Эта рукопись описывает экспериментальный подход к морфологическим и биохимическим характеристикам ооцитов лошадей. В частности, в настоящей работе показано, как собирать незрелые и зрелые ооциты лошади с помощью ультразвукового наводящего пипетки (OPU) и как исследовать сегрегацию хромосом, морфологию веретена, глобальное ацетилирование гистонов и экспрессию мРНК.
Область вспомогательного размножения была разработана для лечения бесплодия у женщин, домашних животных и исчезающих видов. У лошадей вспомогательное воспроизведение также позволяет производить эмбрионы от высоких исполнителей без прерывания их спортивной карьеры и способствует увеличению числа жеребят у кобыл высокой генетической ценности. Настоящая рукопись описывает процедуры, используемые для сбора незрелых и зрелых ооцитов из яичников лошадей с использованием пипетки яйцеклеток (OPU). Эти ооциты затем использовали для исследования частоты анеуплоидии путем адаптации протокола, ранее разработанного на мышах. В частности, хромосомы и центромеры ооцитов метафазы II (MII) флуоресцентно маркировали и подсчитывали на последовательные фокальные планы после сканирования конфокального лазерного микроскопа. Этот анализ выявил более высокую частоту анеуплоидии, когда незрелые ооциты были собраны из фолликулов и созревали in vitro по сравнению сIn vivo. Иммунное окрашивание тубулина и ацетилированная форма гистона-4 в определенных остатках лизина также выявило различия в морфологии мейотического веретена и в глобальной структуре ацетилирования гистонов. Наконец, экспрессия мРНК, кодирующих гистондеацетилазы (HDACs) и ацетилтрансфераз (HATs), исследовалась с помощью обратной транскрипции и количественной ПЦР (q-ПЦР). Отличия в относительной экспрессии транскриптов не наблюдались между созревшими in vitro и ооцитами in vivo . В соответствии с общим молчанием транскрипционной активности во время созревания ооцитов анализ суммарного количества транскриптов может выявить только стабильность или деградацию мРНК. Таким образом, эти выводы показывают, что могут быть затронуты другие правила перевода и посттрансляции.
В целом, настоящее исследование описывает экспериментальный подход к морфологическим и биохимическим характеристикам ооцита лошади,Типа, который чрезвычайно сложно изучить из-за низкой доступности образцов. Тем не менее, он может расширить наши знания о репродуктивной биологии и бесплодии у моновируляционных видов.
Для лечения бесплодия у женщин, животных-компаньонов и исчезающих видов разработано множество методов вспомогательной репродукции. Одной из наиболее распространенных процедур в клинических условиях является извлечение ооцитов из метафазы II (MII) из фолликулов яичников с помощью ультразвуковой трансвагинальной аспирации, пикап яичника (OPU) 1 . Эти ооциты затем оплодотворяются in vitro (IVF), с полученным эмбрионом (ами), имплантированным в матку-реципиенту. MII-стадии (зрелые) ооциты извлекаются после введения экзогенных гонадотропинов. Однако это лечение ассоциируется у некоторых пациентов с развитием синдрома гиперстимуляции яичников (OHSS) 2 .
Пользуясь внутренней способностью полностью выращенных незрелых ооцитов (GV-стадия) спонтанно возобновлять мейоз после выделения из их фолликулов, можно получить зрелые ооциты без введенияГонадотропин 3 . Эта процедура называется созреванием ооцита in vitro (IVM) и представляет собой менее ориентированный на наркотики, менее дорогой и более дружелюбный к пациенту подход к вспомогательным репродуктивным технологиям. Однако успех развития эмбрионов с ооцитами, выращенными in vitro, как правило, ниже, чем у ооцитов созревших in vivo 4 , 5 . Возможное объяснение состоит в том, что созревающие in vitro ооциты в большей степени подвержены ошибкам в сегрегации хромосом, а возникающая анеуплоидия нарушает нормальное эмбриональное развитие 6 .
Понимание молекулярной основы хромосомной неправильной сегрегации во время IVM в конечном счете раскрыло бы полный потенциал этого метода. В этом ключе экспериментальный подход, используемый для исследования морфологических и биохимических особенностей in vitro -зрелых ооцитов, по сравнению с in vivo maturОоциты описаны здесь 7 , 8 . В частности, процедуры OPU незрелых и зрелых ооцитов и IVM незрелых ооцитов иллюстрируются с использованием взрослых лошадей и лошадей с естественной едой в качестве экспериментальной модели. Затем проводят иммунофлюоресценцию и анализ изображения, чтобы исследовать сегрегацию хромосом, морфологию веретена и глобальную картину ацетилирования гистонов на этих гаметах. Наконец, описан протокол обратной транскрипции и количественной ПЦР для анализа экспрессии мРНК.
