Dit manuscript beschrijft een experimentele aanpak om paardocyten morfologisch en biochemisch te karakteriseren. Specifiek illustreert het onderhavige werk hoe u onrijpe en volwassen paardocyten verzamelt door middel van ultrageluidgeleide ovumopname (OPU) en hoe u chromosoom-segregatie, spindemorfologie, globale histonacetylering en mRNA-expressie kunt onderzoeken.
Het gebied van geassisteerde voortplanting is ontwikkeld om onvruchtbaarheid bij vrouwen, gezelschapsdieren en bedreigde soorten te behandelen. In het paard zorgt geassisteerde voortplanting ook voor de productie van embryo's van hoge performers zonder hun sportcarrière te onderbreken en draagt bij aan een toename van het aantal veulen van merries van hoge genetische waarde. Het huidige manuscript beschrijft de procedures die worden gebruikt voor het verzamelen van onvolwassen en rijpe oocyten uit paard eierstokken met behulp van ovum pick-up (OPU). Deze oocyten werden vervolgens gebruikt om de incidentie van aneuploïdie te onderzoeken door een protocol dat eerder is ontwikkeld in muizen aan te passen. Specifiek werden de chromosomen en de centromeren van metafase II (MII) oocyten fluorescent gelabeld en geteld op sequentiële brandpuntsplannen na confocale lasermicroscoopscanning. Deze analyse onthulde een hogere incidentie in de aneuploïditempo wanneer onvolwassen oocyten uit de follikels werden verzameld en in vitro gerijpte vergeleken metIn vivo. Immunostaining voor tubuline en de geacyleerde vorm van histon vier bij specifieke lysine residuen bleek ook verschillen in de morfologie van de meiotische spindel en in het globale patroon van histon acetylering. Tenslotte werd de expressie van mRNA's die coderen voor histon-deacetylasen (HDAC's) en acetyltransferases (HAT's) onderzocht door reverse transcriptie en kwantitatieve-PCR (q-PCR). Geen verschillen in de relatieve expressie van transcripten werden waargenomen tussen in vitro en in vivo rijpe oocyten. In overeenstemming met een algemene stilzetting van de transcriptieactiviteit tijdens oocytmaturatie, kan de analyse van het totale transcriptiemengsel alleen mRNA stabiliteit of afbraak onthullen. Daarom wijzen deze bevindingen erop dat andere vertaal- en post-translationele regelingen zouden kunnen worden beïnvloed.
In het algemeen beschrijft de onderhavige studie een experimentele aanpak om de paardococyt morfologisch en biochemisch te karakteriseren, een ceHet type dat uitermate uitdagend is om te studeren, is vanwege de lage beschikbaarheid van het monster. Het kan echter onze kennis uitbreiden over de voortplantingsbiologie en onvruchtbaarheid bij monovulatoire soorten.
Een groot aantal geassisteerde voortplantingstechnieken is ontwikkeld om onvruchtbaarheid bij vrouwen, gezelschapsdieren en bedreigde diersoorten te behandelen. Een van de meest voorkomende procedures in klinische instellingen is het ophalen van metafase II (MII) -stage-oocyten uit de ovariumfollikels door middel van ultrageluidgeleide transvaginale aspiratie, Ovumopname (OPU) 1 . Deze oocyten worden vervolgens in vitro (IVF) bevrucht, waarbij de resulterende embryo's in een ontvanger van de ontvanger geïmplanteerd worden. De MII-fase (rijpe) oocyten worden opgehaald na de toediening van exogene gonadotropinen. Deze behandeling is echter bij sommige patiënten geassocieerd met de ontwikkeling van ovarium hyperstimulatie syndroom (OHSS) 2 .
Profiteer van het intrinsieke vermogen van volgroeide, onvolwassen oocyten (GV-stadium) om meiosis spontaan te hervatten zodra ze zijn geïsoleerd uit hun follikels, het is mogelijk om volwassen oocyten te verkrijgen zonder adminisGonadotropine 3 . Deze procedure heet oocyt in vitro rijping (IVM) en vertegenwoordigt een minder geneesmiddelgeoriënteerde, goedkopere en meer patiëntvriendelijke aanpak van geassisteerde voortplantingstechnologie. Echter, het succes van embryo-ontwikkeling met in vitro- veroude oocyten is in het algemeen lager dan bij in vivo gerijpte oocyten 4 , 5 . Een mogelijke verklaring is dat in vitro rijpende oocyten meer getroffen worden door fouten bij chromosomsegregatie, en de resulterende aneuploïdie vermindert de normale embryonale ontwikkeling 6 .
Het begrijpen van de moleculaire basis van chromosomale mis-segregatie tijdens IVM zou uiteindelijk het volledige potentieel van deze techniek onthullen. In deze ader gebruikte de experimentele aanpak de morfologische en biochemische kenmerken van in vitro- veroude oocyten, in vergelijking met in vivo maturEd oocyten wordt hier beschreven 7 , 8 . Specifiek worden de procedures voor de OPU van onvolwassen en rijpe oocyten en de IVM van onrijpe oocyten geïllustreerd met behulp van volwassen en natuurlijk fietsende paarden als een experimenteel model. Daarna worden immunofluorescentie en beeldanalyse gebruikt om chromosomsegmentatie, spindelmorfologie en het globale patroon van histonacetylering op deze gameten te onderzoeken. Tenslotte wordt een protocol van omgekeerde transcriptie en kwantitatieve PCR beschreven voor de analyse van mRNA expressie.
