כתב יד זה מתאר גישה ניסיונית מורפולוגית וביוכימית לאפיין ביציות סוסים. באופן ספציפי, העבודה הנוכחית מדגימה כיצד לאסוף ביציות של בוגר בוגרת ובוגרת על ידי אולטראסאונד מונחה איסוף ביצית (OPU) וכיצד לחקור הפרדה כרומוזום, מורפולוגיה ציר, acetylation היסטון גלובלי, ביטוי mRNA.
השדה של רבייה בסיוע פותחה לטיפול בבעיות פוריות אצל נשים, חיות נלוות וסוגים הנמצאים בסכנת הכחדה. בסוס, רבייה מסייעת גם מאפשר ייצור של עוברי מן ביצועים גבוהים בלי להפריע את הקריירה הספורטית שלהם תורמת לעלייה במספר הסייחים ממאדים של ערך גנטי גבוה. כתב היד הנוכחי מתאר את הנהלים המשמשים לאיסוף ביציות בוגר ו בוגר מן השחלות באמצעות ביצית איסוף (OPU). ביציות אלה שימשו אז כדי לחקור את השכיחות של aneuploidy על ידי התאמת פרוטוקול שפותח בעבר בעכברים. באופן ספציפי, הכרומוזומים ואת centromeres של הביציות metaphase II (MII) היו תווית fluorescently ונספר על תוכניות מוקד רציף לאחר מיקרוסקופ לייזר confocal סריקה. ניתוח זה גילה שכיחות גבוהה יותר בשיעור aneuploidy כאשר ביציות בוגרים נאספו הזקיקים והתבגר במבחנה לעומתIn vivo. Immunostaining עבור tubulin ואת הצורה acetylated של היסטון ארבע בשאריות lysine ספציפיים חשף גם הבדלים במורפולוגיה של ציר מיוטי ובתבנית הגלובלית של אצטילציה היסטון. לבסוף, הביטוי של mRNAs קידוד עבור היסטון deacetylases (HDACs) ו acetyl- העברות (HATs) נחקר על ידי שעתוק לאחור quantitative-PCR (q-PCR). לא נמצאו הבדלים בביטוי היחסי של התמלילים שנצפו בין המבחנה לבין הביציות המתבגרות של vivo . בהסכמה עם השתקה כללית של פעילות תמליל במהלך התבגרות הביציות, הניתוח של כמות התמליל הכולל יכול רק לחשוף יציבות mRNA או השפלה. לכן, ממצאים אלה מצביעים על כך שתקנות טרנסלציוניות ופוסט-טרנסלציוניות נוספות עשויות להיות מושפעות.
בסך הכל, המחקר הנוכחי מתאר גישה ניסיונית מורפולוגית וביוכימית לאפיין את הביצית סוס, ceLl סוג זה מאתגר מאוד ללמוד בשל זמינות מדגם נמוך. עם זאת, הוא יכול להרחיב את הידע שלנו על ביולוגיה הרבייה ועקרות מינים monovulatory.
מגוון רחב של טכניקות רבייה בסיוע פותח לטיפול בבעיות פוריות אצל נשים, חיות נלוות וסוגים הנמצאים בסכנת הכחדה. אחד ההליכים הנפוצים ביותר במסגרות קליניות הוא אחזור של ביציות הבמה metaphase II (MII) של זקיקי השחלות על ידי שאיפה transvaginal מונחה אולטרסאונד, איסוף ביצית (OPU) 1 . ביציות אלה מופרות אז במבחנה (IVF), עם העובר שנוצר (ים) מושתל ברחם הנמען. בשלב MII (בוגרת) ביציות מאוחזרים בעקבות ניהול של גונדוטרופינים אקסוגניים. עם זאת, טיפול זה קשור, בחלק מהחולים, עם התפתחות של תסמונת hyperstimulation השחלות (OHSS) 2 .
ניצול של היכולת המהותית של בוגרות, בוגרות בוגרת (שלב GV) כדי לחדש את המיוזה מיד לאחר מבודדים מן הזקיקים שלהם, ניתן להשיג ביציות בוגרות ללא adminisגונדוטרופין 3 . הליך זה נקרא ביצית במבחנה חוץ גופית (IVM) ומייצג גישה פחות סמים, פחות יקר, יותר ידידותי לסבלנות לסיוע טכנולוגיה הרבייה. עם זאת, ההצלחה של התפתחות העובר עם ביציות במבחנה מעובד הוא בדרך כלל נמוך יותר מאשר עם vivo התבגר vivo 4 , 5 . הסבר אפשרי הוא כי ביציות בוגרת מבחנה מושפעים יותר על ידי טעויות הפרדה כרומוזום, וכתוצאה מכך aneuploidy פוגעת התפתחות עובריים נורמלי 6 .
הבנת הבסיס המולקולרי של הפרעה מוטעית כרומוזומלית במהלך IVM תגלה בסופו של דבר את הפוטנציאל המלא של טכניקה זו. ברוח זו, הגישה הניסויית המשמשת לבדיקת התכונות המורפולוגיות והביוכימיות של ביציות במבחנה , בהשוואה ל vivo maturביציות אד כאן מתואר 7 , 8 . באופן ספציפי, את ההליכים עבור OPU של ביציות בשלים בוגרת IVM של ביציות בשלים מודגמים באמצעות סוסים בוגרים טבעי רכיבה כמודל ניסיוני. לאחר מכן, immunofluorescence וניתוח התמונה משמשים לחקור הפרדה כרומוזום, מורפולוגיה ציר, ואת דפוס העולמי של אצטילון היסטון על gametes אלה. לבסוף, פרוטוקול של שעתוק לאחור PCR כמותי מתואר לניתוח ביטוי mRNA.