По сравнению с моделями животных-грызунов лошади не допускают генетических манипуляций, их труднее манипулировать и требуют дорогого ухода. Однако эта модель приобретает значительный интерес для изучения созревания ооцитов 9 , 10 из-за сходства с физиологией яичников у людей 11 , 12 </ SUP>. Более того, разработка надежных протоколов IVM-IVF у лошади имеет существенный экономический интерес, так как это позволило бы увеличить число жеребят у кобыл высокой генетической ценности.
Одним из ограничений проведения экспериментов на ооцитах, особенно в моновируляционных видах, является ограниченная доступность образцов. Этот предел был преодолен путем корректировки подхода, ранее разработанного на мышах, к ооцитам лошадей 13 , 14 , чтобы проводить подсчет хромосом, который минимизирует потерю образца (см. Обсуждение для сравнения с другими доступными методами). Кроме того, протокол трифлуоресцентного окрашивания был оптимизирован для проведения множественных анализов в одном образце, а q-PCR-анализ проводился только для пулов с 2 ооцитами.
В целом, настоящее исследование описывает экспериментальный подход, направленный на морфологически и биохимически чаРактеризировать ооцит лошади, тип клетки, который чрезвычайно сложно изучить из-за низкой доступности образцов. Тем не менее, он может расширить наши знания о репродуктивной биологии и бесплодии моновируляционных видов.
Несмотря на то, что IVM был проведен на лошадях более 20 лет 16 , мы еще не знаем, может ли ооцит быть источником эмбриональной анеуплоидии, как это было предложено для людей 17 . Причина, вероятно, в том, что приготовление спредов ооцитов для подсчета хромосом приводи…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Фабриса Винсента за поддержку лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (LSCM) , а также Филиппа Барьера и Тьерри Бларда за ежедневное ультразвуковое сканирование яичников и инъекцию ХГЧ. Эта работа была частично поддержана проектом "Regione Sardegna and Regione Lombardia" "Ex Ovo Omnia" (Грант № 26096200 по борьбе с отмыванием денег); «Стипендия L'Oreal Italia per le Donne e la Scienza 2012» (контракт от 2012 года до FF), FP7-PEOPLE-2011-CIG, Исполнительное агентство по исследованиям (REA) «Pro-Ovum» (грант № 303640 по VL); И Постдокторской школой земледелия и ветеринарной медицины, финансируемой совместно с Европейским социальным фондом, Секторальная оперативная программа развития людских ресурсов на 2007-2013 годы (контракт № POSDRU / 89 / 1.5 / S / 62371 для IM). Сбор яйцеклеток in vivo финансировался Институтом французского языка им. Шеваля и Эквивалента.
ultrasound probe | Aloka | UST-5820-7,5 | |
human chorionic gonadotrophin | centravet | CHO004 | 1500unit/animal IV |
detomidine | centravet | MED010 | 9-15µg/kg IV |
butylscopolamine bromure | centravet | EST001 | 0,2mg/kg IV |
stereomicroscope | NIKON | SMZ-2B | |
butorphanol | centravet | DOL003 | 10µg/kg IV |
benzyl-penicillin | centravet | DEP203 IM | 15000UI/animal |
TCM199 | Sigma-Aldrich | M3769 10X1L | powder for hepes-buffered TCM199 |
Hepes sodium salt | Sigma-Aldrich | H3784-100G | |
bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | |
heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
NaHCO3-buffered TCM199 | Sigma-Aldrich | M2154-500ML | liquid for IVM medium |
epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
newborn calf serum | Sigma-Aldrich | N4762-500ML | |
4-well dishes | NUNCLON | 144444 | |
incubator | Heraeus | BB6060 | |
monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | |
hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | |
pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | |
paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich | 341584 | |
triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
normal donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
rabbit anti-Aurora B phospho-Thr232 | BioLegend | 636102 | |
TRITC-conjugated donkey anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | 711-025-152 | |
Vecta-Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
YOPRO1 | Thermofisher Scientific | Y3603 | |
confocal laser scanning microscope | LSM 780 | Zeiss | |
confocal laser scanning microscope | LSM 700 | Zeiss | |
ImageJ software | rsb.info. nih.gov/ij/download.html | free resource | |
mouse anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T8203 | |
rabbit anti-acH4K16 | Upstate Biotechnology | 07-329 | |
AlexaFluor 488-coniugated donkey anti-mouse IgG | Life Technologies | A21202 | |
4’,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma-Aldrich | D8417 | DAPI |
centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
RNALater | Invitrogen | AM7020 | |
Luciferase RNA | Promega | L4561 | |
PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
random hexamers | Thermofisher Scientific | N8080127 | |
mouse Moloney leukaemia virus reverse transcriptase | Thermofisher Scientific | 28025013 | |
SYBR green supermix | BioRad | 1708880 | |
specific primers | Sigma-Aldrich | specific primers were designed using Primer3Plus software (free resource) | |
thermal-cycler | BioRad | MyiQ | |
mouse monoclonal anti-CENPA | Abcam | ab13939 | |
mouse monoclonal anti-Aurora B | Abcam | ab3609 |