Summary

Produção de Deleção Rápida em Fungi via<em> Agrobacterium</em> Transformação mediada de construções de eliminação de OSCAR

Published: June 12, 2017
doi:

Summary

Os mutantes de deleção de genes gerados através da recombinação homóloga são o padrão-ouro para estudos de função gênica. O método OSCAR (One Step Construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids) para a geração rápida de construções de exclusão é descrito. A transformação fúngica mediada por Agrobacterium segue. Finalmente, é apresentado um método de confirmação baseado em PCR de deleções genéticas em transformantes fúngicos.

Abstract

Eliminação precisa de gene (s) de interesse, deixando o resto do genoma inalterado, fornece o produto ideal para determinar a função desse gene específico no organismo vivo. Neste protocolo, descreve-se o método OSCAR de construção de plasmídeos de deleção precisa e rápida. OSCAR depende do sistema de clonagem no qual uma única reação de recombinase é realizada contendo os flancos 5 'e 3' amplificados de PCR amplificados do gene de interesse e dois plasmídeos, pA-Hyg OSCAR (o vetor marcador) e pOSCAR (a assembléia vetor). A confirmação do vetor de deleção corretamente montado é realizada por mapeamento de digestão de restrição seguido de seqüenciamento. Agrobacterium tumefaciens é então usado para mediar a introdução da construção de deleção em esporos de fungos (referido como ATMT). Finalmente, um ensaio de PCR é descrito para determinar se a construção de deleção integrada por recombinação homóloga ou não homóloga, indicando deleção de gene ouIntegração ectopica, respectivamente. Esta abordagem foi utilizada com sucesso para a eliminação de numerosos genes em Verticillium dahliae e em Fusarium verticillioides entre outras espécies.

Introduction

A dissecção genética é uma metodologia poderosa para determinar a importância funcional de indivíduos ou combinações de genes. Uma abordagem padrão para entender o papel de genes específicos é a produção de mutantes de genes únicos inalterados em qualquer outro gene. A abordagem mais poderosa e menos potencialmente confusa é a deleção completa e precisa de um quadro de leitura aberto do gene de interesse (GOF ORF) sem danos a qualquer outra função genética.

Como as abordagens de ligadura padrão para a produção de plasmídeos de deleção requerem etapas múltiplas, o racional para OSCAR 1 era produzir uma abordagem in vitro mais rápida. A Figura 1 mostra o processo de montagem na abordagem OSCAR. O método descrito aqui tem a vantagem de combinar a construção rápida de vetores de deleção de genes individuais em uma única reação multipart em combinação com transfo mediado subseqüente Agrobacterium tumefaciens(ATMT). O OSCAR é muito rápido e compara-se bem com outras estratégias, como o uso da montagem de Gibson em leveduras 2 . O método OSCAR foi utilizado com sucesso com diversas espécies de fungos de Ascomycota. Essas espécies incluem: Fusarium verticillioides (não publicado), Verticillium dahliae 3 , Setosphaeria turcica 4 , Metarhizium robertsii 5 , Fusarium oxysporum f. Sp. Vasinfectum 6 , Pestalotiopsis microspora 7 , Colletotrichum higginsianum 8 e Dothistroma septosporum 9 e Sarocladium zeae (não publicado) .

Este protocolo fornece instruções passo-a-passo para o método, incluindo design de iniciadores, amplificação de PCR de flanco, reação de OSCAR BP, confirmação de estrutura de construção de exclusão, transformaçãoIão de Agrobacterium com a construção seguida pela transferência baseada na ATMT da construção de deleção nas células de fungos e, finalmente, diferencia os mutantes de deleção de fungos daqueles com construções de exclusão ectopicamente integradas.

Protocol

1. Projeto de iniciador para amplificação por PCR de flancos de genes Faça o download para um arquivo de processamento de texto da região genômica do gene de interesse (GOI) incluindo o quadro de leitura aberto (ORF) e pelo menos 2 kb flanqueando o gene em cada lado do FungiDB ou outro recurso de dados genômicos. Destaque o ORF destinado a eliminação e rotina de arranque e paragem de codificações. Identificar e destacar ORFs adjacentes dentro da seqüência de download. …

Representative Results

O método OSCAR, em uma única reação, gera um plasmídeo contendo os flancos do gene alvo a ser excluído em torno da cassete marcador selecionável. A produção de construções de exclusão usando o OSCAR é muito eficiente. O sistema pode, no entanto, produzir construções parciais que contenham alguns, mas não todos os três fragmentos (os dois flancos de genes e o marcador selecionável). Geralmente, a maioria dos transformantes de E. coli contém a construção OSCAR…

Discussion

One Step Construction of Agrobacterium – Os plasmídeos prontos para reconstrução (OSCAR) foram empregados com sucesso com um número cada vez maior de fungos de Ascomycota. O método também pode ser facilmente aplicável à Basidiomycota e a espécies de outros filamentos fúngicos (com promotores apropriados que geram genes marcadores selecionáveis), assumindo que a transformação mediada por Agrobacterium e a recombinação homóloga são possíveis. Foram gerados vetores marcadores ad…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem aos seguintes estudantes de graduação e ensino médio por seu trabalho para gerar mutantes OSCAR em falsos verticillioiodes de Fusarium : Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie, Manny Hernandez Ashli ​​Crepsac, Jeff Delong, Christian King, Gi Jeong, Maria Belding, Christy Burre, Daniel O'Meara, Lauren (Victoria) Cook, Jake Goodman, Sampriti De, Oge Okoye, Alyssa Beckstead, Garrett Hibbs, Nick Goldstein, Caroline Twum Chris Benson, Louis Stokes, Hannah Itell, Jane Hulse, Jasim Mohammed, James Loggins, Kelli Russell, Gre'Nisha Jones, Kristin Sheaffer, Mariam Hammady, Ava Wilson, Katrina Bazemore, Toney Harper, Karlin McGhee, Mohmed Momin, Rima Momin Thi Ngoc Le e Angel Pham.