In vergelijking met knaagdierdiermodellen, laten paarden geen genetische manipulatie toe, zijn ze minder makkelijk te manipuleren en duur onderhoud nodig. Dit model krijgt echter grote belangstelling voor de studie van oocytematuratie 9 , 10 door de gelijkenis met menselijke eierstokkenfysiologie 11 , 12 </ Sup>. Bovendien heeft de ontwikkeling van betrouwbare protocollen van IVM-IVF in het paard een aanzienlijk economisch belang, aangezien het het aantal veulen van merries van hoge genetische waarde zou kunnen verhogen.
Een van de beperkingen van het uitvoeren van experimenten op oocyten, vooral bij monovulatoire soorten, is de beperkte beschikbaarheid van het monster. Deze limiet is hier overwonnen door een aanpak, die eerder in muizen is ontwikkeld, aan te passen aan paardocyten 13 , 14 om chromosoomtelling te verrichten die het monsterverlies minimaliseert (zie de bespreking voor een vergelijking met andere beschikbare technieken). Bovendien is een triple-fluorescentie kleuring protocol geoptimaliseerd om meerdere analyses op hetzelfde monster te voeren en q-PCR analyses werden alleen uitgevoerd op pools van 2 oocyten.
Over het geheel genomen beschrijft de onderhavige studie een experimentele aanpak gericht op morfologisch en biochemisch chaRacterize het paard oocyt, een celtype dat uitermate uitdagend is om te studeren door de lage beschikbaarheid van het monster. Het kan echter onze kennis van de voortplantingsbiologie en onvruchtbaarheid van monovulatoire soorten uitbreiden.
Hoewel IVM al meer dan 20 jaar 16 is uitgevoerd in paarden, weten we nog niet of de oocyt de oorsprong kan zijn van embryonale aneuploïdie, zoals voor mensen is voorgesteld 17 . De reden is waarschijnlijk dat de bereiding van oocytspreidingen voor chromosoomtelling resulteert in aanzienlijk monsterverlies. Met dit in het achterhoofd werd een onderzoek uitgevoerd naar de methoden die gebruikt werden om fouten bij chromosoom-segregatie te onderzoeken om te zoeken naar de me…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen Fabrice Vincent bedanken voor de ondersteuning met laserscanning confocal microscopy (LSCM) , en Philippe Barrière en Thierry Blard voor het uitvoeren van dagelijkse ultrasone ovarium scan en hCG injectie. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het project "Ex-Ovo Omnia", "Regione Sardegna en Regione Lombardia" (subsidie nr. 26096200 naar AML); De "L'Oreal Italia per le Donne e la Scienza 2012" gemeenschap (Contract 2012 tot FF), FP7-PEOPLE-2011- CIG, Research Executive Agency (REA) "Pro-Ovum" (Toekenning nr. 303640 tot VL); En door de Postdoctorale School van Landbouw en Veterinaire Geneeskunde, mede gefinancierd door het Europees Sociaal Fonds, Sectorieel Operationeel Programma voor Personeelsontwikkeling 2007-2013 (Contractnummer POSDRU / 89 / 1.5 / S / 62371 tot IM). De in vivo oocyt collectie werd gefinancierd door de Institut Français du Cheval et de l'Equitation.
ultrasound probe | Aloka | UST-5820-7,5 | |
human chorionic gonadotrophin | centravet | CHO004 | 1500unit/animal IV |
detomidine | centravet | MED010 | 9-15µg/kg IV |
butylscopolamine bromure | centravet | EST001 | 0,2mg/kg IV |
stereomicroscope | NIKON | SMZ-2B | |
butorphanol | centravet | DOL003 | 10µg/kg IV |
benzyl-penicillin | centravet | DEP203 IM | 15000UI/animal |
TCM199 | Sigma-Aldrich | M3769 10X1L | powder for hepes-buffered TCM199 |
Hepes sodium salt | Sigma-Aldrich | H3784-100G | |
bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | |
heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
NaHCO3-buffered TCM199 | Sigma-Aldrich | M2154-500ML | liquid for IVM medium |
epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
newborn calf serum | Sigma-Aldrich | N4762-500ML | |
4-well dishes | NUNCLON | 144444 | |
incubator | Heraeus | BB6060 | |
monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | |
hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | |
pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | |
paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich | 341584 | |
triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
normal donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
rabbit anti-Aurora B phospho-Thr232 | BioLegend | 636102 | |
TRITC-conjugated donkey anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | 711-025-152 | |
Vecta-Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
YOPRO1 | Thermofisher Scientific | Y3603 | |
confocal laser scanning microscope | LSM 780 | Zeiss | |
confocal laser scanning microscope | LSM 700 | Zeiss | |
ImageJ software | rsb.info. nih.gov/ij/download.html | free resource | |
mouse anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T8203 | |
rabbit anti-acH4K16 | Upstate Biotechnology | 07-329 | |
AlexaFluor 488-coniugated donkey anti-mouse IgG | Life Technologies | A21202 | |
4’,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma-Aldrich | D8417 | DAPI |
centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
RNALater | Invitrogen | AM7020 | |
Luciferase RNA | Promega | L4561 | |
PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
random hexamers | Thermofisher Scientific | N8080127 | |
mouse Moloney leukaemia virus reverse transcriptase | Thermofisher Scientific | 28025013 | |
SYBR green supermix | BioRad | 1708880 | |
specific primers | Sigma-Aldrich | specific primers were designed using Primer3Plus software (free resource) | |
thermal-cycler | BioRad | MyiQ | |
mouse monoclonal anti-CENPA | Abcam | ab13939 | |
mouse monoclonal anti-Aurora B | Abcam | ab3609 |