Gendeletionsmutanter som alstras genom homolog rekombination är guldstandarden för genfunktionsstudier. OSCAR (One Step Construction av Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids) -metoden för snabb generering av deletionskonstruktioner beskrivs. Agrobacterium- medierad svamptransformation följer. Slutligen presenteras en PCR-baserad bekräftelsemetod av gendeletioner i svamptransformanter.
Exakt deletion av gen (er) av intresse, medan resten av genomet oförändras, ger den idealiska produkten för att bestämma den specifika genens funktion i den levande organismen. I detta protokoll beskrivs OSCAR-metoden för exakt och snabb deletionsplasmidkonstruktion. OSCAR är beroende av kloningssystemet där en enda rekombinasreaktion utförs innehållande de renade PCR-amplifierade 5'- och 3'-flankerna av den aktuella genen och två plasmider, pA-Hyg OSCAR (markörvektorn) och pOSCAR (enheten vektor). Bekräftelse av den korrekt monterade deletionsvektorn utförs genom restriktionsmeltningskartläggning följt av sekvensering. Agrobacterium tumefaciens används sedan för att mediera införandet av deletionskonstruktionen i svampsporer (hänvisad till som ATMT). Slutligen beskrivs en PCR-analys för att bestämma om deletionskonstruktionen integreras genom homolog eller icke-homolog rekombination, indikerande gengenetion ellerEktopisk integration, respektive. Denna metod har framgångsrikt använts för att radera flera gener i Verticillium dahliae och i Fusarium verticillioides bland andra arter.
Genetisk dissektion är en kraftfull metod för att bestämma individens funktionella betydelse eller kombinationer av gener. En standardinriktning för att förstå rollen av specifika gener är produktion av enkla genmutanter som oförändrats i någon annan gen. Det mest kraftfulla och minst potentiellt konfronterande tillvägagångssättet är fullständigt och exakt deletion av en gen av intresseens öppna läsram (GOI ORF) utan skada på någon annan genfunktion.
Eftersom standardiseringsmetoder för deletionsplasmidgenerering kräver flera steg, var det rationella för OSCAR 1 att producera en snabbare in vitro -tillvägagångssätt. Figur 1 visar monteringsprocessen i OSCAR-metoden. Förfarandet som beskrivs här har fördelen att kombinera snabb konstruktion av individuella gendeletionsvektorer i en enda multipartreaktion i kombination med efterföljande Agrobacterium tumefaciens- medierad transfoRmation (ATMT). OSCAR är mycket snabb och jämför bra med andra strategier, såsom användning av Gibson-montering i jäst 2 . OSCAR-metoden har använts framgångsrikt med flera Ascomycota-svamparter. Dessa arter inkluderar : Fusarium verticillioides (opublicerad), Verticillium dahliae 3 , Setosphaeria turcica 4 , Metarhizium robertsii 5 , Fusarium oxysporum f. sp. Vasinfectum 6 , Pestalotiopsis microspora 7 , Colletotrichum higginsianum 8 och Dothistroma septosporum 9 och Sarocladium zeae (opublicerad) .
Detta protokoll tillhandahåller steg för steg instruktion för metoden inkluderande primerdesign, flank-PCR-amplifiering, OSCAR BP-reaktion, deletionskonstruktionsbekräftelse, transformatJon av Agrobacterium med konstruktionen följt av ATMT-baserad överföring av deletionskonstruktionen i svampcellerna och slutligen differentierar svampdeletionsmutanter från de med ektopiskt integrerade deletionskonstruktioner.
Enstegsbyggande av Agrobacterium- Recombination-ready-plasmids (OSCAR) har framgångsrikt använts med ett ständigt ökande antal Ascomycota-svampar. Metoden bör också lätt kunna tillämpas på basidiomycotan och arten från andra svampfyla (med lämpliga promotorer som driver selekterbara markörgener), förutsatt att Agrobacterium- medierad transformation och homolog rekombination är möjliga. Ytterligare markörvektorer har genererats för att diversifiera val av anti-svampförening sa…
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar följande grund- och gymnasieelever för deras arbete att generera OSCAR-mutanter i Fusarium verticillioiodes : Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie, Manny Hernandez Ashle Crepsac, Jeff Delong, Christian King, Gi Jeong, Maria Belding, Christy Burre, Daniel O'Meara, Lauren (Victoria) Cook, Jake Goodman, Sampriti De, Oge Okoye, Alyssa Beckstead, Garrett Hibbs, Nick Goldstein, Caroline Twum , Chris Benson, Louis Stokes, Hannah Itell, Jane Hulse, Jasim Mohammed, James Loggins, Kelli Russell, Gre'Nisha Jones, Kristin Sheaffer, Mariam Hammady, Ava Wilson, Katrina Bazemore, Toney Harper, Karlin McGhee, Mohmed Momin, Rima Momin , Thi Ngoc Le och Angel Pham.
FungiDB | Database/ http://fungidb.org/fungidb/ | ||
IDT PrimerQuest | IDT | Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index | |
Microsoft Word | Sequence file manipulation | ||
Low Na LB Spec 100 medium | E. coli transformant selection, composition: 1% tryptone, 0.05% NaCl, 0.5% yeast extract, 1.5 % agar if for solid medium | ||
Co-cultivation medium | ATMT transformation induction (Reference 12) | ||
Aspergillus minimal medium with Hygromycin | Fungal transformant selection | ||
PDA medium | Acumedia | 7149A | Single spore slant tubes |
PDA-Hyg-Kan medium | Fungal ransformant isolation, PDA containing 150 μg/ml hygromycin B and 100 μg/ml Kanamycin; | ||
Glass beads | Genlantis | C400100 | Plate spreading |
Nitrocellulose filters (47mm) | Fisher | 09-719-555 | Co-culturing for ATMT |
Various centifuge tubes | multiple preps | ||
Petri plates (various) | Culturing of bacteria and Fungi | ||
pA-Hyg OSCAR | Addgene | 29640 | Selectable marker vector |
pOSCAR | Addgene | 29639 | Assembly vector |
DH5a One Shot Competent E. coli cells | Life Technologies | 12297-016 | BP reaction transformation |
ccdB survival E. coli cells | Life Technologies | A10460 | Maintenance of pOSCAR |
Wooden transfer sticks | Colony streaking | ||
Toothpicks | Colony picking | ||
Microcentrifuge | Pelleting Bacteria etc | ||
Preparative centrifuge | Fungal spore collection | ||
Dissecting microscope | Single spore isolation | ||
Automated Cell Counter | Spore suspension calculation | ||
Compound microscope | Hemocytometer cell counting | ||
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR gene flank produict purification |
TaKaRa LA Taq | Takara Bio USA | RR002A | Hi Fidelity taq polymerase for OSCAR flank generation |
Hygromycin B | InvivoGen | ant-hg-5 | |
Spectinomycin | Sigma | 22189-32-8 | |
Cefotaxim | TCI America | C2224 | |
Moxalactam | Sigma-Aldrich | 43963 | |
GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | Post staining agarose gels |
Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Cat. No. 28104) | |||
(OneShot_ Mach1TM T1R or One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R from Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | C862003 | |
Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Fisher Scientific | 11789020 | Used to assemble deletion construct in pOSAR |
PrimerQuest tool | IDT | Used in step 1.4; available on http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |