enn 30 gener generert (upublisert).
I sin nåværende iterasjon krever prosessen ca. 4-6 uker å ha et sett med bekreftede deletjonsmutanter i hånden. Følgende er en kort liste over de viktigste OSCAR-trinnene og omtrentlig tid som trengs for å oppnå dem: 1) Design og anskaffelse av OSCAR-primere basert på genomdata (5 dager), 2) flankforsterkning og kloning, (2 dager), 3) Klonbekreftelse ved miniprep og sekvensering (1 uke), 4) innføring av plasmid i Agrobacterium for ATMT (4 dager), 5) produksjon av transformanter ved ATMT i Fusarium verticillioides og vokse ut (2 uker, merk at dette er avhengig av vekstraten Av fungus under studien), termolyse og PCR-bestemmelse av transformantgenotyper (2 dager), 6) enkeltsporing, genotypebekreftelse og lagring (1-2 uker).
15 . Andre OSCAR-markørplasmider som pA-Bar-OSCAR og pA-Sur-OSCAR kan være tilgjengelige fra forfattere 5 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker følgende grunnskole- og videregående studenter for deres arbeid for å generere OSCAR-mutanter i Fusarium verticillioiodes : Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie, Manny Hernandez , Ashli Crepsac, Jeff Delong, Christian King, Gi Jeong, Maria Belding, Christy Burre, Daniel O'Meara, Lauren (Victoria) Cook, Jake Goodman, Sampriti De, Oge Okoye, Alyssa Beckstead, Garrett Hibbs, Nick Goldstein, Caroline Twum , Chris Benson, Louis Stokes, Hannah Itell, Jane Hulse, Jasim Mohammed, James Loggins, Kelli Russell, Gre'Nisha Jones, Kristin Sheaffer, Mariam Hammady, Ava Wilson, Katrina Bazemore, Toney Harper, Karlin McGhee, Mohmed Momin, Rima Momin , Thi Ngoc Le og Angel Pham.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FungiDB | Database/ http://fungidb.org/fungidb/ | ||
| IDT PrimerQuest | IDT | Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index | |
| Microsoft Word | Sequence file manipulation | ||
| Low Na LB Spec 100 medium | E. coli transformant selection, composition: 1% tryptone, 0.05% NaCl, 0.5% yeast extract, 1.5% agar if for solid medium | ||
| Co-cultivation medium | ATMT transformation induction (Reference 12) | ||
| Aspergillus minimal medium with Hygromycin | Fungal transformant selection | ||
| PDA medium | Acumedia | 7149A | Single spore slant tubes |
| PDA-Hyg-Kan medium | Fungal ransformant isolation, PDA containing 150 μg/mL hygromycin B and 100 μg/mL Kanamycin | ||
| Glass beads | Genlantis | C400100 | Plate spreading |
| Nitrocellulose filters (47 mm) | Fisher | 09-719-555 | Co-culturing for ATMT |
| Various centifuge tubes | multiple preps | ||
| Petri plates (various) | Culturing of bacteria and Fungi | ||
| pA-Hyg OSCAR | Addgene | 29640 | Selectable marker vector |
| pOSCAR | Addgene | 29639 | Assembly vector |
| DH5α One Shot Competent E. coli cells | Life Technologies | 12297-016 | BP reaction transformation |
| ccdB survival E. coli cells | Life Technologies | A10460 | Maintenance of pOSCAR |
| Wooden transfer sticks | Colony streaking | ||
| Toothpicks | Colony picking | ||
| Microcentrifuge | Pelleting Bacteria, etc. | ||
| Preparative centrifuge | Fungal spore collection | ||
| Dissecting microscope | Single spore isolation | ||
| Automated Cell Counter | Spore suspension calculation | ||
| Compound microscope | Hemocytometer cell counting | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR gene flank produict purification |
| TaKaRa LA Taq | Takara Bio USA | RR002A | Hi Fidelity taq polymerase for OSCAR flank generation |
| Hygromycin B | InvivoGen | ant-hg-5 | |
| Spectinomycin | Sigma | 22189-32-8 | |
| Cefotaxime | TCI America | C2224 | |
| Kanamycin | 11815032 | ||
| Moxalactam | Sigma-Aldrich | 43963 | |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | Post staining agarose gels |
| Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Cat. No. 28104) | |||
| (OneShot_ Mach1TM T1R or One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R from Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | C862003 | |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Fisher Scientific | 11789020 | Used to assemble deletion construct in pOSAR |
References
- Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Andrews, D. L., Klosterman, S. J., Baeza-Montañez, L., Gold, S. E. One step construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids (OSCAR), an efficient and robust tool for ATMT based gene deletion construction in fungi. Fungal Genet Biol. 48 (7), 677-684 (2011).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Klosterman, S. J., et al. Comparative genomics yields insights into niche adaptation of plant vascular wilt pathogens. PLoS Pathog. 7 (7), (2011).
- Xue, C., Wu, D., Condon, B. J., Bi, Q., Wang, W., Turgeon, B. G. Efficient gene knockout in the maize pathogen Setosphaeria turcica using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Phytopathology. 103 (6), 641-647 (2013).
- Xu, C., et al. A high-throughput gene disruption methodology for the entomopathogenic fungus Metarhizium robertsii. PloS One. 9 (9), (2014).
- Crutcher, F. K., Liu, J., Puckhaber, L. S., Stipanovic, R. D., Bell, A. A., Nichols, R. L. FUBT, a putative MFS transporter, promotes secretion of fusaric acid in the cotton pathogen Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum. Microbiology. 161, 875-883 (2015).
- Yu, X., Wang, Y., Pan, J., Wei, D., Zhu, X. High frequency of homologous gene disruption by single-stranded DNA in the taxol-producing fungus Pestalotiopsis microspora. Ann Microbiol. 65 (4), 2151-2160 (2015).
- Korn, M., Schmidpeter, J., Dahl, M., Müller, S., Voll, L. M., Koch, C. A Genetic Screen for Pathogenicity Genes in the Hemibiotrophic Fungus Colletotrichum higginsianum Identifies the Plasma Membrane Proton Pump Pma2 Required for Host Penetration. PloS One. 10 (5), e0125960 (2015).
- Chettri, P. Regulation of dothistromin toxin biosynthesis by the pine needle pathogen Dothistroma septosporum: a thesis presented in the partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy (PhD) in Genetics at Massey University, Manawatu, New Zealand . , Massey University. Manawatu, New Zealand. (2014).
- Chen Zhou,, Yujun Yang,, Jong, A. Y. Mini-prep in ten minutes. Biotechniques. 8 (2), 172 (1990).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. P Natl Acad SciUSA. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Khang, C. H., Park, S. Y., Rho, H. S., Lee, Y. H., Kang, S. Filamentous fungi (Magnaporthe grisea and Fusarium oxysporum). Agrobacterium Protocols. Wang, K. an 2, Humana Press Inc. Totowa, NJ. 403-420 (2007).
- Zhang, Y. J., Zhang, S., Liu, X. Z., Wang Wen, H. A., M, A simple method of genomic DNA extraction suitable for analysis of bulk fungal strains. Lett Appl Microbiol. 51 (1), 114-118 (2010).
- Pluthero, F. G. Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 21 (20), 4850-4851 (1993).
- McCluskey, K. Boosting Research and Industry by Providing Extensive Resources for Fungal Research. Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , Springer International Publishing. 361-384 (2016).