Materials

FungiDB Database/ http://fungidb.org/fungidb/
IDT PrimerQuest IDT Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
Microsoft Word Sequence file manipulation
Low Na LB Spec 100 medium E. coli transformant selection, composition: 1% tryptone, 0.05% NaCl, 0.5% yeast extract, 1.5 % agar if for solid medium
Co-cultivation medium ATMT transformation induction (Reference 12)
Aspergillus minimal medium with Hygromycin Fungal transformant selection
PDA medium Acumedia 7149A Single spore slant tubes
PDA-Hyg-Kan medium Fungal ransformant isolation, PDA containing 150 μg/ml hygromycin B and 100 μg/ml Kanamycin;
Glass beads Genlantis C400100 Plate spreading
Nitrocellulose filters (47mm) Fisher 09-719-555 Co-culturing for ATMT
Various centifuge tubes multiple preps
Petri plates (various) Culturing of bacteria and Fungi
pA-Hyg OSCAR Addgene 29640 Selectable marker vector
pOSCAR Addgene 29639 Assembly vector
DH5a One Shot Competent E. coli cells Life Technologies  12297-016 BP reaction transformation
ccdB survival E. coli cells Life Technologies  A10460 Maintenance of pOSCAR
Wooden transfer sticks Colony streaking
Toothpicks Colony picking
Microcentrifuge Pelleting Bacteria etc
Preparative centrifuge Fungal spore collection
Dissecting microscope Single spore isolation
Automated Cell Counter Spore suspension calculation
Compound microscope Hemocytometer cell counting
QIAquick PCR Purification Kit  Qiagen 28104 PCR gene flank produict purification
TaKaRa LA Taq  Takara Bio USA RR002A Hi Fidelity taq polymerase for OSCAR flank generation
Hygromycin B InvivoGen ant-hg-5
Spectinomycin Sigma 22189-32-8
Cefotaxim  TCI America C2224
Moxalactam  Sigma-Aldrich 43963
GelRed  Phenix Research Products RGB-4103 Post staining agarose gels
Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Cat. No. 28104) 
(OneShot_ Mach1TM T1R or One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R from Invitrogen)  Thermo Fisher Scientific C862003
Gateway BP Clonase II Enzyme mix Thermo Fisher Scientific 11789020 Used to assemble deletion construct in pOSAR
PrimerQuest tool IDT  Used in step 1.4; available on http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index

References

  1. Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Andrews, D. L., Klosterman, S. J., Baeza-Montañez, L., Gold, S. E. One step construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids (OSCAR), an efficient and robust tool for ATMT based gene deletion construction in fungi. Fungal Genet Biol. 48 (7), 677-684 (2011).
  2. Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  3. Klosterman, S. J., et al. Comparative genomics yields insights into niche adaptation of plant vascular wilt pathogens. PLoS Pathog. 7 (7), (2011).
  4. Xue, C., Wu, D., Condon, B. J., Bi, Q., Wang, W., Turgeon, B. G. Efficient gene knockout in the maize pathogen Setosphaeria turcica using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Phytopathology. 103 (6), 641-647 (2013).
  5. Xu, C., et al. A high-throughput gene disruption methodology for the entomopathogenic fungus Metarhizium robertsii. PloS One. 9 (9), (2014).
  6. Crutcher, F. K., Liu, J., Puckhaber, L. S., Stipanovic, R. D., Bell, A. A., Nichols, R. L. FUBT, a putative MFS transporter, promotes secretion of fusaric acid in the cotton pathogen Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum. Microbiology. 161, 875-883 (2015).
  7. Yu, X., Wang, Y., Pan, J., Wei, D., Zhu, X. High frequency of homologous gene disruption by single-stranded DNA in the taxol-producing fungus Pestalotiopsis microspora. Ann Microbiol. 65 (4), 2151-2160 (2015).
  8. Korn, M., Schmidpeter, J., Dahl, M., Müller, S., Voll, L. M., Koch, C. A Genetic Screen for Pathogenicity Genes in the Hemibiotrophic Fungus Colletotrichum higginsianum Identifies the Plasma Membrane Proton Pump Pma2 Required for Host Penetration. PloS One. 10 (5), e0125960 (2015).
  9. Chettri, P. . Regulation of dothistromin toxin biosynthesis by the pine needle pathogen Dothistroma septosporum: a thesis presented in the partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy (PhD) in Genetics at Massey University, Manawatu, New Zealand . , (2014).
  10. Chen Zhou, ., Yujun Yang, ., Jong, A. Y. Mini-prep in ten minutes. Biotechniques. 8 (2), 172 (1990).
  11. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. P Natl Acad SciUSA. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  12. Khang, C. H., Park, S. Y., Rho, H. S., Lee, Y. H., Kang, S., Wang, K. a. n. Filamentous fungi (Magnaporthe grisea and Fusarium oxysporum). Agrobacterium Protocols. 2, 403-420 (2007).
  13. Zhang, Y. J., Zhang, S., Liu, X. Z., Wang Wen, H. A., M, A simple method of genomic DNA extraction suitable for analysis of bulk fungal strains. Lett Appl Microbiol. 51 (1), 114-118 (2010).
  14. Pluthero, F. G. Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 21 (20), 4850-4851 (1993).
  15. McCluskey, K. Boosting Research and Industry by Providing Extensive Resources for Fungal Research. Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 361-384 (2016).

Play Video

Cite This Article
Gold, S. E., Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Glenn, A. E. Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs. J. Vis. Exp. (124), e55239, doi:10.3791/55239 (2017).

View Video