בהשוואה למודלים של בעלי חיים מכרסמים, סוסים אינם מאפשרים מניפולציה גנטית, הם פחות קל לתמרן, ודורשים תחזוקה יקר. עם זאת, מודל זה הוא צובר עניין רב עבור המחקר של התבגרות הביצית 9 , 10 בשל הדמיון הפיזיולוגיה השחלות האדם 11 , 12 </ Sup>. יתר על כן, פיתוח של פרוטוקולים אמינים של IVM-IVF בסוס יש אינטרס כלכלי משמעותי, שכן זה יאפשר עלייה במספר הסוסים ממאדים של ערך גנטי גבוה.
אחת המגבלות של ביצוע ניסויים על ביציות, במיוחד במינים monovulatory, הוא זמינות מדגם מוגבל. מגבלה זו כבר התגבר כאן על ידי התאמת גישה, שפותחה בעבר בעכברים, כדי ביציות סוס 13 , 14 כדי לבצע ספירת כרומוזום כי ממזער את ההפסד המדגם (ראה דיון להשוואה עם טכניקות אחרות זמין). יתר על כן, פרוטוקול מכתים הקרינה משולשת כבר אופטימיזציה לבצע ניתוחים מרובים על המדגם אותו, וניתוח ה- Q-PCR בוצעו על בריכות של 2 ביציות בלבד.
בסך הכל, המחקר הנוכחי מתאר גישה ניסיונית שמטרתה מורפולוגית ביוכימית צ'הRacterize את הביצית סוס, סוג התא כי הוא מאתגר מאוד ללמוד בשל זמינות מדגם נמוך. עם זאת, הוא יכול להרחיב את הידע שלנו על ביולוגיה הרבייה ועקרות של מינים monovulatory.
למרות IVM בוצעה בסוסים במשך יותר מ 20 שנים 16 , אנחנו עדיין לא יודעים אם הביצית יכולה להיות המקור של aneuploidy עובריים, כפי שהוצע עבור בני אדם 17 . הסיבה היא כנראה כי הכנת מתפשט הביצית עבור ספירת כרומוזום התוצאות להפסד מדגם ניכר. עם זאת, בסקר של שיטות המ…
The authors have nothing to disclose.
המחברים היו רוצים להודות Fabrice וינסנט לתמיכה עם לייזר סריקת מיקרוסקופיה confocal (LSCM) , ואת פיליפ Barrière ו תיירי בלארד לביצוע אולטרסאונד סריקה השחלה היומית וזריקה hCG. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי פרויקט "אזור Sardegna ו Regione Lombardia" "Ex Ovo Omnia" (מענק מס '26096200 ל AML); את "לוריאל איטליה עבור כל דון e la Scienza 2012" המלגה (חוזה 2012 ל FF), FP7-PEOPLE-2011- CIG, מחקר הסוכנות (REA) "Pro-Ovum" (מענק מס '303640 ל VL); ועל ידי בית הספר הפוסט-דוקטורט לחקלאות ולרפואה וטרינרית, במימון משותף של הקרן החברתית האירופית, תוכנית מבצעית סקטוריאלית לפיתוח משאבי אנוש 2007-2013 (חוזה מס 'POSDRU / 89 / 1.5 / S / 62371 ל- IM). אוסף הביציות של vivo מומן על ידי מכון המחקר של Cheval et de l'Equitation.
ultrasound probe | Aloka | UST-5820-7,5 | |
human chorionic gonadotrophin | centravet | CHO004 | 1500unit/animal IV |
detomidine | centravet | MED010 | 9-15µg/kg IV |
butylscopolamine bromure | centravet | EST001 | 0,2mg/kg IV |
stereomicroscope | NIKON | SMZ-2B | |
butorphanol | centravet | DOL003 | 10µg/kg IV |
benzyl-penicillin | centravet | DEP203 IM | 15000UI/animal |
TCM199 | Sigma-Aldrich | M3769 10X1L | powder for hepes-buffered TCM199 |
Hepes sodium salt | Sigma-Aldrich | H3784-100G | |
bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | |
heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
NaHCO3-buffered TCM199 | Sigma-Aldrich | M2154-500ML | liquid for IVM medium |
epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
newborn calf serum | Sigma-Aldrich | N4762-500ML | |
4-well dishes | NUNCLON | 144444 | |
incubator | Heraeus | BB6060 | |
monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | |
hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | |
pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | |
paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich | 341584 | |
triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
normal donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
rabbit anti-Aurora B phospho-Thr232 | BioLegend | 636102 | |
TRITC-conjugated donkey anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | 711-025-152 | |
Vecta-Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
YOPRO1 | Thermofisher Scientific | Y3603 | |
confocal laser scanning microscope | LSM 780 | Zeiss | |
confocal laser scanning microscope | LSM 700 | Zeiss | |
ImageJ software | rsb.info. nih.gov/ij/download.html | free resource | |
mouse anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T8203 | |
rabbit anti-acH4K16 | Upstate Biotechnology | 07-329 | |
AlexaFluor 488-coniugated donkey anti-mouse IgG | Life Technologies | A21202 | |
4’,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma-Aldrich | D8417 | DAPI |
centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
RNALater | Invitrogen | AM7020 | |
Luciferase RNA | Promega | L4561 | |
PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
random hexamers | Thermofisher Scientific | N8080127 | |
mouse Moloney leukaemia virus reverse transcriptase | Thermofisher Scientific | 28025013 | |
SYBR green supermix | BioRad | 1708880 | |
specific primers | Sigma-Aldrich | specific primers were designed using Primer3Plus software (free resource) | |
thermal-cycler | BioRad | MyiQ | |
mouse monoclonal anti-CENPA | Abcam | ab13939 | |
mouse monoclonal anti-Aurora B | Abcam | ab3609 |